N-Hidroksisinamoilfenalkilamidler (36H), hem antioksidan hem de antitirozinaz yetenekleri sergilemiştir. Bileşik, bir 1,1-difenil-2-pikrilhidrazul- (DPPH-) süpürme testi, bir ferrik iyon azaltıcı antioksidan güç tahlili (FRAP) değerlendirmesi ve bir metal- kullanılarak antioksidatif özellikleri açısından incelenmiştir. şelatlama gücü deneyi. Sonuçlar, 36H'nin DPPH-tutma ve demir indirgeme gücü incelemelerinde antioksidan özelliklere sahip olduğunu, ancak şelatlama gücü testinin antioksidan kapasite göstermediğini gösterdi. 36H ayrıca in vitro mantar, B16F10 fare melanomu ve insan melanosit hücreleri dahil olmak üzere çeşitli tür platformları uygulanarak tirozinaz inhibe edici aktivite açısından ölçülmüştür. İn vitro mantar tirozinaz baskılaması açısından 36H, melanogenez süreçlerini kısıtladı. 36H'nin, mantar tirozinazı için rekabetçi bir inhibitör olarak tirozinaz aktif bölgesini bloke ettiği, dolayısıyla insan normal melanosit hücresel canlılığını azaltmadığı varsayılmaktadır. Kantitatif bir gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ve western blot, pigment üretimi (MITF, tirozinaz, TRP-1 ve TRP-2) dahil olmak üzere 36H'nin melanogenezle ilişkili RNA ve proteinleri aşağı doğru düzenlediğini keşfetti. , melanozom olgunlaşması (Rab27a) ve melanozom nakli (Myo5a, MLPH ve Mreg). Genel olarak, 36H, antioksidasyon ve melanin bastırmanın biyolojik işlevlerini sergiledi, bu nedenle, bir gıda katkı maddesi veya bir cilt beyazlatıcı madde olarak uygulanma olasılığı vardı.

İlgili araştırmalara göre,cistanche"mucize" olarak bilinen yaygın bir bitkidir.bitkiömrünü uzatan". Ana bileşenikistanositgibi çeşitli etkilere sahiptir.antioksidan, antienflamatuvar, Vebağışıklık fonksiyonu teşviki. Cistanche ve arasındaki mekanizmaderibeyazlatmaantioksidan etkisinde yatmaktadır.cistanche glikozitler. İnsan derisindeki melanin oksidasyonu ile üretilir.tirozintarafından katalizetirozinaz, veoksidasyonreaksiyon oksijenin katılımını gerektirir, bu nedenle vücuttaki oksijensiz radikaller melanin üretimini etkileyen önemli bir faktör haline gelir. Cistanche içerirkistanositbir antioksidan olan ve vücuttaki serbest radikallerin oluşumunu azaltabilen, böylecemelanin üretimini inhibe eder.

Cistanche Tubulosa Eki'ne tıklayın

Daha fazlasını iste:

david.deng@wecistanche.com WhatsApp:86 13632399501

1. Giriş

İnsan derisi, insan vücudundaki en büyük organdır; vücut fonksiyonlarını sürdürür ve su, elektrolit ve biyomolekül kaybını önler. Deri, epidermis, dermis ve hipodermisten oluşur. Epidermis ayrıca beş ayrı katmana ayrılır: stratum corneum, stratum lucidum, stratum granulosum, stratum spinosum ve stratum bazale [1]. Dermise bağlı olan epidermisin taban tabakası, melanositleri içeren stratum bazaledir. Melanositler, bu keratinositlerdeki melanin içeriği nedeniyle cilt renginin yüzeyini belirleyen melanini keratinositlere transfer etmek için dendritlere sahiptir [2].

Serbest radikaller, bir veya daha fazla eşleşmemiş elektrona sahip bir atom veya atom grubundan oluşur. Fizyolojik, metabolik ve immün reaksiyonlarda ve sinyal transfer fonksiyonlarında yer alırlar. Vücuttaki normal sağlıklı biyokimyasal süreçlerin bir parçası olmalarına rağmen, hasardan da sorumludurlar. Reaktif oksijen türleri (ROS) ve çeşitli serbest radikaller, süperoksit anyonları veya hidrojen peroksitlerin üretilmesiyle uyarılır. Bu karışık mesajlaşmaya, hücre zarlarında hasara ve lipit peroksidasyonu nedeniyle iyon hücresi iletişiminde hasara neden olabilir. Bu, SH gruplarını ve etkili proteinleri ve DNA'yı içeren hücre içi molekülleri etkiler [3]. ROS miktarı, antioksidanlar gibi normal hallerinde antioksidan aracılı olan kendini savunma sistemleri tarafından kontrol edilir. Bunlar, hücresel hasarı önlemek için serbest radikalleri temizleyen C vitamini, E vitamini veya glutatyon [4] içerir. Ancak, çok fazla ROS ile sonuçlanan hücresel oksidasyon durumunun dengesini bozarlar. Önceki çalışmalar, yaşlanma ve kanser gibi birçok dejeneratif hastalığın aktif oksijen türlerinden veya serbest radikallerden kaynaklandığını göstermiştir. Antioksidan özellikler, melanosit membranlarındaki lipitlerin peroksidasyonunun, depigmentasyondan sorumlu olabilecek hücre içi glutatyon içeriğini arttırdığını göstermektedir [5, 6].

Cildin, gözlerin ve saçın koyulaşması, melanositlerin melanozomunda sentezlenen pigmentli bir biyopolimer olan melanin sentezinden kaynaklanır. Melanin, UV ışığının neden olduğu hasara karşı koruyucu bir mekanizmadır [7]. Konjenital genler cilt rengini etkileyebilir, ancak UV radyasyonu indüksiyonu, iltihaplanma ve hormonal değişiklikler melanositlerin daha fazla melanin sentezlemesine neden olur. Bununla birlikte, melaninin aşırı üretimi melazma, senil lentigo, çiller ve hiperpigmentasyon gibi pigment bozukluklarına neden olabilir [8]. Bunlar genellikle cilt beyazlatıcı bileşenler içeren kozmetikler veya farmasötik bileşenler kullanılarak tedavi edilir. Bu elementler doğal kaynaklardan gelse de, güvenlik endişeleri veya beyazlatma etkinliği endişeleri nedeniyle kozmetik veya ilaçlarda sadece bazı maddeler kullanılmaktadır. Melanogenez, siklik adenozin monofosfatı (cAMP) artıran ve mikroftalmi ile ilişkili transkripsiyon faktörlerini (MITF) aktive eden -melanosit uyarıcı hormonun melanokortine-1 bağlanmasını içerir [9]. MITF, L-tirozinin dihidroksifenilalanine (L-DOPA) hidroksilasyonunda ve L-DOPA'nın dopakinona oksidasyonunda önemli bir işlev gören melanojenik bir enzim olan tirozinazın ekspresyonunu yukarı regüle eder [10]. Tıbbi ve kozmetik tedavilerde giderek artan bir şekilde tirozinaz aktivite inhibitörleri kullanılmaktadır. Melanogenez üretimi ve melanozomların melanositlerden keratinositlere transferi derinin renklenmesi için gereklidir [11]. Melanozomlar, Ras ile ilişkili protein Rab-27 (Rab27a), melanofilin (MLPH) ve miyosin Va'nın (Myo5a) oluşturduğu üçlü kompleks yoluyla melanositlerin çevresinde aktin hücre iskeletine bağlıdır. Rab27a, protein taşınmasında ve küçük GTPaz aracılı sinyal iletiminde yer alan zara bağlı bir proteindir. Melanofilin, motor protein olan Myo5a ile GTP'ye bağlı bölgede Rab27a ile üçlü bir kompleks oluşturur. Saç ve derideki görünür memeli pigmentasyonu, pigment üreten organelleri bağlamak için bu tri-protein kompleksine göredir. Kompleks protein eksikse, F-aktin ve melanozom arasındaki bağlantı bozulur [12].

Pozitif terapötik potansiyel bileşikler içinde, N-hidroksisinamoilfenalkilamidlerin (36H), uyarılmış bir insan lösemi monositik hücre dizisi olan THP-1'de matris metaloproteinaz- (MMP-) 9'un ekspresyonu üzerinde inhibe edici bir etkiye sahip olduğu rapor edilmiştir. tümör nekroz faktörü- (TNF-) tarafından [7]. Önceki bir çalışma, hem protein hem de mRNA seviyeleri için MMP-9'nin indüklenen TNF- ifadesinin, konsantrasyona bağlı bir şekilde (1–20 μM) tamamen inhibe edildiğini gösterdi. 36H'nin, NF-κB raportör gen tahlili tarafından tespit edildiği üzere B hücresi (NF-κB) sinyallemesinde nükleer faktör-κ hafif polipeptit gen arttırıcıyı belirgin şekilde baskıladığı, ancak (κ hafif polipeptitin nükleer faktörü) bozunması üzerinde hiçbir etkisinin olmadığı bulunmuştur. B hücresi inhibitöründe (IκB ) gen arttırıcı veya NF-κB'nin translokasyonu. Kromatin immünopresipitasyon verileri, MMP-9 ve NF-κB p65 alt birimi (p65) promotör geni arasındaki ilişkinin 36H ve fosforilasyon tarafından tamamen reddedildiğini gösterdi p65'in oranı etkilenmedi. Genel olarak önceki bir rapor, 36H'nin THP-1'de NF-κB yolu mekanizmalarının nükleer hedefli aşağı regülasyonu yoluyla MMP-9 salgılanmasını bastırdığını gösterdi. 36H, kafein asidinin bir analoğudur Kanser metastazı ve istilasının bilinen bir baskılayıcısı olan fenetil ester (CAPE) [14] Bazı CAPE analoglarının antioksidan aktiviteleri ve serbest radikal yakalaması incelenmiştir ve bu çalışmaların sonuçları, bu çalışmayı 36H'nin azaltılıp azaltılmadığını belirlemeye sevk etmiştir. tirozinaz aktivitesi ve aşağı doğru düzenlenmiş melanogenez ile ilişkili RNA ve proteinler. Bu çalışma, 36H'nin potansiyel ve pozitif bir antioksidan ve cilt beyazlatıcı bir ajan olduğunu bulmuştur.

2. Malzemeler ve Yöntemler

2.1. Reaktifler ve Malzemeler.Dimetil sülfoksit (DMSO) ve L-tirozin, Sigma-Aldrich Chemical Inc.'den (St. Louis, MO, ABD) elde edildi. Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM) ve fetal sığır serumu (FBS), Gibco-BRL'den (Gaithersburg, MD, ABD) satın alınmıştır. Tüm reaktifler ve alternatif tamponlar, en yüksek ticari saflıkta elde edildi.

2.2. 36H'nin Kimyasal Sentezi.36H, bileşikleri elde etmek için amid bağlama eşleşmesinden sonraki yöntemleri kullanan Profesör Yueh-Hsiung Kuo tarafından sağlandı. Benzotriazol-1-iloksitris (dimetilamino)-fosfonyum hekzaflorofosfat (BOP), dimetilformamid (DMF) içinde bir R2-NH2, R1-COOH ve trietilamin (Et3N) karışımı ile birleştirildi. Reaksiyon solüsyonu 3{{1{{30}}} dakika 0°C'de karıştırıldı ve sonra 25°C'de 2 saat karıştırıldı. Kimyasal sıvı buharlaştırıldığında, tortu, H20 ve etil asetat (AcOEt) arasında paylaştırıldı. Tortu daha sonra süzüldü ve silis jel (70–230 ve 230–400 ağ gözü, Merck 7734) üzerinde bir yıkama solüsyonu (AcOEt–CH2Cl2, 1:1, v/v) ile kolon kromatografisi kullanılarak saflaştırıldı. Ürünler, en iyi Oksidatif Tıbbı ve Hücresel Uzun Ömrü ve en ideal kristalleri elde etmek için AcOEt'ten yeniden kristalleştirildi. Elektron darbeli kütle spektrometresi (EIMS) için bir Finnigan TSQ-46C kütle spektrometresi kullanıldı. 1H ve 13C NMR spektrumları, bir Bruker Avance 500 spektrometre kullanılarak elde edildi. Bir Nicolet Magna-IR 550 spektrofotometre, IR spektrumlarını kaydetti. 36H, sonraki çalışmalardan önce ilk olarak DMSO çözeltisi içinde çözüldü. Her tahlil için, yüzde 0.2'lik (v/v) sabit ve nihai konsantrasyona sahip DMSO kullanıldı. Bu bileşik bir antioksidan veya cilt beyazlatıcı olarak bilinmemektedir [7, 13] ve yapı Şekil 1'de gösterilmektedir. Numuneler DMSO içinde eritildi ve yüzde 0.5'in altında bir nihai DMSO konsantrasyonu ile çeşitli konsantrasyonlar hazırlandı.

2.3. DPPH Radikal Temizleme Kapasitesi Testi.DPPH, 2,2-difenil-1-pikrilhidrazildir ve serbest radikal içerdiğinde koyu mor olur. Antioksidan, radikali DPPH˙'den süpürdüğünde, DPPH˙'yi açık sarı bir renge sahip olan kararlı bir DPPH'ye indirger [14]. 36H'nin (toplam hacimde 2 uL) çeşitli dozajları, 98 uL DPPH (60 uM) karışımı içinde birleştirildi ve plaka, 517 nm'lik bir enzime bağlı immünosorbent tahlili (ELISA) spektroskopik okuyucu kullanılarak incelendi. Pozitif kontrol olarak L-askorbik asit kullanıldı. Kalıntı DPPH oranları, eski DPPH konsantrasyonunu azaltan antioksidan miktarını belirlemek için örneğin yanında haritalandı. Süpürme özelliği (yüzde) olarak belirlendi

2.4. Gücü Azaltma Testi.Ferrik iyon azaltıcı antioksidan güç testi (FRAP) genellikle içeceklerin, gıdaların, meyvelerin ve flavonoidler veya polifenoller dahil olmak üzere besin takviyelerinin antioksidan kapasitesini değerlendirmek için uygulanır. 67 mM fosfat tampon karışımına (0.085 mL, pH 6.8) ve yüzde 20 potasyum ferrisiyanide [K3Fe(CN)6, 2.5 uL) çeşitli dozlarda 36H eklendi. Çözelti 20 dakika 50°C'de reaksiyona sokuldu ve daha sonra çözeltiye trikloroasetik asit (yüzde 10, 0.16 mL) ilave edildi ve 3000g'de 10 dakika santrifüjlendi [14]. Çözelti süpernatanı (75 uL) yüzde 2 FeCl3 (25 uL) ile birleştirildi ve daha sonra bir ELISA spektroskopik okuyucu, kuyulu bir plaka için 700 nm'de elde edilen absorbansı ölçtü. Pozitif kontrol olarak bütillenmiş hidroksianisol (BHA) kullanıldı. İndirgeyici nitelik ne kadar yüksek olursa, absorbans o kadar güçlü olur.

2.5. Metal Şelatlama Aktivitesinin Tahlili.Klorofilin iyon şelatlayıcı demir potansiyeli, Chen ve diğ. tekniği kullanılarak ölçüldü. [14]. Kısaca, numunelerin belirli dozajları DMSO içinde eritildi ve bir FeCl2·4H2O (2.0 mM, 0.05 mL) karışımına eklendi. Ferrozin (5 mM, 0.2 mL) ilavesi, çözelti kuvvetlice çalkalandığında reaksiyonu başlattı ve ardından 25°C'de 10 dakika bırakıldı. Reaksiyon dengeye ulaştığında, çözelti için absorbans değerleri 560 nm'de kullanılarak belirlendi. boş bir araç Pozitif kontrol olarak EDTA kullanıldı. Şelatlama aktivitesi için hesaplama formülü (1) ile aynıydı.

2.6. Mantar Tirozinaz Aktivitesi Testi.Hem mantar tirozinaz aktivitesinin baskılanması hem de hücresel tirozinaz inhibisyonu, küçük değişikliklerle önceki yöntem kullanılarak spektrofotometrik olarak belirlendi [2]. Tirosinaz aktivite deneyi için pozitif kontrol olarak kojik asit kullanıldı. Materyaller önce sulu DMSO içerisinde çözündürüldü ve fosfat tamponu (50 mm, pH 6.8) ile L-tirozin (2.5 mg/mL) içerisinde kültürlendi. Tüm modeller, DMSO oluşturduğunda tirozinaz aktivitesiyle ilgisi olmayan DMSO kullanmıştır.<0.5% of the total volume. Subsequently, 25 U/mL of mushroom tyrosinase with an identical buffer was then added, and the solution was incubated at 37° C for 30 min. An ELISA spectroscopic reader was used to conduct the absorbance measurements for the assays at 475 nm, using 96-well microplates (Molecular Devices, CA, USA).

2.7. İnsan Melanosit Hücresi (HMC) Kültürleri.Yenidoğan sünnet derisinden birincil insan epidermal melanositleri, Cascade Biologics'ten alındı. Bu aynı zamanda Wang ve diğerleri tarafından uygulandı. [2]. Ortam 254'te (M-254- 500; Cascade Biologics, Portland, OR, ABD) kültürlendi ve insan melanosit büyüme takviyesi (HMGS, kat. numarası S-002-5) ile geliştirildi. Medium 254, bazı esansiyel olmayan ve esansiyel vitaminler, organik bileşikler, amino asitler, inorganik tuzlar ve eser mineraller içeren bazal bir besiyeridir. İnsan melanosit büyüme takviyesi, sığır fetüsü serumu, sığır insülini, sığır hipofiz özütü, sığır transferini, hidrokortizon, temel fibroblast büyüme faktörü, forbol 12-miristat 13-asetat ve heparini içermektedir. Tüm hücreler, yüzde 5 CO2 atmosferi ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 derece C'de inkübe edildi.

2.8. HMC'nin Hücre Canlılığının Belirlenmesi.Hücre canlılığı, bir MTT testi [3] kullanılarak belirlendi. Sarı bir tetrazol, canlı hücrelerde mitokondriyal dehidrojenaz (ubikinon) ile birleştirildiğinde, MTT'nin tetrazolyum halkaları ayrılır ve mor formazana dönüşür. Hücreler, kuyu plakalarında 9 x 103 hücre/oyuk yoğunlukta tohumlandı. Hücreler bir gün boyunca kültürlendikten sonra ortam değiştirildi ve 100 uL'lik nihai ortam hacmine farklı konsantrasyonlarda 36H eklendi. Bunlar 48 saat inkübe edildikten sonra ortam, MTT (0.5 mg/mL) dahil olmak üzere taze bir ortam (100 uL) ile ikame edildi. Plaka daha sonra bir inkübatörde 37 derece C'de 2 saat yüzde 5 C02 ile kültürlendi. Daha sonra mor formazan kristallerini çözmek için her bir oyuğa DMSO (100 uL) eklendi. Kapların maksimum çözünmeye ulaşmasını sağlamak için kaplar yavaşça çalkalandı ve karanlıkta 10 dakika karıştırıldı ve 595 nm'de ölçüldü. Hücre büyümesi şu şekilde hesaplandı:

2.9. HMC'den Tirosinaz Aktivitesinin Ölçümü.İnsan melanosit hücrelerinde (HMC) (oyuk başına 5 x 104 hücre) tirozinaz aktivitesini belirlemek için, bunlar farklı dozlarda 36H içeren 1000 μL ortam içinde 12-kuyu plakalarına yerleştirildi ve 48 saat kültürlendi [2] . Numune ile işlenmiş hücreleri yıkamak için PBS tamponu kullanıldı ve bunlar daha sonra yüzde 1 Triton X-100/PBS ile parçalandı. Daha sonra elde edilen hücresel lizattan enzim özü toplandı ve 50 uL 2 mM L-tirozin ile birleştirildi. Ekstraktlar daha sonra karanlıkta 37°C'de 3 saat inkübe edildi. Daha sonra 490 nm'de absorbanslarını belirlemek için bir spektrofotometre kullanıldı.

2.10. HMC'de Melanin İçeriğinin Belirlenmesi.Bazı küçük değişikliklerle, bu deney için önceki teknik de kullanıldı [2]. Hücre peletleri, yüzde 10 DMSO içeren 2.0 N NaOH içinde eritildi ve 1 saat 90°C'ye ısıtıldı. Süspansiyonlar, 10 dakika 10,000g'de santrifüj edilerek ayrıldı. Bir spektrofotometre kullanılarak, melanin içeriği, 475 nm'lik bir absorbans seviyesinde üretilen veriler aracılığıyla belirlendi.

2.11. Kantitatif Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu.qRT-PCR için, 20 μL'lik bir reaksiyon, iki ters transkriptazın 0,4 mL karışımını içeriyordu: 10 μL 2 × QuantiTect SYBR Green Master Mix (QIAGEN, Valencia , CA, ABD) sıcak başlangıçlı Taq polimeraz, 0,8 mL primer ve 0,5 mL (10 ng/mL) şablon ile. Primer dizileri Tablo 1'de listelenmiştir. StepOnePlus™ Sistemi tüm gerçek zamanlı PCR testlerinde kullanılmıştır. Reaksiyon, RT reaksiyonunun 42°C'de 20 dakika süreyle gerçekleştirilmesi ve ardından FastStart Taq DNA polimerazın 95°C'de 5 dakika süreyle etkinleştirilmesiyle tamamlandı. Bu daha sonra denatürasyon, tavlama ve 60 derece C'de 5 saniye süreyle edinme için 95 derece C'de 5 saniye boyunca 40 veya 50 döngü için amplifiye edildi. Son olarak 72°C'de 15 saniye uzatıldı. Floresans, uzama fazından sonra da ölçülebilir, ancak bu deney için, tavlama fazından sonra ölçülmüştür. Kuyulu bir plaka ile, SYBR Green I için Eurogentec qPCR çekirdek kitinden 10,6 μL MasterMix (1,4 μL 50 mM MgCl2, 2) içeren 11 μL reaksiyon karışımına 9 μL lizat eklendi μL 10x reaksiyon tamponu, 0,8 μL 5 mM dNTP karışımı, 0,6 μL SYBR Green I, 5,7 μL nükleaz içermeyen su ve 0,1 μL sıcak GoldStar Taq polimeraz), 0,1 μL MS2 RNA, 0,1 μL 10x seyreltilmiş RNAse inhibitörü ve 0,1 μL REV primeri (100 μM) ve ayrıca ABI 7300 qPCR sisteminde SG-PERT tahlilleri için MS2 FWD. qRTPCR reaksiyonu, sıcak GoldStar Taq enziminin aktivasyonu, 40-döngü amplifikasyonu, tavlama ve edinim, 95 derece C'de denatürasyon ve 72 derece C'de uzama ABI 7300 aletini kullandı. Testi hazırlamak için tüm reaktifler ya bir soğutma bloğu üzerinde ya da buz üzerinde tutuldu. Her lizat örneğinde çift SGPERT reaksiyonları gerçekleştirildi. qPCR yazılımını ve cihazlarını kullanarak, eşiği manuel olarak belirlenen bir ABI 7300 ve maksimum ikinci türev yöntemiyle bir LightCycler® 480, ölçüm döngüsü (Cq) değerleri üretti. Her iki cihaz için aynı yazılımı kullanarak erime tepe noktaları da otomatik olarak hesaplandı.

2.12. Batı Lekesi.Toplam 1 × 105 hücre, iki gün boyunca numune grupları veya boş araç kontrolü ile işlendi. Hücreler toplandı ve lizis tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 137 mM sodyum klorür, 50 mM sodyum L florür, 10 mM sodyum pirofosfat, 20 mM - gliserofosfat, 1 mM fenilmetilsülfonil L florür) ile parçalandı , 1 mM EDTA, yüzde 10 gliserol, yüzde 1 Nonidet P-40, 2 uM leupeptin, 0,1 mM sodyum ortovanadat ve 2 ug/mL aprotinin) [14]. Lizatlar, 30 dakika boyunca 20,{22}} xg'de santrifüjlendi ve süpernatan solüsyon içindeki protein konsantrasyonları, bir bisinkoninik asit (BCA) protein tahlil kiti (Pierce, Rockford, IL, ABD) ile belirlendi. Eşit miktarlarda protein, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile ayrıldı ve daha sonra bir nitroselüloz membrana (PALL Life Science, Ann Arbor, MI, ABD) elektrotransfer edildi. Zar, PBS-T tamponunda (yüzde 0.1 Tween 20 içeren PBS) yüzde 5 yağsız sütle 1 saat bloke edildi. Transfer filmi, ıslak transfer tankından ve yarı kuru transfer yuvasından dikkatli bir şekilde çıkarıldı ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca 1x TBST içinde yüzde 5 yağsız süt içeren bir kutuya yerleştirildi. Daha sonra yağsız süt kalıntılarını gidermek için 1x TBST ile hafifçe yıkandı. Membran daha sonra ilgili birincil antikorlarla inkübe edildi. Her durumda zarlar, yaban turpu peroksidaz-konjuge antitavşan veya fare antikoru ile inkübe edildi ve ardından ECL tespit reaktifleri (PerkinElmer, ECL1: ECL{38}}: 1) ile işlendi. Bantları saptamak için ölçüm için Life Science'tan mini boyutlu bir kemilüminesan görüntüleme sistemi kullanıldı [14].

2.13. İstatistiksel analiz.Standart ve numuneler için her konsantrasyondan üçü kullanıldı. Student t testi kullanılarak sonuçlar istatistiksel olarak karşılaştırıldı ve ortalama değerlerin ortalaması ± standart sapma (SD) kullanılarak ifade edildi.

3. Sonuçlar

3.1. DPPH Serbest Radikal Temizleme Aktivitesi.ROS, serbest radikaller ve doğal antioksidanlar arasındaki denge bozulduğunda lipid peroksitler, DNA hasarı, protein ekspresyonu, doku yaşlanması ve kanser oluşumuna neden olabilir. Serbest radikal zincir reaksiyonları, elektron bağışlarını veya kabullerini nötralize ederek ve serbest yalnız çiftleri şelatlayarak bloke edilir. İçsel ve dışsal yönlerden oksidatif stresi azaltmak, sağlığı artırmanın bir yoludur. Bu çalışma, ferrik indirgeme gücünü, DPPH serbest radikal yakalama kapasitesini ve metal şelatlama gücünü belirleyerek antioksidan özellikleri inceledi. Artan ROS üretimi ve birikimi, gıda ve kozmetikte lipid oksidasyonu ve doğal antioksidan aktivite üretir. Özellikle fonksiyonel beslenme katkı maddeleri ve cilt bakım ürünlerinde serbest radikalleri yok etme özellikleri hayati önem taşır.

İlk oksidasyon önleyici tahlil, DPPH serbest radikal yakalama testiydi. Bu, antioksidanların oksidasyon ürünlerini önlemek için hareket ettiği basit ve ekonomik bir deneysel platformdur. Antioksidanlar, kararlı radikal DPPH reaktifinin rengini mordan difenil-pikrilhidrazinin açık sarısına değiştirir. 36H'nin antioksidan özelliklerini belirlemek için, süpürme kabiliyetini belirlemek için 100 uM'lik bir doz uygulandı. Tablo 2, 36H'nin mükemmel serbest radikal süpürme yeteneği sergilediğini ve DPPH serbest radikalinin yüzde 60'ını ve C vitamininin aynı konsantrasyonda (100 uM) yüzde 85,3'ünü süpürdüğünü göstermektedir.

3.2. Demir İndirgeyici Antioksidan Güç.İkinci oksidasyon önleyici deney, Fe(III)-ferrisiyanür kompleksinin sentezini ölçmenin yaygın ve güvenilir bir yolu olan ferrik indirgeme gücü testidir. Fonksiyonel bir ajan, Fe3 artı /ferrisiyanür komplekslerini demir formuna indirger. Bu kombinasyon 7{{10}}0 nm'de mavi bir renge sahipti çünkü K4Fe(CN)6, Fe3 artı ile reaksiyona girerek Fe[Fe(CN)6]3 oluşturdu. Deneyde, hedef bileşiğin indirgeme gücüne bağlı olarak çözeltinin rengi açık sarıdan mavi ve yeşilin farklı tonlarına dönüştü. Tablo 2, BHA'ya kıyasla 100 uM'de BHA'nın 0,95'lik bir indirgeme gücü değerine sahip olduğunu ve 100 uM'de 36H'nin 0,85'lik bir indirgeme gücü değerine sahip olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, 36H'nin iyi bir ferrik indirgeyici antioksidan güce sahip olduğu gösterilmiştir.

3.3. Demirli İyon Şelatlama Kapasitesi.36H'nin demir iyonları için şelatlama aktivitesi Tablo 2'de gösterilmiştir. Pozitif kontrol olarak EDTA (100 uM) kullanıldı. Fe2 plus ve ferrozin kantitatif olarak kompleksler oluşturur. Reaktif komplekslerinin oluşumu, kompleksin kırmızı renginde bir azalmaya neden olan şelatlayıcı ajanlar nedeniyle genellikle bozulur. 10 uM'lik bir dozajda 36H'nin Fe2 artı süpürme kapasitesi üzerinde önemli bir etkisi olmadı ve 100 uM'lik konsantrasyonda yüzde 43,2 oranında engelleme sergiledi. Pozitif kontrol EDTA, 100 uM'de yaklaşık yüzde 80 iyon şelatlama kapasitesine sahipti.

3.4. 36H'nin Mantar Tirosinaz Aktivitesi Üzerindeki Etkisi.Tirosinaz aktivitesinin inhibisyonu, çoğu model olarak mantar tirozinazını kullanan çok sayıda raporda açıklanmıştır. Avantajları, bilim adamları tarafından iyi geliştirilmiş olması, kolay işlemler, düşük maliyetli, hızlı pigmentasyon süreci, memelilerle benzer yapısal ve fonksiyonel özellikler ve melanin gelişimini gözlemleme kolaylığıdır. Mantar tirozinaz aktivitesinin 36H ile inhibisyonu incelenmiştir ve inhibitör yeteneği, 36H konsantrasyonu ile pozitif bir korelasyona sahiptir (Şekil 2(a)). 15. dakikada 36H'nin farklı konsantrasyonlarda (1, 5 ve 10 mM) kontrole göre OD değerlerini düşürdüğü görüldü. Enzim aktivitesi, araç kontrolüne kıyasla 1 mM'de yaklaşık yüzde 10, 5 mM'de yüzde 30 ve 10 mM'de yüzde 40 oranında azalır (Şekil 2(b)). Tirosinaz aktivitesi ile 36H'deki konsantrasyonu arasındaki ilişki incelenmiştir. İnhibitörün farklı konsantrasyonları, tamamı orijinden geçen bir grup çizgi verir. Tirosinaz aktivitesinin 36H tarafından inhibisyonu, enzim miktarını etkilemedi, bu da 36H'nin geri dönüşümlü bir inhibitör olduğunu gösterdi (Şekil 2(c)). 36H tarafından tirozinaz üzerindeki inhibisyon tipi, bir Lineweaver-Burk çift karşılıklı çizimi kullanılarak doğrulandı. 1/v'ye karşı 1/[s] grafikleri, 36H'nin rekabetçi bir kompleks olduğunu gösteren, orijinden geçen bir düz çizgi ailesi verdi. Enzimin kinetiği Şekil 2(d)'de sunulmaktadır.

3.5. HMC'de Hücre Canlılığı, Hücresel Tirosinaz ve Melanin İçeriğinin 36H Üzerindeki Etkisi.Güçlü bir cilt aydınlatıcı bileşik olarak bileşen, istenmeyen sitotoksik yan etkiler olmaksızın zararsız olmalıdır. Şu anda dünya çapında kozmetik bileşenler olarak kullanılan kojik asit, arbutin, PTU veya hidrokinon dahil olmak üzere bazı iyi bilinen melanin sentezi inhibitörleri vardır. Ayrıca, bu melanojenik inhibitörlerin yüksek konsantrasyonlu dozlarda veya sık kullanımda insan derisi tümörijenisitesini indükleyebileceğini de keşfettik [2]. HMC, 1, 5, 10 ve 25 uM'lik çeşitli konsantrasyonlarda 48 saat boyunca 36H'de kültürlendi ve hücre canlılığının, Şekil 3(a)'da düşük hücresel toksisiteler gösterdiği belirlendi. Maddenin insanlarda terapötik veya kozmetik kullanımı düşünüldüğünde, insan dermal hücresel canlılıkları üzerindeki sitotoksik sonuçların önemsiz olduğunu bulduk. 36H'nin melanogenez üzerindeki inhibe edici etkisini anlamak için HMC'de hücre içi tirozinaz aktivitesini değerlendirdik. HMC'deki tirozinaz aktivitesi sonuçları, konsantrasyon arttıkça bariz bir varyasyon olduğunu ve düşük hücre toksisitesi için tirozinaz aktivitesinin azaldığını gösterdi. Tedaviden sonra, tirozinaz aktivitesi doza bağımlı bir şekilde 25 uM'de yüzde 39 ± 2,2'ye düşürüldü (Şekil 3(b)). Bu sonuçlar, 36H'nin hücre içi tirozinaz aktivitesini inhibe ettiğini gösterdi. Melanin testi sonuçları, 36H'nin HMC'deki melanin içeriğini doza bağımlı bir şekilde azalttığını açıkça göstermiştir (Şekil 3(c)). Kontrol yüzdesi melanin içeriğini temsil eder. Tedaviden sonra melanin içeriği 25 uM'de yüzde 77, 10 uM'de yüzde 84, 5 uM'de yüzde 88 ve 1 uM'de yüzde 90 idi. Bu sonuçlar, 36H'nin HMC'de 25 uM'de melanin sentezi üzerinde önemli bir inhibe edici etkiye sahip olduğunu gösterdi.

3.6. Melanin Biyosentezi ile İlgili mRNA ve Proteinler, HMC'de 36H'den Etkilendi.Melanin biyosentezi melanozomlarda meydana gelir ve ilk amino asit substratı tirozindir. Tirozin ilk olarak tirozinaz aracılığıyla L-DOPA'ya katalize edilir ve aynı enzim olan tirozinaz kullanılarak DOPA, dopakinona katalize edilir. Dopakinon, ömelanin oluşturmak için dopakrom tautomeraz (tirozinaz ile ilişkili protein- 2, TRP-2), TRP-1 ve tirozinaz tarafından katalize edilir. HMC'de 36H, Şekil 4'te gösterildiği gibi hücresel melanogenezle ilişkili RNA'ları ve proteinleri aşağı doğru düzenledi.

3.7. 36H'nin Melanozom Olgunlaşması Üzerindeki Etkisi.Melanozom, melanositlerde melanin sentezine dayanan bir organeldir. Melanozomlar ne kadar olgunlaşırsa, o kadar fazla melanin oluşur. Bu nedenle, melanozom olgunlaşması cilt beyazlatma mekanizmasında önemlidir. Premelanozom proteini 17 (Pmel17), proteolitik olarak birkaç küçük parça halinde işlendiği melanozom olan pigment organelinin öncülerini hedef alır. Bu parçalardan bazıları, tabakalar halinde bir araya gelen ve melanom ince yapısının altında yatan çizgili modeli oluşturan patolojik olmayan amiloidler oluşturur. Bu çalışma, 36H'nin HMC'de Pmel17 RNA ve protein ekspresyonunu aşağı regüle ettiğini gösterdi (Şekil 5).

3.8. 36H'nin Melanozom Taşımacılığına Etkisi.Rab27a, MLPH ve Myo5a, melanosit periferlerinde melanozomları bağlamak için bir tri-protein kompleksi oluşturur. Melanozom taşıma sürecinde, üçlü kompleks, aktin hücre iskeleti ve melanozom arasındaki bağlantıdır. Bu proteinlerin eksikliği taşımayı etkiler ve melanoregulin (Mreg), düzenlenmiş bir dökülme mekanizması yoluyla melanositlerden keratinositlere melanozom transferini sağlar. Bu çalışma, 36H'nin bu ilgili RNA ve proteinleri etkileyerek melanozom taşınmasını azalttığını göstermiştir (Şekil 6).

Daha fazlasını isteyin: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501