[6]-Gingerol, TRPV1 Kanalı Kısım 1'i Hedefleyerek Birincil İnsan Nötrofillerinde CXCL8 Salgısını Ve ROS Üretimini Kolaylaştırır

1. Giriş

İmmünomodülatör özelliklere sahip gıda bileşenlerinin ilgili moleküler hedefleriyle birlikte tanımlanması son yıllarda artan bir ilgi çekmiştir. Yüksek ligand çeşitliliği nedeniyle, iyon kanallarının (TRP kanalları) geçici reseptör potansiyeli üst ailesi, potansiyel hedef yapıların çok ilginç bir sınıfını temsil eder.

Moleküler hedef, bir ilacın vücutta etki gösterdiği spesifik bir moleküldür. Bağışıklık, vücudun hastalığa direnme yeteneğinin gücünü ifade eder.

Moleküler hedefler ile bağışıklık arasında yakın bir ilişki vardır. İlaçların etkileri genellikle vücudun bağışıklığını etkiler. Örneğin, belirli ilaçlar, bir organizmanın bağışıklık sisteminin işlevine müdahale ederek belirli kronik hastalıkları tedavi edebilir. Buna ek olarak, tümör tedavisinde genellikle hedefe yönelik terapi kullanılır, yani kanser hücrelerine saldırmak için belirli moleküler hedefleri hedefleyerek, böylece bağışıklığın kanser hücreleriyle savaşma yeteneğini geliştirir.

Ayrıca bağışıklığın gücü de ilaçların etkisini etkileyecektir. Bağışıklık sistemi zayıflamış kişiler, kullanıldıklarında yan etkiler veya daha az etkili ilaçlar yaşayabilirler çünkü bağışıklık sistemi ilaçları iyi emmez ve bu da daha az etkili tedaviyle sonuçlanır. Bu nedenle, sağlıklı bir bağışıklık sisteminin sürdürülmesi ilaç tedavisi için çok önemlidir.

Sonuç olarak, moleküler hedefler ile bağışıklık arasında yakın bir ilişki vardır ve bu ilişkinin tam olarak anlaşılması ilaçların akılcı kullanımı için büyük önem taşımaktadır. Sağlığımızı daha iyi korumak için aktif olarak bağışıklığımızı güçlendirmeli, doktor tavsiyelerine göre ilaçları doğru kullanmalı ve hedefe yönelik tedavilerle bağışıklığı güçlendirmeliyiz. Bu açıdan bağışıklığımızı güçlendirmemiz gerekiyor. Cistanche bağışıklığı önemli ölçüde artırabilir çünkü Cistanche ayrıca bağışıklık sisteminin savaşma yeteneğini güçlendirebilen ve vücudun bağışıklığını iyileştirebilen anti-virüs ve anti-kanser etkilerine sahiptir.

Cistanche'nin sağlığa faydalarına tıklayın

Memeli TRP kanalı üst ailesi, altı ilgili protein ailesini içerir; yani ankirin (TRPA), kanonik (TRPC), melastatin (TRPM), mukolipin (TRPML), polisistin (TRPP) ve vanilloid (TRPV) ailesi. hepsi tipik olarak değişen katyon seçiciliğine sahip katyon geçirgen gözenekler oluşturmak için tetramerler olarak bir araya gelen altı transmembran segmenti paylaşır.[1] TRPV1 kanalı, TRP süper ailesinin açık ara en yoğun araştırılan üyesi olabilir. TRPV1 başlangıçta acı biberlerin keskin bileşeni olan kapsaisin reseptörü olarak tanımlandı.[2] Daha sonra, zencefilden elde edilen keskin içerikli zencefilollerin de TRPV1'i aktive ettiği gösterildi.[3]

TRPV1'in nöronal olmayan hücre tiplerindeki biyolojik rolü hala kapsamlı bir araştırma altındadır, ancak mevcut sonuçlar, duyusal ve termal algının çok ötesinde işlevlere işaret etmektedir. Örneğin, yapısal bir kapsaisin analoğu olan günlük 0,15 mg TRPV1 agonisti nonivamid dozuyla 12-haftalık bir müdahale, vücut yağ kütlesinde diyete bağlı artışı önledi ve plazma serotoninini artırdı sağlıklı aşırı kilolu deneklerdeki seviyeleri.[4]

3T3-L1 adipositlerinde nonivamid tarafından TRPV1'in aktivasyonu, PPAR𝛾 ifadesini baskılayarak farklılaşma ve olgunlaşma sırasında lipid birikimini azalttı.[5] Makrofajlarda, kapsaisin ve nonivamid, IL6, CXCL8 ve TNF-alfa gibi proinflamatuar sitokinlerin LPS kaynaklı salınımını TRPV1-bağımlı bir şekilde zayıflattı.[6] Yine de, TRPV1'in insan kan lökositlerindeki belirli işlevleri belirsizliğini koruyor. İnsan NK hücrelerinde, 10 ve 50 μM kapsaisin, hücre içi Ca2 artı konsantrasyonlarında bir artışa neden olarak işlevsel bir TRPV1 kanalına işaret eder.[7]

Bununla birlikte, hücrelerin kapsaisin ile 10–100 μM konsantrasyon aralığında 1 saat ön işleme tabi tutulmasıyla indüklenen, sitotoksik degranülasyon ve sitokin salgılanması gibi sönümlenmiş NK hücre efektör fonksiyonları, büyük ölçüde TRPV1'den bağımsızdı.[7 ] T hücrelerinde, TRPV1'in T hücresi reseptör sinyali, T hücresi proliferasyonu ve farklılaşmasının yanı sıra sitokin üretimi süreçlerinde yer aldığı belgelenmiştir.[8] Grubumuzun önceki çalışması, insan birincil T hücrelerinde TRPV1'in işlevsel ifadesini de göstermiştir.[9] Ayrıca, 0,03 ila 300 μmol L-1 aralığındaki konsantrasyonlardaki doz-yanıt analizleri, [6]-gingerolün, 82,2 μmol L-1 IC50 değeri ile birincil insan lökositleri tarafından sitokin salgılanmasını inhibe ettiğini ortaya koydu.

Bununla birlikte, [6]-gingerol'ün sağlıklı deneklerin plazma örneklerinde nicelleştirilmesi, 1 L zencefil çayı alımından sonra yalnızca 42.0 ± 16.3 nmol L-1'lik bir ortalama maksimum plazma konsantrasyonu ortaya çıkardı. Bu [6]-gingerol konsantrasyonlarının önceki çalışmalarda sitokin sekresyonu üzerinde önemli bir etkisi olmadığı için,[9] 1 L zencefil tüketiminden sonra kan plazmasında diyetle ilgili 50 nmol L-1 konsantrasyonuna ulaşılıp ulaşılmadığı açık değildir. çay, diğer insan birincil lökositlerindeki hücresel bağışıklık tepkilerini modüle etmek için yeterlidir.

İnsan nötrofilleri için TRPV1'in fonksiyonel rolü hakkındaki bilgiler sınırlıdır. Köse ve Nazıroğlu˘ [10], 10 μM kapsaisin'e yanıt olarak nötrofillerde Ca2 artı -akılarının TRPV1 antagonisti kapsazepin tarafından azaldığını gösterirken, diğer sonuçlar, 1 konsantrasyon aralığında test edildiğinde kapsaisinin bir Ca2 artı akısı indüklediğini göstermedi. –100 μM, saptanabilir bir TRPV1 RNA ifadesine rağmen.[11]

Nötrofiller, insan kanında en bol bulunan lökositlerdir ve dolaşımdaki tüm beyaz kan hücrelerinin yüzde 60-70'ini oluşturur. Enfeksiyon bölgelerine alınan ilk bağışıklık hücreleridir; bu nedenle genellikle ilk savunma hattı olarak anılırlar.[12] Nötrofillerin toplanması, diğerlerinin yanı sıra, bakteriyel veya mitokondri türevi peptit N-Formilmetiyonin-lösil-fenilalanin (fMLF) veya CXCL8 (IL-8) ​​gibi kemokinler tarafından tetiklenir.[13]

Nötrofillerin savunma mekanizmaları arasında fagositoz,[14] degranülasyon yoluyla anti-mikrobiyal enzim salınımı,[15] reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumu,[16] ve nötrofil hücre dışı tuzaklarının oluşumu yer alır.[17] Bu doğrudan savunma mekanizmalarının yanı sıra nötrofiller, çeşitli sitokinler ve kemokinlerin salınması yoluyla sonraki bağışıklık tepkilerine de katkıda bulunur.[18] Ayrıca nötrofiller, sonraki tam aktivasyona daha güçlü yanıt vermelerini sağlayan bir hazırlık sürecinden geçebilir.[16b]

Son yıllarda, gıda ve/veya şifalı bitkilerden elde edilen bileşenlerin, insan nötrofillerinin bahsedilen savunma tepkilerinden birini veya birkaçını değiştirebildiğine dair kanıtlar arttı. Bu modifikasyonlar arasında artan fagositotik aktivite[19] ve ROS üretimi,[20] fMLF'ye yönelik artırılmış kemotaksis[21] ve hücre dışı nötrofil tuzaklarının oluşumu yer alır.[20] Bununla birlikte, aktif bileşik(ler) tanımlanmamıştır. Ferula akitschkensis'ten (𝛽-pinene, sabinene, 𝛾-terpinene, geranyl asetone ve izobornil asetat) bileşenler, nötrofilleri fMLF- ve CXCL8- ile indüklenen Ca2 artı içeri akışına karşı duyarsızlaştırdı ve fMLF'nin indüklediği kemotaksisi inhibe etti; burada geranil aseton- indüklenen etkilere TRPV1 aracılık etti.[22]

Mevcut verilere dayanarak, TRPV1'in [6]-gingerol tarafından ligandla indüklenen aktivasyonunun, genel nötrofil fonksiyonlarını doğrudan veya aktive edici uyaranlara tepkilerini artırarak etkileyebileceğini varsaydık. Bu hipotez kapsamında, özellikle lökosit popülasyonunun bir parçası olarak insan birincil nötrofillerinde hücresel bağışıklık tepkilerini modüle etmek için beslenmeyle ilgili doğrulanmış bir konsantrasyonun yeterli olup olmadığını açıklamayı amaçladık. '

Ayrıca, insan lökositlerinde TRP kanal ifadesinin niteliksel ve niceliksel olarak kapsamlı bir genel bakışını elde etmek için insan kanındaki en belirgin beş hücre tipindeki memeli TRP üst ailesinin tüm üyelerinin RNA ifade düzeylerini karşılaştırmayı amaçladık.

2. Sonuçlar

2.1. İnsan Lökositlerinde TRP Kanallarının Bolluğu ve Göreceli Transkript Düzeyleri

Kan lökositlerinde TRP kanalı RNA ekspresyonunu değerlendirmek için, en belirgin lökosit hücre tiplerinden beşi sağlıklı donörlerin kanından izole edildi ve TRP kanallarının RNA ekspresyonu, kantitatif RT-PCR ile analiz edildi (Şekil 1).

TRPV'nin yanı sıra TRPM ailesinin spesifik transkriptleri, analiz edilen tüm hücre tiplerinde yüzde 75-100 gibi yüksek frekanslarla tespit edildi. Tüm hücre tiplerini dikkate alan ortalama genel sıklık, TRPV ailesi için yüzde 96 ve TRPM ailesi için yüzde 98 idi. TRPC'ye özgü transkriptler, monositlerde, NK hücrelerinde, T hücrelerinde ve B hücrelerinde yüzde 0'dan NK hücrelerinde yüzde 100'e ve genel ortalama frekansı yalnızca yüzde 53 olan T hücrelerine kadar değişen çok daha az boldu (Şekil 1A). TRPC'ye5-özgü transkript, yüzde 70 sıklıkta yalnızca nötrofillerde saptandı.

Ayrıca, TRPA1-spesifik transkript genellikle nötrofillerde yüzde 100, monositlerde yüzde 25, NK hücrelerinde yüzde 80, T hücrelerinde yüzde 100 ve yüzde 60 sıklıkta analiz edilen hücre türlerinde oldukça düşük bir bolluk ortaya çıkardı. B hücrelerinde yüzde Benzer şekilde, TRPML3-spesifik transkripti, nötrofillerde (%50), monositlerde (%25), NK hücrelerinde (%40) ve B hücrelerinde (%20) düşük bir sıklık gösterdi, ancak yüzde 100'lük bir sıklık gösterdi. T hücreleri. TRPV'ye{12}}özgü transkript tüm hücre türlerinde saptandı; monositlerde, NK hücrelerinde ve T hücrelerinde yüzde 100, nötrofillerde yüzde 90 ve B hücrelerinde yüzde 80 sıklık gösterdi.

Göreceli RNA ifadesi ile ilgili olarak, ilgili frekanslarla karşılaştırıldığında, TRP kanalları, analiz edilen farklı hücre tiplerindeki ilgili Δct değerlerinin karşılaştırılmasıyla açıkça görüldüğü gibi, daha hücre tipine özgü bir ifade modeli ortaya çıkardı (Şekil 1B). Örneğin TRPP3 tüm hücre tiplerinde yüzde 100 sıklıkta saptanırken monositlerde en yüksek ekspresyon seviyesini ortaya çıkardı.

Buna karşılık, incelenen tüm hücre tiplerinde TRPV2 kanalı, nispeten yüksek bir RNA ekspresyon seviyesinin yanı sıra yüksek bir frekansla tespit edildi. Aynı şekilde, incelenen tüm hücre tiplerinde TRPV1'in transkript seviyeleri benzerdi (Şekil 1B).

2.2. Nötrofillerde TRPV1 Yüzey İfadesi

TRPV1'in insan nötrofillerindeki işlevi hakkındaki mevcut bilgiler hala belirsizdir. TRPV1'in insan nötrofillerindeki rollerini daha fazla araştırmak için, daha sonra canlı hücre akış sitometrisi kullanılarak TRPV1 kanalının birincil insan nötrofillerinin yüzeyinde ifade edilip edilmediğini araştırdık (Şekil 2).

İzole nötrofiller, nötrofiller için bir yüzey belirteci olarak CD15 için boyandı (Şekil 2A, B) ve aynı anda ya TRPV1 proteininin ilk hücre dışı döngüsündeki bir epitopa karşı yükseltilmiş bir antikorla (Şekil 2B) ya da ilgili izotip kontrolüyle boyandı. ikincisi, spesifik olmayan bağlanmayı ölçmek için bir vekil görevi görür (Şekil 2A). CD15 plus popülasyonu içinde, FITC için floresan yoğunluğu analiz edildi. Nötrofillerin TRPV1 antikoru ile boyanması, izotip kontrolüne kıyasla ayırt edilebilir bir floresan sinyaline yol açtı ve böylece birincil insan nötrofillerinde TRPV1'in yüzey ekspresyonunu doğruladı (Şekil 2C). Dört ayrı donörden alınan nötrofillerin analizi, TRPV1'in karşılaştırılabilir bir yüzey ifadesini ortaya çıkardı (Şekil 2D).

2.3. [6]-Gingerol Kaynaklı Hücre İçi Ca2 Artışı plus

TRPV1'in ligandla indüklenen aktivasyonu, bir Ca2 artı akışıyla sonuçlanacağından, [23] hücre içi Ca2 artı nötrofil konsantrasyonları, Ca2 artı duyarlı boya Fura-2 aracılığıyla belirlendi. Önceki bulgularımıza dayanarak,[9] iyi bilinen TRPV1 ligandı [6]-gingerol'ün 50 nM'lik bir konsantrasyonu ve 2 saatlik bir inkübasyon süresi seçildi. Analizler, nötrofillerin 50 nM [6]-gingerol ile inkübasyonunun, 1 uM iyonofor iyonomisin uygulanarak belirlendiği üzere, maksimum değerin ortalama yüzde 18,4 ± yüzde 1,0'ı olan artan hücre içi Ca2 artı konsantrasyonlarla sonuçlandığını gösterdi. DMSO'nun neden olduğu artış yüzde 4,7 ± yüzde 1,2 idi (Şekil 3).

2.4. [6]-Gingerol'ün TRPV1 İfadesi Üzerindeki Etkisi

Daha sonra, [6]-gingerol ile TRPV1 stimülasyonunun transkript seviyesinde q-RTPCR yoluyla ve ayrıca canlı hücre boyama yoluyla yüzey protein seviyesinde TRPV1 ekspresyonu üzerindeki etkisini analiz etmeyi amaçladık. Bu amaçla, insan nötrofilleri 50 nM [6]-gingerol ile 2 saat süreyle inkübe edildi ve ilgili ekspresyon seviyeleri ölçüldü.

Bu 2 saatlik inkübasyon, ne TRPV1 transkriptini ne de protein seviyelerini etkilemedi (Şekil 4) ve araştırılan ortak sitokin ve kemokin genlerinin RNA ifadesi olan IL6, IL17A, IL24, C5 ve GDF5 dışında değişmedi (Şekil S1, Tablo S2, Destekleyici Bilgiler).

2.5. [6]-Gingerol'ün Nötrofil Yüzey Belirteçlerinin İfadesi Üzerindeki Etkisi

Bu deney dizisinde, [6]-gingerol'ün nötrofiller için ortak yüzey belirteçlerinin ifadesi üzerinde bir etkisinin olup olmadığını sorduk. [6]-gingerol ile 2 saatlik inkübasyon süresinden sonra CD11b ve CD66b belirteçlerinin ekspresyonunun solvent kontrolü ile karşılaştırıldığında arttığını, oysa CD62L'nin etkilenmediğini bulduk (Şekil 5). Ayrıca, fMLF reseptörü FPR1'in yüzey ifadesi, çözücü kontrolüne kıyasla hücrelerin 50 nM [6]-gingerol ile işlenmesinden sonra önemli ölçüde yükseldi.

For more information:1950477648nn@gmail.com