Renal Lenfatik Yoğunluğu Arttıran Böbrek Hedefli Bir Nanopartikül, Hipertansif Farelerde Kan Basıncını Düşürüyor
Nov 10, 2023
Soyut:Kronik interstisyel inflamasyonve aktive edilmiş bağışıklık hücrelerinin renal infiltrasyonu hipertansiyonda tamamlayıcı bir rol oynar. Lenfatikler inflamasyonu düzenlerbağışıklık hücrelerinin temizlenmesive aşırı interstisyel sıvı. Daha önce göstermiştikböbrek lenfanjiyogenezinin arttırılmasıFarelerde hipertansiyonu önler. Vasküler endotelyal büyüme faktörü-C'nin (VEGF-C) böbreğe hedeflenen nanoparçacık iletiminin, hipertansif farelerde kan basıncını düşürerek renal lenfanjiyogenezi tetikleyeceğini varsaydık. Böbrekleri hedef alan bir nanoparçacık, VEGF-C'nin VEGF reseptörüne-3- spesifik bir formuyla yüklendi ve anjiyotensin II'nin neden olduğu hipertansiyonu veya LNAME'nin neden olduğu hipertansiyonu olan farelere her 3 günde bir enjekte edildi. Nanopartikül ile tedavi edilen fareler, tek başına VEGF-C enjekte edilen hipertansif farelere kıyasla renal lenfatik damar yoğunluğu ve genişliğinde artış sergiledi. Nanopartikül ile tedavi edilen farelerde sistolik kan basıncında azalma,pro-inflamatuar böbrek bağışıklık hücrelerive idrarla fraksiyonel sodyum atılımında artış. Bulgularımız farmakolojik olarak genişleyen renal lenfatiklerin kan basıncını düşürdüğünü ve kan basıncında olumlu değişikliklerle ilişkili olduğunu göstermektedir.böbrek bağışıklık hücreleriVeartan sodyum atılımı.
Anahtar Kelimeler:böbrek; lenfatikler;iltihaplanma; bağışıklık; hipertansiyon
BÖBREKLER İÇİN SİSTANÇIN BİTKİSEL FORMÜLÜNÜ ALIN
1. Giriş
Neredeyse her 2 ABD'li yetişkinden 1'inde hipertansiyon vardır ve birçok hastada bu durum kontrol edilememektedir [1]. İyileştirilmiş eğitime, halk sağlığı çabalarına ve reçeteli ilaçlara rağmen, hipertansif hastaların yaklaşık %30-60'ı ideal kan basıncına ulaşamamaktadır. Sistolik kan basıncında 10 mmHg'lik bir azalma bile sağlık risklerini önemli ölçüde azalttığı ve sonuçları iyileştirdiği için bu talihsiz bir durumdur [2]. Bu hipertansif popülasyonun kan basıncını ideal olarak normotansif aralığa düşürmesine yardımcı olmak için ek tedavi seçeneklerine ihtiyaç vardır.
Renal immün hücre infiltrasyonu, inflamasyon ve sodyum tutulumu hipertansiyonla güçlü bir şekilde ilişkilidir [3-5]. Lenfatik damarlar sıvıyı, elektrolitleri, hücreleri ve proteinleri interstisyel boşluktan drenaj yapan lenf düğümüne ve daha sonra dolaşıma geri taşır [6,7]. Akut böbrek hasarında inflamasyonla ilişkili lenfanjiyogenez görülür.kronik inflamatuar hastalıklarörneğindiyabetik nefropatiVeböbrek kanseri[8]. birinflamatuar durumLenfatiklerdeki artış, bağışıklık hücrelerinin, proteinlerin ve sıvının organdan uzaklaştırılmasına yardımcı olmaya çalışır. Daha önce çeşitli hipertansiyon modellerinde telafi edici bir yanıt olarak böbreklerde lenfanjiyogenezin de meydana geldiğini bildirmiştik [9-11]. Ancak renal lenfatiklerdeki bu telafi edici artış inflamasyonu ve hipertansiyonu gidermeye yetmedi. Farelerde renal spesifik lenfanjiyogenezin genetik olarak indüklenmesi, tuza duyarlı hipertansiyon, nitrik oksit inhibisyonu (L-NAME) kaynaklı hipertansiyon (LHTN) ve anjiyotensin II kaynaklı hipertansiyon (A2HTN) gelişimini önledi ve bu, renal immün hücre birikimi ve artan sodyum atılımı [9,11,12]. Ek olarak, farelerde renal spesifik lenfanjiyogenezin genetik indüksiyonu mevcut LHTN'yi zayıflattı ve buna sodyum atılımında bir artış eşlik etti [12].
Burada, özellikle böbreği hedef alacak ve hipertansif koşullar altında kan basıncını düşürmek için lenfanjiyogenezi teşvik edecek potansiyel bir translasyonel terapötik geliştirmek istedik. Böbrekleri hedef alan nanopartiküller hakkındaki önceki raporlara dayanarak lenfatik spesifik büyüme faktörü dağıtımı için nanopartikül teknolojisini kullandık [13-15]. Nanopartikülleri kullanan başka ilaç dağıtım sistemleri de mevcuttur ve hepsinin amacı verimliliği, özgüllüğü ve biyoyararlanımı arttırmaktır. Nanopartiküller boyut (50~200 nm), şekil ve yüzey kimyası gibi benzersiz fizikokimyasal özellikler sergileyecek şekilde tasarlanabilir ve bir veya daha fazla tanısal ve/veya tedavi edici maddeyi taşıyacak ve bunları sıcaklık gibi harici tetikleyiciler yoluyla serbest bırakacak şekilde donatılabilirler. , pH ve enzimler. Ayrıca, bu terapötik veya tanısal ajanların nanopartiküller içerisinde kapsüllenmesi, bunların sistemik yarı ömürlerini arttırmalarına olanak tanır ve böylece hedeflenen alana önemli ölçüde lokalize edilebilirler. Günümüzde morfolojilerine göre miseller, lipozomlar, nanosferler, nanotüpler, nanokapsüller, kübozomlar ve hidrojeller gibi çeşitli nanopartiküller bulunmaktadır. Burada hangisinin daha etkili olduğunu belirlemek için hem misel hem de lipozom nanopartiküllerini test ettik.
Bizim hipotezimiz, vasküler endotelyal büyüme faktörü C'nin (VEGF-C) vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörü-3 (VEGFR-3)'ye özgü izoformu olan pro-lenfanjiyojenik büyüme faktörünü sağlayan böbrek hedefli bir nanoparçacıktı. , A2HTN veya LHTN'li erkek ve dişi farelerde renal lenfatik yoğunluğu artıracak ve kan basıncını azaltacaktır. Ayrıca kan basıncındaki azalmanın, pro-inflamatuar böbrek bağışıklık hücrelerinde azalma, anti-inflamatuar böbrek bağışıklık hücrelerinde artış ve artan sodyum atılımı ile ilişkili olabileceğini varsaydık. Farelerde tuza duyarlı hipertansiyonu tetiklemenin uzun süresi ve sınırlı sayıda kuyruk damarı enjeksiyonu nedeniyle bu model mevcut çalışmada kullanılmamıştır.
2. Malzemeler ve Yöntemler
2.1. Nanopartikül Geliştirme ve Karakterizasyonu
PLGA-PEG-folat blok kopolimeri PolySciTech'ten (West Lafayette, IN, ABD) satın alınmıştır ve NMR, FTIR analizi ve GPC'yi gösteren Analiz Sertifikası Şekil S1'de görülebilir. 50 mg PLGA-PEG-folat blok kopolimeri, 10 mg Coumarin 6 boyası, 10 mg FITC-ovalbümin veya 1 mg VEGF-C kullanılarak, misel oluşturmak için bir diyaliz yöntemi kullanılarak nanopartiküller içine kapsüllendi. nanopartikül 1 (NP1). Spesifik olarak ilaç ve polimer, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözüldü ve çözelti, bir diyaliz membranına (MWCO 100,000) aktarıldı. Diyaliz 24 saat süreyle DI suya karşı gerçekleştirildi. Bundan sonra, sulu parçacık çözeltisi santrifüjlendi ve parçacıkları konsantre etmek için sonikasyona tabi tutuldu. Lipozomal nanoparçacığı yapmak için, DSPC (120 mg), kolesterol (16 mg), DSPE-PEG-folat (24 mg) ve Coumarin 6 boyası (10 mg) veya FITC-ovalbumin (10 mg) dahil olmak üzere çeşitli lipit bileşenleri kullandık. . İlk olarak yukarıdaki bileşenlerin tümü DCM (10 mL) içerisinde çözündürüldü ve daha sonra DCM, cam şişelerin yüzeyinde ince bir film oluşturmak üzere hava akışı yoluyla çıkarıldı. Daha sonra lipozomal nanoparçacık 2'yi (NP2) yapmak için ince filme 10 mL PBS ilave edildi. Nanopartiküllerin boyutu, bir Zetasizer (Malvern Panalytical, Malvern, UK) kullanılarak dinamik ışık saçılımı (DLS) ile belirlendi. Numune konsantrasyonu 0,5 mg/mL'de tutuldu. Coumarin 6 boya kapsülleme miktarı, 100 uL nanoparçacıkların 900 uL DMSO içinde çözülmesiyle absorbans ölçümünden elde edildi; bu, Coumarin 6'nın DMSO çözeltisine salınmasını sağladı.
Daha sonra absorbans 444 nm'de ölçüldü. Titre edilmiş konsantrasyonuna göre Coumarin 6 absorbansının önceden ölçülmüş bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak kapsüllenmiş Coumarin 6 konsantrasyonu hesaplandı (NP1: 5 ± 0,35 mg ve NP2: 4 ± {{10 Kumarin 6 için }}.89 mg). Titre edilmiş konsantrasyonuna göre FITC-ovalbümin absorbansının önceden ölçülmüş bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak kapsüllenmiş FITC-ovalbümin konsantrasyonu hesaplandı (4 ± 0,51 mg). NP içindeki VEGF-C'nin kapsüllenme miktarı ELISA ile belirlendi ve ~500 ± 17 µg idi. Folat reseptörlerinin yüksek ekspresyonu göz önüne alındığında, tüm NP'ler, onları böbreğin proksimal tübüllerine hedef alan folatlarla kaplandı. NP düzeneğini gösteren bir şema Şekil S2'de görülebilir.
Coumarin 6 veya FITC-ovalbumin'in salım profilleri, membran tüplü diyaliz yöntemi kullanılarak incelenmiştir. Bir diyaliz tüpüne (Cutoff MW 3500) bir mL nanopartikül çözeltisi ilave edildi ve ardından %0,5 v/v Tween 80 çözeltisi içeren 10 mL PBS içerisine daldırıldı. Belirtilen zamanda medya toplandı ve değiştirildi. Toplanan numunelerin floresans yoğunluğu, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak FITC-ovalbumin için Ex/Em=444/500 nm (Coumarin 6) veya Ex/Em=488/530 nm'de ölçüldü. Hem Coumarin 6'nın hem de FITC-ovalbüminin folat nanopartiküllerinden kümülatif salınım yüzdesi Şekil S3'te görülebilir.
Transmisyon elektron mikroskobu (TEM, JEOL JEM-2010, Japonya) çalışması için, numune süspansiyonları karbon kaplı bir bakır ızgaraya bırakıldı ve vakum koşulları altında kurutuldu. Izgara daha sonra bir JEOL transmisyon elektron mikroskobu altında 200 kV'luk bir hızlanma voltajında gözlendi. İn vivo biyolojik dağılımı belirlemek için her NP1'den (10 mg/mL) veya NP2'den (10 mg/mL) 100 uL dişi C57BL/6J farelerine (n=3) kuyruk damarından enjekte edildi. Kumarin 6'nın floresans sinyalleri Ex/Em=444/500 nm'de kaydedildi. Enjeksiyondan on iki saat sonra hayvanlara ötenazi uygulandı ve her organ toplandı. NP dağılımını ölçmek için toplanan organlar bir In Vivo FX Pro tarayıcı altında tarandı. Farelerde gerçekleştirilen tüm prosedürler, NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna uygun olarak Texas A&M Üniversitesi IACUC tarafından onaylandı.
2.2. Fareler
Yabani tip C57BL/6J fareleri, Jackson Laboratories'den (Bar Harbor, ME, ABD) satın alındı. 10-14 haftalık erkek ve dişi farelere, anjiyotensin II (490) içeren ozmotik mini pompalarla (Alzet, model 1004, Cupertino, CA, ABD) inhale izofluran (%1,5-5) anestezisi altında cerrahi olarak implante edildi. ng/kg/dak; BACHEM, Torrance, CA, ABD) (A2HTN), ardından topikal lidokain. Başka bir grup erkek ve dişi fareye, deney süresi boyunca (LHTN) içme sularında (0,5 mg/mL) L-NAME (Sigma, St. Louis, MO, ABD) verildi. 2 gün sonra tüm gruplarda hipertansiyon kuyruk manşet kan basıncı ile doğrulandı. Fareler daha sonra rastgele seçildi ve kuyruk damarına ya VEGF-C'nin VEGFR{16}} spesifik mutantı (VEGF C c156s) [16] ile yüklenmiş bir misel nanoparçacık ya da her 3 günde bir tek başına serbest VEGF-C proteini enjekte edildi. 16 gün boyunca (toplam 4 kuyruk damarı enjeksiyonu). Bu enjeksiyon programı önceki çalışmadan sonra modellenmiştir [17] ve kan basıncını etkilemeye yetecek düzeyde vasküler yeniden şekillenmenin gerçekleşmesi için yeterli süreye izin verilmiştir. Ek olarak, 3-günlük dinlenme periyodu, lenfanjiyogenik sinyali tutarlı tutarken hassas fare kuyruk damarlarının ömrünü uzattı. İyileşme döneminde bile kuyruk damarları geri dönülemez hasara uğramadan önce yalnızca 5 enjeksiyonu kaldırabildi. Tüm fareler, ilk enjeksiyondan 16 gün sonra kurban edildi. Farelere, derin izofluran anestezisi altında doku perfüzyonu ve ardından doku toplanmasından önce servikal dislokasyon yoluyla ötenazi uygulandı. Farelerde gerçekleştirilen tüm prosedürler, NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna uygun olarak Texas A&M Üniversitesi IACUC tarafından onaylandı.
2.3. Tansiyon
Sistolik kan basıncı (SKB) ölçümleri çeşitli zaman noktalarında kuyruk manşonu yoluyla alındı. Tüm ölçümler için fareler için IITC Life Science noninvazif kan basıncı toplama sistemi (IITC Inc., Woodland Hills, CA, ABD) kullanıldı. Kan basınçları, belirlenmiş sessiz bir alanda 30-dakikalık bir alışma süresinden sonra alındı. Bu süre zarfında ısıtma odası ve kısıtlama odalarının 34 ◦C'ye ısınmasına izin verildi. Fareler, uygun büyüklükteki kısıtlama odalarına yavaşça yüklendi ve SBP ölçümlerinden önce 5 dakika boyunca ısıtma odasında iklime alışmaları için bırakıldı. SKB ölçümleri iki bağımsız, kör araştırmacı tarafından yapılan basınç izlemelerinden elde edildi.
2.4. Serum ve İdrar Toplama ve Önlemler
Serum ve İdrar Toplama ve Ölçümler: Fareler metabolik kafeslere (Hatteras, Cary, NC, ABD) yerleştirildi ve gece boyunca ortama alışmaları sağlandı. Alıştırmanın ardından 24 saat boyunca idrar toplandı ve ötenazi ile sonuçlandırıldı. Toplanan idrar ölçüldü. Ötenazi sırasında sol ventrikül yoluyla kan toplandı ve daha sonraki ölçümler için serum izole edildi. Serum ve idrar, bir DxC 700 AU Kimya Analizörü (Beckman Coulter, Brea, CA, ABD) kullanılarak sodyum için kılcal elektroforez ile ve bir P/ACE MDQ Plus Kapiler Elektroforez Sistemi (Sciex, Redwood City, CA) kullanılarak kreatinin için doğrudan potansiyometre ile analiz edildi. , AMERİKA BİRLEŞİK DEVLETLERİ). Bu ölçümler idrarla atılımı, fraksiyonel sodyum atılımını (FENa) ve kreatinin klerensini hesaplamak için kullanıldı.
2.5. İmmünfloresan
Ötenazi sırasında böbrekler toplandı, sagittal olarak ikiye bölündü ve 48 saat boyunca %10 tamponlu formalin solüsyonunda (Sigma, St. Louis, MO, ABD) sabitlendi. Fiksasyonun ardından böbrek yarımları %100 etanolde yıkandı ve parafine gömüldü. Böbrek yarıları 5-7 µm'lik bölümler halinde kesildi; bunlar deparafinize edildi, yeniden hidratlandı ve %0.1 Triton çözeltisi (BioRad, Hercules, CA, ABD) ile geçirgenleştirildi. Doku, gece boyunca lenfatik endotel hücre belirteçleri LYVE-1 veya podoplanin (keçi poliklonal; R&D Systems, Minneapolis, MN, ABD) ile immüno-etiketlenmeden önce %10 AquaBlock çözeltisi (EastCoastBio, North Berwick, ME, ABD) ile bloke edildi. 4 ◦C'de inkübasyon. Lenfatik damarları görselleştirmek için Alexafluor 488 veya 594 (Life Technologies, Carlsbad, CA, ABD) ikincil antikorları kullanıldı. Numuneler, oda sıcaklığında bir saat boyunca uygun şekilde konjuge edilmiş ikincil antikorlarla inkübe edildi. Negatif kontroller yalnızca ikincil bir antikorla inkübe edildi. Etiketli slaytların tümü, DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD) içeren ProLong Gold solmayı önleyici reaktifle monte edildi. Görüntüleme için Olympus Q5 kameralı Olympus BX51 floresan mikroskopi sistemi kullanıldı. Görüntüler Olympus CellSens görüntüleme yazılımı (Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japonya) kullanılarak 40x büyütmede çekildi. Kalp, karaciğer, akciğer ve derideki lenfatikleri görüntülemek için aynı yöntemler kullanıldı (10x veya 20x büyütme).
2.6. Böbrek İmmünofloresansı
Niceleme Her böbrek bölümünden, önceden belirlenmiş alanlardan 20x çözünürlükte 5-7 görüntü toplandı; bu görüntüde genellikle doku defektleri, küçük kaliks ve çok sayıda glomerül önlendi. ImageJ, pozitif endotel için eşik ayarlandıktan sonra toplam podoplanin+ piksel sayısını ölçen alan değerlerini toplamak için kullanıldı.
2.7. Maksimal Böbrek Lenfatik Damar Genişliği Kantifikasyonu
Her böbrek bölümünden, korteks içindeki arterle ilişkili tüm lenfatik damarların 20x'te görüntüleri toplandı. Lenfatik damarlar podoplanin boyamasının varlığıyla tanımlandı. ImageJ, lümen içeren tüm lenfatik damarların en geniş noktasının uzunluğunu piksel cinsinden toplamak için kullanıldı.
2.8. Akış Sitometrisi
Ötenazi sırasında böbrekler toplandı ve kapsüller çıkarıldı. Doku iyice kıyıldı ve Kollajenaz D (2,5 mg/mL, Roche Sigma, St. Louis, MO, ABD) ve Dispase II (1 mg/mL, Sigma) içeren tamponda 37 ◦C'de 1 saat boyunca sindirildi. Sindirilen numuneler filtrelendi ve 100 ve 40 µm'lik süzgeçlerden geçirilerek durulandı. Akış, hücresel bileşenleri izole etmek için santrifüjlendi ve kırmızı kan hücreleri, NH4Cl/EDTA'da parçalandı. Splenositler, antikor kontrolleri olarak kullanılmak üzere ve bağışıklık hücresi boyutu ve şeklinin ileri ve yan dağılım kapılaması için benzer şekilde izole edildi. Böbrek hücreleri %0.1 FBS solüsyonunda yeniden süspanse edildi. Spesifik olmayan Fc bağlanmasını önlemek için numuneler, bir anti-fare CD16/CD32 antikoru (BD Pharmingen, San Jose, CA, ABD) ile buz üzerinde 10 dakika boyunca inkübe edildi. Hücreler daha sonra CD45, F4/80, CD11c ve CD3e'ye karşı floresan-konjuge antikorlarla inkübe edildi ve başka bir steril 40 um'lik süzgeçten filtrelendi. Tüm antikorlar BD Biosciences'tan satın alındı. Açıklayıcı panel için Çevrimiçi Tablo S1'e bakın. Edinim için FACS DIVA yazılımına (BD Biosciences, San Jose, CA, ABD) sahip bir BD LSR Fortessa X-20 akış sitometresi kullanıldı. 500000 hücreye kadar olan popülasyonlar FlowJo v10.6.2.1 (FlowJo, LLC, Ashland, OR, ABD) kullanılarak analiz edildi. CD3e+ popülasyonlarının miktarı CD45+ geçidinde ölçüldü. CD3e PacBlue+ popülasyonları florofor PE ve PerCP-Cy5.5 için negatifti. F4/80+ ve CD11c+ popülasyonları, CD45+/CD3e- kapısı içinde ölçüldü (Şekil S4). Bu popülasyonlar PacBlue, APC ve APC-Cy7 floroforları açısından negatifti. Sonuçlar böbrek başına toplam CD{48}} hücrelerinin yüzdesi olarak ifade edilir. Geçitleme stratejisi Şekil S4'te bulunabilir. Antikor bilgileri Tablo S1'de bulunur.
2.9. İstatistik
Sonuçlar nokta grafikleri ve ortalamalar veya ortalama ± SEM olarak sunulur. 2 grup arasındaki farklar, 2-kuyruklu eşleştirilmemiş bir Öğrenci t testi ile ve 3 veya daha fazla grup arasındaki farklar tek yönlü ANOVA ve ardından Öğrenci-Newman-Keuls post hoc testi ile değerlendirildi. Tüm karşılaştırmalar için anlamlılık düzeyi 0.05 olarak belirlendi. Tüm istatistiksel analizler SigmaPlot 10 yazılımı (Systat, San Jose, CA, ABD) kullanılarak yapıldı.
Wecistanche Destek Hizmeti-Çin'deki en büyük cistanche ihracatçısı:
E-posta:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Daha Fazla Özellik İçin Alışveriş Yapın Detaylar:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
