Bir Alfa-Naftilizotiyosiyanat (ANIT) Hepatotoksisite Sıçan Modelinde Validasyonlu Kolestatik Hepatit Tedavisinde Hypericum Japonicum'un Moleküler Mekanizmalarının Ağ Farmakolojisi Çalışması

Daha fazla bilgi için. İletişimtina.xiang@wecistanche.com

Arka fon: Bu ağ farmakolojisi çalışması, Hypericum japonicum'un kolestatik hepatit üzerindeki etkilerine dahil olan aktif bileşikleri ve moleküler mekanizmaları tanımlamayı amaçlamıştır. Bir alfa-naftil-izotiyosiyanat (ANIT) sıçan hepatotoksisite modelindeki bulguları doğruladık.

Malzeme/Yöntemler: H.japonicum'un kimyasal bileşenleri ve hedefleri ile daha önce kolestatik hepatit ile ilişkilendirilen hedef genler kamuya açık veri tabanlarından alınmıştır. Cytoscape 3.7.2 yazılımı kullanılarak bir ağ oluşturuldu ve STRING veritabanı ve potansiyel protein işlevleri, biyo-informatik kamu platformuna dayalı olarak analiz edildi. 36 Sprague-Dawley sıçanı kullanılarak bir sıçan modelinde kolestatik hepatiti indüklemek için ANIT kullanıldı ve bu model, 3 dozkuersetin(düşük doz, 50 mg/kg; orta doz, 100 mg/kg; ve yüksek doz, 200 mg/kg), H.japonicum'un ana aktif bileşenidir. Serum biyokimyasal indekslerinin seviyeleri ticari kitler ile ölçüldü, ve karaciğer ve mitokondriyal fonksiyon belirteçlerinin haberci RNA (mRNA) seviyeleri veoksidatif stresgerçek zamanlı ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile tespit edildi.

Sonuçlar: H. japonicum'un ana aktif bileşenleri quercetin, kaempferol ve tetra methoxy luteolin'dir. ve anahtar hedefleri arasında prostaglandin G/H sentaz 2(PTGS2), B hücreli lenfoma-2 (BCL2), kolesterol7-alfa-hidroksilaz (CYP7A1) ve farnesoid X reseptörü (FXR) bulunur. Quercetin müdahalesi, kolestatik hepatitten iyileşmeyi destekledi.

Bu araştırmadan elde edilen bulgular, kuersetin, kaempferol ve kersetin rolleri hakkında gelecekteki araştırmalara destek sağlamaktadır.

Sonuçlar: insan karaciğer hastalığında tetra metoksi luteolin ve kolestatik hepatitte PTGS2, BCL2, CYP7A1 ve FXR genlerinin rolleri.

anahtar kelimeler: Kolestaz, İntrahepatik· Gen Düzenleyici Ağlar ·Hypericum·Tıp, Geleneksel Çin · Farmakoloji · Quercetin

Arka fon

kolestazanormal safra oluşumu, salgılanması ve atılımının neden olduğu karaciğer lezyonlarını içeren klinik bir sendromdur. Kolestatik karaciğer hastalıkları, safra asidi sentezi ve taşınmasındaki bozukluklarla yakından ilişkilidir ve sıklıkla kolestatik karaciğer hasarına neden olur ve sonuçta karaciğer fibrozu, siroz ve karaciğer yetmezliğine ilerleyebilir [1,2].

Kolestaz, kolestatik hepatitin ve alfa-naftilizotiosiyanat(ANIT) kaynaklı kolestazın ana nedenlerinden biridir ve sonuçta kolestatik hepatit ile sonuçlanabilir. ANIT, deneysel hayvan modellerinde karaciğer hasarı veya kolestatik hepatit üretmek için kullanılan hepatoselüler nekroz, safra kanalı hiperplazisi ve karaciğer fibrozisini indüklemek için kullanılan kimyasal bir toksindir. Araştırma çalışmalarında, kolestatik hepatiti [3-5] kopyalamak için sıçanlara intraperitoneal olarak ANIT enjekte edilir. Kolestaz sırasında karaciğer hasarının histopatolojik özellikleri, karaciğer dokusu nekrozu, safra kanalı proliferasyonu, hidropik değişiklikler,iltihap, ve fibrozis. Hayvanlarda ANIT ile indüklenen kolestaz, alanin aminotransferaz (ALD), aspartat aminotransferaz (AST), alkalin fosfataz ve y-glutamik-iltranspeptidaz (y-GGT) gibi karaciğer hasarının plazma biyobelirteçlerinde önemli bir yükselme sergiler.Oksidatif stresAyrıca, yüksek seviyelerde reaktif oksijen türleri, lipid peroksidasyonu, tükenmiş glutatyon rezervuarları ve karaciğerdeki bozulmuş doku antioksidan kapasitesi ile kanıtlandığı gibi, önemli ölçüde artar. Daha da önemlisi, ANIT ile indüklenen hayvanlar, mitokondriyal dehidrojenaz aktivitesinin inhibisyonunu, mitokondriyal membran potansiyelinin çökmesini ve mitokondriyal şişmeyi gösterir. ANIT ile indüklenen kolestatik sıçanlardan mitokondri, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözenek açılmasına karşı artan duyarlılık ve ATPaz aktivitesinin azaltılmış repolarizasyonu sergiler. Sonuç olarak kolestatik hepatit, karaciğer fonksiyonu, oksidatif stres ve mitokondrinin yapısı ve fonksiyonları ile yakından ilişkilidir [6,7].

Şu anda, ursodeoksikolik asit (UCDA) gibi sadece birkaç ilaç tedavisinde kullanılmaktadır.kolestaz[8,9]; ancak bu ilaçların zayıf yanıt, advers reaksiyonlar ve düşük uyum gibi dezavantajları vardır. Bununla birlikte, geleneksel Çin tıbbı, intrahepatik kolestaz gibi karaciğer hastalıklarının tedavisinde uzun bir geçmişe ve zengin klinik deneyime sahiptir. Hypericum japonicum, Hypericum japonicum Thunb'un kurutulmuş bütün otudur. Di-er-Cao veya Tian-ji-Huang olarak da bilinen ex Murray, Qing hanedanlığından beri sarılık tedavisinde kullanılmıştır. H. japonicum, ısıyı temizleme, nemi giderme, karaciğeri sakinleştirme ve safra kesesini güçlendirme işlevlerine sahiptir ve nemli-ısı sarılığının klinik tedavisinde yaygın olarak kullanılır [10]. H. japonicum'un kimyasal bileşimi flavonoidleri, lantanoidleri, kromon glikozitleri, floroglusinol türevlerini ve laktonları içerir. Flavonoidler arasında quercitrin, isoquercitrin ve quercetin-7-O- -l-rhamnoside hepatoprotektif aktiviteye sahip bileşenlerdir [11]. Ning Wang ve arkadaşları, quercetin, iso-quercetin ve quercetin dahil olmak üzere H.japonicum'un sulu ekstraktlarının, karbon tetraklorür kaynaklı hepatit ve ANIT kaynaklı kolestaz deney hayvanları üzerinde bir antihepatotoksik ve anti-kolestaz etkisine sahip olduğunu gösterdi [12]. Ancak H. japonicum'un intrahepatik kolestaz tedavisindeki mekanizmaları ve hedefleri hala belirsizdir.

Bu çalışmada ağ farmakolojisi ve farmakolojik deneyler birleştirilmiştir. İlk olarak, H.japonicum'un ana aktif bileşenleri ve hedefleri in silico olarak tanımlandı ve bir bileşen-hedef ağı oluşturmak için kullanıldı[13,14]. Kolestatik hepatit tedavisinde olası terapötik mekanizmaları araştırmak için hedef genlerin fonksiyonel zenginleştirme analizleri yapıldı. Daha sonra, H.japonicum'un kolestatik hepatit tedavisindeki etkilerinin altında yatan mekanizmaları ve karaciğer üzerindeki koruyucu etkilerini ortaya çıkarmak için ANIT tarafından oluşturulan bir kolestatik hepatit sıçan modeli kullanıldı. Spesifik olarak, mitokondriyal membran potansiyelini, hepatosit apoptozunu, intrahepatik safra asidi homeostazının düzenlenmesini ve diğer yolları araştırdık.

Araç ve yöntemler

Kimyasallar ve tepkimeler

H. japonicum Thunb. Murray'den Kangmei Pharmaceutical Co., Ltd.'den (Puning, Çin) satın alındı; -naftil izotiyosiyanat (ANIT, yüzde 98) Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.'den (Shanghai, China) satın alındı;kuersetin(>98.0%)and ursodeoxycholic acid (UCDA,>yüzde 98) Dalian Melone Biology Technology Co., Ltd.'den (Dalian, Çin) satın alındı. Zeytinyağı Sigma Aldrich Trading Co., Ltd.'den (Shanghai, China) satın alındı. Malondialdehit (MDA), süperoksit dismutaz (SOD), direkt bilirubin (DBI), toplam bilirubin (TBIL), toplam safra asidi (TBA), ALT ve AST tahlil kitleri ve glutatyon peroksidaz (GSH-Px) kitleri satın alındı. Nanjing Jiancheng Biyomühendislik Enstitüsü (Nanjing, Çin). Bio-Rad DC protein tahlil reaktif paketi Bio-Rad Laboratories'den (CA, ABD) satın alındı. HyPure moleküler biyoloji dereceli su, FastStart Universal SYBR Green Master karışımı (Rox) ve RevertAid First Strand cDNA sentez kiti Thermo Fisher'dan satın alındı Scientific Co., Ltd. (Şangay, Çin). PTGS2, B hücreli lenfoma-2(BCL2), kolesterol 7-alfa hidroksilaz (CYP7A1), farnesoid X reseptörü (FXR), interlökin-1 beta(L{{{ 13}}B) ve tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-o) Service bio Technology Co., Ltd.'den (Wuhan, Çin) satın alındı. Diğer tüm kimyasallar ve reaktifler analitik veya daha yüksek kalitedeydi ve ticari kaynaklardan satın alındı.

Hayvanlar

180 g ila 220 g ağırlığındaki erkek Sprague-Dawley sıçanları, Southam Tıp Üniversitesi (SCXK(YUE)2018-0085) Deney Hayvanları Merkezi'nden satın alındı. Sıçanlar, ad libitum yem ve su sağlanan kafeslerde barındırıldı ve her deneyden 1 hafta önce laboratuvara alıştırıldı. Hayvanları ve bakımı içeren tüm prosedürler, Guangzhou Tıp Üniversitesi Eğitim ve Araştırma Departmanındaki İnsan ve Hayvan Deneklerinin Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Hayvan sertifika numarası 44002100016560 idi.

H.japonicum Bileşenlerinin ve Hedeflerinin Taranması

"Di-er-cao" kelimesini arama anahtar kelimesi olarak alarak, Çin bitkisel ilaçlarının sistem farmakolojisi araştırmaları için değerli bir platform olan Geleneksel Çin Tıbbı Sistemleri Farmakolojisi veritabanında H.japonicum'un kimyasal bileşenlerini ve ilgili hedeflerini aradık. ilaçlar, hedefler ve hastalıklar arasındaki ağ ilişkileri veritabanı [15]. Hedeflere karşılık gelen gen isimleri, proteinler hakkında fonksiyonel bilgilerin toplanması için merkezi bir merkez olan UniPort Bilgi Bankası kullanılarak elde edildi[16]. Organizma "insan" olarak seçilmiştir.

Terapötik Hedef Tahmini ve Ağ İnşası

"Kolestatik hepatit", sayısız veri kaynağından insan gen-merkezli bilgileri otomatik olarak çıkaran ve bütünleştiren GeneCards veri tabanında kolestatik hepatit için protein hedefleri ve ilgili gen adlarını elde etmek için anahtar kelime olarak kullanıldı [17]. "Hediyeler 230" olan hedefler, kolestatik hepatit için terapötik hedefler olarak seçilmiştir. H.japonicum'un kolestatik hepatit tedavisine yönelik potansiyel hedeflerini elde etmek için ilaç hedefleri ve hastalık hedefleri "gen adı"na göre kesiştirildi. Bileşen-hedef ağını oluşturmak için Cytoscape 3.7.2 yazılımı [18] kullanıldı ve ağ topolojisi parametrelerini analiz etmek için ağ analizörü işlevi kullanıldı.

Hedef Protein Etkileşim Analizi

H.japonicum ve kolestatik hepatitin kesişme hedefleri, doğrudan (fiziksel) ve dolaylı (fonksiyonel) protein-protein etkileşimlerini (PPI) ortaya çıkarabilen String veritabanına aktarılmıştır [19]. Tarama koşulu olarak yüksek güvenle (0.9), izole edilmiş hedeflerin çıkarılması ve türün insan olarak tanımlanmasıyla bir ÜFE ağı oluşturuldu. Yukarıdaki verileri Cytoscape'e aktardıktan sonra, PPI ağının temel düzenleyici hedeflerini analiz etmek için sitoHubba eklentisindeki Maximal Clique Centrality (MCC) analiz yöntemi kullanıldı.

Hedef Fonksiyon ve Yol Zenginleştirme Analizi

Hedef protein genlerinin biyolojik süreçlerini ve sinyal yollarını daha iyi anlamak için, kolestatik hepatitin H. japonicum tarafından tedavisine yönelik hedefler, güçlü bir gen açıklama analiz aracı olan Metascape'e girdi[20]. Türler insanlarla sınırlıydı ve P<0.01 was="" set="" as="" the="" significance="" threshold.="" gene="" ontology="" (go)="" functional="" annotation="" and="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes="" (kegg)pathway="" enrichment="" analyses="" were="" carried="" out,="" and="" the="" first="" 20="" cluster="" analysis="" results="" were="" drawn="" into="" a="" bar="" chart="" for="" visual="" processing="" using="" the="" omicshare="" tools,="" a="" free="" online="" platform="" for="" data="" analysis="" and="" detailed="" implementation="" process,="" as="" shown="" in="" figure="">

Quercetin'in ANIT ile indüklenen sıçan Kolestatik Hepatit üzerindeki Terapötik Etkileri

Otuz altı erkek Sprague-Dawley sıçanı rastgele 6 gruba ayrıldı (grup başına n=6): Grup yerel olarak 7 gün boyunca boş araç ve 5. günde ip zeytinyağı enjeksiyonu (2 mL/kg vücut ağırlığı) aldı. ; Grup II, 7 gün boyunca sözlü olarak boş araç aldı; Grup II, 7 gün boyunca oral olarak UCDA (50 mg/kg vücut ağırlığı) ile tedavi edildi; Grup V, 7 gün boyunca yüksek doz kersetin (Que H;200 mg/kg vücut ağırlığı) ile oral yoldan tedavi edildi; Grup V, 7 gün boyunca orta doz kersetin (QueM;100 mg/kg vücut ağırlığı) ile oral yoldan tedavi edildi; ve Grup VI, 7 gün boyunca düşük doz kersetin (Quel, 50 mg/kg vücut ağırlığı) ile oral yoldan tedavi edildi. Grup Il-VII'deki sıçanlara 5. günde UCDA veya kersetin uygulamasından 2 saat sonra ANIT-zeytinyağı solüsyonu (100 mg/kg, ip,2 mL/kg vücut ağırlığı) uygulandı. Model ve kontrol grupları oral olarak günlük bir boş çözücü [21,22].

Son ANIT uygulamasından kırk sekiz saat sonra, hayvanlara ip enjeksiyon (100 mg/kg pentobarbital) yoluyla anestezi ile ötenazi yapıldı. Biyokimyasal değerlendirme için abdominal aorttan kan alındı. Karaciğer hemen çıkarıldı ve tartıldı. Karaciğerin büyük bir kısmı sıvı nitrojen içinde aniden donduruldu ve kalan doku yüzde 4 paraformaldehit içinde sabitlendi, işlendi ve hematoksilen ve eozin (H&E) boyamasından sonra histolojik inceleme için parafine gömüldü. Karaciğer hasarı, bir Chemray 240 Otomatik Biyokimyasal Analiz Cihazı (Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd., Shenzhen, Çin) kullanılarak ALT, AST, DBIL, TBIL, TBA ve andy-GGT seviyelerine göre değerlendirildi. MDA, GSH-Px ve SOD seviyeleri, üreticinin talimatlarına göre ticari kitler kullanılarak değerlendirildi ve histolojik değerlendirme ve puanlama, çalışmaya kör bir patolog tarafından standart kriterlere göre yapıldı. Gerçek zamanlı ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) analizi için karaciğer dokusu sıvı nitrojen içinde hızla donduruldu ve analize kadar -80 derecede saklandı.

PTGS2, BCL2, CYP7A1, FXR, Il-1 ve TNF-mRNA'ların RT-PCR ile analizi

toplam RNA, üreticinin talimatlarına göre (Service bio, Wuhan, Çin) TRlzol kullanılarak karaciğer dokularından ekstre edildi. Toplam RNA（10 μLl）, cDNA'ya ters kopyalandı. GAPDH, PTGS2, BCL2, CYP7A1, FXR, TNF- ve IL-1 için PCR reaksiyonları （20ul） 2 μL cDNA içeriyordu ,2μL 2.5 μMprimer, 10μLgPCR mix ve 6 μL ddH,O. Reaksiyonlar 65 derecede 10 dakika, ardından 42 derecede 60 dakika inkübe edildi ve 72 derecede 15 dakika sonlandırıldı. PCR primer sekansları Tablo 1'de listelenmiştir. RT-PCR reaksiyonları şu şekilde gerçekleştirilmiştir: 95 derece C'de 10 dakika boyunca bir ön döngü aşaması, ardından 95 derece C'de 30 saniye boyunca 40 döngü denatürizasyon ve 60 derece C'de tavlama 60 sn. Erime eğrisi, 0.3 derece C/15 s'lik bir rampa oranıyla 65 dereceden 95 dereceye kadardı. Her tavlama aşamasının sonunda floresans ölçüldü ve PCR ürünlerinin özgünlüğünü doğrulamak için erime eğrileri izlendi. Kontrol geni GAPDH'ye göre PTGS2,BCL2,CYP7A1, FXR,IL-1B ve TNF-mRNA'ların mRNA ekspresyon seviyelerini belirlemek için 2-一CT yöntemi kullanıldı.

İstatistiksel analiz

Tüm veriler ortalama±standart sapma (SD) olarak ifade edildi. İstatistiksel analiz GraphPad Prism 8 kullanılarak yapıldı.

3.0(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, ABD). Veriler, tek yönlü varyans analizi (ANOVA), ardından Dunnett testi ile analiz edildi.P<0.05 was="" considered="" statistically="">

Sonuçlar

H.japonicum Bileşenleri ve Hedefleri

H. japonicum'un bileşenlerini tam olarak araştırmak için oral biyoyararlanım ve ilaç benzerliği gibi farmakokinetik parametreleri tarama kriteri olarak belirlemedik. TCMSP veri tabanı aracılığıyla, H. japonicum'un 49 aktif bileşeni ve buna karşılık gelen 499 hedef elde edildi. Uniprot tarafından kopyaları kaldırdıktan ve adları düzelttikten sonra 269 hedef tutuldu. H.japonicum'un aktif bileşenleri ve parametre bilgileri Tablo 2'de gösterilmiştir.

Kolestatik Hepatit Tedavisinde H.japonicum'un Hedefleri

GeneCards veri tabanında, 682 kolestatik hepatit hedefi tarandı. Son olarak, aktif bileşen ve hastalık hedefleri çaprazlanarak kolestatik hepatitin H. japonicum tedavisi ile ilgili olabilecek 93 hedef elde edildi (Şekil 2).

Bileşik hedefli Ağ

H. japonicum'un kolestatik hepatit tedavisinde bileşen-hedef ağı, aktif bileşenleri temsil eden 22 altıgen düğüm ve hedefleri temsil eden 93 V şekilli düğüm ile 115 düğüm ve 175 kenardan oluşuyordu (Şekil 3).

Düğümlerin boyutu ve şeffaflığı dereceye göre ayarlandı. Derece değeri ne kadar yüksek olursa, düğüm o kadar büyük ve renk ne kadar koyu olursa, bağlantı ve önem o kadar büyük olur. Sonuçlarda gösterildiği gibi, H. japonicum çok bileşenli ve çok hedefli eyleme sahipti; yani, birden fazla hedefle etkileşime giren 1 bileşik ve aynı hedefle etkileşime giren farklı bileşikler. Derece, aradalık ve yakınlık gibi ağ topolojisi parametrelerine göre, ana aktif bileşenler quercetin, kaempferol ve tet-ramethoxyluteolin (Tablo 3) ve çekirdek hedefler PTGS2, nitrik oksit sentaz (NOS3), peroksizom proliferatif aktifleştirilmiş reseptör gama (PPARG), dipeptidil peptidaz V(DPP4), BCL2 ve TNF (Tablo 4).

ÜFE Ağı

93 ilaç-hastalık kesişim hedefinin etkileşimi, STRING veri tabanı kullanılarak analiz edildi. Yüksek güvenilirlik (0.9) ayarlandı, izole hedefler gizlendi ve 81 hedef ve 299 etkileşim bağlantısına sahip bir ÜFE ağı elde edildi (Şekil 4A). sitoHubba'nın MCC algoritmasını uygulayarak, ÜFE ağındaki ilk 10 temel düzenleyici hedef TNF, IL6, IL1B, CXCL8, IL10, CCL2, ICAM1, NFKB1, NFKBIA ve MYC idi(Şekil 4B).

Hedef Fonksiyon ve Yol Zenginleştirme

Terapötik hedeflerin GO fonksiyonel notasyonu ve KEGG yolu zenginleştirme analizleri Metascape kullanılarak gerçekleştirildi. Hücre kompozisyonu için 41 madde, moleküler fonksiyon için 105 madde ve biyolojik işlem için 1753 madde olmak üzere toplam 1899 GO maddesi elde edildi. H. japonicum'un dahil olduğu ana biyolojik süreçler ve hücresel bileşenler, lipopolisakkarit, sitokin aracılı sinyalleme, apoptotik sinyalleme, membran sal (Şekil 5A,5B) ve sitokin reseptörü bağlanması, transkripsiyon faktörü bağlanması ve serin dahil moleküler fonksiyonlara verilen yanıtları içeriyordu. -tip endopeptidaz aktivitesi (Şekil 5C).Toplamda, 146 KEGG sinyal yolu analiz edildi, en dikkate değer olanı AGE-RAGE ve TNF sinyal yolları ve hepatit B, arginin biyosentezi ve safra salgısıdır. (Şekil 5D).

Sıçanlarda ANIT ile İndüklenen Kolestatik Hepatite Karşı Korunan Quercetin

İntrahepatik kolestaz sıçan modelinde, kersetin, kolestazlı karaciğer hasarında karaciğer/vücut ağırlığı oranını eski haline getirdi (Şekil 6). Hepatik hücre hasarı ile ilişkili intrahepatik safra kanalı proliferasyonunu ve kolestazı değerlendirmek için kullanılan serum ALT, AST, DBIL, TBIL, TBA ve Y-GGT, model sıçanlarda büyük ölçüde arttı. Buna karşılık, quercetin doza bağlı olarak serum ALT, AST, DBIL, TBIL, TBA ve GGT seviyelerini azalttı. Benzer şekilde, kersetin tedavisi ANIT'nin neden olduğu hepatik oksidatif stresi iyileştirdi, serum SOD ve GSH-Px düzeylerini artırdı ve MDA düzeylerini düşürdü (Şekil 7).

H&E boyamasıyla yapılan histolojik değerlendirmeler, kuersetin'in ANIT'nin neden olduğu intrahepatik kolestaz üzerindeki önleyici ve terapötik etkilerinin doğrudan kanıtını sağladı. H&E boyaması, kontrol grubunun karaciğer dokusunun normal bir mikro yapı sergilediğini, karaciğer lobüllerinin açık olduğunu ve karaciğer hücre kablosunun anormal morfolojik değişiklikler olmaksızın düzgün ve düzenli olduğunu gösterdi. Buna karşılık, ANIT ile tedavi edilen karaciğer bölümleri belirsiz karaciğer lobül yapısı, hepatik kord düzensizliği, hepatik şişme, hiperemi ve nekroz gösterdi (Şekil 8A). Bununla birlikte, kersetin, bir doz-etki ilişkisi göstererek hepatik çürüme derecesini ve inflamatuar hücre infiltrasyonunu önemli ölçüde azalttı. Bu sonuçlar, quercetin'in sıçanlarda intrahepatik kolestazdan kaynaklanan ANIT'nin neden olduğu karaciğer hasarına karşı koruduğunu ortaya koydu.

Quercetin Korumalı PTGS2, BCL2, CYP7A1, FXR I-1B ve TNF- mRNA İfadesi

Quercetin'in ANIT ile indüklenen intrahepatik kolestatik karaciğer hasarı sıçanlarında hepatositler üzerindeki koruyucu etkisini daha fazla değerlendirmek için PTGS2, BCL2, CYP7A1, FXR, IL-1 ve TNF- RT-PCR kullanılarak ölçüldü. Şekil 8B'de gösterildiği gibi, kontrol farelerininkiyle karşılaştırıldığında, PTGS2, CYP7A1, IL-1 ve TNF-, ANIT model grubunda yukarı doğru düzenlenmiştir, ancak BCL2 ve FXR aşağı doğru düzenlenmiştir. Bununla birlikte, kuersetin (50,100 ve 200 mg/kg dozlarında) ve UCDA uygulaması

PTGS2, CYP7A1, IL-1 ve TNF- mRNA'nın ifadesini yüzde 44,4 oranında önemli ölçüde azalttı (P<><><0.05), and=""><0.05), respectively,="" and="" increased="" the="" expression="" of="" bcl2="" and="" fxr="" mrna="" by="" 92.9%="" and=""><0.01), respectively,="" was="" the="" anit="" model="" group.="" these="" results="" showed="" that="" quercetin="" could="" protect="" hepatocytes="" by="" accelerating="" the="" excretion="" and="" transport="" of="" bile="" acids,="" maintaining="" the="" mitochondrial="" membrane="" potential="" of="" hepatocytes,="" and="" inhibiting="">

Tartışma

Toplu olarak, H.japonicum'un kolestatik hepatitin tedavisi olabileceğini gösteren ANIT ile indüklenen bir sıçan modeli kullandık. Ağ farmakolojisi ve farmakodinamik deneyleri, kolestatik hepatit tedavisinde H. japonicum'un etkisini ve moleküler mekanizmasını aydınlattı ve bitkinin daha ileri araştırmaları ve klinik uygulamaları için teorik bir temel sağladı.

H. japonicum'un ana kimyasal bileşenleri, diğerleri arasında flavonoidler [23], floroglusinol türevleri ve dipeptitlerdir [11]. Puthur ve arkadaşları, asit hücreleri üzerindeki H.japon-icum asetonik ekstraktlarının IC50'sinin 29.30 ug/mL olduğunu, sonuçlarının in vitro olarak iyi bir anti-tümör aktivitesi gösterdiğini ve H.japonicum'un metanolik ekstraktlarının üzerinde sinerjistik bir etkiye sahip olduğunu belirlediler. bazı anahtar enzimlerin inhibisyonu yoluyla zararlılar. Deneyleri, H. japonicum'un daha fazla araştırma gerektiren çeşitli biyolojik aktivitelere sahip olduğunu ortaya koydu [24,25]. Modern farmakolojik çalışmalar, H. ja-ponicum ekstraktının hepa koruyucu, antioksidan,antienflamatuvar, ve antitümör etkileri. H.japonicum ve ana bileşenleri, karbon tetraklorür kaynaklı hepatit, ANIT kaynaklı kolestaz ve anti-ördek hepatit A viral aktivitesine karşı koruma sağlar ve karaciğer fonksiyonunu ve oksidatif hasarı iyileştirir[12,26]. Isoquercitrin ve quer-cetin 7-rhamnoside ana aktif hepatoprotektif bileşenlerdir [11,27]. Bu çalışma, H.japonicum'un temel bileşeni olan kersetin'in, ANIT'nin neden olduğu hepatosit dejenerasyonunu ve nekrozunu azaltabildiğini ve karaciğer hasarının derecesini azaltabildiğini göstermiştir. H&E sonuçları, quercetin'in kolestatik hepatit üzerindeki koruyucu etkisini daha da doğruladı.

Bu çalışmada, ağ farmakolojisi araştırmasını hayvan farmakolojik deneyleriyle birleştirdik. İlk olarak, kolestatik hepatit tedavisinde H. japonicum'un ana aktif bileşenlerini ve hedeflerini taradık. Daha sonra bir "bileşen-hedef" ağı oluşturduk ve kolestatik hepatite karşı terapötik etkisinin olası mekanizmasını araştırmak için hedeflerin fonksiyonel zenginleşmesini analiz ettik. Son olarak, hayvan deneyleriyle bu hedefleri ve moleküler mekanizmaları doğruladık. Gözlemlediğimiz intrahepatik kolestazın biyokimyasal indeksleri ve patolojik özellikleri, insan hastalıklarıyla tutarlıydı ve sıçan kolestatik hepatit modelimizin klinik ilişkisini destekliyordu.

Safra asidinin serum seviyesi, intrahepatik kolestaz bozukluklarının ve bunların sonucunda ortaya çıkan karaciğer hasarının klinik teşhisi için çok önemli bir kanıt olarak kabul edilir. İntrahepatik kolestaz, safra ve karaciğer fonksiyonunun normal atılımının engellenmesine yol açar.

enzimler, serum TBIL, DBIL ve TBA'da bir artışa neden oldu ve kersetin'in ANIT kaynaklı safra asidi düzensizliğini tersine çevirdiğini gösterdik. Ek olarak, kersetin, hepatositlerin dejenerasyonu ve nekrozu ve hepatosit membran hasarı nedeniyle önemli ölçüde artan AST, ALT ve y-GGT serum seviyelerini önemli ölçüde azalttı.

Lipid peroksidasyonu, ANIT'nin neden olduğu kolestatik hepatitin önemli patolojik mekanizmalarından biridir ve karaciğer hücre hasarına neden olur |28-30]. Vücuttaki oksidatif stres düzeyi kolestatik hepatitin şiddetini yansıtır, bu nedenle lipid peroksit düzeylerini değerlendirmek için kullanılan GSH-Px, SOD ve MDA önemli göstergelerdir. Bu çalışmada, her bir kersetin dozlama grubu, artan SOD ve GSH-Px aktiviteleriyle birlikte önemli ölçüde azaltılmış MDA gösterdi. Bu sonuçlar, kersetin tarafından karaciğer hücre hasarının hafifletilmesinin, serbest radikal temizleme, lipid peroksidasyonunun inhibisyonu ve lipid peroksit üretiminin azalması ile ilişkili olduğunu göstermiştir.

Ağ farmakolojisi sonuçları, kolestatik hepatitin H. japonicum tarafından tedavisi için temel ilgili hedeflerin PTGS2, NOS3, PPARG, DPP4, BCL2 ve TNF'yi içerdiğini göstermiştir. Bu çalışmada 5 hedef, PTGS2, BCL2, TNF- , FXR ve CYP7A1. moleküler düzeyde araştırma için kolestatik hepatit, karaciğer fibrozu ve karaciğer hasarı ile ilişkili olanlar seçilmiştir. Siklooksijenaz 2 olarak da bilinen PTGS2, NF-KB yolunun aşağı akış molekülüdür [31,32]. PTGS2, hücre proliferasyonunu teşvik ederek, hücre apoptozunu inhibe ederek, anjiyogenezi teşvik ederek ve bağışıklık fonksiyonunu inhibe ederek inflamasyon oluşumuna katılır. TNF- kolestaz sürecine katılan önemli bir inflamatuar aracıdır. Çalışmamızda, ANIT ile indüklenen kolestatik karaciğer hasarı modeli sıçanların karaciğer dokularında PTGS2, TNF-protein ve mRNA'nın ekspresyon seviyeleri yukarı regüle edildi, bu da PTGS2 aşırı ekspresyonunun akut karaciğer hasarını ve gelişimini destekleyebileceğini düşündürdü. kolestaz.

BCL2, hücre apoptozunu inhibe eden bir proteindir. Hücre bileşenlerinin oksidatif hasarını ve DNA parçalanmasını önler ve anti-oksidatif yolları düzenler [33]. Aynı zamanda mitokondriyal membran potansiyelini iyileştirir ve hücre membran transportunu etkileyerek sitokrom C'nin mitokondriyal salınımını ve apoptozu indükleyen faktörleri inhibe eder, böylece karaciğer hücresi apoptozunu ve diğer etkileri inhibe eder [34,35].

FXR, karaciğerdeki safra asidi homeostazını düzenleyen bir safra asidi reseptörüdür [36]. Küçük bir heterodimer şaperonun aracılık ettiği negatif geri besleme düzenlemesi yoluyla safra asidi sentezi hız sınırlayıcı enzim CYP7A1'in aktivitesini inhibe eder ve safra asidi sentezini azaltır. Aynı zamanda FXR, karaciğer hücrelerini korumak için safra asitlerinin atılımını ve taşınmasını hızlandırarak hepatosit safra kanalının yan membranında BSEP ve MRP2 taşıyıcılarının ekspresyonunu yukarı doğru düzenleyebilir [37,38].

Sonuçlarımız, model sıçanların ANIT etkisi altında büyük miktarda kolik asit stazına sahip olduğunu ve bunun FXR ifadesinin aşağı regülasyonu ve bunun sonucunda CYP7A1 ifadesinin artmasına yol açtığını gösterdi. Ayrıca, FXR'nin aşağı doğru düzenlenmiş ifadesi, düzenlediği aşağı akış genleri BSEP ve MRP2'nin ifadesinde bir azalmaya neden oldu. Quercetin müdahalesi, sıçan karaciğer dokularında FXR'nin ekspresyon seviyesini önemli ölçüde restore etti ve aşağı akış genleri CYP7A1, BSEP ve MRP2'nin ekspresyonunu model grubunun ters yönünde düzenledi. Bu çalışmanın sonuçları, önceki araştırma sonuçlarıyla uyumludur.

ANIT kaynaklı kolestatik hepatit, insanlardakine benzer biyokimyasal ve patolojik değişikliklere sahiptir. Bununla birlikte, bu çalışmada tek ANIT tedavisinin patolojik süreci kısaydı ve normalde 48 ila 72 saatlik daha uzun bir deneysel süre gerektiren araştırmayı kısıtladı. ANIT'nin çoklu aralıklı yönetimi bu dezavantajın üstesinden gelecektir. Geleneksel Çin tıbbının ağ farmakolojisi, tıbbi malzemelerde bulunan kimyasal bileşimleri araştırma nesnesi olarak alır; bununla birlikte, geleneksel Çin tıbbının ilaç etkinliğine dahil olan kimyasal maddeler, tek bir bileşen olmak zorunda değildir, çünkü etkili madde bir grup farmakodinamik bileşen olabilir. Geleneksel Çin tıbbında maddelerin hedefleri ve yolları genellikle bilindiğinden, yeni mekanizmaların keşfi için sınırlamalar vardır. Gelecekte, daha kapsamlı ve objektif bilgiler elde etmek için yapay zeka algoritmaları ağ farmakolojisi ile birleştirilebilir.

Sonuçlar

Özetle, H. japonicum, quercetin gibi aktif bileşenlerin yardımıyla FXR'yi aktive edebilir, CYP7A1'i inhibe edebilir, hepatositlerde safra asidi sentezini azaltabilir ve safra asidinin ekstrahepatik atılımını artırabilir. Ayrıca, mitokondriyal membran potansiyelini iyileştirmek, hepatosit apoptozunu inhibe etmek ve karaciğerdeki safra asidinin homeostazını düzenlemek için BCL2'yi düzenleyebilir. Ayrıca, PTGS2, IL-1 ve TNF-'nin ekspresyonunu inhibe ederek, inflamatuar yanıta müdahale edebilir. Özetle, ağ farmakoloji analizine göre, kersetin, kaempferol ve tetra metoksi luteolin, kolestatik hepatiti iyileştirmek için H. japonicum'un ana aktif bileşenleridir. Bu çalışmanın sonuçları, insan karaciğer hastalığında kersetin, kaempferol ve tetra-metoksiluteolin'in rolü ve kolestatik hepatitte PTGS2, BCL2, CYP7A1 ve FXR genlerinin rolleri hakkında gelecekteki araştırmalara destek sağlayabilir.