Yeni Bir Netrin-1-türetilmiş Peptit, Farelerde Nöronal Ölüme Karşı Korumayı Artırıyor ve İntraserebral Kanamayı Azaltıyor Bölüm 3
Aug 19, 2024
Tuzlu su, TAT veya TE1 (tuzlu suda çözünmüş) tedavi grupları, farelere ICH'den 2 hafta sonra ve 5 gün boyunca her gün hayvan başına toplam 0.1 mL hacimde intraperitoneal enjeksiyon yoluyla verildi. Peptitler kör bir şekilde 12 mg/kg'lık dozlarda verildi.
Fizyolojik salin, tıbbi ve biyolojik deneylerde yaygın olarak kullanılan, yaygın olarak kullanılan bir fizyolojik tampondur. Ama biliyor muydun? Fizyolojik salin aynı zamanda hafızamızı da geliştirebilir!
Her şeyden önce fizyolojik salin, hücrelerin normal fonksiyonunda önemli bir rol oynar. Normal hücre ozmotik basıncını koruyabilir ve hücrelerin normal morfolojisini ve fonksiyonunu koruyabilir. Beyinde çok sayıda sinir hücresi, temel madde olarak fizyolojik saline ihtiyaç duyar ve fizyolojik salin takviyesi, beyin hücrelerinin normal çalışmasını destekleyebilir, beyin için yeterli oksijen ve besin sağlayabilir ve beyni daha sağlıklı hale getirebilir.
İkincisi, fizyolojik salin, beyin nöronları arasındaki sinyal iletimini destekleyebilir ve beynin öğrenme yeteneğini geliştirebilir. Araştırmalar, görev öğrenme sürecinde fizyolojik salin enjeksiyonunun öğrencilerin öğrenme etkisini önemli ölçüde artırabildiğini, öğrencilerin duygusal durumunu iyileştirebileceğini, öğrenme kaygısını ve stresini azaltabileceğini göstermiştir. Aynı zamanda fizyolojik salin, hipokampustaki nöronların sayısını ve nöronların karmaşıklığını da artırabilir, bu da hafızanın oluşumuna ve korunmasına yardımcı olur.
Ayrıca fizyolojik salin, beynin metabolik ortamını iyileştirebilir ve hasar, lezyonlar, iskemi ve hipoksi gibi beyin üzerindeki çeşitli zararlı etkileri azaltabilir. Bunlar beyne zarar verebilecek faktörlerdir ve fizyolojik salin enjeksiyonu beynin başa çıkma yeteneğini artırabilir ve hasarını azaltabilir, böylece beynin hafızasını ve düşünme yeteneğini geliştirebilir.
Genel olarak salin, hafızayı geliştirmek için ideal bir maddedir. Nöronların sayısını ve karmaşıklığını arttırmak, metabolik ortamı geliştirmek ve nöronlar arasındaki sinyal iletimini teşvik etmek de dahil olmak üzere beyin üzerinde birçok olumlu etkisi olabilir. Bu nedenle hafızamızı geliştirmemiz gerektiğinde beynimize daha iyi koruma ve destek sağlamak için salin enjekte etmeyi düşünebiliriz. Belleğimizi geliştirmemiz gerektiği görülebilir ve Cistanche hafızamızı önemli ölçüde geliştirebilir çünkü aynı zamanda hafıza ve öğrenme için çok önemli olan asetilkolin ve büyüme faktörlerinin seviyelerini arttırmak gibi nörotransmitterlerin dengesini de düzenleyebilir. Ayrıca Cistanche kan akışını iyileştirebilir ve oksijen dağıtımını destekleyebilir, bu da beynin yeterli beslenme ve enerji almasını sağlayarak beyin canlılığını ve dayanıklılığını artırır.
Belleğinizi geliştirmenin yollarını bilin'e tıklayın
4.13. ICH'nin Kollajenaz Kaynaklı Fare Modeli
Kollajenaz enjeksiyonu ICH'yi indüklemek için yaygın olarak kullanılır [60]. Erkek C57BL/6 farelerine (8 ila 12 haftalık) izofluran (%2 ila 5) ile anestezi uygulandı ve bir stereotaksik çerçeveye yerleştirildi.
İşlem sırasında her hayvanın vücut ısısı homeotermik battaniye ile 37 ◦C'de tutuldu. Stereotaksik bir alet (Ruiwode Life ScienceCo., Ltd., Shenzhen, Çin) ve bir şırınga (Hamilton Company, Reno, NV, ABD) kullanılarak, 0.3 µLof kollajenaz (0.{{12) }}45 IU; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABD) sağtriatuma (AP: +0,2 mm; ML: -2,3 mm; DV: -3,5 mm) akış hızında aşılandı. 0,1 µL/dak.
Kontrol hayvanlarına toplam 0,3 uL salin aşılandı. Tüm cerrahi işlemler aseptik koşullar altında gerçekleştirildi. Bu çalışmada 66'dan fazla erkek fare kullanılmış ve hayvanlar her deneyden önce rastgele gruplara atanmıştır [57].
4.14. Davranış Analizi
Beyin hematomu oluşumundan sonra farelerin nörolojik davranış analizi, yapışkan bant çıkarma testi [61] ve silindir testi [60] ile tespit edildi. Yapışkan bandı çıkarma testi, yapışkan bandın farelerin her ön pençesinin (sağ ve sol) ekim bölgesine yerleştirilmesiyle gerçekleştirildi.
Her fare yeni bir kafese yerleştirildi.
Bandın uygulandığı andan farenin başarıyla çıkarıldığı ana kadar geçen süre her pençe için kaydedildi. Her pençe için maksimum 300 saniyeye izin verildi. Deneyler arasında hayvanlar, patojen içermeyen bir tesisteki ev kafeslerinde barındırıldı.
Silindir testi, bir farenin şeffaf akrilik cam silindire (çap: 8 cm; yükseklik: 25 cm) 2 ayna ve bir kameranın önüne 5 dakika süreyle yerleştirilmesiyle gerçekleştirildi. Kamera, en uygun videoyu elde etmek için 2 aynanın ve silindirin önüne merkezi olarak yerleştirildi.
Bağımsız ön ayak kullanımının değerlendirilmesi için, (1) farelerin tam büyüme sırasında silindir duvarına bir ön ayakla temas etme yeteneği ve (2) farelerin tam büyüme sonrasında yalnızca bir ön ayakla yere inme yeteneği değerlendirildi. Her ön ayak için en az 20 temas noktası yavaş çekim kullanılarak sayıldı.
Ameliyat öncesi temel analiz için test, denemeler arasında 1 saatlik ara ile fare başına iki kez gerçekleştirildi. Ön ayakların kullanımı, sağ ve sol taraftaki bağımsız ön ayak kullanımının oranı olarak ifade edilir.
4.15. Hematom Hacim Analizi
Tedavilerin hematom hacmini azaltıp azaltmadığını belirlemek için fareler ICH'den 5 gün sonra kurban edildi; beyinler çıkarıldı ve OCT'de hızla donduruldu. Koronal kesitler 30 µm kalınlığında dilimlendi ve doğrudan cam slaytlara yerleştirildi. Hematom hacmini ölçmek için kesitler standartlaştırılmış koronal seviyelerde dijitalleştirildi.
Kör bir kullanıcı, her bölümde sol ve sağ hemisferlerdeki konturları ve hematomu ölçtü. Hematom hacmi ve şişme ImageJ (NIH) kullanılarak ölçüldü ve hesaplandı.
Grup başına en az 5 beyin hematom ölçümlerine tabi tutuldu ve hematomavolüm beyin boyunca ölçüldü.
4.16. Floro-Yeşim C Boyama
Kollajenaz kaynaklı ICH'yi takiben farelerde nörodejenerasyon, üreticinin protokolüne göre bir Fluoro-jade C Seyreltmeye Hazır Boyama Kiti (TR-100-FJT, Biosensis, Thebarton, Avustralya) ile boyama yoluyla değerlendirildi [62].
Kısaca, kontrol fareleri ve ICH fareleri (±ip peptidi), modellemeden 5 gün sonra feda edildi ve beyinler, immünositokimya deneyi için kullanılan protokole göre işlendi.
Yüzen beyin bölümleri 5 dakika boyunca %1 sodyum hidroksit çözeltisine daldırıldı, 2 dakika boyunca %70 etanol içerisinde durulandı ve ardından 2 dakika boyunca damıtılmış su içerisinde durulandı. Daha sonra yüzen bölümler, 10 dakika boyunca %0,06'lık bir potasyum permanganat çözeltisine (damıtılmış su içinde KMnO4) daldırıldı.
Kesitler ddH2O ile yıkandıktan sonra karanlıkta hafifçe çalkalanarak 20 dakika boyunca 0%0001 Floro-yeşim boyama çözeltisine (distile su içinde Floro-yeşim C) daldırıldı.
Kesitler ddH2O ile yıkandı, kaplanmış lamlara yerleştirildi ve gece boyunca oda sıcaklığında, karanlıkta kurutuldu. Perihematomal bölge içindeki Floro-Jade C boyaması bir Zeiss LSM 880 konfokal mikroskobu kullanılarak incelendi. Floro-yeşim C boyamanın kantifikasyonu ImageJ yazılımı kullanılarak yapıldı.
4.17. Doku İmmünofloresansı
Doku immünofloresan boyaması bir dizi 30-μm kalınlığında kesitler kullanılarak gerçekleştirildi. Bölümler aşağıdaki birincil antikorlarla inkübe edildi: fare antiNeuN (1:500, Millipore, MAB377, Billerica, MA, ABD) veya fare anti-GFAP (1:200, SigmaAldrich, G3893, St Louis, MO, ABD) antikorları 4'te Gece boyunca ◦C. PBS ile yıkandıktan sonra kesitler, Alexa Fluor 488-konjuge eşek anti-fare (1:1000;Invitrogen, A21202, Carlsbad, CA, ABD) antikoru ile inkübe edildi.
4.18. TÜNEL Testi
Beyin perihematomal bölgesinde nükleer DNA fragmantasyonu olan apoptotik hücreleri tanımlamak için bir terminal deoksinükleotidil transferaz aracılı deoksiüridin trifosfat (dUTP) nick uç etiketleme (TUNEL) tahlili kullanıldı.
Boyama, ticari bir tek adımlı TUNEL apoptoz tahlil kiti (Beyotime, C1090, Nanjing, Çin) kullanılarak yapıldı ve üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirildi. Doku immünfloresansının ardından TUNEL reaksiyonu gerçekleştirildi.
Beyin bölümleri TUNEL reaksiyon karışımıyla (37 °C'de 1 saat) inkübe edildi ve ardından bölümler PBS ile yıkandı ve DAPI ile zıt boyandı. NeuN-TUNEL boyamasının ortak lokalizasyonu, Zeiss LSM 880 konfokal mikroskop kullanılarak incelendi.
Striatum içindeki perihematomal bölgedeki TUNEL pozitif nöronlar (NeuN pozitif), 20X objektif altında alınan fare başına üç farklı resim üzerinde ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü. GFAP-TUNEL boyamasının kolokalizasyonu NeuN-TUNEL boyamasınınkine benzerdi.
4.19. In Vivo Kan-Beyin Bariyeri Geçirgenliği Testi
İn Vivo, Kan-Beyin Bariyeri Geçirgenliği Testleri daha önce anlatıldığı gibi yapıldı [63-65]. Kısaca, kontrol farelerine ve ICH farelerine (±ip peptidi), FITC etiketli 4 kDa dekstran (PBS'de 100 uL 2 mM stok, Sigma Aldrich, 46944-100 MG-F, St Louis, MO, ABD) intraperitoneal olarak enjekte edildi. Modellemeden 5 gün sonra, ardından 5 dakika sonra anestezi uygulandı.
İzleyici için 10 dakikalık bir dolaşım süresinden sonra hayvanlar transkardiyal perfüzyon için hazırlandı ve atriyal ponksiyondan hemen sonra göğüs boşluğundan ~ 300 ul kan toplandı, ardından 3 dakika boyunca PBS ile perfüzyon yapıldı. Yarım beyin (koku alma lobları, beyincik ve arka beyin içermeyen) ve tek bir böbrek toplandı ve hemen sıvı nitrojen içinde donduruldu ve -80 ◦C'de saklandı.
Floresan ölçümü için numuneler buzda eritildi, tartıldı ve PBS içerisinde homojenleştirildi (hemiserebrum için 400 uL ve böbrek için 600 uL), ardından 4 °C'de ve 15,000x g'de 20 dakika boyunca santrifüj uygulandı.
Süpernatanlar (100 uL) ve eşit hacimlerde serum (PBS'de 1/5 seyreltme), bir 96-kuyulu siyah plakaya yüklendi ve karşılık gelen uyarım (490 nm)/emisyonda (520 nm) floresans ölçüldü. ) bir plaka okuyucusunda (Tecan, Männedorf, İsviçre). Otofloresan değerlerini çıkarmak için sahte hayvanlar (iz enjeksiyonu olmayan) kullanıldı. Geçirgenlik indeksi (mL/g), doku RFU'ları/g doku ağırlığının serum RFU'ları/mL serumuna oranı olarak hesaplandı.
4.20. Floresan Lektin Boyama
Beyin mikrodamarlarını görselleştirmek için, yüzen bölümleri 1 saat süreyle suya batırmak amacıyla fluorescein-konjuge Lycopersicon esculentum lectin'i (1:200, Vector Laboratories, FL-1171, Burlingame, CA, ABD) kullandık.
Kesitler, 20x objektif altında Zeiss LSM 880 konfokal mikroskopta görüntülendi ve görüntüler 1,3 gama ayarıyla işlendi. Hayvanın koronal beyninin perihematomal bölgesindeki önceden belirlenmiş 3 alandan üç görüntü alındı. Her beyindeki damar dallanma noktaları kör bir araştırmacı tarafından ölçüldü. Dallanma noktası, belirgin şekilde 2 farklı ve ayrı damar yoluna ayrılan tek bir floresan etiketli damar olarak tanımlandı [66].
4.21. İstatistiksel Analiz
Tüm deneysel prosedürler kör olarak yürütüldü ve daha önce açıklandığı gibi bağımsız olarak 3 kez gerçekleştirildi [67]. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. İstatistiksel analiz, GraphPad Prism v7 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, ABD) kullanılarak uygun şekilde Tek Yönlü ANOVA, İki Yönlü ANOVA ve Öğrenci testi ile gerçekleştirildi. ) ve SPSS yazılımı sürüm 20.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, ABD).
İstatistiksel parametreler ilgili şekil açıklamalarında bulunabilir. İstatistiksel anlamlılık *p < {{0}}.05 olarak belirlendi; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001.]
5. Sonuçlar
Netrin-1'in EGF3 alanı, Netrin-1'nin DCC ile etkileşimi için çok önemlidir ve farklı sinyal yollarını etkinleştirebilir. Netrin-1'in kesik peptidi E1 (407-422 numaralı kalıntılar), nöronları heminin neden olduğu toksisiteden korumak için DCC ile etkileşime girer.
E1 peptidinin uygulanması deneysel bir ICH modelinde fonksiyonel iyileşmeyi geliştirir. Ayrıca peptid E1, nöronları ICH sonrasında dejenerasyon ve apoptozdan koruyabilir.
Yazar Katkıları: Kavramsallaştırma, LL, Z.-XH ve X.-JZ; metodoloji, LL, K.-JL ve J.-BC; doğrulama H.-LY ve X.-XH; soruşturma, X.-JZ; veri iyileştirme, JY; kaynaklar LL ve Z.-XH; LL, Z.-XH ve X.-JZ yazma; denetim, Z.-XH, X.-JZ; finansman alımı, Z.-XHand X.-JZ Tüm yazarlar yazının yayınlanmış versiyonunu okudu ve kabul etti.
Finansman: Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31671065 ve 32071018), Jilin Eyaleti Bilim ve Teknoloji Geliştirme Planı (202520YY01017404) tarafından finanse edildi.
Kurumsal İnceleme Kurulu Beyanı: Tüm prosedürler Kuzeydoğu Normal Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (NENU/IACUC, AP2016200299) tarafından onaylandı. Çin Halk Cumhuriyeti Ulusal Standartları (GB/T 35892–2018), Hayvan Refahının Etik İncelemesine İlişkin Laboratuvar Hayvanları Kılavuzu, hayvan bakımımız ve protokollerimiz için yol göstericiydi.
Bilgilendirilmiş Onam Beyanı: Geçerli değil.
Teşekkür: Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31671065 ve 32071018) ve Jilin Eyaleti Bilim ve Teknoloji Geliştirme Planı (202520YY01017404) tarafından desteklenmiştir.
Çıkar Çatışmaları: Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir. Fon sağlayıcıların çalışmanın tasarımında hiçbir rolü yoktu; verilerin toplanmasında, analiz edilmesinde veya yorumlanmasında; Makalenin yazılmasında veya sonuçların yayınlanması kararında.
Referanslar
1. Kirshner, HS İntraserebral kanamanın tıbbi yönetimi: Temellere dönüş. Uluslararası J. Clin. Pratik yapın. 2008, 62, 521–522.[CrossRef] [PubMed]
2.Anderson, CS; Heeley, E.; Huang, Y.; Wang, J.; Stapf, C.; Delcourt, C.; Lindley, R.; Robinson, T.; Lavados, P.; Neal, B.; ve ark. Akut intraserebral kanamalı hastalarda hızlı kan basıncının düşürülmesi. N. İngilizce J. Med. 2013, 368, 2355–2365. [CrossRef][PubMed]
3. Kureyşi, AI; Mendelow, AD; Hanley, DF İntraserebral kanama. Lancet (Lond. Engl.) 2009, 373, 1632–1644. [ÇaprazRef]
4. RF'yi koruyun; Hua, Y.; Xi, G. İntraserebral kanama: Yaralanma mekanizmaları ve terapötik hedefler. Lancet Neurol. 2012, 11,720–731. [ÇaprazRef]
5. Schrag, M.; Kirshner, H. İntraserebral Kanamanın Yönetimi: JACC Odak Semineri. J. Am. Col. Cardiol. 2020, 75, 1819–1831.[CrossRef] [PubMed]
6. Kandasamy, R.; İdris, Z.; Abdullah, JM İntraserebral Kanama Cerrahisi. Nörovasküler Cerrahide Nörovasküler Hastalıklara Cerrahi Yaklaşımlar; July, J., Wahjoepramono, EJ, Eds.; Springer: Singapur, 2019; s. 201–210.7. Broughton,
7. Broughton, BR; Reutens, DC; Sobey, CG Serebral iskemi sonrası apoptotik mekanizmalar. İnme 2009, 40, e331–e339. [CrossRef][PubMed]
8. Kristiansen, M.; Graversen, JH; Jacobsen, C.; Sonne, O.; Hoffman, HJ; Hukuk, SK; Moestrup, SK Hemoglobin temizleyici reseptörünün tanımlanması. Doğa 2001, 409, 198–201. [ÇaprazRef]
9. Madangarli, N.; Bonsack, F.; Dasari, R.; Sukumari-Ramesh, S. İntraserebral Kanama: Kan Bileşenleri ve Nörotoksisite.Brain Sci. 2019, 9, 316. [CrossRef]
10. Deiner, MS; Kennedy, TE; Fazeli, A.; Serafini, T.; Tessier-Lavigne, M.; Sretavan, DW Netrin-1 ve DCC, optik diskte yerel olarak akson rehberliğine aracılık eder: İşlev kaybı, optik sinir hipoplazisine yol açar. Nöron 1997, 19, 575–589. [ÇaprazRef]
11.Kennedy, TE; Serafini, T.; de la Torre, JR; Tessier-Lavigne, M. Netrinler, embriyonik omurilikteki komissural aksonlar için yayılabilir kemotropik faktörlerdir. Hücre 1994, 78, 425–435. [ÇaprazRef]
12. Flores, C. Mezokortikolimbik dopamin sisteminin organizasyonu ve işlevinde netrin-1'in rolü. J. Psikiyatri Neurosci. Jpn.2011, 36, 296–310. [ÇaprazRef]
For more information:1950477648nn@gmail.com
