Telomerik Protein TRF2'nin İfade Düzenleyicileri İçin Yeni Bir Ekran, TRF2'ye Bağımlı İmmünosupresyonu ve Tümör Büyümesini Bozan Küçük Molekülleri Tanımladı

Lütfen iletişime geçinoscar.xiao@wecistanche.comdaha fazla bilgi için

Basit Özet:Telomerik protein TRF2 (Telomerik tekrar bağlama faktörü 2), insan kanserlerinde yukarı doğru düzenlenir ve kötü prognoz ile ilişkilidir. TRF2 onkojenik özellikleri, içsel telomer koruyucu rolüne ve ayrıca immünosupresif ve anjiyojenik aktiviteler yoluyla hücre dışı etkilere dayanır. Bu nedenle, TRF2'yi hedeflemek, umut verici bir terapötik anti-kanser stratejisi olarak görünmektedir. Bu çalışmada, TRF2 pro-onkojenik özelliklerini in vivo olarak körelten iki bileşiği tanımlamamıza izin veren TRF2 inhibitörlerini taramak için hücre bazlı bir yöntem geliştirdik.

Özet: Telomerik tekrar bağlama faktörü 2 (TRIF2), telomerleri istenmeyen DNA hasar tepkisi (DDR) aktivasyonuna bağlayan ve bunlardan koruyan sığınak protein kompleksinin bir alt birimidir. TRF2 ekspresyonu, hücresel yaşlanma sırasında aşağı regüle edilerek ve onkogenez sırasında aşırı eksprese edilerek yaşlanma ve kanserde çok önemli bir rol oynar. TRF2'yi aşırı eksprese eden kanserler genellikle kötü bir prognoz sergiler. Kanser hücrelerinde, TRF2, telomer koruması ve hücre dışı otonom roller de dahil olmak üzere, neo-anjiyogenezi ve immünosupresyonu teşvik eden birçok işlevi yerine getirir.püriten c vitaminiBurada, TRF2 ekspresyonunu azaltan veya artıran küçük moleküllerin tanımlanmasını sağlayan orijinal bir tarama stratejisi sunuyoruz. Gıda ve İlaç Kurumu (FDA) onaylı ilaçların küçük bir kitaplığını tarayarak, bir farede TRF2 ekspresyonunu aşağı regüle ederek tümör büyümesini, neo-anjiyogenezi ve immünosupresyonu bozan iki molekül (AR-A014418ve alexidin-2HCl) belirledik. ksenograft modeli. Bu sonuçlar, agresif insan tümörlerini tedavi etmek için TRF2 ekspresyonunu aşağı regüle eden kemoterapötik stratejiyi destekler ve TRF2 ekspresyon seviyelerini modüle ederek potansiyel anti-kanser ve anti-aging molekülleri için tarama yapabilen bu hücre bazlı testi doğrular.

Anahtar Kelimeler:TRF2; kanser; yaşlanma; hücre bazlı tarama deneyi; neo-anjiyogenez; bağışıklık bastırma

Daha fazla bilgi için lütfen buraya tıklayın

1. Giriş

Telomerler, telomeraz, sığınak protein kompleksleri ve kodlamayan telomerik tekrar içeren RNA gibi telomer ile ilişkili faktörler tarafından düzenlenen lineer kromozomların uçlarında bulunan özel nükleoprotein yapılarıdır [1]. Uygun şekilde düzenlendiğinde, telomerler kromozomları kararsızlığa ve yaşlanmaya karşı korur. Telomerik DNA kısalması, programlanmış fizyolojik gelişim ve yaşlanmanın bir parçası olarak ortaya çıkar [2]. Bununla birlikte, aşırı telomer DNA kısalması, diskeratoz konjenita gibi nadir görülen progeroid sendromları tetikler [3]. Ayrıca, düzensiz telomer durumları, neredeyse tüm kanser türleri ve çeşitli dejeneratif hastalıklar dahil olmak üzere genel popülasyonda yaygın olan çok sayıda hastalıkta rol oynar [4]. Bu nedenle, spesifik telomer bileşenlerini hedef alan farmakolojik tedaviler geliştirmek, bu tür hastalıkları önlemek ve tedavi etmek için umut vericidir.

Telomer ve kanser söz konusu olduğunda, hayati DNA hasar yanıtı (DDR) kontrol noktaları bazen başarısız olur; bu, aşırı telomerik DNA kısalmasına ve anormal kromozom yeniden düzenlemelerine yol açabilir ve bu da onkogeneze katkıda bulunabilir. Ayrıca, telomerazın yukarı regülasyonu, kanser hücrelerine sınırsız büyüme sağlayabildiği için tüm kanserlerin yaklaşık yüzde 90'ının gelişiminde kilit bir olaydır [5]. Bu nedenle telomeraz inhibisyonu, kanser tedavilerini geliştirmeye yönelik birçok çalışmanın hedefi olmuştur [6]. Son zamanlardaki ilerlemeye rağmen, anti-telomeraz ilaçlarının klinik kullanımında bazı sınırlamalar vardır. Örneğin, kanser hücresi proliferasyonunu durdurmak için kritik derecede kısa bir telomerik DNA uzunluğuna ulaşılmalıdır ve kısaltılmış telomerlerin anti-onkojenik etkileri, p53 tümör baskılayıcı genin yokluğunda kaybolur [7,8]. Bu gecikme süresi, hücre yenilenmesini sınırlayarak ve alternatif rekombinasyona dayalı telomer uzama mekanizmalarının aktivasyonunu destekleyerek terapötik etkinliği azaltır ve yaşlanmayı geciktiren yan etkileri artırır [9,10].sistancheBu nedenle, anti-telomeraz stratejileri, halihazırda kritik derecede kısa telomerleri barındıran kanser hücrelerini hedeflemek için daha uygun olabilir [11].

Telomerazın yanı sıra, sığınak kompleksi alt birimlerinin (TRF1,TRF2,RAP1,TIN2,TPP1 ve POT1) ekspresyonundaki ve aktivitelerindeki değişiklikler, tümör oluşumunda ve bazı durumlarda telomer uzunluğundan bağımsız olarak [12-16] yer alır. Bu nedenle, kanser tedavisi için sığınağı hedeflemek, anti-telomeraz müdahalelerine ilginç bir alternatif olabilir. Shel-terin alt birimi TRF2, ilginç bir adayı temsil eder; TRF2, hem kanserde hem de vasküler hücrelerde çeşitli insan malignitelerinde aşırı eksprese edilir ve bu tipik olarak kötü bir prognoz ile ilişkilidir [17-20]. Özellikle, TRF2 aşırı ekspresyonu, hücre dışı tümör oluşumunu otonom olarak destekleyebilir, bu da immünosupresyona ve neo-anjiyogeneze yol açar[13,18-20]Özellikle, TRF2 upregülasyonu, güçlü bir immünosupresif mikro-ortam oluşturur. TRF2, heparan sülfat proteoglikanlarının ekspresyonunu değiştirerek, TLR2 yolu yoluyla miyeloid türevli baskılayıcı hücreleri (MDSC'ler) doğrudan toplar ve aktive eder [21]. Kanser hücrelerinde TRF2 aşırı ekspresyonu, HSPG sentezinin düzenlenmesi yoluyla tümör mikroçevresinde NK hücresi alımını güçlü bir şekilde inhibe ederken[13], TRF2'nin aşırı ekspresyonu tarafından indüklenen MDSC'nin TLR2 aktivasyonu, güçlü bir azalma ile NK hücresi immüno-gözetiminin güçlü bir inhibisyonuna yol açar. NK hücrelerinin degranülasyonu, IFNgamma üretimi ve öldürülmesi [21].cistanche nedirBu nedenle, TRF2 aşırı ekspresyonu, NK hücrelerinin alımını doğrudan inhibe ederek ve MDSC'ye bağlı bir immünosupresif mikro ortamın şekillendirilmesi yoluyla NK hücrelerinin işlevselliğini dolaylı olarak inhibe ederek anti-tümör immüno-gözetiminin erken aşamasını güçlü bir şekilde köreltir. Sonuç olarak, kanserlerde TRF2'yi hedeflemek, yaşlanmayı teşvik etmenin yanı sıra neo-anjiyogenez ve bağışıklık kaçışını bozarak hücre otonom ve hücre otonom olmayan süreçler yoluyla değerli bir çoklu vuruş stratejisi olabilir.

cistanche yaşlanma karşıtı olabilir

Bugüne kadar, TRF2'yi hedef alan tüm tanımlanmış küçük bileşikler, kromozom uçlarını DDR'den koruma yeteneğini bozar ve bu nedenle potansiyel yaşlanma yan etkileri [22]. Önceki çalışmamız, TRF2 ekspresyonunun kısmi bir azalmasının, DDR'yi indüklemeden, hücre-otonom olmayan etkiler yoluyla fare modellerinde tümörijenisiteyi tersine çevirebileceğini göstermiştir [13]. Bu nedenle, aşırı ekspresyonundan kaynaklanan kanserlerde aşırı TRF2'yi azaltmaya odaklanmanın, yaşlanmayı geciktiren yan etkiler olmadan kanseri tedavi etmek için ilginç bir strateji olabileceğini düşündük. Bu çalışmada, TRF2 stabilitesini hedefleyen küçük bileşikleri tanımlamak için orijinal bir tarama platformu sunuyoruz. İki üst vuruşun, TRF2 aşırı ekspresyonunun tümörijenik aktivitesini inhibe ettiğini gösterdik. Bu çalışma, TRF2 ekspresyonunun farmakolojik olarak modüle edilebileceğini ve tarama testimizin, potansiyel antikanser ve yaşlanma karşıtı özelliklere sahip TRF2 ekspresyon seviyelerini modüle edebilen ilaçların seçimi için güvenilir bir yöntem olduğunu göstermiştir.

2. Malzemeler ve Yöntemler 2.1.Hücreler

İnsan embriyonik böbrek (HEK)293-T hücreleri(ATCC CRL-1573) ve BJ-HELTRAs hücreleri[13], Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) (Lonza, Levallois Perret, Fransa) ile takviye edilmiş olarak büyütüldü. Yüzde 10 fetal buzağı serumu (FCS),100 IU/mL penisilin ve 100ug/mL streptomisin（Invitrogen,Cergy Pontoise,Fransa）.

2.2.SDS-PAGE ve Western Blotlama

Toplam hücre lizatları hazırlandı, elektroforez ile ayrıldı ve daha önce tarif edildiği gibi lekelendi [14]. Kısaca, hücreler toplandı ve lizis tamponunda (8.76 g/L NaCl 10 mM Tris-HCL pH7.2,0%0.1 SDS,0%0.1 Triton X) lize edildi. -100,10 g/L sodyum deoksikolat, 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA),1{{50}} ug/mL leupeptin,1 mM AEBSF ve 19 ug/mL aprotinin). Numuneler daha sonra BCA protein tahlil kiti (Interchim, Monlucon, Fransa) kullanılarak titre edildi. Örnekler (60 ug/şerit), yükleme tamponunda (500 mM Tris-HCl, 100 mM DTI, yüzde 2 SDS, yüzde 0.1 bromofenol mavisi, yüzde 10 gliserol pH 6.8) 95 derecede 5 dakika ısıtıldı. Daha sonra numuneler yüzde 10 poliakrilamid jellere yüklendi ve 45 dakika 160 V'ta çalıştırıldı. Proteinler daha sonra Trans-Blot SD Yarı Kuru Elektroforetik Transfer Hücresi (Bio-Blot) kullanılarak Immobilon-FL membranlarına (Millipore, Upstate New York, ABD) aktarıldı. Rad, Hercules, CA, ABD). Zarlar, bir primer antikor karışımıyla (mouselgGl anti-TRF2, 1'de seyreltilmiş) 4 derecede gece boyunca inkübasyondan önce Intercept Blocking buffer (LI COR, Lincoln, NE, ABD) içinde 1 saat süreyle bloke edildi: 250; ve tavşan IgGanti-Beta-aktin, yüzde 0,5 Tween20 içeren Intercept Blocking tamponunda 1:10'da seyreltildi,000). PBS yüzde 0.1 Tween20'de yıkandıktan sonra, membranlar, ikincil antikorların bir karışımı ile yüzde 0.25 Tween20 içeren Intercept blokaj tamponunda oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildi: anti-TRF2 antikoru için keçi-anti-fare IRDye 680 ve keçi anti-tavşan IRDye Anti-Beta-aktin antikoru için 800CW (1:15,000 seyreltme).Yaşlanma karşıtı cistancheKullanılan birincil ve IRDye ikincil antikorları, aşağıda antikor tablosunda listelenmiştir(Tablo 1). Son olarak, protein bantları LiCor Odyssey 9120 görüntüleme sistemi (LI-COR) kullanılarak görselleştirildi. TRF2 ekspresyonu, TRF2 bant yoğunluğunun aktin bandının ve arka planın yoğunluklarına normalleştirilmesiyle ölçüldü.

2.3.Klonlama Stratejisi

İnsan TRF2 cDNA dizisi, bir HIV-SFFV-GFP-WPRE türevi olan bir lentiviral SFFV-GPR plazmidinin BamHI/BclI kısıtlama bölgeleri arasında klonlandı [23]. SFFV-GPR plazmidi, yeşil floresan protein (GFP), bir puromisin direnç proteini ve Etiket-kırmızı floresan proteini (RFP)-T (S158T mutasyona uğramış Etiket) için cDNA dizilerini içeren bir GPR polisistronik genini kontrol eden bir dalak odağı oluşturan virüs (SFV) promotörünü içerir. -RFP), her biri E2 ve T2 Picornaviridae dizileriyle ayrılmış. hTRF2 cDNA, bir RFP-TRF2 füzyon proteininin ekspresyonunu sağlamak için RFP-T'nin C-terminal bölgesine yerleştirildi.

2.4.Lentivirüs Üretimi

Lentivirüs üretimi için, 5 x 10* HEK 293-T hücreleri, 8.6 ug boş SFFV-GPR veya RFP-TRF2-SFFV-GPR vektörü, 8.6 ug Lenti ifade eden ile transfekte edildi. - Kalsiyum fosfat aracılı transfeksiyon yoluyla delta 8.91 ve 2.8 ug VSV-g. Transfekte edilmiş hücreler, 10-cm tabaklarda yüzde 5 CO2 ile 37 derecede yüzde 10 FCS ile desteklenmiş DMEM içinde kültürlendi. Yeni oluşturulan virüsleri içeren süpernatanlar 48 saat sonra toplandı, ardından 0.45-um Millipore filtresinden geçirildi. Virüs titrasyonundan sonra, TRF2 kusurlarına direnci için seçilen BJ-HELTRAs hücre hattını enfekte etmek için 1∶1 （virüs∶hücre） oranı kullanıldı[13].cistanche faydalarıGFP ve kaynaşmış RFP-TRF2 proteinini orta düzeylerde eksprese eden bir klon daha sonra floresanla aktive olan hücre sınıflandırması (FACS) ile izole edildi.

2.5.Akış Sitometrisi Taraması

SFFV-GPR vektörünü içeren ve RFP-TRF2 füzyon proteinini eksprese eden BJ-HELTRAs klonal çizgi hücreleri, yüzde 10 FCS ve yüzde 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş DMEM ortamında 96-kuyu plakalarında kültürlendi. 24 saatlik ilaç tedavisinden sonra, hücreler daha sonra tripsinize edildi ve 0.5 mM EDTA ve yüzde 2 FCS içeren fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yıkandı, ardından yüzde 0,5 formaldehit (FA) ile sabitlendi. Sabitlenmiş hücreler daha sonra tabi tutuldu. FacsCalibur yüksek verimli örnekleyici (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, ABD) kullanarak sitometri akışı yapmak için.

2.6.Gerçek Zamanlı Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-qPCR)

Toplam RNA, RNeasy Mini Kit (Qiagen, Venlo, Hollanda) kullanılarak izole edildi. Ters transkripsiyon, 1 ug toplam RNA ile Superscript II ters transkriptaz (Invitrogen) kullanılarak yapıldı. Her genin ifadesi, GAPDH'ninkine normalleştirildi. Aşağıdaki primerler kullanıldı: hTRF2 Fw 5'-GCTGCCTGACTIGAACAGT-3';hTRF2 Rv 5'-CCGTTCTCAACCAACCCCTC-3';hGAPDHFw5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'hGAPDH Rv 5'ACC-GTCCCCA{ATA 14}}. 2.7.AlamarMavi

96-Kuyucuklu düz tabanlı bir plakada, oyuk başına 5 x 103 hücre, yüzde 10 FCS ile desteklenmiş 200 uL DMEM'de tohumlandı. İlaç tedavisinden 24 saat sonra, 10 uL AlamarBlue (Bio-Rad) ilave edildi ve bir Spectrostar Nano plaka okuyucusunda (BMGLabtech, Ortenberg, Almanya) 36 saat boyunca 570 nm ve 600 nm'de absorbans ölçüldü. AlamarBlue'nun oksidasyon-azaltma yüzdesi, üretici tarafından tarif edildiği gibi belirlendi.

2.8.Hayvanlar

Deneyler, Janvier Labs'den (Fransa) 8- ila 12-haftalık NMRI çıplak dişi fareler üzerinde yapıldı. Tüm fare deneyleri yerel ve uluslararası kurumsal yönergelere göre yapıldı ve IRCAN Hayvan Bakım Komitesi ve bölgesel (CIEPAL Cote d'Azur #187 ve #188) ve ulusal (Fransa Araştırma Bakanlığı #03482.01/02482.2) tarafından onaylandı. ve #02973.01/02973.2)yetkililer.

2.9.Tümör Büyüme Deneyleri

Her bir NMRI çıplak fareye, grup başına 100 uL PBS n=8 faresi içinde süspanse edilmiş 1 x 106 BJ-HELTRAs hücresi ile arkadan deri altından enjekte edildi）. Fareler 16, 18, 20 ve 22. günlerde 100 uL DMSO (yüzde 45), aleksidin-2HCl (1 mg/kg) veya AR-A014418(5 mg/kg) intraperitoneal enjeksiyonlarla tedavi edildi. daha sonra 26. güne kadar takip edildi. Tümör görünümü her gün palpasyonla değerlendirildi. Tümör boyutu, bir kumpas kullanılarak her 2-3 günde bir ölçülmüştür. Tümör hacmi daha sonra hemi-elipsoid formülü kullanılarak belirlendi: π×(L×1×h)/6, burada L sırasıyla tümörün uzunluğuna, I genişliğine ve h yüksekliğine karşılık gelir.

2.10.Matrigel Plug Testleri

BJ-HELTRAs hücreleri, 2 gün boyunca DMSO (yüzde 1), alexidin-2HCl (1 uM) veya AR-A014418 （10 uM） ile işlendi. Daha sonra, 400 uL büyüme faktörü azaltılmış Matrigel (Corning, New York, ABD) ile birlikte PBS içinde süspanse edilen 100 uL 1 x 106 derece muamele edilmiş hücreler, izofluran anestezisi altında NMRI çıplak farelerin arkasına deri altından aşılandı. Aşılamadan sonraki 5. günde, Matrigel tıkaçları hasat edildi ve infiltre edici hücreler, dispase (Corning), kollajenaz A (Roche, Bale, İsviçre) ve DNAseI (Roche) sindirimi yoluyla 30 dakika boyunca 37 derecede [13] enzimatik ayrışma yoluyla toplandı. ]. Hücreler, 4 derecede 30 dakika boyunca birleştirilmiş antikorlarla boyamadan önce Fe-Blok anti-CD16/CD32 antikorları (klon 2.4G2) ile buz üzerinde 15 dakika boyunca doyuruldu. Kullanılan konjuge antikorlar, antikor tablosunda listelenmiştir. Hücreler, 0.5 mM EDTA, yüzde 2 FCS ile PBS içinde yıkandı ve yüzde 0.5 FA ile sabitlendi. Lekeli hücreler, DIVA6 yazılımı (BD Biosciences) ve FlowJo 10(LLC) ile bir ARIA III sitometresi kullanılarak analiz edildi.

2.11.İstatistikler

Tüm grafikler ve istatistiksel analizler, GraphPad Prism yazılımı (San Diego, CA, ABD) kullanılarak üretilmiştir. Tüm sonuçlar, ortalama ± standart sapma (sd) veya ortalamanın ortalama ± standart hatası (SEM) olarak temsil edilir. Ortalamalar arasındaki önemli farklılıklar Mann-Whitney iki kuyruklu testi kullanılarak belirlendi. Tümör alımını belirlemek için log-rank (Mantel-Cox) testi kullanıldı. Her test için, p<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Sonuçlar

3.1.TRF2 İnhibitör Moleküllerinin Tanımlanması

TRF2 protein seviyelerini modüle edebilen ilaçları taramak için, GFP genini ve TRF2'nin N-terminaline kaynaşmış RFP'yi birlikte kopyalamak için bir lentiviral sistem kullandık. Başka bir yerde açıklanan genel bir stratejiyi takiben [23], SFFV promotörünün GFP'yi, bir puromisin direnç proteinini ve yalnızca kontrol olarak RFP-TRF2 veya RFP'yi kodlayan bir poli-sistronik genin ekspresyonunu kontrol ettiği bir GRT lentivirüsü oluşturduk (Şekil 1 A). Sonuç olarak, dönüştürülmüş tüm hücreler hem GFP hem de RFP-TRF2'yi ifade etti. Bu sistem, akış sitometrisi kullanılarak RFP yoğunluğunu ölçerek TRF2 ekspresyonunu modüle eden ilaçları tanımlamak için tasarlanmıştır, GFP yoğunluğu ise raportör yapısının transkripsiyonu için dahili bir kontrol görevi görür.

GRT lentivirüslerini, SV40 ve hTERT tarafından ölümsüzleştirilen ve Ras v12 [13] tarafından onkojenik hale getirilen insan BJ-HELTRAs fibroblastlarına dönüştürdük. TRF2'nin hem yukarı hem de aşağı regülasyonunun ölçümlerini kolaylaştırmak için, hem GFP hem de RFP-TRF2 proteinlerini orta derecede eksprese eden puromisin dirençli bir klon, FACS sıralama kullanılarak izole edildi ve GRI-BJ-HELTRAs olarak adlandırıldı (Şekil 1A). Pozitif bir kontrol olarak, GRT-BJ-HELTRAs hücrelerini, daha önce tarif edilen bir TRF2 stabilite modülatörü [24] olan 10 uM gemsitabin ile 24 saat tedavi ettik. Boş vektör ile transdüksiyona tabi tutulan hücrelerde hiçbir RFP modülasyonu saptanmazken, DMSO ile muamele edilmiş kontrole kıyasla gemsitabin ile muamele edilmiş GRT-BJ-HELTRAs hücrelerinde RFP/GFP ortalama floresan yoğunluğu (MFI) oranında önemli bir azalma gözlemlendi (yüzde 82). kontrolün; p<0.0001)(figure 1b).moreover,="" gemcitabine="" specifically="" diminished="" rfp-trf2="" protein="" levels="" without="" affecting="" gfp="" levels="" (figure="" s1a).="" of="" note,="" we="" observed="" here="" that="" gemcitabine="" is="" reducing="" trf2="" level="" in="" contrast="" to="" the="" published="" work[24],="" a="" difference="" that="" may="" be="" explained="" by="" cell="" type="" differences="" in="" the="" dna="" damage="" response="" induced="" by="" gemcitabine="" since="" trf2="" stability="" can="" be="" altered="" in="" a="" p53-dependent="" manner="" [25].="" this="" effect="" was="" further="" confirmed="" by="" western="" blotting="" analyses="" where="" we="" observed="" that="" endogenous="" trf2="" levels="" were="" affected="" by="" gemcitabine="" treatment="" on="" untrans-duced="" bj-heltras="" cells="" (figure="" s1b).therefore,="" grt-bj-heltras="" cells="" enabled="" detection="" of="" specific="" variations="" in="" trf2="" protein="" levels="" induced="" by="" drug="" treatment.="" or="" gemcitabine="" (right="" panel)(n=""><0.001;two-tailed student'st="" test).="" (c)representative="" rfp/gfp="" flow="" cytometry="" plots="" of="" trf2="" vector-transduced="" bj-heltras="" cells="" treated="" with="" 10="" um="" of="" alexidine-2hcl,="" ar-a014418="" or="" dmso="" (left="" panel).="" box-plot="" quantification="" of="" rfp-trf2="" fusion="" (trf2="" vector)="" proftein="" levels="" following="" treatment="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418(right="" panel)(n=""><0.05;mann-whitney test).(d)representative="" western="" blotting="" showing="" reduced="" trf2="" protein="" levels="" following="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" in="" untransduced="" bj-heltras="" cells="" (left="" panel;="" full="" western="" lolotting="" image="" is="" presented="" in="" figure="" s2a).="" quantification="" of="" trf2="" protein="" levels="" after="" treatment="" with="" 10="" μm="" alexidine-2hccl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" （right="" panel)(n="2;mean" +="" standard="" error="" of="" the="" mean).(e)quarntification="" of="" trf2="" mrna="" levels="" analyzed="" by="" rt-qpcr="" after="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="">

Akış sitometrisini kullanarak, daha sonra altı ana biyolojik süreç kategorisini hedefleyebilen 396 Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) onaylı farmakolojik bileşiği taradık: iyon kanalları, fosfatazlar, kinazlar, epigenetik faktörler, nükleer reseptör ligandları ve Wnt yolu (Şekil S1C). ).GRT-BJ-HELTRAs hücreleri ilk olarak akış sitometrisi analizinden önce 24 saat boyunca 396 bileşiğin her birinden 10 uM veya DMSO ile işlendi (Şekil S1D). Bu durumda, 84 bileşiğin TRF2 protein seviyelerini modüle ettiği bulundu (Şekil S1D, sağ panel; Tablo S1) ve ikincil bir ekran için kullanıldı (Şekil S1E;Tablo S1). Bu ikincil ekranda, GRT-BJ-HELTRAs hücrelerinin 10 uM seçilen bileşiklerle işlenmesine ek olarak, dönüştürülmemiş BJ-HELTRAs hücreleri veya boş bir vektörle dönüştürülmüş BJ-HELTRAs hücreleri, kırmızı yayan yanlış pozitifleri atmak için benzer şekilde tedavi edildi. veya yeşil otofloresan veya RFP veya GFP proteinlerini etkileyen. Daha sonra en iyi 18 bileşik, Western blot analizine dayalı olarak dönüştürülmemiş BJ-HELTRAs hücrelerinde endojen TRF2 ekspresyonunu modüle etme yeteneklerini belirlemek için seçildi (Şekil S2A,B Tablo S1). Vuruşları, TRF2 dozajının en az yüzde 20'sini (yukarı veya aşağı) modüle eden bileşikler olarak tanımladık. Bu kriterleri kullanarak, Western blot ile değerlendirilen 18 ilaçtan 9'u azalmış ve biri artmış endojen TRF2 protein seviyeleri (Şekil S2A, Tablo S1) Daha sonra, in vivo deneyler için bu ilaçlar arasından iki bileşik seçmeye karar verdik. TRF2 aşırı ekspresyonunun pro-onkojenik etkilerine karşı koymak. Tümörojenik olmayan hücrelerde DDR aktivasyonunu ve yan etkileri önlemek için, TRF2 dozajını ne en yüksek ne de en düşük seviyelere düşürmeyen bileşikler seçtik. Bunlar arasında AR ve AD bu kriterlere karşılık geliyordu. Her iki bileşik de akış sitometrisi (Şekil 1C), Western blot analizi ile gösterildiği gibi endojen TRF2 protein seviyeleri (Şekil 1D; Şekil S2A,B) ve RT ile belirlenen TERF2 mRNA seviyeleri ile analiz edildiği gibi GRT-BJ-HELTRAs hücrelerinde RFP-TRF2'yi aşağı regüle etmiştir. -qPCR (Şekil 1E). Ayrıca, AR ve AD'nin ilgili LD50 konsantrasyonları ile tedavi, hem BJ-HELTRAs hücrelerinde hem de TRF2-aşırı ifade eden BJ-HELTRAs hücrelerinde TERF2 mRNA ifadesini azalttı (Şekil S3A-C).

3.2.AR-A014418 ve Aleksidin-2HCl, Yüksek TRF2 İfade Düzeylerinin Sağladığı Tümörijenisiteyi Tersine Çevirdi

Daha sonra AR ve AD'nin tümör büyümesi üzerindeki etkisini değerlendirdik. TRF2-aşırı eksprese eden kanserleri hedefleme yeteneklerini kontrol etmek için, AR ve AD'nin hem standart BJ-HELTRAs hücreleri hem de TRF2-aşırı eksprese eden BJ-HELTRAs hücreleri üzerindeki potansiyel anti-tümörojenik etkilerini analiz ettik. BJ-HELTRAs hücreleri, TRF2lentiviral vektör veya boş vektör ile transdükte edildi, ardından çıplak farelere deri altından enjekte edildi. Fareler daha sonra enjeksiyondan sonraki 16,18,20 ve 22. günlerde DMSO,1 mg/kg AD veya 5 mg/kg AR ile tedavi edildi [26,27](Şekil 2A). Daha önce bildirildiği gibi [13,21], TRF2 aşırı ekspresyonu tümör ini'yi destekledi. in vivo büyüme ve büyüme (Şekil 2B-D;p<0.05). treatment="" with="" neither="" ar="" nor="" ad="" impacted="" tumor="" volume="" in="" bj-heltras="" cells="" transduced="" with="" the="" empty="" vector="" (figure="" 2e,="" upper="" panels)="" neither="" tumor="" growth="" rate(figure="" 2f-h).="" by="" contrast,="" both="" drugs="" induced="" a="" significant="" decrease="" in="" the="" tumor="" volume="" of="" trf2-overexpressing="" xenografted="" tumors,="" leading="" to="" significantly="" smaller="" tumor="" sizes="" at="" day="" 26="" (figure="" 2e,middle=""><001)but also="" of="" the="" tumor="" growth="" rate="" (figure="" 2f-h)="" at="" each="" time-point.="" furthermore,="" the="" vol-ume="" and="" growth="" rates="" of="" trf2-overexpressing="" tumors="" treated="" by="" the="" two="" drugs="" returned="" to="" levels="" similar="" to="" those="" of="" the="" control="" tumors,="" thus="" demonstrating="" the="" trf2-specific="" selectivity="" of="" ar="" and="" ad="" (figure="" 2e,lower="" panels).these="" results="" show="" that="" ar="" and="" ad="" treatment="" reversed="" specifically="" the="" tumorigenicity="" conferred="" by="" trf2="" overexpression.="" or）="" were="" injected="" subcutaneously（1×10°cells/100μl）into="" nmri="" nude="" mice.="" the="" mice="" were="" then="" treated="" with="" dmso,alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)="" or="" ar-a014418(5="" mg/kg)="" at="" days16,18,20="" and="" 22="" post-injection,="" then="" followed="" up="" until="" day="" 26="" (n="8" mice="" per="" group).(b-d)="" the="" percentage="" of="" tumor-free="" mice="" (b)="" and="" tumor="" volumes(c)="" were="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" in="" mice="" injected="" with="" bj-heltras="" cells="" overexpressing="" trf2(trf2="" vector)="" or="" empty="" vector.="" tumor="" take="" based="" on="" palpability="" was="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" and="" is="" represented="" as="" a="" percentage="" of="" tumor-free="" mice.p="" values="" were="" determined="" using="" the="" log-rank="" mantel-cox="" test(*=""><0.05). tumor="" volumes="" were="" assessed="" at="" different="" time-points="" (mean="" ±="" standard="" deviation);="" tumor="" volume="" at="" d.ay="" 15="" is="" represented="" in="" (d).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><0.001). (e)="" tumor="" volumes="" were="" followed="" as="" in="" (c)="" after="" repetitive="" treatments="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg),="" or="" ar-a014418(5mg/kg).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><0.0001;ns: not="" significant).(f-h)="" tumor="" growth="" rate="" of="" ar-a014418(5mg/kg)treated="" mice(f,h)="" or="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)(g,h)="" treated="" mice="" were="" determined="" by="" considering="" the="" last="" day="" before="" treatment="" for="" empty="" vector="" or="" trf2="" vector="" as="" 100%.="" variations="" of="" the="" growth="" rate="" in="" both="" treatments="" over="" the="" time="" are="" represented="" in="" (f,g)="" and="" for="" each="" time-point="" (h).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><>

3.3.AR-A014418 ve Alexidin-2HCI ile Etkilenen TRF2-Bağımlı İmmünosupresyon ve Neo-Anjiyogenez

AR ve AD'nin antitümör etkilerinin TRF2'nin hücre dışı otonom onkojenik özelliklerini hedefleyip hedefleyemediğini belirlemek için, tedavi edilen tümörlerde immün hücre infiltrasyonu ve aktivasyonunun yanı sıra anjiyogenezi inceledik. Çıplak farelere Matrigel ile deri altı enjeksiyonlarından önce standart ve TRF2-aşırı eksprese eden BJ-HELTRAs hücrelerini (Şekil S3A) 1 uM AD, 10 uM AR veya DMSO ile 48 saat tedavi ettik. Matrigel tıkaçları daha sonra akış sitometrisi ile tümör mikro ortamını analiz etmek için enjeksiyondan 5 gün sonra toplandı (Şekil 3A). Beklendiği gibi [13,21], TRF2 aşırı ekspresyonu, global immün hücre (CD45 artı hücre) infiltrasyonunu değiştirmedi (Şekil 3B; Şekil S4A), ancak doğal öldürücü (NK) hücre alımını (Şekil 3C; Şekil S4B) ve NK işlevini engelledi -alite (Şekil 3C-E; Şekil S4C) ve MDSC sızmasını artırın (Şekil 3F). Spesifik olarak TRF2-aşırı eksprese eden BJ-HELTRAs hücrelerinde, herhangi bir ilaçla tedavi, global immün infiltrasyonu (Şekil 3B; Şekil S4A) ve ayrıca tümör içi NK hücrelerinin miktarını ve işlevselliğini (Şekil 3C-E; Şekil 3C-E; Şekil S4A) arttırdı. S4B,C). Özellikle, her iki ilaç da TRF2 aşırı ekspresyonu tarafından indüklenen NK hücre aracılı immün sürveyansın (CD107a artı ve CD69 artı NK hücresi) inhibisyonunu tamamen kurtardı (Şekil 3C). Bu, MDSC alımında dramatik bir düşüşle (Şekil 3F; Şekil S4D) ve monosit ve makrofaj alımının artmasıyla (Şekil 3G) ilişkilendirildi.

Daha önce bildirildiği gibi [14,20], tümör anjiyogenezi, kontrol tümörlerine kıyasla TRF2-aşırı eksprese eden tümörlerde daha yüksekti. TRF2 aşırı ekspresyonu, tümör yatağı içindeki CD31 artı CD45-endotel hücrelerinin miktarını arttırırken (Şekil 3H; Şekil S4E), her iki ilaçla tedaviden sonra boş vektör veya TRF2-aşırı eksprese eden tümörler arasında hiçbir fark tespit edilmedi. TRF2（TRF2 vektörü） veya boş vektör, NMRI çıplak farelere Matrigel (1 x 10 derece hücre) ile subkutan enjeksiyondan 2 gün önce 1uM alexidin-2HCl veya 10 μM AR-A014418 veya DMSO ile tedavi edildi( n=8). Bağışıklık ve endotelyal hücre infiltrasyonu, enjeksiyondan 5 gün sonra akış sitometrisi ile değerlendirildi. (BH). Matrigel tıkacının bağışıklık sızıntısının akış sitometrisi analizi. Canlı hücreler arasında Matrigel tıkaçlarına sızan bağışıklık hücrelerinin sayıları gösterilmiştir. Toplam immün hücre infiltrasyonu (CD45 artı hücreler) (B)'de gösterilir; doğal öldürücü (NK) hücre (NKp46 artı hücreler) infiltrasyonu (C)'de gösterilir; aktive edilmiş NK hücresi (CD107a artı ve CD69 artı NK hücreleri) infıltrasyonu (D,E)'de gösterilmektedir; miyeloid türevli baskılayıcı hücre (MDSC; CD11b artı GR1 artı ))infiltrasyonu (F)'de gösterilmiştir; monosit-makrofaj infiltrasyonu (G)'de gösterilmiştir ve endotelyal hücre infiltrasyonu (H)'de gösterilmiştir.p Değerler Mann- kullanılarak belirlendi. Whitney testi(*p<><><0.001;n =="" 8="" mice="" per="">

4. Tartışma

Burada, telomerik protein TRF2'nin ekspresyonunu modüle eden bileşikleri taramak için hücre bazlı bir tahlilin gelişimini rapor ediyoruz. FDA onaylı moleküllerden oluşan küçük bir kütüphaneyi tarayarak, TRF2 ekspresyon seviyelerini artırabilecek veya azaltabilecek bileşikler belirledik. AD ve AR'nin TRF2'yi aşağı regüle ettiğini ve TRF2'yi aşırı eksprese eden tümör hücrelerine özgü anti-tümörojenik aktivite sergilediğini keşfettik. TRF2-spesifik aktivitelerini daha da gösteren AR ve AD tedavisi, TRF2 aşırı ekspresyonunun sağladığı immünosupresyonu ve neo-anjiyogenezi kurtardı. Çarpıcı bir şekilde, AR veya AD tedavisinden sonra TRF2 aşırı eksprese eden tümörler için global immün infiltrasyonunun artması, bu ilaçların TRF2 aşırı eksprese edildiğinde bağışıklık tepkisini arttırmada daha güçlü olduğunu göstermektedir. Bu ilaçlar, NK hücre işlevselliğini (CD107a ve CD69 artı NK hücreleri) geri yükleyerek TRF2 aşırı ekspresyonunun immünosupresif etkisini inhibe eder ve MDSC infiltrasyonunu güçlü bir şekilde azaltır. Bu, bu ilaçların, bağışıklık kaçışını ve bağışıklık baskılanmasını tetikleyen TRF2-bağımlı spesifik programı körelttiğini ve özellikle TRF2 aşırı eksprese edildiğinde bağışıklık tepkisini artıran Tehlikeyle İlişkili Moleküllerin (DAMP) salınımını artırabileceğini düşündürmektedir. Not olarak, AR ve AD'nin, daha önce DDR'den bağımsız olarak gösterdiğimiz TRF2 aşırı ekspresyonunun iki özelliği olan TRF2 aşırı ekspresyonunun immünosupresif ve pro-anjiyogenik fonksiyonlarını kurtardığını gözlemliyoruz. Bu nedenle, AR ve AD'nin tümör büyümesi üzerindeki etkilerinin DDR'den bağımsız olduğunu ve daha sonraki çalışmalarda tam olarak açıklanmaya devam eden bir mekanizma olduğunu varsaydık. Mevcut kavram kanıtı çalışması, TRF2 ekspresyonunun farmakolojik azalmasının değerli bir kanser karşıtı strateji olabileceğine dair kanıt sağlar.

Tarama yöntemi, transkript seviyelerinden bağımsız olarak TRF2 protein seviyelerini dikkate alsa da, her iki ilaç da endojen TERF2 mRNA seviyelerini azalttı, bu da AR ve AD'nin çoklu TRF2 düzenleme seviyelerini hedeflediğini ima etti. Bunu destekleyen AR, TERF2 transkripsiyonunun [29] bir aktivatörü olan Wnt sinyalinin [28] bir inhibitörüdür. Daha genel olarak, Wnt sinyal yolunu hedefleyen ilaçlar, tarama adımları sırasında zenginleştirildi (Şekil S1B-D). Bir mitokondri hedefleme ajanı olan AD'nin TRF2 ifadesini nasıl etkilediği henüz belirlenmemiştir. Yüksek TRF2 seviyeleri sergileyen kanserler kötü prognoza sahip olduğundan ve kemoterapiye karşı artan direnç sergilediğinden [21], AR ve AD bu tür tümörler için terapötik ajanlardır. TRF2'nin [13] telomerik ve pro-onkojenik aktivitelerini ayırma potansiyeli, TRF2'yi farmakolojik olarak aşağı regüle etme olasılığını arttırır, böylece zararlı pro-yaşlanma yan etkileri olmaksızın çoklu vuruş anti-kanser yararları sağlar. Bu nedenle, klinik çalışmalarda bu ilaçların TRF2 ekspresyon seviyeleri üzerindeki sinerjik etkilerini belirlemek için gelecekteki çalışmalar garanti edilmektedir.

TRF2, çeşitli insan kanserlerinde yukarı regüle edilse de [13,21], birçok dokunun hem normal hem de patolojik yaşlanması sırasında ekspresyonu aşağı regüle edilir [30,31] Ayrıca, TRF2 düzensizliğinin fare modellerini içeren birkaç rapor, TRF2'nin yaşlanma ve kanser arasındaki kavşak [31-35]. Bu nedenle, burada açıklanan tarama prosedürü ile tanımlanan moleküller, hem bu çalışmada onaylandığı gibi TRF2 aşağı regülasyonu için anti-kanser ajanları hem de potansiyel olarak TRF2'yi yukarı regüle ederek yaşlanma karşıtı ajanlar olarak ilginç ilaç adaylarıdır.

Bu makale Cancers 2021, 13, 2998'den alınmıştır. https://doi.org/10.3390/cancers13122998 https://www.mdpi.com/journal/cancers