Spektrum-Etki İlişkisi Analizi ve Ağ Farmakolojisine Dayalı Cistanche Tubulosa'daki Aktif Bileşenleri Taramak İçin Yeni Bir Strateji Ⅱ

3. Sonuçlar ve tartışma

3.1. HPLC Parmak İzleri

3.1.1. Yöntem geçerliliği

HPLC yönteminin doğrulanması, yöntemin kesinliği, tekrar üretilebilirliği ve kararlılığı için göreli standart sapmanın (RSD) göreli tepe alanı (n = 11) için yüzde 2,85'ten az ve yüzde 0,77 olduğunu gösterdi. göreli tutma süresi için (n = 11). Aynı örnek çözümün kesinliği, göreli zaman için yüzde 0.05–{{10}},77 ve 0,28– aralığında göründü. Ortak zirvelerin göreli alanı için yüzde 2,70. Deneyin yeniden üretilebilirliği, bağıl süre için yüzde 0.03–{26}},20 ve ortak tepe noktalarının göreli alanı için yüzde 0,23–2,59 aralığındaydı. Numune stabilitesi, nispi tutma süresi için yüzde 0,09-0,24 ve ortak piklerin nispi alanı için yüzde 0,75-2,85 idi. Bu sonuçlar, kurulan parmak izinin tatmin edildiğini gösterdi. Geniposidik asit için doğrusal ilişkiler,ekinakozit, akteosit, tubulosit A, VeizoakteositTablo S4'te gösterilmiştir. R karenin değeri 1.0000 idi, bu da iyi doğrusallığı gösteriyor. Numune geri kazanımının sonuçları, geniposidik asit, ekinacosid'in ortalama geri kazanımlarının,akteosit, tubulosit A, Veizoakteosityüzde 100,37, yüzde 103,59, yüzde 98,46, yüzde 100,81 ve yüzde 101,19 idi ve numune geri kazanımları için MSB yüzde 2,68'den azdı.

Cistanche Aktif Bileşenleri hakkında daha fazla bilgi almak için Burayı Tıklayın

3.1.2. Pik Alanı (PA) ve Bağıl Tutma Süresi (RRT)

11 parti C. tubulosa'dan alınan HM'lerin, WE'lerin ve HR'lerin referans parmak izleri ve parmak izleri Şekil 2'de sunulmaktadır. İyi bir ayırma ve çözünürlük sergileyen on bir tepe, HM'ler, WE'ler ve HR'ler arasında ortak tepe noktaları olarak tanımlandı. Beş standart bileşik, geniposidik asit (A2) olarak tanımlandı,ekinakozit(A8),akteosit (A9), tübülosidA (A10) veizoakteosit(A11). standart bileşik,ekinakozitUygun bir pik alanı ve iyi stabilite ile tüm kromatogramlarda (ortalama alıkonma süresi 12.86 dakika) bulunan, referans pik olarak seçildi ve diğer on kromatogramın nispi alıkonma sürelerini (RRT'ler) hesaplamak için kullanıldı. ortak zirveler Bu farklı formların RRT'leri 0.16–1.51 aralığındadır. Bu yaygın piklerin PA ve varyans katsayısı (yüzde CV) Tablo S5-S7'de listelenmiştir. Verilerden, çeşitli formlardaki PA için CV yüzde değerleri sırasıyla HM'ler, WE'ler ve HR'ler için yüzde 25,78 – yüzde 142,02, yüzde 23,36 - yüzde 150,38 ve yüzde 28,91 - yüzde 112,78'dir. Bu sonuçlar, her birinin konsantrasyonundaki önemli farklılıkları ortaya koymaktadır.Cistanche tubulosafarklı formlar arasında bileşik. HM'lerin, WE'lerin ve HR'lerin parmak izleri Şekil 3'te gösterilmiştir.

Şekil 2 Standart numunelerin HPLC parmak izleri

3.1.3. HM'lerin, WE'lerin ve HR'lerin içerikleri

Beş standart bileşenC. tubulosaölçülmüştür. Ana bileşenlerin içerikleri Tablo 1'de gösterilmektedir. HM'ler, WE'ler ve HR'ler arasındaki karşılaştırma Tablo 2 ve Şekil 4'te gösterilmektedir. C. tubulosa'daki PhG'ler biyolojik olarak aktiftir ancak ısıya duyarlıdır. Suda çözünen ısıya duyarlı bileşenler, makul bir yöntem kullanılarak verimli bir şekilde ekstrakte edilebilir. Genel olarak, Cistanche herba su ile ekstrakte edilir ve daha sonra aşağıdaki kimyasal analizler için konsantre bir çözelti halinde buharlaştırılır [26, 27, 30]. Ekstraksiyon ve konsantrasyondan sonra sprey kurutma teknolojisi kullanıldı ve prosedür önceki makaleden değiştirildi. Su, sıvı buhardan hızla uzaklaştırıldı ve ardından bitkilerden ham maddelerin kuru özleri elde edildi. Bu adımda, maltodekstrin eklenmesi, dağılımı arttırmak ve depolama süresini uzatmak için ortak bir taşıyıcı olarak kabul edilir. Bitkisel bitkiler, bir dizi üretim sürecinden geçerek, katkı maddeleriyle formül granüllerine preslendi. Bu eksipiyan ekleme adımı deneye dahil edilmemiştir. Genel olarak üretim sürecimiz, formül granül üretim sürecine paralel olarak Bölüm 2.2'de açıklandığı gibi ekstraksiyon, konsantrasyon ve sprey kurutmayı içerir. Bu yarı mamulleri üretebilmek için yukarıdaki üç adım takip edilmelidir. WE'leri oluşturma prosedürü, ısıya duyarlı bileşenlerin kaybına kolayca neden olan konsantrasyon ve püskürtmeli kurutmayı içerir, ancak HR'ler, HM'lerin ekstraksiyonundan ve kurutulmasından sonra elde edilir. Aktif bileşenlerin HR'lerde kalmasının mümkün olup olmadığını merak ediyoruz. Sonuçlarımıza göre, verbascoside içeriği HM'lerden WE'lere ve HR'lere (sırasıyla ve ) önemli ölçüde azaldı. Verbascoside'ın termal kararlılığı, ısıtma işlemi sırasında pik alanındaki değişimler HPLC ile izlenerek araştırılır. 4 saat ısıtıldıktan sonra geriye yüzde 41.6 verbascoside kalır. Verbascoside'ın ısıya duyarlı olduğunu gösterir [31]. WE'lerde izoacteoside, tubuloside A ve ekinacoside, karmaşık işleme prosedürlerinden sonra stabil kaldı. Uzun süreli kurutma işlemi sırasında, PhG'lerin birikimi, bu ısıya duyarlı bileşenlerin termal bozunmasına atfedilebilecek önemli bir düşüş göstermiştir [32]. Diğer hedef bileşenler açısından, HR'ler ve WE'ler, verbascoside dışında önemli ölçüde farklılık göstermedi. Bu farkı anlamamız, gelecekte bitki artıkları için daha iyi kalite standartları geliştirmemizi ve bunları ürünlere dönüştürmemizi sağlayacaktır.

Tablo 1 11 parti C. tubulosa içeriği

Tablo 2 Ana bileşenlerin içeriklerinin karşılaştırılması (n = 11).

,

Şekil 4 Farklı formlardan (n = 11) beş bileşenin içerik belirlemesi. , ns: önemli değil.

3.1.4. Parmak İzi Benzerlik Analizi

Üç C. tubulosa grubu arasındaki benzerlikler değerlendirildi. Bitkisel madde-su özü, bitkisel malzeme-bitkisel kalıntı ve su özü-bitkisel kalıntı benzerlik değerleri 0.943–0.994, 0.847–{ aralığındaydı. {9}}.995 ve 0.938–1.000, sırasıyla (Tablo 3).

Tablo 3 11 parti C. tubulosa için HM-WE, HM-HR ve WE-HR benzerlikleri.

3.2. Antioksidan Aktivite Testi Sonuçları

C. tubulosa'nın çeşitli formlarının antioksidan aktiviteleri, DPPH, , ve süpürme kapasitesi deneyleri kullanılarak belirlendi ve ilgili sonuçlar Şekil 5'te sunuldu. Tablo S8'de, DPPH ve süpürme kapasitesi deneyi sonuçları { {2}}.04–37,80, 0,98–843,90 ve 0,32–27,65 mg/mL, 11 grup C. tubulosa arasında üç farklı form için. Üç antioksidan aktivite testinde, HM'ler ve WE'ler yakın inhibisyon aktivitesi sergilerken, HR'ler en zayıf inhibisyonu gösterdi.

Püskürterek kurutulmuş WE'lerin düşük konsantrasyonlarda bile önemli aktiviteler sergiledikleri bulundu. Önceki bir rapor, spreyle kurutulmuş bir Vernonia amigdalina WE'nin 0,17 mg/mL'de yüzde 50 süpürme inhibisyonu elde ettiğini gösterdi [33]. Uzun ekstraksiyon süreleri ve yüksek sıcaklıkların uygulanması iki ucu keskin bir kılıçtır. Bir yandan, ekstraksiyon süresinin ve püskürtmeli kurutma giriş sıcaklığının artırılması verimi ve verimliliği artırır. Ayrıca, ekstraktlar güçlü antioksidan aktivite ve bu bitkilerden daha yüksek biyolojik bileşen konsantrasyonları elde eder [34]. Öte yandan, aşırı sıcak giriş havası biyoaktif bileşikleri bozar. Bu tür yüksek hava giriş sıcaklıkları, antioksidan Bidens pilosa ekstresi aktivitesinde kayıplara yol açtı ve fenolik bileşiklerdeki azalmalara bağlandı [35]. Mevcut sonuçlar yukarıda belirtilen raporla tutarlıdır. Örneğin, S6'daki WE, hem HM hem de HR'den daha zayıf radikal inhibe edici yetenekler sergiledi. Ayrıca, S5'teki HR, HM ve WE'den daha güçlü DPPH ve süperoksit anyon temizleme yetenekleri sergiledi. PhG'lerin yapısı, enzimatik etki altında kolayca hidrolize olan veya yüksek sıcaklıklarda ayrışan glikozidik bağlar ve asetil gruplarından oluşur. Bu reaksiyonlar, büyük ölçekli üretim sırasında bazı ana bileşenlerdeki düşüşleri açıklayabilir. Bununla birlikte, belirli bileşenlerin hidrolizi veya izomerizasyonu, diğer bileşenlerin sentezini hızlandırabilir. Bu tür dönüşümler, Cistanches bitkilerini işlerken yaygındır [36–38]. PhG'lerin suda çözünür olması, çoğu biyolojik bileşenin su ekstraksiyonu yoluyla kullanılabileceği anlamına gelir. Aktif bileşenlerin çoğunluğunun WE'lerde kaldığı iddiası on yıllardır devam etmektedir, bu nedenle ıslak artık malzemelerin ekstraksiyondan sonra atılabileceğini varsaymak makul görünmektedir. Ancak C. tubulosa'nın HR'lerini atık olarak kabul etmek yanlıştır. Araştırmacılar, PhG'lerin kararsız olduğuna ve enzimatik veya hidrolitik bozunmaya duyarlı olduklarına dikkat çekmektedir [39]. İşleme sırasında bitki ilaçları içindeki biyolojik bileşenlerin azalmasına katkıda bulunan hidroliz veya izomerizasyon reaksiyonları, aynı zamanda HR'lerden yararlanmak için yeni fırsatlar sunabilir. Geleneksel ekstraksiyon yöntemleri dönüştürülerek, tıbbi kalıntılar geliştirilebilir ve daha etkin bir şekilde kullanılabilir. Panax ginseng tortusunu mono şekerlere dönüştürmek için enzimatik hidroliz gerçekleştirildi. Şeker, süksinik asit, ginseng polisakkaritleri ve ginsenositler gibi polisakkaritlerin ve ginsenosidlerin verimleri artmıştır [40]. Sophora flavescens kalıntıları, etil asetat ile ultrasonik dalgalarla yeniden özütlenir [41]. Bitkisel kalıntıları kullanmak için güncellenmiş teknolojiler, Huang ve diğerleri tarafından özetlenmiştir. [42].

PLSR ve BCA sonuçlarına dayalı olarak, en önemli zirveleri belirlemek için DPPH, süperoksit anyon ve hidroksil radikal yakalama deneyleri kullanılarak farklı formlardaki ilk beş zirve tarandı. Sonuçlar Venn tablosunda gösterilmektedir (Şekil 7). A2, A6, A8 ve A10, süperoksit anyon ve hidroksil radikal yakalama deneylerinde HM, WE ve HR (Şekil 7(a) ve 7(c)) tarafından paylaşılan ortak tepe noktalarıdır; oysa HM, WE ve HR, hiçbir DPPH testi pikini paylaşmaz. Bu arada BCA modelleri, A1, A2, A3 ve A6'nın HM, WE ve HR tarafından paylaşılan ortak pikler olduğunu göstermektedir (Şekil 7(d)–7(f)). Özellikle, Venn şemasındaki örtüşmeler, BCA modelinin PLSR modelinden daha uygun göründüğünü, eski modelin daha fazla tekrar gösterdiğini göstermektedir. BCA model katsayıları ve antioksidan yetenek IC50 değerleri RDA aracılığıyla analiz edildi. Şekil 8'de gösterilen RDA olarak, HM ve HR'den A1, A3 ve A6, antioksidan indeksleri ile pozitif olarak ilişkilidir, ancak A3'ün hidroksil radikali yakalama kapasitesi ile negatif bir ilişkisi vardır. WE'den A1 ve A6, DPPH ve süperoksit anyonu ile güçlü korelasyonlara sahiptir. Çeşitli formlardan not edilen A6 pikleri, DPPH, süperoksit anyonu ve hidroksil radikalleri ile en güçlü bağlantıyı sergiler. A1 ve A3 de benzer bir bağlantı sergiler.

Şekil 7

PLSR ve BCA modelinin Venn diyagramları: (a) DPPH testi. (b) süpürme deneyi. (c) süpürme deneyi, PLSR modeli ile analiz edildi. (d) DPPH deneyi. (e) süpürme deneyi. (f) süpürme deneyi, BCA modeli ile analiz edildi. Çakışan bölüm, HM, WE ve HR tarafından ortak zirveler parçasıydı.

3.4. Ağ Farmakolojisi Tabanlı Analiz

3.4.1. CT Ağının İnşası

GeneCards veri tabanından ve OMIM veri tabanından antioksidan aktivite ile ilgili toplam 4359 hedef elde edildi. Aynı zamanda, aktif bileşenler TCMSP veri tabanından ve SwissTargetPrediction veri tabanından tarandı. Daha sonra UniPort veritabanı aracılığıyla 198 hedef toplandı ve standardize edildi. Aktif bileşenler ve antioksidanla ilişkili hastalıklar tarafından paylaşılan 159 hedef gen vardı (bakınız Şekil S1). CT ağı, bileşikler ve anahtar gen hedefleri arasındaki korelasyonu göstermek için inşa edildi (Şekil 9).

Şekil 9 CT ağı. Ağ, aktif bileşenler ile anahtar gen hedefleri arasındaki ilişkiyi gösterdi.

3.4.2. ÜFE Ağının Oluşturulması ve Temel Hedeflerin Taranması

ÜFE, STRING veri tabanı kullanılarak görselleştirildi (Şekil 10). Ağ 159 düğüm ve 2528 kenar içeriyordu. Etkileşim ağının tamamında, bağlantı bileşenleri veya daha fazla hedef noktası olan düğümler, C. tubulosa'da antioksidan rol oynayan anahtar bileşen veya hedef gen olabilir. Sonuçlar indirildi ve görselleştirme için Cytoscape'e dahil edildi. DC değeri ne kadar yüksek olursa, renk o kadar koyu olur ve birleşik puan değeri ne kadar büyük olursa, kenar o kadar kalın olur. RAC-alfa serin/treonin-protein kinaz (AKT1), interlukin-6 (IL6), tümör nekroz faktörü (TNF) ve vasküler endotelyal büyüme faktörü A'nın (VEGFA) merkezi olarak yerleştirildiğini bulduk (Şekil 11), aktif bileşenler bir antioksidan etki gösterdiğinde bunların kilit hedefler olduğunu belirtir. Ekinakozidin, mitojenle aktive olan protein kinazlar (MAPK) ve AKT'yi ve bunların fosforillenmiş formlarını düzenleyerek mitokondriyal disfonksiyonu azalttığı bildirilmektedir [43]. Araştırmacılar, C. tubulosa'nın glikozitlerinin antidiyabetik etkisinin, IL-6 ve TNF- gibi proinflamatuar sitokinleri aşağı doğru düzenleyerek PhG'lerin antioksidan aktivitesinden kaynaklanabileceğini tahmin ettiler [44]. Ek olarak, ekinacoside, anjiyogenezi inhibe etmek için VEGFA ekspresyonunu aşağı doğru düzenleyerek yumurtalık kanseri hücresi büyümesini bozabilir [45].

Şekil 10 ÜFE ağı.

3.4.3. Zenginleştirme Analizi ve CTP Network Kurulumu

Potansiyel antioksidan bileşikler, BP, CC ve MF dahil olmak üzere çok sayıda biyolojik fonksiyon üzerinde etkili olmuştur. Şekil 12(a)'da ilk 10 yol gösterilmektedir. ÜFE ağından tahmin edilen hedefler, temel olarak organik siklik bileşikler, ksenobiyotik uyarıcı, inorganik maddeler, oksijen seviyeleri ve hücresel bileşen hareketinin pozitif düzenlemesi gibi birçok biyolojik sürece yanıt verdi. Hücresel bileşen analizi, genlerin esas olarak membran salı, hücre dışı matris, salgı granül lümeni, transkripsiyon düzenleyici kompleksi ve hücrenin apikal kısmı ile ilişkili olduğunu gösterdi. Bu hedefler ayrıca DNA bağlayıcı transkripsiyon faktörü bağlanması, protein homodimerizasyon aktivitesi, protein alanına özgü bağlanma ve sitokin reseptörü bağlanması dahil olmak üzere birçok moleküler fonksiyonda yer alır.

Şekil 12 Zenginleştirme analizi: (a) GO zenginleştirme analizi. (b) KEGG zenginleştirme analizi.

Bu ana merkezlerin biyolojik fonksiyonlarını araştırmak için bir yol zenginleştirme analizi yapıldı. KEGG zenginleştirme sonuçlarından, ilk 20 yolu göstermek için bir kabarcık diyagramı çizildi. Nokta ne kadar büyükse, yola o kadar fazla gen dahil edildi. Şekil 12(b)'de gösterildiği gibi, C. tubulosa'nın anahtar yolları, kanser, lipid ve aterosklerozdaki yollar, diyabetik komplikasyonlarda AGE-RAGE sinyal yolu, kimyasal karsinojenez - reseptör aktivasyonu ve MAPK sinyal yolu ile ilişkiliydi. C. tubulosa'nın apoptoz ve hücresel redoks homeostazı üzerindeki etkileri araştırıldı. Veriler, C. tubulosa'nın anti-kolon kanseri tedavisi için umut verici bir aday olabileceğini düşündürmektedir [47]. C. Deserticola ekstresi yaşlı insanlarda bulunur [48].

Şekil 13, C. tubulosa'nın yolları ve ilgili hedefleri arasındaki korelasyonu ve örtüşen hedef genler ile biyolojik olarak aktif bileşenleri arasındaki ilişkiyi göstermektedir. 12 bileşen, 159 hedef ve 20 yoldan oluşan CTP ağının küresel bir görünümü oluşturuldu. Hedeflerin çoğu aday aktif bileşikler tarafından paylaşıldı. Yüksek ara bağlantı derecelerine sahip bu aday aktif içerik maddeleri, özellikle quercetin (derece = 131) ​​olmak üzere CTP ağının yüksek birbirine bağlılığından sorumluydu. AKT1, IL6, TNF ve VEGFA gibi hedeflerin çoğu, kanser yollarıyla ilişkili KEGG yollarıyla eşlendi.

Şekil 13 CTP ağı.

4. Sonuçlar

Bu çalışmada, HM, WE ve HR arasındaki spektrum-etki ilişkilerini düşünürken öncelikle karmaşık durumları inceledik.C. tubulosa. HPLC parmak izleri veantioksidan deneyleriHs, WEs ve HRs arasındaki farkları belirlemek için kullanıldı.C. tubulosa. HPLC parmak izlerine göre, 11 Hs, WEs ve HR grubu arasında 11 pik ortaktı. geniposidik asit,ekinakozit, Verbascoside, tubulosit A, Veizoakteositbu pikler arasında tespit edilmiştir. Bu beş bileşenin içerikleri belirlendi. Ayrıca antioksidan etkilerininC. tubulosaHs, WEs ve HRs, karmaşık üretim koşullarının neden olduğu kimyasal bileşimlerdeki değişiklikler nedeniyle değişiklik göstermiştir. Çeşitlendirilmiş istatistiksel modellere dayalı olarak, spektrum-etki ilişkisi çalışması, zirve A6'nın üç form arasında en belirleyici bileşen olabileceğini gösterdi.C. tubulosa. Çalışma, potansiyel mekanizmalarını keşfetmek için ağ farmakolojisine dayanıyordu.C. tubulosaAçıkantioksidasyonbileşiklerin taranması, kilit hedeflerin tahmini, ağların inşası ve zenginleştirme analizinin yürütülmesi yoluyla. Sonuçlarımız, bitkisel kalıntıların geri dönüşümü ve potansiyeli için teorik bir temel sağlar.C. tubulosatedavisindeantioksidan ilişkili hastalıklar.