Birinci Bölüm Engellenmiş NF-κB Sinyal Yolu ve AMPK Aracılı Mitokondri Fonksiyonu İyileştirmesi Yoluyla Acteoside Bastırılmış Mikroglia M1 Polarizasyonu

daha fazla bilgi için:ali.ma@wecistanche.com

BÖLÜM 1 Cistanche Acteosides beyin hücresi canlılığını nasıl artırır ve Alzheimer hastalığını nasıl rahatlatır?

Cistanches ürünleri için tıklayın

Ying-Qi Li Çin Eczacılık Üniversitesi

Yi Chen Çin Eczacılık Üniversitesi

Si-Qi Jiang Çin Eczacılık Üniversitesi

Yuan-Yuan Shi Çin Eczacılık Üniversitesi

Xiao-Li Jiang Çin Eczacılık Üniversitesi

Shan-Shan Wu Çin Eczacılık Üniversitesi

Ping Zhou Çin Eczacılık Üniversitesi

Hui-Ying Wang Çin Eczacılık Üniversitesi

Ping Li Çin Eczacılık Üniversitesi

Araştırma Anahtar Kelimeleri: asteosit, BV-2 hücreleri, metabolizma, RNA dizilimi, mitokondri, nöroinşamasyon

Soyut

Arka plan: Alzheimer hastalığı (AH) en sık görülen demans türüdür. Süreasteosit(ACT), bir bileşikyalıtılmışitibarenCistanche tübüloza, sahipnöroprotektif özellikler. Bununla birlikte, mikroglia polarizasyonunu düzenlemenin altında yatan mekanizma tam olarak tanımlanmamıştır. Yöntemler: Burada, ACT'nin terapötik etkinliğini ortaya çıkarmak için zebra¦sh larvalarında AlCl3-indüklediği AD modeli uygulandı. ACT'nin mikroglia polarizasyonu üzerindeki rolünü göstermek için BV-2 hücreleri kullanıldı. RNA-Sekansı, HPLC-Q-TOF-MS, western blot ve moleküler yerleştirme, mekanizmasını doğrulamak için birleştirildi.

Sonuçlar: ACT, zebrash'ta deneysel diskinezi ve sinir sistemi bozukluklarını önemli ölçüde iyileştirdi. Ardından, M1 polarizasyonunu bastırdı ve LPS ile indüklenen BV-2 hücrelerinde M2 ​​fenotipini destekledi. İlk olarak, ACT'nin, mitokondri işleviyle bağlantılı olarak, pantotenat ve CoA biyosentezinin yanı sıra, enfeksiyon, arginin biyosentezindeki anahtar sinyal yollarının düzenlenmesini içeren derin transkriptomik etki uyguladığını gösterdik. ACT tedavisi, NF-κB sinyal yolunu inhibe ederek mikroglia M1 polarizasyonunu azalttı. Ve metabolik yollar HPLC-Q-TOF-MS ile daha da doğrulandı. Ek olarak, ACT, metabolik değişikliklerle tutarlı olarak AMPK aracılı PGC-1 ve UCP-2 upregülasyonu yoluyla mitokondri işlevini eski haline getirmek için aşırı ROS'u düzeltti. Şaşırtıcı bir şekilde, ACT, moleküler yerleştirme ile kanıtlandığı gibi, hem NF-KB'ye hem de AMPK'ye doğrudan bağlanabilir. Sonuçlar: Araştırma, ACT'nin aşılayıcı bir mekanizmasını sağladı ve metabolizma ile mikroglia polarizasyonu arasındaki bağlantıyı ortaya çıkarmak için mitokondriyal disfonksiyona dayalı yeni bir bakış açısı gösterdi.

Arka fon

Alzheimer hastalığı (AH), bilişsel bozulma ve diskinezinin eşlik ettiği yaygın bir nörodejeneratif hastalıktır[1]. Şiddetli nöron kaybı, senil plaklar ve nöro¦briller yumaklar[2] ile karakterizedir. AD'nin patogenezi çok boyutludur ve nöroinşamasyonla bağlantılıdır. Nöroinsammasyon, AD'nin gelişimi ile yakından ilişkili olan glial hücrelerin aktivasyonu tarafından yönlendirilir.[3, 4]. Nöroinsamasyonun ilerlemesi ve alevlenmesi sırasında, mikroglia anahtar faktör olarak kabul edilir. Mikroglia, merkezi sinir sistemindeki birincil bağışıklık hücreleridir. Beyin gelişimini içeren, nötr bir çevreyi korumanın yanı sıra yaralanma ve onarıma yanıt vermeyi içeren bir dizi süreçle yakından ilişkilidir[1]. Ayrıca, mikroglia bir M1 fenotipine uyarılabilir ve AD gibi nöroinşamasyonla ilişkili hastalıklar meydana geldiğinde pro-inflamatuar sitokinlerin ekspresyonu artar[5]. Çalışmalar ayrıca M1 fenotipine polarizasyona sıklıkla metabolik bozuklukların[6] eşlik ettiğini ve bunun da enerji metabolizması dengesizliğine ve mitokondriyal disfonksiyona[7] neden olduğunu göstermektedir. Bu olumsuz değişiklikler, nörodejenerasyondan, hatta AD'den türetilir.

Acteoside(ACT), bir feniletanoid glikozit, önceliklecistanchetübüloza. Artan kanıtlar gösteriyor kiDAVRANMAKçok sayıda farmakolojik maddeye sahipnöro-koruyucu[8], iltihap önleyici[9] ve antioksidan[10] etkiler dahil olmak üzere aktiviteler. Özellikle, ACT'nin streptozotosin ile indüklenen sıçanlarda öğrenme ve hafıza bozukluğunu iyileştirdiği ve ayrıca enerji metabolizmasını düzenlediği bildirilmiştir [11]. Ayrıca deneysel otoimmün ensefalomiyelit farelerinde nöronal apoptotik hücre ölümünü ve mitokondriyal hasarı inhibe ettiği öne sürülmüştür[12]. Ancak, ACT'nin mikroglia M1/M2 polarizasyonu üzerindeki etkisine odaklanan daha az çalışma bulunmaktadır. Özellikle mitokondri fonksiyonunun onarımı ve hücre metabolizmasının düzenlenmesi gibi çeşitli mekanizmalar gerçekleştirilmemiştir. Ayrıca, mekanizmanınDAVRANMAKmikrogliaya katkıda bulunan M1/M2 polarizasyonu keşfedilmemiş olarak kalmıştır. Bu raporun amacı, ACT'nin terapötik etkinliğinin yanı sıra altta yatan moleküler mekanizmayı araştırmaktı.DAVRANMAKiçindeAD. burada,DAVRANMAKAlCl3-'ün neden olduğu AD zebra balığı larvalarında önemli bir nöroproteksiyon etkisi gösterdi. Ek olarak, ACT, M1 polarizasyonunu etkili bir şekilde inhibe etti ve LPS ile indüklenen BV-2 hücrelerinde M2 ​​fenotipini destekledi. Mikroglia polarizasyonunu düzenlemede ACT'nin altında yatan mekanizmayı daha iyi anlamak için metabolomik yöntemle entegre RNA-Sekanslama (RNA-Seq). Mitokondriyal fonksiyon açısından metabolizma ve mikroglia polarizasyonu arasındaki karışma araştırıldı. Bu çalışma, AD tedavisi için potansiyel bir terapötik ajan olarak ACT'nin daha fazla araştırılmasına yeni bir saygı sağlayacaktır.

yöntemler

Hayvanlar ve model gruplama

Bu çalışmada vahşi tip zebra (AB suşu, 4 aylık) seçildi (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Önceki yöntem[13] izlenerek 28 derecede 14/10 saat aydınlık/karanlık döngüsü altında tutuldular. Doğal gübre ve normal olarak geliştirilmiş embriyolar üretildi ve bir aydınlatma inkübatöründe döllenmeden 3 gün sonraya kadar (pdf) kültürlendi. Tüm zebra balığı deneyleri, Çin Eczacılık Üniversitesi Hayvan Etik Kurulu gözetiminde gerçekleştirildi. Zebra balığı larvaları altı gruba ayrıldı ve 3 pdf'den 7 pdf'ye kadar tedavi edildi: kontrol grubu, model grubu, model artı donepezil hidroklorür (DPZ) grubu, model artı ACT grupları. Kontrol grubu, yüzde 0,2 DMSO içeren ortamda tutuldu ve model grubu, 150 uM AlCl3 (pH 5.8) ile muamele edildi. Model artı DPZ grubu, AlCl3 ve 8 uM DPZ ile birlikte işleme tabi tutuldu. Model artı ACT grupları, AlCl3 ve farklı ACT konsantrasyonları (200, 100, 50 uM) ile birlikte tedavi edildi. ACT (HPLC saflığı yüzde 98'den büyük veya buna eşit) Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd.'den (Baoji, Çin) elde edildi. AlCl3·6H2O ve DPZ, Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD'den satın alındı. (Şangay, Çin).

Davranış analizi Sayfa 3/34Zebra balığı larva hareketleri bir ViewPoint davranış analiz cihazı (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) ile 28 derecede kaydedildi. Brie§y, davranış parametreleri ve sonuç işleme, daha önce belirlediğimiz yöntemle tutarlıydı[13]. Burada, zebra balıklarında diskinezi iyileşmesini değerlendirmek için ortalama hız (AS), hız değişimi (ΔS), diskinezi iyileşme oranı (DRR) ve tepki verimliliği (RE, yüzde) seçildi.

Asetilkolinesteraz (AChE) ve kolin asetiltransferaz (ChAT) aktivitesinin belirlenmesi

3 pdf'den 7 pdf'ye kadar tedaviden sonra, AChE ve ChAT aktivitesini ölçmek için zebra balığı larvaları toplandı.

Üreticinin protokolüne dayalı olarak, aktivite, enzime bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) kitleri (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Şangay, Çin) tarafından tespit edildi. Ve farklı örneklerin protein konsantrasyonları BCA yöntemi ile belirlendi.

Hücre kültürleri ve tedavileri

BV-2 hücre çizgisi (ölümsüzleştirilmiş murin mikroglial hücre çizgisi), American Type Culture Collection'dan (ATCC, Manassas, VA, ABD) satın alındı. DMEM'de (KeyGen Biotech Co., Ltd, Nanjing, Çin) kültürlendiler. Ortam, 37 derecede yüzde 95 hava/5 yüzde CO2 ile yüzde 10 FBS (Gibco, Grand Island, NY, ABD), 100 U/mL penisilin ve 100 mg/mL streptomisin ile desteklendi. BV-2 hücreleri, ACT (50, 25, 12.5 uM) ile inkübe edildi veya 24 saat boyunca Lipopolisakkarit (LPS, 1 ug/mL; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABD) ile uyarıldı. Son olarak, çeşitli analizler için tüm hücreler veya süpernatan toplandı.

Hücre canlılığı tahlili

BV-2 hücrelerinin canlılığını değerlendirmek için Hücre Sayma Kiti-8 (CCK-8) testi (JianCheng Biyomühendislik Enstitüsü, Nanjing, Çin) kullanıldı. Hücreler bir 96-kuyu plakasına (1x104 hücre/kuyu, Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.) ekildi. Kısaca, tedavi sonunda ortam çıkarıldı ve her bir kuyucuğa 2 saat 37 derecede CCK-8 solüsyonu içeren 100 μL serumsuz ortam eklendi. Absorbans, bir mikroplaka okuyucu (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, ABD) ile 450 nm'de ölçüldü. Hücre canlılığı, kontrol grubunun yüzdesi olarak ifade edilir. Deney üç defa tekrar edildi.

Nitrik oksit (NO) üretim tahlili

NO, Griess reaktifi kullanılarak BV-2 kültür süpernatanındaki nitrit seviyeleri ölçülerek belirlendi. Brie§y, tedavinin sonunda, ortam (100 uL) yeni bir 96-kuyulu plakaya aktarıldı. Her kuyucuğa aynı Sayfa 4/34 hacim Griess reaktifi eklendi ve karanlıkta 15 dakika reaksiyona girdi. 540 nm'de absorpsiyon, bir Mikroplaka Okuyucu ile belirlendi.

Süpernatanttaki inflamatuar sitokin seviyeleri

BV-2 hücre süpernatanındaki TNF-, IL-1 ve IL-10 konsantrasyonları, üreticinin talimatlarına göre ELISA kitleri ile belirlendi (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Şanghay, Çin ).

Hücresel morfolojinin gözlemlenmesi

ACT'nin BV-2 hücresinin M1/M2 polarizasyonu üzerindeki etkisini belirlemek için hücreler bir 6-yuvaya yerleştirildi ve ters mikroskop (Nikon ECLIPSE Ti2, Japonya) altında gözlemlendi.

HPLC-Q-TOF-MS analizi ile hücresel metabolizma tayini

BV{{0}} hücreleri bir 6-kuyu kabına ayrı ayrı (n=6/grup) ekildi. İşlemden sonra ortam çıkarıldı ve hücreler üç kez soğuk PBS ile yıkandı. Daha sonra hücre metabolizmasını bastırmak için hemen sıvı nitrojene maruz bırakılır. Hücreler, soğuk yüzde 80 metanol (1 mL/çukur) ile hasat edildi ve süspansiyon, 2 mL'lik bir Eppendorf tüpüne aktarıldı. Protein çökelmesini kolaylaştırmak için 1 dakika kuvvetli bir şekilde vortekslendi ve 13,000 rpm'de 15 dakika 4 derecede santrifüjlendi. Hücre süspansiyonu yeni bir 2 mL Eppendorf tüpüne aktarıldı ve bir nitrojen akımı altında kurutuldu ve analize kadar -80 derecede saklandı. Kurutulmuş kalıntı, 15{{40}} uL önceden soğutulmuş yüzde 25 asetonitril içinde sulandırıldı. Sekans analizinin stabilitesini ve doğruluğunu sağlamak için, her bir hücre numunesinin eşit hacimleri (10 μL) kalite kontrol (QC) numuneleri olarak birleştirildi. Metabolit tespiti sırasında, bu numuneler, stabilitelerini doğrulamak için her altı hücre numunesinden sonra enjekte edildi. HPLC-Q-TOF-MS için 1 uL'lik bir kısım enjekte edildi. HPLC-Q-TOF-MS analizi, Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) kütle spektrometresi (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ABD) ile bağlantılı Agilent 1290 HPLC sistemi üzerinde gerçekleştirilmiştir. Ayırma, bir ACQUITY UPLC BEH C18 kolonu (2.1×100 mm, 1.7 um) üzerinde gerçekleştirildi. Mobil faz yüzde 0.1 formik asit-su (h/h; A) ve asetonitrilden (B) oluşuyordu. Akış hızı, aşağıdaki optimal gradyan elüsyon koşuluyla 0.4 mL/dk'ya ayarlandı: 0 ila 2 dakika, yüzde 5 B; 2 ila 20 dakika, yüzde 5 ila yüzde 95 B (pozitif iyon modu); 0 ila 2 dakika, yüzde 5 B; 2 ila 20 dakika, yüzde 5 ila yüzde 95 B (negatif iyon modu). Kütle spektrometresinin çalışma parametreleri şu şekilde ayarlandı: gaz sıcaklığı, 320 derece; kurutma gazı, 10 L/dak; nebulizatör, 35 psi; VCap, 4000 V; parça, 120 V. Ham veriler MassHunter Workstation Software sürüm B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ABD) altında çalıştırıldı. Ham veriler, XCMS platformu tarafından önceden işlendi. Normalleştirilmiş verilerin temel bileşenler analizi (PCA) ve kısmi en küçük kareler diskriminant analizi (PLS-DA) MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca) ile yapılmıştır. Literatürle birlikte, diferansiyel metabolitler (VIP > 1, T-testi P < 0.05)="" hmdb'de="" (https://hmdb.ca)="" tanımlandı.="" son="" olarak="" metaboanalyst="" ile="" yol="" analizi="">

Mitokondriyal membran potansiyelinin (MMP) ölçümü

MMP, üreticinin talimatlarına göre §uorescent probu JC-1 (Beyotime, Çin) kullanılarak tespit edildi. Kısaca, farklı gruplardan hücreler PBS ile yıkandı ve 20 dakika boyunca 37 derecede JC-1 boyama solüsyonu ile inkübe edildi. Boyamadan sonra hücreler boyama tamponu kullanılarak iki kez yıkandı. Ardından, akış sitometrisi (BD Accuri C6) ile floresan sinyalleri tespit edildi.

Mitokondriyal adenosin 5'-trifosfat (ATP) ölçümü

Mitokondrideki ATP konsantrasyonu, üreticinin talimatlarına uygun olarak bir ATP Test Kiti (Beyotime, Çin) ile tespit edildi. Kısaca, farklı gruplardan BV-2 hücrelerinin kültür ortamı atıldı ve hücreler buz üzerinde lizis tamponu ile homojenleştirildi. Santrifüjden sonra elde edilen süpernatan (12,000 g, 5 dakika) ATP konsantrasyonunu belirlemek için kullanıldı. Lüminesans (lusiferaz katalizli §uorescein reaksiyonu), EnVision Multimode Mikroplaka Okuyucu (PerkinElmer) tarafından tespit edildi.

Hücre içi reaktif oksijen türleri (ROS) seviyesinin ölçümü

ROS seviyesini ölçmek için ROS Assay Kit (Beyotime, Çin) kullanıldı. Farklı gruplardan hücreler DCFH-DA (10 µM) ile 37 derecede 20 dakika inkübe edildi. Prob yüklemesinden sonra hücreler DMEM ile üç kez yıkandı. Ardından, akış sitometrisi (BD Accuri C6) ile floresan sinyaller tespit edildi.

Transmisyon elektron mikroskobu (TEM)

BV-2 hücreleri bir 6-kuyu kabına ekildi. Ortam çıkarıldı ve her bir oyuğa 1 mL yüzde 2.5 glutaraldehit hızla ilave edildi. Daha sonra hücreler 1.5 ml'lik bir Eppendorf tüpüne aktarıldı ve 1000 rpm'de 3 dakika santrifüjlendi. Hücreler gece boyunca 4 derecede yeni yüzde 2.5 glutaraldehit ile sabitlendi. Sabitleme, dehidrasyon ve gömme işleminden sonra hücreler, bir HT7800 transmisyon elektron mikroskobu (Hitachi, Tokyo, Japonya) ile gözlendi.

RNA-seq ve biyoinformatik veri analizi

BV-2 hücrelerinden toplam RNA (n=3/group), reaktif üreticisinin talimatlarına göre Trizol reaktifi (Vazyme Biotech, Çin) kullanılarak ekstre edildi. Tüm analitik numuneler, RNA dizi analizini gerçekleştirmek için Majorbio'ya (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd.) gönderildi. Veriler, Majorbio Bulut Platformunun ücretsiz çevrimiçi platformunda analiz edildi. Diferansiyel ifade analizi için parametreler şunlardı:P-ayarla < 0.05 ve |log2FC|Büyük veya eşit1. Orijinal dizi verileri, NCBI Dizi Okuma Arşivi (SRA) veri tabanına gönderilmiştir.

Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR)

Her gruptaki BV-2 hücrelerinin toplam RNA'sı, 500 μL RNA-easyTM İzolasyon Reaktifi (Vazyme Biotech, Çin) kullanılarak toplandı ve FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech, Çin) ile bir ters transkripsiyon reaksiyonu gerçekleştirildi. . Reaksiyonlar, üreticinin protokolüne göre gerçekleştirilmiştir. cDNA, özel primerler ve TransStart TOP Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, Çin) ile qRT-PCR testlerine tabi tutuldu. Primerler Tablo S1'de listelenmiştir (bkz. Ek Dosya 1) ve dahili kontrol olarak -actin kullanılmıştır. Kantitatif analiz için 2-ΔΔCT yöntemi kullanıldı.

Western blot analizi

BV-2 hücreleri, toplam protein elde etmek için yüzde 1 Proteaz İnhibitör Kokteyli (Thermo Fisher) içeren RIPA lizis tamponu (KeyGen Biotech Co., Ltd, Nanjing, Çin) ile parçalandı. NC membranlarına aktarılan proteinleri ayırmak için yüzde 10'luk bir SDS-PAGE yapıldı. 2 saat boyunca yüzde 5 yağsız süt/BSA ile bloke edildikten sonra, membranlar AMPK (Proteintech), p-AMPK (A¨nity Biosciences), PGC-1 (Proteintech), NF-κB (Proteintech), ile inkübe edildi. p-NF-KB (ABklonal) veya GAPDH (ABklonal) antikorları, gece boyunca 4 derecede yüzde 5 TBST'de. Zarlar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca ikincil yaban turpu peroksidaz-konjuge antikoru (ABklonal) ile inkübe edildi. Görselleştirme ve niceleme için yüksek sig ECL western blot substratı (Tanon, Çin), Jel görüntüleme sistemi (Tanon, Çin) ve ImageJ yazılımı kullanıldı.

moleküler yerleştirme

Moleküler yerleştirme analizleri, Autodock yazılımı (Sürüm 4.2) kullanılarak yapıldı. ACT ve proteinler arasındaki afinite, AutodockTools yazılımı tarafından gözlemlendi. AMPK'nin (PDB ID: 5g5j) ve NF-KB'nin (PDB ID: 4q3j) üç boyutlu (3D) protein yapıları Protein Veri Bankasından alınmıştır.

istatistiksel analiz

Tüm veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edilir. Farklı gruplar arasındaki farklar, tek yönlü varyans analizi (ANOVA), ardından Tukey's multiple ile analiz edildi.

Sonuçlar

ACT, zebra balığı larvalarında diskineziyi hafifletti ve kolinerjik sistem fonksiyonunu iyileştirdi

ACT'nin AD üzerindeki etkisini göstermek için zebra balığı larvalarında AlCl3-indüklenmiş AD modeli kullanıldı. İlk olarak, zebra balığı larvalarının aydınlık/karanlık döngüsü içindeki hareketi gözlemlenmiş ve yüzme parkurları kaydedilmiştir (Şekil 1a, 1b). Uygulamadan sonra karşılık gelen sürede AlCl3 tarafından indüklenen zebra balığı hareketinin AS ve ΔS'si hesaplandı. Sonuçlar, farklı ACT dozlarının zebra balıklarının AS ve ΔS'sini etkili bir şekilde arttırdığını gösterdi (Şekil 1c). DRR ve RE, ACT ve DPZ'nin daha sezgisel bir karşılaştırmasını ortaya çıkardı (Şekil 1d). Buna göre ACT, DPZ ile benzer etkiler sergileyerek diskineziyi hafifletti. Kolinerjik sistemin öğrenme ve hafıza süreçlerinde önemli bir rol oynadığı genel olarak kabul edilmektedir. Böylece ACT'nin etkisini ortaya çıkarmak için AChE ve ChAT aktiviteleri kullanıldı. Zebra balığındaki AlCl3 maruziyeti, beyin kolinerjik değişikliği ile işlendi (Şekil 1e). ACT tedavisinin AChE aktivitesini baskılaması olağanüstüydü. Ek olarak, ACT tedavisinden sonra ChAT aktivitesi bir düşüş sergiledi. Kısaca, ACT, AlCl3-'ün neden olduğu AD zebra balığı larvalarında kolinerjik sistem fonksiyonu üzerinde derin bir etki göstermiştir.

ACT, LPS ile indüklenen BV-2 hücrelerinde M1 polarizasyonunu bastırdı ve M2 polarizasyonunu destekledi

ACT'nin mikroglia polarizasyonu üzerindeki etkileri araştırıldılaboratuvar ortamındaBV-2 mikroglial hücreleri kullanarak. LPS, 24 saat tedavi edildikten sonra BV-2 hücre canlılığını önemli ölçüde azalttı. Neyse ki ACT, LPS ile indüklenen BV-2 hücrelerinin hücre canlılığını arttırdı (Şekil 2a). Ayrıca BV-2 hücrelerinin morfolojisi gözlemlendi. 24 saatlik LPS stimülasyonundan sonra, BV-2 hücrelerinin bir M1 polarizasyon durumuna maruz kaldığını gösterdi. Morfolojik değişiklikler ACT birlikte tedavisi ile önlendi (Şekil 2b). Ayrıca, sonuçlar, LPS tarafından uyarılan BV-2 hücrelerinin aksine, ACT ile birlikte tedavi edilen BV-2 hücrelerinin önemli ölçüde baskılanmış TNF- (Şekil 2c), IL-1 ( Şekil 2d) ve hücre üst sıvısındaki NO (Şekil 2f) ifadeleri. Bunlar, M1 mikroglia polarizasyonunun göstergeleri olarak klasik pro-inflamatuar sitokinlerdir. ELISA sonuçlarına benzer şekilde, qPCR sonuçları da TNF- , nitrik oksit sentaz (iNOS), IL-1 ve CD86 mRNA ifadelerinin anlamlı olduğunu keşfetti.LPS grubu ile karşılaştırıldığında ACT tedavisi ile kısmen inhibe edilmiştir (Şekil 3a). Ayrıca, M2 mikroglia polarizasyon seviyelerini ELISA (Şekil 2e) ve qPCR (Şekil 3b) ile ölçtük, bunun sonuçları ACT'nin M2 mikroglia ile ilişkili işaretleyici ekspresyon seviyelerini (IL-10, CD206) önemli ölçüde arttırdığını gösterdi. , TGF- ve Arg-1). Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar ACT'nin M1 mikroglia polarizasyonunu baskıladığını ve M2 fenotipini desteklediğini gösterdi.

ACT, LPS ile indüklenen BV-2 hücrelerinde NF-κB sinyal yolunun inhibisyonu yoluyla M1/M2 polarizasyonunu düzenledi

Transkriptomik analiz, genel bir seviyeden BV-2 hücrelerinde ACT mekanizmasını anlamak için RNA-seq tarafından gerçekleştirilmiştir. PCA, kontrol, LPS ve ACT gruplarının iyi ayırt edilebileceğini gösterdi (Şekil 4a). Kontrol grubu ile LPS grubu arasında 899 farklı şekilde eksprese edilmiş gen (DEG'ler) ortaya çıkarırken, LPS grubu ile ACT grubu arasında 49° vardı (Şekil 4b). Tutarlı bir şekilde, Gen Ontolojisi (GO) zenginleştirme analizi (Şekil 4c) ve Kyoto Genler ve Genler Ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizi (Şekil 4d), ACT'nin etkisinin NF-κB sinyal yolunda yer aldığını ortaya çıkardı. NF-κB sinyal yolu ile ilişkili gen seti ayrıca doğrulandı ve homeostazları kesinlikle LPS'den etkilendi. Beklendiği gibi, ACT onların ifadelerini önemli ölçüde etkiledi (Şekil 4e). Bir NF-κB sinyal yolu, inflamasyonun ilerlemesini düzenlemek için klasik bir yoldur ve sonuçta, pro-inflamatuar faktörlerin salınmasıyla sonuçlanır. Mekanistik destek elde etmek için, NF-κB sinyal yolunun önemli bir proteini western blot analizi ile değerlendirildi. LPS stimülasyonu, M1 polarizasyonunu teşvik etmekle ilişkili NF-κB'nin aktivasyonuna yol açtı. RNA-seq analizi ile uyumlu olarak, ACT, LPS ile uyarılan NF-KB fosforilasyonunu inhibe etti (Şekil 4f). Bu nedenle ACT, BV-2 hücrelerinde NF-κB sinyal yolu aracılığıyla LPS kaynaklı M1 polarizasyonunu rahatlattı.

LPS ile indüklenen BV-2 hücrelerinde ACT bozulmuş arginin biyosentezinin yanı sıra pantotenat ve CoA biyosentezi

RNA-seq, ACT'den etkilenen yolların ayrıca arginin (Arg) biyosentezinin yanı sıra pantotenat ve CoA biyosentezini de içerdiğini gösterdi (Şekil 4d). Ve LPS uyarısının, M1 polarizasyonu ile ilişkili BV-2 hücre metabolizması bozukluklarına neden olduğu öne sürülmüştür[14]. Bu nedenle, ACT'nin hücre metabolizması üzerindeki etkisini belirlemek için HPLC-Q-TOF-MS tarafından hedeflenmemiş bir hücre metabolomu kullanıldı. PCA (Şekil 5a) ve PLS-DA (Şekil 5b), kontrol, LPS ve ACT gruplarının hücre içi metabolitlere dayalı olarak iyi ayırt edilebileceğini göstermiştir. LPS ile indüklenen BV-2 hücrelerindeki çeşitli metabolitlerin seviyeleri ACT tedavisinden sonra değişti (Şekil 5c). Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, LPS grubunda önemli ölçüde değişen 11 metabolit vardı (Tablo S2, bkz. Ek Tablo 2). Oysa 14 metabolit, ACT tedavisinden sonra belirgin şekilde değişmiştir (Tablo S3, bkz. Ek bölüm 3), 11 metabolik yol içerir (Şekil 5d). ACT'nin etkisi temel olarak amino asit metabolizmasını (fenilalanin, tirozin ve triptofan biyosentezi, D-Glutamin ve D-glutamat metabolizması, Arg biyosentezi, fenilalanin metabolizması), nükleotid metabolizmasını (pürin metabolizması, pirimidin metabolizması), enerji metabolizmasını (azot metabolizması) düzenlemekten oluşuyordu. metabolizması) ve ayrıca kofaktörlerin ve vitaminlerin metabolizması (pantotenat ve CoA biyosentezi). İlginç bir şekilde, metabolom tarafından elde edilen metabolik yollar, Arg biyosentezinin yanı sıra pantotenat ve CoA biyosentezi dahil olmak üzere RNA-seq ile tutarlıydı. Yukarıdakiler, ACT'nin LPS ile uyarılan BV-2 hücrelerinde Arg biyosentezinin yanı sıra pantotenat ve CoA biyosentezini düzenleyebileceğini gösterdi.

Eylem Azaltılmış Lps kaynaklı Bv-2 Mitokondriyal Disfonksiyon

Mitokondri, metabolik yolların merkezinde yer alır. Mitokondrinin mikroglial M1/M2 polarizasyonunda kilit oyuncular olduğuna dair kanıtlar gelişiyor. Önceki araştırmalar, LPS'nin mitokondriyal disfonksiyona neden olabileceğini göstermiştir. Morfoloji ve hücre dağılımındaki mitokondri durumuna genel bir bakış TEM tarafından değerlendirildi. LPS stimülasyonundan sonra, BV-2 hücreleri çekirdek kromatin yoğunlaşması, sitoplazma azalması ve daha az mitokondri gösterdi (Şekil 6a). Ek olarak, LPS grubunun mitokondriyal kristaları, kısmi kristoliz, küçültülmüş boyut ve yuvarlak şekilli morfoloji sergileyerek düzensiz veya hatta kayboldu. İlginç bir şekilde, ACT tedavisi, mitokondride LPS'nin neden olduğu morfolojik değişiklikleri hafifletebilir. Sırayla, MMP dahil olmak üzere LPS ile tedavi edilen BV-2 hücrelerinin mitokondri fonksiyonunu ve mitokondriyal ATP üretimini inceledik. Mitokondride MMP (Şekil 6b, 6c) ve ATP üretimi (Şekil 6d), LPS grubuna kıyasla ACT ile tedavi edilen hücrelerde önemli ölçüde iyileştirildi. Mitokondriyal disfonksiyon, hücredeki artan ROS seviyesi ile ilişkili olabilir. Akış sitometrisi analizi, LPS grubunda ROS içeriğinin aşırı yüklendiğini ortaya çıkardı (Şekil 6e, 6f). Neyse ki, ACT aşırı ROS'u ortadan kaldırdı. ACT'nin ROS'u temizleyerek mitokondri işlevini geri yükleyebileceğini öne sürüyor.

ACT, PGC-1 ve UCP-2'nin yukarı regülasyonu yoluyla mitokondri işlevini restore etti

Peroksizom proliferatif aktive reseptör-ko-aktivatör-1 (PGC-1) mitokondriyal biyogenezde önemli bir rol oynar[15]. LPS'nin uyarılması, mitokondri disfonksiyonu sergileyerek PGC-1 ifadesini azalttı. Dikkat çekici bir şekilde, PGC-1 gen mRNA'sı ve protein ekspresyonu, LPS ile tedavi edilen BV-2 hücrelerinde ACT tedavisi ile önemli ölçüde tersine çevrildi (Şekil 7a). Mitokondriyal ayrışma proteini-2 (UCP-2) de mitokondriyal fonksiyonları düzenlediği biliniyordu. PGC-1'nin aşağı akış proteini olarak, LPS kaynaklı MMP depolarizasyonunu ve ROS üretimini kontrol edebilir. Son raporlar, M1 ve M2 polarizasyonunun zıt düzenlemesi ile mikroglial aktivasyon sürecinin merkezinde olduğunu göstermektedir.[16]. Western blot sonuçları, LPS stimülasyonundan sonra UCP-2 protein seviyesinin düştüğünü gösterdi. LPS ve ACT'nin birlikte tedavisi, LPS tedavisine kıyasla UCP-2 ifadesini yukarı doğru düzenleyebilir. UCP-2'nin mRNA ekspresyon seviyesi de benzer değişiklikler gösterdi (Şekil 7b). Birlikte ele alındığında, ACT geri yüklenen mitokondri, PGC-1 ve UCP-2'nin yukarı regülasyonu yoluyla işlev görür.

ACT, AMPK aktivasyonu yoluyla mitokondriyal fonksiyon kurtarma yoluyla mikroglia M1 polarizasyonunu bastırdı

Anahtar hücresel enerji sensörü olarak AMP ile aktive olan protein kinaz (AMPK), hücre metabolizması dengesinin korunmasında önemli bir rol oynar. Aynı zamanda, PGC-1, AMPK'nın aşağı akış proteinidir. Sonuçlar, LPS'nin AMPK aktivasyonunu inhibe ettiğini ve hücre metabolizması bozukluklarına ve mitokondriyal disfonksiyona neden olduğunu ortaya çıkardı. ACT'nin doza bağlı olarak p-AMPK'nin protein ekspresyonunu arttırabilmesi dikkate değerdir (Şekil 8a). ACT'nin, PGC-1 ifadesini artırabileceği ve AMPK sinyal yolunu aktive ederek mitokondriyal işlevi eski haline getirebileceği önerilmektedir. Bu çalışmada, AMPK aktivasyonunun ACT'nin M1/M2 polarizasyonu üzerindeki düzenleme etkisine katkıda bulunup bulunmadığını araştırmak için, AMPK'nin etkisini inhibe etmek için bileşik C (CC) kullanıldı. ACT tedavi grubundaki aşağı regüle edilmiş NO seviyesinin aksine CC, ACT'nin NO seviyesi üzerindeki etkisini kısmen bloke etmiştir (Şekil 8d). Bu sonuçlara dayanarak, ACT, AMPK aktivasyonu ile BV-2 hücrelerinin M1/M2 polarizasyonunu düzenleyebilir.

ACT bağı ve NF-κB'ye ve ayrıca aktive edilmiş AMPK'ye inhibe

ACT'nin NF-κB ve AMPK proteinlerine bağlanıp bağlanmadığını doğrulamak için moleküler yerleştirme uygulandı. Bulgular, ACT ve NF-κB'nin bağlanma enerjisinin -8,4 kcal/mol olduğunu, ACT ve AMPK'nin ise − 10.8 kcal/mol olduğunu göstermiştir. Önemli özellikler ACT'nin doğrudan NF-κB ve AMPK'ye bağlı olduğunu doğruladı (Şekil 9). Daha sonra, Phe A146, Pro A147, Asn A240, Leu A236, Arg A232, His A183, Arg A239, Glu A179, Cys A149 ve Tyr A227 of NF dahil olmak üzere amino asit cebi içindeki olası bağlanma modları ve etkileşimler daha fazla araştırıldı. -κB (Şekil 9c) ve ayrıca AMPK'nin Phe A213, Gly A481, Ala A370, Leu A482, Arg A212, Ile A369, Arg A106, Phe A215, Phe A108, Thr A309, Ser A119 ve Thr A224 (Şekil 9f). Bu sonuçlar, ACT'nin BV-2 mikroglia M1 polarizasyonunu azaltmak ve M2 fenotipini desteklemek için NF-κB ve AMPK'yi doğrudan etkileyebileceğini gösterdi.