Quercetin'in SK-N-SH Nöroblastom Hücrelerinin Zarları Üzerindeki Avantajlı/Olumsuz Etkisi Bölüm 2

lütfen tıklayınoscar.xiao@wecistanche.comdaha fazla bilgi için

2.2.2. Quercetin'in Antioksidan Aktivitesi

Quercetin'in membranları oksidatif strese karşı korumadaki etkinliğini test etmek için, zarın lipid modellerinin （Şekil 4a） yokluğunda ozona ve 6.25 μM konsantrasyonunda kersetin varlığında (Şekil 4b) maruz bırakıldığı deneyler yapıldı.

Ozonun etkisi altında, hem bağımlılığın, yani π{{0}}f(A) ve Cs-1=f(rn)'nin seyri değişir. Ozon içeren alt fazda tek tabakalı yayılma için elde edilen izotermler, daha küçük bir eğim ve daha düşük A değerlerine doğru bir kayma ile karakterize edildi. Ayrıca ozon etkisi altında Cs-1 değerleri düşmüştür. Bu değişiklikler, yaklaşık 0.4 ppm'lik bir ozon konsantrasyonunda en fazlaydı.cintancheOzon konsantrasyonunda daha fazla artış, tek tabaka özelliklerindeki değişiklikleri artırmadı (Şekil 4a eki).

Şekil 4. Alt faza yayılan nöroblastom tabakalarının lipid modelinin yüzey basınç izotermleri ve karşılık gelen sıkıştırılabilirlik modülü (iç kısım), tampon içinde çözünmüş belirtilen ozon konsantrasyonlarını içeriyordu. İzotermler:(a)antioksidanların yokluğunda;（b）ozon içeren tampona eklenen quercetin （6.25 μM） varlığında.

6.25 μM'lik bir konsantrasyonda kersetin alt faza eklendiğinde, ozon r(A) izoterminin gidişatını önemli ölçüde etkilemedi; ancak sıkıştırma modülünün değerleri ozon varlığında kuersetin yokluğunda olduğu gibi değişti (Şekil 4b ek).

Daha fazla bilgi için lütfen buraya tıklayın

Elde edilen izotermlere dayalı olarak belirlenen tek tabakaları karakterize eden parametrelerin sayısal değerleri Tablo 3'te sunulmuştur.

Tablo 3. Tek tabakaların yüzey parametreleri Alim ve Cs-I, alt fazda yayılan nöroblastom membran modelinin tek tabakaları için hesaplandı, kersetin (6.25 uM) varlığında ve yokluğunda tamponda çözünen belirtilen konsantrasyonlarda ozon içeriyordu. Veriler, üç deneyin ortalamasını temsil eder ± SD. Farklı harfler önemli farklılıkları gösterir (p 0.05'ten küçük veya eşittir).

Ozon varlığında, yoğun bir şekilde paketlenmiş tek tabakada molekül başına (Alim) yüzey alanında hafif bir azalma gözlenir. Bu parametrenin maksimum azalması, kontrole kıyasla yüzde 3,2'dir (saf tampon üzerinde tek katman). Cs-I parametresi de azalır ve 0.6 ppm O üzerindeki ozon konsantrasyonlarında plato değerlerine ulaşır. Bu parametrenin maksimum azalması, kontrole göre yüzde 24'e ulaşır.

Alt fazda 6.25 uM'lik bir konsantrasyonda kersetin bulunduğunda, Alim değerleri (yüzde 1-2) hafifçe düşerken, Cs-1değerindeki azalma yaklaşık yüzde 27'dir.

Ozon ve ozonun mevcudiyetinde Alim değişikliklerinin doğası, kuersetin ile kombinasyon halinde farklı seyirlere sahiptir. Yaklaşık 0.3 ppm'lik bir ozon konsantrasyonunda, kersetin yokluğunda, Aimde aniden yaklaşık 88.3 A2'ye düşer. Daha sonra, karakteristik S-şekli bağımlılığını veren minimum plato değerine ulaşır (Şekil 5a, kırmızı noktalar). Quercetin varlığında, Alim'de hafif bir düzgün monotonik azalma olur ve daha yüksek bir ozon konsantrasyonuna yaklaşık 93.5 A2'lik bir platoya ulaşır(Şekil 5a, yeşil noktalar).

Şekil 5. Molekül başına alanın ozon konsantrasyonuna bağımlılığı (a) ve alt fazdaki nöroblastom zarı için sıkıştırma modülünün ozon konsantrasyonuna (b) bağımlılığı: Kuersetin-kırmızı noktaları olmadan; quercetin-yeşil noktaları ile. Çizgiler herhangi bir fiziksel model sunmuyor, matematiksel olarak yerleştirilmiş ve parametre değişikliklerini izleme kolaylığı için çizilmiştir. Maksimal tabaka sıkıştırma modülü değerleri, her ikisi için de ozon konsantrasyonu ile benzer şekilde değişir: Quercetin yokluğunda ve varlığında (Şekil 5b).

3. Tartışma

Quercetin'in etki mekanizması uzun yıllardır yoğun bir şekilde incelenmiştir, ancak deneylerin sonuçları genellikle çelişkilidir ve bazı durumlarda bu bileşiğin faydalı olduğunu ve diğerlerinde hücreler için elverişsiz olduğunu gösterir. Mevcut çalışmaların analizi, bu bileşiğin hücreler üzerindeki etkisinin, membranlarla etkileşimi ve antioksidan aktivite olmak üzere iki yönüyle ilgili olduğunu göstermektedir. Ancak hücrelerde, kersetin etkisinin bu iki modunu ve bu bileşiğin, örneğin antitümör aktiviteye sahip potansiyel bir madde olarak uygunluğunun değerlendirilmesini ayırt etmek mümkün değildir. Bu nedenle deneyler, bu bileşiğin membranların mekanik özellikleri üzerindeki etkisini ve ayrıca model sistemdeki antioksidan aktivitesini kalitatif ve kantitatif olarak değerlendirecek şekilde planlanmıştır. diğer metabolik yolların aktivitesi.

Gerçekleştirilen deneylere dayanarak, en düşük konsantrasyonlarda (6.25 uM) bile kersetin'in, nöroblastom hücrelerinin zarının lipid kısmını taklit ederek model tek tabakalarını değiştirdiği (Alimdeğerindeki artışla belirtildiği gibi) doğrulandı. Düşük konsantrasyonlarda bile beyne ulaştığında quercetin'in bu hücrelerin zarlarıyla etkileşime girme olasılığına işaret ediyor. Bu, zarları nispeten büyük miktarlarda lipid içeren sinir hücreleri için özellikle önemlidir.

Cistanche bağışıklığı artırabilir

Sinir hücreleri için yaklaşık lipid-protein oranı yüzde 80:20'dir ve örneğin eritrosit zarı için bu oran yüzde 50:50'dir [29]. Sinir hücrelerinin zarındaki böyle bir lipit seviyesi, bu hücrelerin elektrik sinyallerini iletmedeki rolüyle bağlantılıdır. Aynı zamanda, hücre zarının esneklik ve katılık gibi fizikokimyasal özelliklerindeki küçük değişiklikler bile bu işlevi önemli ölçüde bozabilir.

Aksiyon potansiyeli, iyon kanallarının çalışması sayesinde sinir hücresinin zarı boyunca aktarılır ve daha sonra iyon pompalarının etkisi sayesinde dinlenme potansiyeli geri yüklenir. Bu proteinlerin düzgün çalışması (özellikle şekillerine göre belirlenir) lipid ortamına yakından bağlıdır. Ayrıca, zarın mekanik özelliklerindeki değişiklikler, geçiş mekanizması tam olarak zarın mekanik özelliklerine bağlı olan kanalların çalışmasını bozabilir.

Bu tezler, kuersetin'in hücre zarı üzerindeki etkisinin, diğerlerinin yanı sıra, Ca2 artı iyonlarının ve/veya Ca2 artı metabolizmasının taşınmasıyla ilgili olduğunu gösteren çalışmalarla doğrulanmıştır [30,31]. Bu nedenle, kersetin moleküllerinin zarın (özellikle sinir hücrelerinin) ortamına girmesi, işlevleri üzerinde önemli sonuçlar doğurabilir.

Model sistemlerde belirlenen kersetin etkisinin hücrelerde yararlı mı yoksa olumsuz bir rol oynayıp oynamadığını kontrol etmek için model membranlar için elde edilen sonuçlar bu bileşiğin tüm nöroblastom hücreleri üzerindeki etkisiyle karşılaştırılmıştır. SK-N-SH hücreleri için MTT testi yapıldı,Cistanche Özü Anti Alzheimermitokondriyal dehidrojenaz enzimleri ile doğru orantılı olan hücrelerin hücre canlılığı hakkında bilgi verir.

Elde edilen sonuçlar, 100 ve 200uM konsantrasyonlarda quercetin varlığının canlı hücre sayısını arttırdığını gösterdi. Bao ve diğerleri tarafından da benzer sonuçlar elde edilmiştir. [32], kersetin'in PC-12 hücreleri üzerindeki etkisini araştırıyorlar. Hücre zarının bozulması hakkında bilgi veren hücre dışı ortama LDH sızıntısı da aynı kersetin seviyelerinde incelendi. Elde edilen sonuçlar, test edilen hücrelerin zarlarının bu koşullar altında zarar görmediğini gösterdi. Botlar ve ark. [2], kuersetin'in akciğer epitel hücreleri üzerindeki etkilerini inceleyerek benzer sonuçlar gözlemledi. Bu nedenle, bu konsantrasyonlarda quercetin'in hücreler üzerinde olumlu bir etkiye sahip olduğu ve Canlılıklarını arttırdığı sonucuna varılabilir.

Quercetin etki mekanizmasının ikinci önemli yönü, antioksidan özellikleri ile ilgilidir. Çalışılan polifenolün ilişkili etkisini değerlendirmek için, oksidatif strese maruz kalan hücrelerde quercetin'in koruyucu bir rol oynayıp oynamadığının kontrol edildiği deneyler yapıldı. Hücre ortamına H, O2 sokularak oksidatif stres oluşturuldu.Belleği geliştirmek için CistancheBu çalışmada gösterildiği gibi, hidrojen peroksit, mitokondriye verilen hasar olarak ifade edilen önemli hücre ölümüne neden olur.

SK-N-SH hücreleri, 3 ve 5 mM H2O2 içeren bir ortamda 3 saat boyunca kültürlendiğinde, hücre canlılığı, işlenmemiş hücrelerinkinin yaklaşık yüzde 44'üne düştü (MTT tahlili). Çalışmalar, hücrelerin quercetin ile 24 saat ön tedavisinin, H2O2 ile tedavi edilen hücrelere göre canlı hücre sayısında bir artışa neden olduğunu gösterdi. Suematsu et al. [13] benzer etkiler bildirmiştir.

Ayrıca lipid peroksidasyonunun son ürünü olarak oksidatif stresin bir biyobelirteç olan MDA seviyesini de ölçtük[33]. Hücrelerin yüksek kersetin konsantrasyonları ile ön muamelesi, ardından hidrojen peroksit ilavesi, tek başına H2O'ya maruz kalan hücrelere kıyasla MDA içeriğinde hafif bir artışa neden oldu. Bunun nedeni, quercetin'in (daha yüksek konsantrasyonlarda) ayrıca oksit indirgeyici aktivasyona girebilmesi ve hücre içi reaktif oksijen türleri üreterek redoks döngüsünün bir konusu olabilmesi olabilir [34].

Hücrelerin yalnızca oksidatif strese maruz kaldığı duruma kıyasla, quercetin ve H2O2 ile tedavi edilen hücrelerin membran yıkımında (değişmeyen LDH seviyesi ile gösterildiği gibi) önemli bir değişiklik olmamıştır. Bu nedenle, lipid peroksidasyonundaki artışa rağmen (yüksek kersetin konsantrasyonlarında), bunun membranları yok edecek ve devamlılığını bozacak kadar önemli olmadığı sonucuna varılabilir.

Doğal sistem için elde edilen gözlemler, hem quercetin konsantrasyonunun hem de stres seviyesinin tam olarak kontrol edilmesinin mümkün olduğu bir model sistem için alınanlarla karşı karşıya kaldı. Nöroblastom zarının lipid kısmının oksidatif strese ne kadar dirençli olduğu kontrol edildi. Ozon tampona dahil edilerek stres koşulları yaratılmıştır, burada su ortamı ozon, diğerleri arasında hidroksil radikalleri ve süperoksit anyon radikalleri arasında oksidatif radikaller oluşturan ayrışma reaksiyonlarına girer [35]. Elde edilen reaktif oksijen türlerinin karışımı, redoks durum bozukluğu dengesizliği [36-38] nedeniyle hücrelerde doğal olarak oluşanlara karşılık gelir.

Stresin etkisi altında, izotermlerin şekli değişti, bu da yoğun bir şekilde paketlenmiş tek tabakada tek molekül başına alanda önemli bir azalma olduğunu gösterdi. Bu tür değişiklikler, yağ asidi zincirlerindeki doymamış bağların oksidasyonu nedeniyle gerçekleşti. Bu etki, ozon konsantrasyonundaki artışla yaklaşık {{0}}.3 ppm'ye yükseldi ve ardından ROS'taki artışa rağmen bu izoterm parametresi aynı seviyede kaldı. Bu, yaklaşık 0,3 ppm'lik bir ozon konsantrasyonunda, tek tabakada bulunan tüm doymamış yağ asitlerinin oksitlendiği anlamına gelir (nöroblastom modelinde, doymamış yağ asitlerinin toplam miktarı yüzde 52 idi)

Oksitlenmiş tek tabakalar önemli ölçüde sertliğe sahiptir,cistanche ÇinceCs-1 değeriyle temsil edildiği gibi (bu parametrenin değeri ne kadar yüksekse, katmanın sertliği de o kadar büyük olur). Quercetin varlığında, （6.25 μM） düşük konsantrasyonda bile, Alim değerindeki değişikliklerle görselleştirildiği üzere ozona maruz kalan zarın modifikasyonları önemli ölçüde azaldı (Şekil 5a), bu da bu bileşiğin antioksidan aktivitesini kanıtlıyor. . Bununla birlikte, quercetin doymamış yağ asitlerini oksidasyona karşı koruyarak radikalleri temizlemesine rağmen, membran sertliğindeki değişiklikleri tersine çevirmediğini belirtmekte fayda var (Şekil 5b).

Böylece, kersetin'in bir antioksidan etki gösterdiği, ancak lipid molekülleri arasındaki varlığının, laverin parametrelerini etkilediği (belirlediği) gösterilmiştir, yani, yağ asidi zincirlerinin oksidasyona karşı korunmasına rağmen, membran sertliği önemli ölçüde azalmıştır (Cs- Kontrole kıyasla yaklaşık yüzde 25 daha düşük değer veriyorum).

Bu sonuçlar, kersetin varlığından kaynaklanan hücresel etkilerde ana faktörün membran değişikliği olduğunu göstermektedir. Ancak bu değişikliğin sonuçları (sinyalleşmenin değişmesi, taşınma) polifenol moleküllerinin sayısına, zarın ilk bileşimine ve hücrenin işlevine bağlı olarak değişir. Bu, farklı koşullarda ve farklı çalışmalarda quercetin'in neden koruyucu bir etki gösterdiğini, diğerlerinde ise tam tersini açıklıyor.

Yüksek oksidatif stres durumunda, antioksidan etki, bileşenlerini hasara karşı koruyarak hücreye yardımcı olur. Bununla birlikte, zarlar, bu bileşiğin çevrelerine yerleştirilmesiyle önemli ölçüde değiştirilirse, değişen zar sertliği ile sinyalleşme veya taşıma yollarının dağılımı ile sonuçlanırsa, bu olumsuz etkilere yol açabilir. Ayrıca bir hücrede hem zarlarla ilgili hem de oksidatif stres oluşturan birçok işlemin aynı anda gerçekleştiği unutulmamalıdır. Spesifik göstergelerin seviyesi belirlenerek gözlemlenebilen ve ölçülebilen etki her zaman toplamdır. Bu nedenle, kuersetin etkisinin olumlu ve olumsuz olarak algılandığı durumlar vardır.

4. Malzemeler ve Yöntemler

4.1.Malzemeler

Nöroblastom hücre zarının lipid kısmının modelinin bileşimi, [39-41] yazarlarının çalışmasına dayalı olarak oluşturulmuştur. Fosfolipitler: 1-oleoil-2-palmitoil-sn-gliserol-3-fosfokolin;1-heksakosanoil-d4-2-hidroksi-sn-gliserol-3-fosfokolin; 1,2-dioleoil-sn-gliserol-3-fosfokolin; L- -fosfatidiletanolamin (Beyin); sphingomyelin (Beyin)-(Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL, ABD). Kolesterol satın alındı ​​(Sigma-Aldrich, Darmstadt, Almanya). Fosfolipid kolesterol oranı yüzde 79 ila yüzde 21 idi. Doymuş yağ asitlerinin doymamış yağ asitlerine oranı yüzde 48 ila yüzde 52 idi.

Kimyasal saflığın çözücüleri (kloroform, etanol)-Poch (Gliwice, Polonya); HLP 5 Hydrolab (Straszyn, Polonya) tarafından üretilen taze deiyonize su. Kültür ortamı, serum ve antibiyotikler CytoGen GmbH'den satın alındı. Deneylerde kullanılan kimyasal reaktifler Sigma Aldrich'ten temin edilmiştir.

4.2.Hücre Kültürü

İnsan nöroblastom hücre dizisi SK-N-SH (Avrupa Doğrulanmış Hücre Kültürleri Koleksiyonu (ECACC), yüzde 0.01 penisilin ile takviye edilmiş Dulbecco'nun Değiştirilmiş Kartal Ortamı (DMEM) içinde yüzde 10 fetal sığır serumu (FBS) içinde kültürlendi. -% 5 CO2 içeren nemli bir atmosferde 37 derecede streptomisin.

4.3. Hücre Canlılığının Ölçülmesi (MTT Testi)

Hücreler bir {{0}}kuyu plakasına 0,1 mL hacimde oyuk başına 1 x 104 hücre yoğunluğunda ekildi. Hücreler 24 saat boyunca çeşitli konsantrasyonlarda quercetin (3.75-200 μM）) ile muamele edildi. Bu süreden sonra, 3 saat boyunca 3 mM ve 5 mM hidrojen peroksit eklendi. HO2 at3 ve 5 μM konsantrasyonları, istatistiksel çalışmalar için aynı tedaviler olarak işleme tabi tutuldu ve 3-5 uM H2O2 işlemi olarak tanımlandı.

Daha sonra 50μL MTT（3-【4,5-dimetiltiazol-2-il】-2,5 difenil tetrazolyum bromür）çözeltisi (5'lik steril stok çözelti) mg/mL) hücrelere eklendi ve nemlendirilmiş yüzde 5 CO2 atmosferinde 37 derecede 2 saat inkübe edildi. Daha sonra her bir kuyucuğa 0.4 mL dimetil sülfoksit(DMSO) ilave edildi ve 10 dakika tutuldu. Santrifüjden sonra süpernatantın optik yoğunluğu bir mikrolitre plaka okuyucu (BioTek Instruments, VT, ABD) kullanılarak 570 nm'de ölçüldü.

4.4.Mem1brane Hasar Testi (LDH Testi)

Laktat dehidrojenaz (LDH) tahlili, hücre zarı bütünlüğünün bir işareti olarak kullanıldı.

Kuyu başına 1 × 1{{10}}* hücre miktarındaki hücreler bir 96-kuyu plakasına ekildi ve kuersetin （3 varlığında inkübe edildi.75-200 μM） 24 saat için; Daha sonra 3 saat boyunca 3 mM ve 5 mM H2O eklendi. 0.5 mL 0.75 mM sodyum piruvat ve 37C'de 10 dakika ısıtılmış 10 uL NADH（140 μM）（ içeren tüplere 150 μL süpernatant eklenerek 37 derecede 30 dakika inkübe edildi. Daha sonra numuneye 0,5 mL 2,4-dinitrofenilhidrazin eklendi ve 1 saat sonra 450 nm'de absorbans ölçüldü.

4.5. Lipid Peroksidasyonu (MDA Konsantrasyon) Tayini

Membran lipid peroksidasyonu, malondialdehit (MDA) ile tiyobarbitürik asit (TBA) reaksiyonu ile tahmin edildi. Hücreler, {{0}}kuersetin ve H, O2 (yukarıda açıklanan konsantrasyonlarda ve zamanlarda) içeren kuyucuklu plakalara, kuyu başına 1x104 hücre miktarında { {10}}.25 mL. İşlemden sonra numuneler toplandı ve santrifüjlendi (1000×&,5dk). Peletlere 0.5 mL yüzde 0.5 TCA eklendi, 1 dakika vortekslendi ve 5 dakika sonikasyon yoluyla parçalandı. 10 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüjden sonra, yüzde 0.5 TBA ile 1.25 mL yüzde 20 TCA'ya 0.4 mL süpernatan ilave edildi ve 30 dakika boyunca kuru bir termoblok (100 derece) içinde ısıtıldı. Soğutulduktan sonra, absorbans, 155 M-1 cm-1'e eşit MDA molar sönme katsayısı kullanılarak 532 nm'de ölçülmüştür.

4.6.Model Membranlar

Tampon Ozonlama. Fosfat tamponu (0.01 M, pH 7.4), ozon jeneratörü FM 500 (Grekos, Polonya) tarafından üretilen ozon ile doyuruldu. Bir tampon içindeki ozon konsantrasyonu, Bader ve Hoigne'ye göre belirlendi [42].

Yüzey Basıncı İzotermleri.cistanche penis büyümesi5 mm/dk bariyer hızına karşılık gelen sabit bir sıkıştırma oranında yüzey basıncı izoterm kaydı için Langmuir teknesi (KSV, Finlandiya) kullanıldı. Lipid tek tabakası, kersetinli veya ozonsuz ve ozonlu veya ozonsuz, sulu 0.01 M fosfat tamponu, pH 7.4'ten oluşan alt faza 1 mg/mL konsantrasyonda tanımlanmış bir miktarda lipid kloroform çözeltisinin yayılmasıyla oluşturulmuştur. Yüzey gerilimleri bir Pt-Wilhelmy plakası ile ölçülmüştür. Deneyler 25 derece ±1 derecede gerçekleştirilmiştir.

4.7. İstatistiksel analiz

Test edilen her varyant için üç ila altı bağımsız analiz yapıldı ve ortalaması alındı ​​(±SD). Kontrollere kıyasla önemli farklılıklar, SAS ANOVA prosedüründen yararlanılarak tahmin edildi. İstatistiksel analiz Duncan'ın çoklu aralık testi ile yapıldı, p<0.05. statistical="" tests="" were="" carried="" out="" using="" statistica="" 13.3(cracow,="">

Yazar Katkıları: Kavramsallaştırma, BK, BD ve ER-S.methodology, BBBD; yazılım, BK, BDvalidation, BK, BD, ER-S., ABwriting—orijinal taslak hazırlama BK, BD, ER-S., yazma—inceleme ve düzenleme, BK, BD, ER-S., ABvisualization, BK, BDsupervision, BK, BD, ER-S., ABTüm yazarlar makalenin yayınlanmış halini okumuş ve kabul etmiştir.

Finansman:Bu araştırma hiçbir dış finansman almamıştır.

Kurumsal İnceleme Kurulu Açıklaması: Uygulanamaz.

Bilgilendirilmiş Onam Beyanı: Uygulanamaz.

Veri Kullanılabilirlik Bildirimi: Veriler makale içerisinde yer almaktadır. Çıkar Çatışmaları: Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Bu makale Molecules 2021, 26, 4945'ten alınmıştır. https://doi.org/10.3390/molecules26164945 https://www.mdpi.com/journal/molecules