Yaşlanma ve Uzun Ömür, Organizmalar İçin Her Zaman Baştan Çıkarıcı Konular Oldu. Kendini Yenileme Kapasitesine Sahip Bir Yetişkin Kök Hücre Türü Olarak

Lütfen iletişime geçinoscar.xiao@wecistanche.comdaha fazla bilgi için

Soyut:Mezenkimal kök hücrelerde (MSC'ler) yaşlanma, yalnızca MSC'lerin rejeneratif tıpta uygulanmasını engellemekle kalmaz, aynı zamanda biyolojik yaşlanma ve dejeneratif hastalıkların gelişimi ile de yakından ilişkilidir. Bu çalışmada, kurkuminin (Cur) köpek kemik iliği kaynaklı MSC'ler (cBMSC'ler) üzerindeki yaşlanma karşıtı etkilerini araştırdık ve otofaji modülasyonuna dayalı potansiyel etki mekanizmasını daha da aydınlattık. cBMSC'ler, bir erken yaşlanma hücre modeli oluşturmak için standart prosedürlerle in vitro olarak genişletildi.cistanche dozajı redditKanıtlarımız, cBMSC'lerin üçüncü geçişi ile karşılaştırıldığında, cBMSC'lerin altıncı geçişinde birçok tipik yaşlanma ile ilişkili fenotipin gözlendiğini göstermektedir. Cur tedavisi, cBMSC sağkalımını iyileştirebilir ve Cur(1 uM) tedavisinin koloni oluşturan birim fibroblastların (CFU-Fs) verimliliğini iyileştirebileceği ve pluripotent transkripsiyon faktörlerinin (SOX{{5}) mRNA ekspresyonunu artırabileceği gözlemlerine göre cBMSC yaşlanmasını geciktirebilir. } ve Nanog), ayrıca yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz (SA- -gal) aktivitelerini ve yaşlanma ile ilgili belirteçlerin (pl6 ve p21) ve pro-inflamatuar moleküllerin (tümör nekroz faktörü- mRNA ekspresyonunu) inhibe eder. (TNF-a) ve interlökin-6(IL-6)). Ayrıca, Cur（0.1 uM~10μM）'nin, mikrotübül ile ilişkili protein 1 hafif zincir 3'ün (LC3), otofajiyi aktive eden kinaz gibi unc51-yukarı regülasyonu ile tanımlandığı gibi, otofajik aktiviteyi arttırdığı gözlemlendi. -1 (ULK1), otofaji ile ilgili gen (Atg)7 ve Atg12 ve hafif zincir 3(LC3-II) tip II'nin oluşumu, böylece otofajik vakuolleri ve asidik veziküler organelleri arttırır. p62 protein seviyesinde önemli bir düşüşe neden olur. Ayrıca, otofaji aktivatörü rapamisin (RAP) ve Cur'un cBMSC'lerin yaşlanma özelliklerini kısmen iyileştirdiği bulunurken, otofaji inhibitörü 3-metiladenin(3-MA) cBMSC'lerin yaşlanmasını şiddetlendirdiği ve Cur tedavisinin bastırılmış otofajiyi geri yükleyebilir ve 3-MA kaynaklı cBMSC yaşlanmasına karşı koyabilir. Bu nedenle, çalışmamız Cur kaynaklı otofajinin önemli rolünü ve bunun cBMSC yaşlanmasını iyileştirme üzerindeki etkilerini vurgular ve yaşlanmayı geciktirmek ve MSC'lerin terapötik potansiyelini geliştirmek için yeni bilgiler sağlar.

Daha fazla bilgi için lütfen buraya tıklayın

Anahtar Kelimeler:kurkumin;yaşlanma; otofaji; köpek kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler

1. Giriş

Yaşlanma ve uzun ömür, organizmalar için her zaman baştan çıkarıcı konular olmuştur. Kendini yenileme, bağışıklığı baskılama, farklılaşma ve göç etme kapasitesine sahip bir yetişkin kök hücre türü olarak mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) yaygın olarak kemik iliği, yağ dokusu, amniyotik sıvı, plasenta, göbek bağı gibi çeşitli doku ve organlarda bulunur. kord ve kas [1,2] ve bir organizmanın ömrü boyunca doku homeostazını sürdürmede önemli bir rol oynar [3,4]. Biriken kanıtlar, biyolojik yaşlanmanın ve birçok dejeneratif hastalığın gelişiminin MSC yaşlanmasına bağlanabileceğini ortaya koymuştur [5,6]. Ek olarak, MSC'ler umut verici hücre bazlı rejeneratif terapi kaynaklarıdır, ancak tedaviler için minimum MSC transplantasyon sayısını (20-100 milyon) elde etmek için genellikle in vitro genişletilmeleri gerekir [7]. Bununla birlikte, in vitro kültür, MSC'lerin in vivo mikro ortamını tamamen simüle edemez ve kaçınılmaz olarak hücresel yaşlanmayı tetikler [8,9]Mitoz hücrelerde yaşlanma, telomer disfonksiyonu [10], DNA gibi çeşitli stresörlere yanıt olarak meydana gelir. hasar [11], oksidatif stres [12] ve onkogen aktivasyonu [13] ve sonuçta hücre bölünmesinin sona ermesine yol açar. Ayrıca, yaşlanan MSC'ler, immünomodülasyon, farklılaşma ve göç dahil olmak üzere biyolojik fonksiyonlar üzerinde olumsuz bir etki gösterir [14]. MSC'lerde yaşlanmayı geciktirmek için etkili stratejiler oluşturmaya yönelik birçok çalışma yapılmıştır. Son zamanlarda, organizma sağlığını ve uzun ömürlülüğünü desteklemek için bitki türevli birkaç ürün önerilmiştir ve MSC yaşlanmasını geciktirmek için umut verici araçlar olabilir [15].

Cistanche yaşlanmayı geciktirebilir

Geleneksel Çin tıbbı zerdeçalından elde edilen hidrofobik bir polifenol olan Curcumin(Cur), doku hücrelerinde ve bazı hastalık modellerinde anti-inflamatuar, antioksidan, anti-apoptotik, anti-tümör ve yaşlanma karşıtı etkileri nedeniyle büyük ilgi görmüştür. {4}}]. Çok sayıda çalışma, Cur'un osteoartiküler, nörolojik, üreme ve kardiyovasküler hastalıklar dahil olmak üzere yaşa bağlı hastalıklarda sağlıkla ilgili faydaları olduğunu göstermiştir [20-24]. Yaşlanma, kas-iskelet sistemi değişiklikleri ve osteoartiküler hastalıkların başlaması ve ilerlemesi ile ilişkilidir. Cur ile yapılan kronik diyet müdahalesinin, orta yaşlı maymunlarda el ve parmakların motor fonksiyonunu iyileştirdiği ve yaşlı iskelet kası üzerinde faydalı etkileri olduğu bulunmuştur [25,26]. Buhrmann ve meslektaşlarından elde edilen veriler, Cur'un kondrosit sağkalımını ve inflamatuar yanıtları dengeleyerek çevre kaynaklı osteoartriti hafifletebileceğini ortaya koymuştur [27,28]. Ek olarak Cur, otofaji ve inflamasyona aracılık ederek nöroprotektif etkiler gösterir ve bu nedenle Alexander hastalığı, Alzheimer hastalığı ve Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkları olan hastalar için etkili bir tedavi olabilir [29,30].

Gerçekten de Cur'un pleiotropik aktiviteye sahip olması, MSC'ler üzerindeki aktivasyon ve koruma etkilerine bağlanabilir [31,32]. Birkaç çalışma, Cur'un immünomodülatör yeteneklerin düzenlenmesinde rol oynadığını doğrulamıştır; MSC'lerin farklı hücre soylarına (nörosit, kondrosit, adiposit ve osteoblast) farklı potansiyeli ve çoklu sinyal mekanizmaları bu süreçte yer alır [2831,33-35]. Ayrıca Cur, telomeraz ters transkriptaz (TERT) gen ekspresyonundaki artıştan dolayı sıçan yağ dokusu türevli mezenkimal kök hücrelerinin (ADSC'ler) ömrünü iyileştirmek için iyi bir antioksidan olarak kabul edilir [36]. Yakın tarihli bir çalışma, p65'in Cur tarafından inhibisyonunun, insan göbek kordonundan türetilen MSC'lerde hücresel yaşlanmayı ve inflamatuar aktivasyonu önleyebileceğini göstermiştir [37].cistanche özü faydalarıAçıktır ki, muazzam terapötik potansiyelleri nedeniyle Cur'un MSC'lerde yaşlanma karşıtı etkilerine daha fazla dikkat çekilmiştir, ancak bu etkinin altında yatan mekanizmalar hala belirsizdir. İn vitro çalışmalardan elde edilen bazı kanıtlar, Cur tarafından uygulanan faydalı etkilerin, otofaji modülasyonuna atfedilebileceğini doğrulamıştır [29,38-41]. Han ve meslektaşları, Cur'un insan göbek damarı endotel hücrelerini (HUVEC'ler) H2O2-indüklediği oksidatif hasardan koruyabildiğini ve fosfatidilinositol 3-kinaz (PI3K)/Akt/ yoluyla otofajiyi güçlendirerek pozitif etkilerin meydana geldiğini gösterdi. rapamisinin memeli hedefi (mTOR) inhibisyonu [40]. Başka bir çalışma, Cur'un kardiyomiyositler arasında hipoksi/reoksijenasyon (H/R) kaynaklı apoptozu ve aşırı otofajiyi inhibe ederek hücre sağkalımını destekleyebildiğini gösterdi [41]. Bu nedenle, Cur'un otofajinin pozitif veya negatif düzenleyicisi olarak çalışıp çalışmadığı, stres üreten uyarana ve hücresel ayara bağlıdır ve Cur tarafından otofaji modülasyonunun MSC yaşlanmasını geciktirmek için etkili bir strateji olup olmadığını belirlemek için daha fazla ayrıntı gereklidir. Hücre içi maddeler için bir bozunma ve geri dönüşüm yolu ilkesi olarak, otofaji, hücresel homeostazın korunmasında ve çevresel baskıya dayanmada çok önemli bir rol oynar ve hücresel yaşlanmayı geciktirmek ve yaşa bağlı hastalıkları tedavi etmek için muazzam bir potansiyel sergilemiştir. Organel disfonksiyonu ve toksik metabolit birikimi, yaşlanan MSC'lerin temel özellikleridir [42], bu nedenle otofaji ve yaşlanma arasında potansiyel bir bağlantı olduğunu düşündürür. Ma ve meslektaşları, yaşlı BMSC'lerin otofajik aktivitesinin genç BMSC'lere kıyasla azaldığını ve otofaji inhibitörü 3-metiladenin (3-MA) genç MSC'lerde yaşlanmayı hızlandırabildiğini buldular; aksine, otofaji aktivatörü rapamisinin (RAP) yaşlı BMSC'lerin biyolojik özelliklerini kısmen eski haline getirebileceğini bulmuşlardır[5]. Yakın tarihli bir çalışma, D-galaktoz(D-gal) tarafından indüklenen MSC yaşlanmasında RAP ve 3-MA'nın kullanılması yoluyla modüle edilmiş otofajinin rolünü incelemiş ve RAP'nin MSC yaşlanmasını önemli ölçüde azalttığını göstermiştir [43]. İlginç bir şekilde, birkaç çalışma, yaşlanan MSC'lerde otofajide bir artış gözlemlendiğini ve MSC yaşlanma süreçlerini sürdürmek için otofajinin vazgeçilmez olduğunu göstermiştir [44,45]. Bu nedenle, otofajinin MSC'lerde yaşlanmanın olumlu veya olumsuz bir düzenleyicisi olarak kabul edilip edilemeyeceği çelişkili ve belirsizdir. Sonuç olarak, yaşlanmayı geciktirmek ve MSC'lerin terapötik potansiyelini geliştirmek için daha geniş bir perspektif sağlayabilecek otofaji, MSC yaşlanması ve Cur arasındaki ilişkiyi araştırmak ilginç olacaktır.

Bu çalışmada birincil amacımız, Cur tedavisinin köpek kemik iliği kaynaklı MSC (cBMSC) yaşlanmasını geciktirip geciktiremeyeceğini ve altta yatan mekanizmanın otofaji modülasyonu ile korele olup olmadığını açıklamaktı. Bu amaçla, yaşlanan cBMSC'lerde Cur'e maruz kaldıktan sonra fenotipik karakterizasyonu, otofajik aktiviteyi ve gen ekspresyonunu ve ayrıca otofaji ile cBMSC yaşlanması üzerindeki etkileri arasındaki ilişkinin 3-MA ve RAP kullanılarak belirlenip belirlenmediğini değerlendirdik. .

2. Sonuçlar

2.1. cBMSC'lerin özellikleri

cBMSC'ler standart prosedürlerle in vitro olarak genişletildi ve dokuz nesil boyunca stabil bir şekilde geçirildiği gösterildi (veriler gösterilmemiştir). cBMSC'ler, kültürleme işlemi boyunca plastik yapışık ve fibroblast benzeri bir görünüm sergiledi (Şekil 1A). cBMSC'lerin farklılaşma kapasitesi, adipojenik ve osteojenik indüksiyon ile doğrulandı (Şekil 1B, C). cBMSC'lerin immünofenotipi, akış sitometrisi kullanılarak değerlendirildi. Sonuçlar, hücre popülasyonunun CD90, CD105 ve ITGB1'i pozitif olarak ifade ettiğini ve CD31, CD34 ve CD45'i negatif olarak ifade ettiğini gösterdi, bu da bunların hematopoietik kökenden ziyade mezenkimal olduğunu düşündürdü (Şekil 1 ve Tablo 1).

2.2.cBMSC'ler In Vitro Genişleme Boyunca Yaşlanan Özellikleri Aşamalı Olarak Gösterir

Erken geçiş cBMSC'leri (P1 ve P3) uzun bir fusiform veya üçgen şekil sergiler ve in vitro büyümeden sonra bir girdap şeklinde düzenlenir (Şekil 2A). Daha sonra, cBMSC'ler, genişlemiş ve düz bir morfoloji ve proliferasyonda bir azalma ile karakterize edilen, in vitro uzun süreli ekim sırasında yavaş yavaş yaşlanma ile ilişkili fenotipler sergiledi (Şekil 2A, B). Ek olarak, bir koloni oluşturan birim fibroblast (CFU-F) tahlilinden elde edilen sonuçlar, hem CFU-F sayısının hem de kolonilerin boyutunun, aşağı regüle edilmiş mRNA ile tutarlı olarak kültür pasajları boyunca (Şekil 2C) önemli ölçüde azaldığını gösterdi. 6. ve 9. pasajda pluripotent transkripsiyon faktörleri Nanog ve SOX-2 ifadesi (Şekil 2G).

Senesans ile ilişkili -galaktosidaz (SA- -gal), aktivitesi hücresel yaşlanma ile güçlü bir şekilde ilişkili olan bir lizozomal enzimdir [46]. SA- -gal boyamanın sonuçları, SA- -gal pozitif hücre sayısının yüzde 7,5±2,4'ten (P3) 65'e çıktığını gösterdi.0 ±5.0 sırasıyla yüzde (P6) ve yüzde 87,3± 3,3 (P9) (Şekil 2D).cistanche cengiz hanEk olarak, yaşlanma ile ilişkili salgı fenotipinin (SASP) bileşenleri olarak işlev gören hücre döngüsü kinaz inhibitörlerinin (p21 ve p16) ve proinflamatuar moleküllerin (TNF- ve IL-6) ekspresyonunda artışlar tespit edildi. 6. ve 9. pasajda (Şekil 2E, F). Bu nedenle, cBMSC'ler yaşlanan fenotiplerde geçişe bağlı bir artış sergiler ve 9. geçişte çoğalmayı durdurur.

2.3. Cur, cBMSC'lerin Yaşlanma Durumunu Hafifletiyor

6. pasaj cBMSC'leri, Cur'un yokluğunda veya varlığında 0.1,0.5,1,5 veya 10μmol/mL（μM） dozlarında inkübe edildi. 12h,24h, 48h ve 72h ve hücresel canlılıkları CCK-8 kullanılarak değerlendirildi. Sonuçlar, Cur'un (0.1-10 uM) cBMSC'lerde toksik bir etki yaratmadığını ve 24 saatlik tedaviden sonra cBMSC'lerin canlılığını arttırmada elle tutulur etkileri olduğunu gösterdi (Şekil 3A). Cur'un hücresel yaşlanma üzerindeki etkisini değerlendirmek için, cBMSC'ler 24 saat boyunca farklı Cur (0,1,1 ve 10 uM) konsantrasyonlarına maruz bırakıldı. Sonuç, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında Cur（1 μM ve 10uM） ile tedaviden sonra cBMSC'lerde SA- -gal-pozitif hücre sayısının önemli ölçüde azaldığını gösterdi (Şekil 3B). CFU-F deneyleri, Cur'un cBMSC'lerin (P6) kendi kendini yenileme verimliliği üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılmıştır. 1 uM Cur dozunun, cBMSC'lerin CFU-F'sinin verimliliğini artırmak için en etkili konsantrasyon olduğu bulundu. Bununla birlikte, 10 μM Cur dozunun cBMSC'lerin kendini yenileme verimliliği üzerinde olumsuz etkileri oldu(Şekil 3C), Ek olarak, Cur'un yaşlanmayı hafifletici etkisi, 1 μM'lik bir dozda gözlendi, p16'nın aşağı regülasyonu ile kendini gösterdi, IL-6 ve TNF- ve Nanog ve SOX-2 ifadesinin yukarı regülasyonu (Şekil 3D-F).cistanche ömrü uzatmaBirlikte ele alındığında, bu sonuçlar Cur'un 1 uM'lik bir dozda yaşlanmış cBMSC'ler üzerinde sitoprotektif etkileri etkili bir şekilde uygulayabildiğini göstermektedir.

2.4. cBMSC'lerde Cur Tedavisi Geliştirilmiş Otofajik Aktivite

Lizozom fonksiyonel aktivasyonu, otofajinin seyrinde kritik bir rol oynar ve lizozomal asitlenme bozuklukları, lizozomal degradasyon fonksiyonuna terstir [38]. Bu nedenle, otofajik aktivite ilk olarak lizozomal asitleşmeyi izleyebilen LysoTracker boyaması ile tespit edildi. Sonuç, Cur ile ön koşullandırmanın doza bağlı olarak cBMSC'lerde kırmızı floresan yoğunluğunu arttırdığını gösterdi, bu da lizozom asitlenmesinin arttığını gösterdi (Şekil 4D).

Cur'un cBMSC'lerin otofajisi üzerindeki etkilerini daha fazla değerlendirmek için, otofajik akıyı değerlendirmek için çok önemli belirteçler olan mikrotübülle ilişkili protein 1A/1Belight zincir 3 (LC3) ve p62/SQSTM1 otofagozom belirteçlerini kullandık[47,48] ]. Hızlanan p62'nin yanı sıra LC{{10}}I'nin LC3-II'ye dönüşümünde doza bağlı bir artışla gösterildiği gibi, Cur'a maruz kaldıktan sonra cBMSC'lerde artan otofajik aktivite gözlendi. bozunma(Şekil 4A).Ayrıca, ATG7, ATG12.LC3'ün mRNA ifadesi. ve ULK1, Cur tedavisinden sonra yukarı regüle edildi(Şekil 4B). cBMSC'lerin üst yapısı, transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak incelendi. Daha sonra, 24 saat boyunca 0,1, 1 ve 10 μM dozlarında Cur ile tedaviden sonra cBMSC'lerde otofagozom ve otolizozom oluşumunda bir artış gözlemledik（Şekil 4C）.cistanche nzİmmünofloresan boyama ayrıca, LC3'ün karakteristik noktalı floresan noktalarının sayısının Cur tedavisi ile önemli ölçüde arttığını gösterdi (Şekil 4E). Bu sonuçlar, Cur'un doza bağlı bir şekilde lizozomal asitleşmeyi ve otofaji aktivasyonunu destekleyebileceğini gösterdi.

Bu makale Int. J. Mol. bilim 2021, 22, 11356. https://doi.org/10.3390/ijms222111356 https://www.mdpi.com/journal/ijms