IL-12-Tabanlı bir Nanositokin, Gelişmiş Soğuk Tümörlerini Ortadan Kaldırmak İçin Enflamasyonun Uzay-zamansal Kontrolü Yoluyla Antikanser Bağışıklığını Güvenli Bir Şekilde Güçlendirir

İmmünolojik olarak soğuk tümörlerin tedavisi, immün kontrol noktası inhibitörleri (ICI'ler) için büyük bir zorluktur. İnterlökin 12 (IL-12), güçlü bir antitümör bağışıklığı oluşturarak ICI'leri soğuk tümörlere karşı güçlendirebilir. Bununla birlikte, toksisitesi ve bağışıklık sistemini baskılayan sinyallerin önlenmesinin sistemik indüksiyonu, çeviriyi engellemiştir. Burada, IL-12 aktivitesi, fizyolojik pH'ta inaktif kalan ancak asidik tümör pH'ında tüm aktivitesini serbest bırakan bir nano sitokin üreterek, müdahale eden bağışıklık tepkilerinin uyarılması olmadan, etkinliği güvenli bir şekilde artırmak için uzay-zamansal olarak kontrol edilir. IL-12-tabanlı nano sitokin (Nano-IL-12), tümör dokularında IL-12'yi biriktirir ve serbest bırakır, lokalize antitümöral enflamasyonu ortaya çıkarır, aynı zamanda sistemik bir bağışıklık tepkisini, karşıt bağışıklık reaksiyonlarını ve karşıt bağışıklık tepkilerini önler. Tekrarlanan intravenöz uygulamadan sonra bile olumsuz toksisiteler. Nano-IL-12-aracılı inflamasyonun uzay-zamansal kontrolü, üstün antikanser etkinliğini teşvik eder ve tümör mikro ortamını derinlemesine alevlendirmek ve ICI'ye dirençli primer ve metastatik tümörleri tamamen yok etmek için ICI'lerle sinerji oluşturur. Strateji, daha güvenli ve daha etkili immünoterapilere yönelik umut verici bir yaklaşım olabilir.

Cistanche tubulosa'nın faydaları-Antitümör

1. Giriş

Anti-PD-1 (nivolumab) ve anti-CTLA- 4 (ipilimumab) antikorları gibi bağışıklık kontrol noktası inhibitörleri (ICI'ler), kanser tedavisinde devrim yaratmıştır.[1,2] Bununla birlikte, çok sayıda hastalar halen bu tedavilerden fayda görmemektedir.[3] Bu tür yetersiz yanıt, ICI'lere karşı duyarsız bir soğuk tümör fenotipi ile ilişkilendirilmiştir.[4,5] Bu soğuk tümörler genellikle immünsüpresif bir mikro ortam ve ICI'lerin etkilerini zayıflatan düşük seviyelerde T hücresi infiltrasyonu sunar.[5–7 Bu nedenle, tümörü soğuk fenotipten yüksek T hücre infiltrasyonuna sahip iltihaplı (sıcak) fenotipe geçirecek, ICI'lerin etkinliğini arttıracak ve terapötik alanı genişletecek ajanlara acil bir ihtiyaç vardır. En güçlü proinflamatuar sitokinler arasında yer alan interlökin-12 (IL-12), antitümör bağışıklığını artırma ve ICI direncini aşma konusunda yüksek bir potansiyele sahiptir.[8–10] Bununla birlikte, IL-12, sistemik olarak enjekte edildiğinde ciddi immün bağlantılı advers olaylar (irAE'ler).[8,10] Bu nedenle, immün sitokinler,[11–13] füzyon proteinleri[14] ve proteaza duyarlı sitokinler[15 dahil olmak üzere çeşitli protein mühendisliği yaklaşımları kullanılır. ], sistemik maruziyeti azaltarak ve tümör seçiciliğini artırarak IL-12'nin güvenliğini artırmaya yönelik yoğun bir araştırma altındadır. Öte yandan, IL-12 hala inflamasyonun uzay-zamansal dinamikleri ile ilgili kritik dezavantajlar sunmakta olup, bu da karşıt bağışıklık reaksiyonlarının etkinliğini zayıflatmasına yol açmaktadır.[16–19] Örneğin, tekrarlanan IL-12 enjeksiyonu teşvik edilmiştir. hastalarda antiinflamatuar interlökin-10 (IL-10)'nin sistemik genişlemesi, bu da anti-tümör etkinliğini sınırladı.[20–22] Bu bağlamda, IL'yi uzay-zamansal olarak kontrol edebilen sistemler geliştirmek{{36 }}aracılı inflamasyon, efektör fonksiyonlarını en üst düzeye çıkarabilir ve güçlü antitümör bağışıklığını uyarabilirken, aynı zamanda immün reaksiyonları engelleyebilir. Ne yazık ki, yukarıda sözü edilen protein-mühendislik sistemleri için inflamatuar dinamikler tam olarak anlaşılamamıştır ve bunların ikincil tepkilere karşı koyma ile ilişkileri açıklığa kavuşturulmayı beklemektedir. Burada, aktivitesinin uzay-zamansal kontrolünü elde etmek için doğal IL-12'yi biyouyumlu polimerlerle kapsülleyerek uyaranlara duyarlı nano ölçekli sitokinler (nano sitokinler) geliştirdik. IL-12-tabanlı nano sitokinler (Nano-IL-12), asidoz kanserin bir işareti olduğundan asidik intratumoral pH'ı algıladıktan sonra tamamen aktif IL-12'yi serbest bırakmak üzere tasarlandı[23] ve immünosupresyon ile bağlantılıdır.[24,25] Aslında yakın zamanda pH değiştirilebilen fonksiyonun, ICI'ye dirençli tümörlerde yüksek ve seçici aktivasyona izin verebileceğini bulduk.[26] Nano-IL-12'nin farmakokinetiği, güvenliği ve etkinliği, soğuk melanom ve meme kanserinin fare modellerinde değerlendirildi. Sonuçlarımız, NanoIL-12'in, IL-12'ye maruz kalmanın yoğunluğunu ve süresini artırarak tümör dokularında sürekli bir inflamatuar reaksiyona neden olduğunu ve aynı zamanda sağlıklı dokulardaki bağışıklık hücreleriyle etkileşimi önleyerek IL-12'e maruz kalmanın baskılanmasını sağladığını gösterdi. bağışıklık yanıtını hedef alır. Böylece Nano-IL-12, ikincil reaksiyonları hem sistemik hem de intratumoral olarak etkisiz hale getirerek etkili bir şekilde bloke etti ve doğal IL'den 10-kat daha düşük-12 dozlarda etkinlik gösterdi. Nano-IL-12'in gelişmiş antitümör bağışıklığı, tümör mikro ortamını (TME) yoğun bir şekilde alevlendirmek için ICI'lerle güvenli bir şekilde sinerji oluşturarak, ICI'ye dirençli melanom modellerinde ve üçlü primer ve akciğer metastazında tam yanıtlara (CR) yol açar. negatif meme kanseri (TNBC).

cistanche tubulosa-bağışıklık sistemini iyileştirir

2. Sonuçlar

2.1. Nano-IL-12 Tamamen Aktif Sitokin Salmak İçin Tümör İçi pH'ı Algılar

Nano-IL-12'yi oluşturmak için, rapor edilen yöntem[27] (Şema S1, Destek Bilgisi). Polimer, pLL bloğundaki amino gruplarının yarısına amid bağlantısı yoluyla CDM ile konjuge edilmiştir (Şekil S1-S3, Destekleyici Bilgi). Nano-IL{{10}}, organik çözücüler eklenmeden sadece polimerin sitokin ile sulu koşullarda karıştırılmasıyla oluşturulur (Şekil 1a). Polimerdeki amino grupları, proteinlerdeki karboksilat kısımlarıyla iyon kompleksleri oluştururken, CDM grupları, pH'a duyarlı amid bağları oluşturmak için polimer iplikçiklerinin yanı sıra IL-12'deki amino gruplarıyla reaksiyona girer. IL-12'nin nanositokinlerdeki kapsüllenme etkinliğinin, Alexa Fluor 647 (A647) etiketli serbest IL-12 ile pik alanları karşılaştırılarak HPLC ile ölçüldüğü üzere %80 civarında olduğu belirlendi. IL-12 nanositokine yüklendi (Şekil 1b). IL-12 etiketli floresans olmaması durumunda, kapsülleme verimliliği ELISA ölçümüyle doğrulanmıştır, çünkü ELISA yöntemi, Nano'nun polimer kaplaması nedeniyle reaksiyona giren karışımdaki yalnızca kapsüllenmemiş serbest IL-12'yi tespit edebilmektedir. -IL-12, yüklü IL-12'nin tespit antikoruyla tanınmasını engeller. Böylece, kapsüllenmemiş IL-12'nin toplam IL-12 beslemesine oranı hesaplanarak, kapsülleme verimliliğinin de %80 civarında olduğu belirlendi (Şekil S4a, Destekleyici Bilgiler), bu da şu sonuçla tutarlıdır: HPLC ölçümleri. NanoIL-12, serbest IL-12'yi ve nispeten küçük polimer-IL-12 konjugatlarını çıkarmak için santrifüjlü filtreleme yoluyla saflaştırıldı (Şekil S4b, Destekleyici Bilgi). Saflaştırma HPLC ile doğrulandı (Şekil 1b, alt panel). Nano-IL-12 üzerinde polimerik kalkanın oluşumu, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve dinamik ışık saçılımı (DLS) ile doğrulandı. TEM'de, polimerin pLL bloğu ve IL-12 tarafından oluşturulan NanoIL-12'in IL-12-yüklü çekirdeği, uranil asetat[28] ile boyandı ve tekdüze siyah noktalar olarak görselleştirildi. 23,2 ± 4 nm'de ortalama çap (Şekil 1c,d). DLS ile Nano-IL-12'nin hidrodinamik çapının 42 ± 2 nm olduğu ölçüldü (Şekil 1e). TEM ve DLS ile ölçülen boyutu karşılaştırarak bu parçacıklardaki PEG kabuğunun kalınlığının yaklaşık 10 nm olduğunu hesaplayabiliriz. Bu sonuç, farmakokinetiğin iyileştirilmesinde faydalı olabilecek yoğun bir PEGilasyonu göstermektedir.[29] Ayrıca, A647-etiketli Nano-IL-12'nin floresans korelasyon spektroskopisi (FCS) çalışmaları, serbest A647-etiketli IL'den-12 daha büyük moleküler ağırlığa sahip bileşiklerin oluşumunu doğruladı. (Tablo S1, Destekleyici Bilgiler). A647-etiketli IL-12 ve A647-etiketli Nano-IL-12 örneklerinin FCS ölçümünde molekül başına sayıları karşılaştırarak, her bir Nano-IL{ {67}} ortalama olarak yaklaşık 1,5 IL-12 molekül içerir. Ek olarak, Nano-IL-12'nin yüzey yükünün nötre yakın olduğu bulundu (Tablo S2, Destekleyici Bilgiler), bu da polimerin negatif yüklü IL-12'yi koruduğunu düşündürmektedir. CDM kısımları ve birincil aminler arasında oluşan Nano-IL-12'deki amid bağlarının pH'a duyarlı olduğu bildirilmektedir.[30] Dolayısıyla Nano-IL-12'nin asidik koşullar altında kapsüllenmiş sitokini serbest bırakmak üzere ayrışması beklenir. İlk olarak Nano-IL-12'nin pH duyarlılığını, pH 4,5 ile 8,5 arasında değişen çeşitli pH değerlerinde FCS ölçümüyle taradık ve Nano-IL-12'nin ayrışma durumunu yansıtmak için difüzyon katsayısı. Parçacıkların moleküler ağırlığındaki azalmaya karşılık gelen difüzyon katsayısındaki artış, pH 7,0'ın altındaki asidik koşullar altında gözlemlenebilir; bu da Nano-IL-12'nin fizyolojik pH'ta stabil olduğunu ancak özelliklerini kaybedebileceğini düşündürür. asitlendirilmiş ortamla intratumoral lezyonlarda bütünlük[23,31] (Şekil 1f). Daha sonra, Nano-IL-12'nin fizyolojik pH 7,4 ve tümör içi pH 6,5'teki ayrışma kinetiğini FCS ölçümüyle araştırdık. FCS ölçümü, Nano-IL{104}} ve salınan IL{105}}'nin difüzyon katsayılarının hassas bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır. Yeni sonuç, Nano-IL{107}}'nin pH 6,5'te bütünlüğünü hızla kaybettiğini ve numunenin difüzyon katsayısının 4 saatlik inkübasyonun ardından serbest IL-12 değerine ulaştığını gösterdi; bu da Nano-IL'nin tamamen aktivasyonunu düşündürüyor -12 bu koşullar altında. Üstelik pH 7,4'te Nano-IL{117}} stabildi (Şekil 1g), birkaç gün sonra bile difüzyon katsayılarını korudu (Şekil S4c, Destekleyici Bilgi). Bu gözlemler, Nano-IL{121}}'nin tümör içi pH koşullarında seçici aktivasyonunu ve fizyolojik koşullardaki stabiliteyi destekler. IL-12, splenositlerden IFN-𝛾 salgılanmasını uyarabildiğinden,[32] polimer korumanın/koruyuculuğun kaldırılmasının Nano-IL-12'nin biyoaktivitesi üzerindeki etkisi in vitro splenosit tahlili ile değerlendirildi ( Şekil 1h). Nano-IL-12, fare splenositlerinden daha düşük seviyelerde IFN-𝛾 üretimini tetikledi; bu, IL{132}} biyoaktivitesinin polimer kapsülleme tarafından bloke edildiğini gösterir. Öte yandan, asitte (pH 6,5) ön inkübasyonla etkinleştirilen Nano-IL-12, doğal IL-12 ile benzer biyoaktivite gösterdi; bu da, etkinleştirilmiş Nano-IL-12'nin varlığını akla getiriyor sitokinin biyoaktivitesini tam olarak geri alabilir.

Şekil 1. Nano-IL-12, tamamen aktif sitokini serbest bırakmak için tümör içi pH'ta aktive olur. a) IL-12-tabanlı nanositokinin (Nano-IL- 12) oluşumu ve yapısı. Nano-IL-12, polimerin IL-12 ile basitçe karıştırılmasıyla sulu koşullarda kendiliğinden birleştirilir. Düzenek, pH'a duyarlı amid bağları ve elektrostatik etkileşimler tarafından yönlendirilir. b) Serbest IL-12 proteininin, PEG-pLL(CDM) + IL-12 karışımının ve saflaştırılmış Nano-IL-12'nin HPLC sonuçları. IL-12 proteinleri A647 ile etiketlenmiştir. c) Saflaştırılmış Nano-IL-12'nin temsili TEM görüntüsü, parçacıkların çekirdek yapısını açıkça göstermektedir. d) TEM görüntülerinden ölçülen parçacık çekirdek çapının dağılımı. n=100 parçacık sayıldı. e) Nano-IL-12'nin DLS tarafından ölçülen hidrodinamik çaplarının dağılımı. f) 24 saat boyunca farklı pH altında inkübe edilen Nano-IL-12'nin FCS ölçümü ile gösterilen pH'a bağımlı Nano-IL-12 ayrışması. 5,3 × 107 cm2 s−1'deki noktalı çizgi, serbest IL-12'nin difüzyon katsayısını ifade eder. g) FCS yöntemiyle ölçülen Nano-IL-12'nin IL-12 salım profili. 1,2 × 107 cm2 s−1 ve 5,3 × 107 cm2 s−1'deki noktalı çizgiler, sırasıyla sağlam Nano-IL-12 ve serbest bırakılan serbest IL-12'nin difüzyon katsayılarını belirtir. h) Nano-IL-12, aktive edilmiş Nano-IL-12 ve doğal IL-12 ile işlenmiş fare splenositleri tarafından IFN-𝛾 salgılanması. IFN-𝛾 ELISA ile ölçüldü. Veriler ortalama ± SD olarak gösterilmiştir; f ve g için n=3 paralel ölçüm. h, n=5 paralel ölçüm için.

Formülasyonun korunması ve stabilitesi aynı zamanda Nano-IL-12'nin bir ilaç olarak dönüştürülmesi için de önemlidir. Bu nedenle, dondurarak saklama koruyucusu olarak trehaloz kullanarak Nano-IL-12'nin liyofilize bir versiyonunu geliştirdik.[33] Yeniden oluşturulan Nano-IL-12, kargo sızıntısı olmadan taze Nano-IL-12 ile karşılaştırılabilir boyut ve yüzey yükü gösterdi ve karşılaştırılabilir pH duyarlılığını ve in vitro IFN-𝛾 teşvik yeteneğini paylaştı (Şekil S4d–g ve Tablo S2, Destekleyici Bilgiler). Bu sonuçlar, liyofilize formülasyonun geçerli bir Nano-IL-12 muadili olduğunu desteklemektedir.

Şekil 2. Nano-IL-12 farmakokinetiği ve anti-tümör etkinliğini geliştirir. a) 10 ug A647-etiketli IL-12 veya Nano-IL-12'nin (kırmızı renk) iv enjeksiyonundan sonra farelerin kulak memesi derisinin IVCLSM görüntüleri. Ölçek çubuğu=50 μm. Enjeksiyondan 5 saat sonra doku alanındaki (beyaz kutular) ortalama floresan yoğunluğu ölçüldü ve enjeksiyondan hemen sonra damar sistemindeki maksimum yoğunluğa (Vmax) göre normalleştirildi. b) ELISA ile belirlenen 10 ug IL-12 veya eşdeğeri Nano-IL-12'nin iv enjeksiyonundan sonra serbest IL-12 ve Nano-IL-12'nin kan dolaşım profilleri. Ayrıca, Nano-IL-12'den salınan IL-12'nin kandaki konsantrasyonu da grafiğe geçirilir (veriler ortalama ± SD, grup başına n=5 fare olarak gösterilir). c) A647 ile etiketlenmiş 10 ug IL-12 veya eşdeğer Nano-IL-12'nin iv enjeksiyonundan 24 saat sonra eksize edilen B16F10 melanom tümörlerinin IVIS görüntüsü. d) 4T1 TNBC tümörlerinde IL-12 seviyesinin 24-'te ve 10 ug IL-12 veya eşdeğeri Nano-IL-12'nin iv enjeksiyonundan 48 saat sonra ELISA ile ölçülmesi ( Veriler ortalama ± SD; grup başına n=3 fare; p değerleri tek yönlü ANOVA ile hesaplanır). e) 10 ug IL-12 veya eşdeğeri Nano-IL{'nin tek bir iv enjeksiyonunun anti-tümör aktivitesi (enjeksiyon günleri okla gösterilir (B16F10 modeli için 8. Gün ve 4T1 modeli için 7. Gün)) {51}}. B16F10 melanomunun sonuçları üst panelde, 4T1 TNBC'nin sonuçları ise alt panelde gösterilmektedir. Bireysel tümör büyüme eğrileri sol panellerde gösterilmektedir. Ortalama tümör hacmi eğrileri orta panellerde gösterilir ve hayatta kalma eğrileri sağ panelde gösterilir (Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilir; grup başına n=5 fare, p değerleri log-rank analizi yoluyla hesaplanır) ).

2.2. Nano-IL-12, IL-12 Farmakokinetiğini İyileştirir ve Antitümör Etkilerini Güçlendirmek İçin Tümörlerde Etkinleşir

Nano-IL-12'ye kapsülleme, IL-12'nin farmakokinetiğini iyileştirebilir. İntravenöz (iv) enjeksiyon sonrasında Nano-IL-12 dolaşımını görselleştirmek için, A647-IL-12-tabanlı Nano-IL'yi izlemek üzere in vivo eş odaklı lazer tarama mikroskobu (IVCLSM) kullanıldı Kuyruk damarından enjeksiyon sonrasında fare kulak memelerinin damarlarında -12. Serbest IL-12, enjeksiyondan sonra ekstravazasyon gösterdi (Şekil 2a), bu doku interstisyumundaki artan floresans yoğunluğuyla gösterilir. 70 kDa dekstran ve albümin (65 kDa) gibi IL-12 (75 kDa) ile karşılaştırılabilir boyuta sahip makromoleküllerin cilde sınırlı erişim gösterdiği göz önüne alındığında,[34] IL-12 sızıntısı damarlardan kan dolaşımı sırasında IL-12'nin kararsızlığını akla getirir. Aslında önceki çalışmalar, serumda bulunan enzimler tarafından IL-12'nin proteolizini göstermiştir.[35,36] Deneylerimizde IL-12'nin bozunmasını daha da desteklemek için, A{{22'nin stabilitesi Fare plazmasında }} etiketli IL-12, boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile araştırıldı. Fare plazması ile inkübasyonun ardından, IL-12'nin daha küçük moleküler ağırlığa sahip parçalara ayrıldığını bulduk (Şekil S5, Destekleyici Bilgi), bu da IL-12'nin kandaki kararsızlığını doğruluyor. Öte yandan, Nano-IL-12 deriye minimum düzeyde sızıntı gösterdi, bu da kan dolaşımındaki stabiliteyi gösteriyor. ELISA tahlilinden ölçülen niceliksel dolaşım profili, genel Nano-IL-12'nin serbest IL-12'den daha uzun dolaşıma sahip olduğunu doğruladı (Şekil 2b). Bu arada, salınan IL-12 tarafından belirlenen aktifleştirilmiş Nano-IL-12 seviyesi kanda oldukça kısıtlıydı, bu da Nano-IL-12'nin sistemik süreç boyunca in vivo stabilitesine işaret ediyordu. sistemik yan etkilerin azaltılmasına yardımcı olan dolaşım. Nano-IL-12'nin kalpte, dalakta, akciğerde ve böbreklerde birikmesi, uygulamadan 24 ve 48 saat sonra serbest IL-12'ninkine benzerdi; karaciğerde ise Nano-IL-12, 24 saatte serbest IL-12'den daha yüksekti ancak 48 saatte karşılaştırılabilir (Şekil S6, Destekleyici Bilgiler). Nano-IL-12, enjeksiyondan 24 saat sonra serbest IL-12'den önemli ölçüde daha yüksek tümör birikimi gösterdi (Şekil 2c). Üstelik serbest IL-12, enjeksiyondan 48 saat sonra tümörlerden temizlenirken, Nano-IL-12 konsantrasyonu yüksek kaldı (serbest IL-12'den yaklaşık 4-kat daha yüksek{{59}) }) (Şekil 2d), Nano-IL-12'nin tümörlerin içindeki IL-12'nin konsantrasyon eğrisinin altındaki alanı (AUC) arttırdığını öne sürüyor. Tümörlerdeki yüksek birikim ve canlı aktivasyona paralel olarak Nano-IL-12, deri altı B16F10 melanom ve ortotopik 4T1 üçlü negatif meme kanseri (TNBC) modellerinde serbest IL-12'ye göre gelişmiş antitümör etkinliği gösterdi (Şekil 2e). Her iki modelde de, 10 ug IL-12 eşdeğerinde Nano-IL-12'nin yalnızca tek bir iv enjeksiyonu, tümör büyümesinin IL-12'ye göre önemli ölçüde daha iyi bir şekilde engellenmesine yol açtı ve bu da daha uzun hayatta kalma süresine yol açtı . Özellikle, güçlü bağışıklık bastırması ve ICI tedavisine karşı direnciyle ünlü olan 4T1 TNBC modelinde,[37] Nano-IL-12 ile tedavi açıkça önemli bir terapötik etkiye yol açarken, serbest IL{{83} } tümör büyümesine karşı faydasızdı.

2.3. Nano-IL-12 Enflamatuar Yanıtı Uzay-Zamansal Olarak Kontrol Etti

Nano-IL-12 ve serbest IL-12'nin biyolojik etkileri arasındaki farkı daha fazla araştırmak için, tedaviden kaynaklanan inflamasyon tepkisinin seviyesi, hem hedef dışı bölgelerdeki sitokin tepkisi ile değerlendirildi; , kan ve sağlıklı organlarda ve tümörlerde (ortotopik 4T1 modeli). IL-12'nin dört aşağı yönlü sitokini, yani IFN-𝛾, tümör nekroz faktörü-𝛼 (TNF-𝛼), interlökin{{10}} (IL-6) ve interlökin -10 (IL-10) inflamasyon yanıtının göstergeleri olarak seçildi. Bunların arasında IFN-𝛾, TNF- 𝛼 ve IL-6, IL-12,[20,38]'nin antitümoral etkisiyle ilişkili önemli proinflamatuar sitokinlerdir; IL{{20' ise }}, IL-12 stimülasyonunu antagonize eden negatif geri beslemeli bir antiinflamatuar sitokindir.[20,39] Nano-IL-12 ve serbest IL-12, 0. Günde ve iki kez enjekte edildi. 3 ve inflamasyon tepkisi 1 hafta boyunca günlük olarak takip edildi. Bu deneysel ayar, hem tek enjeksiyonun hem de tekrarlanan dozajın uzay-zamansal inflamatuar yanıt üzerindeki etkilerini belirlememize olanak sağladı. 0. Günde ilk serbest IL-12 enjeksiyonu, kanda ve organlarda dört sitokinin salgılanmasına yol açtı; 2. Günde plazma konsantrasyonunda bir zirve gözlendi (Şekil 3a–e,g), bu da güçlü bir kapalılığı işaret ediyor -IL-12'nin bağışıklıkla ilgili olumsuz olayları (irAE'ler) ile ilişkili inflamasyonu hedefleyin.[8,10] Öte yandan, Nano-IL- 12'nin ilk enjeksiyonu, önceki enjeksiyona kıyasla önemli ölçüde daha düşük sitokin seviyeleri gösterdi. kanda ve sağlıklı organlarda serbest IL-12; bu da hedef dışı iltihaplanma tepkisinin düzenlendiğini gösterir. 3. Günde ikinci serbest IL-12 enjeksiyonu, IFN-𝛾, TNF-𝛼 ve IL-6'nin salgılanmasını yeniden uyardı. Ancak 5. Günde gözlemlenen IFN-𝛾 ve TNF-𝛼 zirve seviyeleri, ilk IL{52}} enjeksiyonundan sonra 2. Günde gözlemlenenlerden açıkça daha düşüktü. Üstelik serbest IL-12'nin ikinci enjeksiyonu, plazma, organlar ve tümörlerdeki anti-inflamatuar IL-10 seviyesini aşırı derecede yükseltti; bu, Th1 hücrelerinin sistemik hiper-genişlemesi ile ilişkilendirilerek indüklenmeye neden olur. düzenleyici bir aşamadır.[40] Tekrarlayan IL-12 tedavisinden kaynaklanan bu tür farklılaşmış tepki, insanlardaki klinik deneylerde doğrulanmıştır ve antitümör gücü de dahil olmak üzere IL-12'nin biyolojik etkilerinin azaltılmasına katkıda bulunur.[20] IL-12'nin aksine, Nano-IL-12'nin ikinci enjeksiyonu, kanda ve organlarda IL-10'nin salgılanmasını şiddetlendirmedi. Ayrıca kandaki ve sağlıklı dokulardaki inflamatuar sitokinlerin konsantrasyonu, serbest IL-12'ninkinden önemli ölçüde daha düşüktü. Bu sonuçlar, Nano-IL-12'nin yalnızca sistemik inflamatuar yanıtı azaltmakla kalmayıp, aynı zamanda karşıt anti-inflamatuar yanıtı tetikleyen tekrarlanan IL{69}} uygulamasının sınırlamalarının da üstesinden gelebildiğini göstermektedir. Tümörlerde, Nano-IL-12'nin tek bir damar içi enjeksiyonu, inflamatuar IFN-𝛾, TNF-𝛼 ve IL-6 üretimini artırdı ve serbest IL{{77}'den önemli ölçüde daha yüksek tümör içi konsantrasyonlara ulaştı. } tedavi (Şekil 3f,g). Bu arada Nano-IL-12 tedavisi, tümörlerde serbest IL-12'den daha düşük anti-inflamatuar IL-10'ye neden oldu ve anti-inflamatuar yanıtın başlamasını önledi. Üstelik, Nano-IL-12'nin ikinci enjeksiyonu üzerine, tümörlerdeki inflamatuar sitokinlerin yüksek seviyesi korunurken tümör içi IL{87}} konsantrasyonu düşük tutuldu. Tümörlerdeki IFN-𝛾, TNF-𝛼 ve IL{90}}'deki bu artış ve IL{91}}'deki düşüş, Nano-IL-12'nin yüksek ve sürekli intratumoral seviyeleriyle ilişkilidir ve destek sağlar. Antitümör etkinliğini arttırmak için kritik olan Nano-IL-12 için yüksek bir inflamatuar reaksiyon.[41]

Nano-IL-12'in, inflamasyonun uzay-zamansal kontrolü aracılığıyla etkinliği arttırıp arttıramayacağını test etmek için Şekil 2e'deki deneyi tekrarladık, ancak bu sefer farelere 10- kat daha düşük bir doz uyguladık, yani: 1 ug IL-12 eşdeğeri, serbest IL- 12 için karşı etkili bağışıklık tepkisini tetikleyen tekrarlanan bir dozlama programı kullanılarak. Bu yinelenen düşük doz tedavisi altında, Nano-IL-12, 4T1 TNBC tümörlerinde (Şekil 3h) anti-tümör etkinliğini IL-12'ye göre açıkça arttırdı, bu da daha yavaş tümör büyümesine ve daha uzun hayatta kalmaya yol açtı. Öte yandan, ücretsiz IL-12 tedavisi, altı kez yoğun şekilde enjekte edildikten sonra bile ihmal edilebilir düzeyde etkinlik gösterdi; bu, IL-10 gibi antiinflamatuar sitokinlerin genişlemesine atfedilebilir. Bu sonuçlar, Nano-IL- 12'nin, inflamasyonu uzay-zamansal olarak kontrol ederek antitümör etkinliğini güçlendirme yeteneğini desteklemektedir. Enflamatuar tepkinin kontrolü aynı zamanda güvenliğin artmasına da yol açtı. 0. ve 3. Günlerdeki iki enjeksiyondan sonra IL{{20}} ve Nano-IL-12'nin toksisitesini belirlemek için histolojik bir değerlendirme ve kan analizi gerçekleştirdik (Şekil S7a,c, Destekleyici Bilgiler) . Sonuçlar, serbest IL-12 ile karşılaştırıldığında Nano-IL-12 tedavisi üzerine karaciğer, böbrek ve pankreasta önemli ölçüde daha düşük toksisite gösterdi. Ayrıca tedaviler sırasındaki vücut ağırlığındaki değişiklikler de toksisitenin bir parametresi olarak takip edildi. Nano-IL-12 ile tedavi edilen hayvanlar tedavi sırasında hafifçe kilo alırken, serbest IL-12 alan farelerde ağırlık kaybı yaşandı (Şekil S7b, Destekleyici Bilgi). Dolayısıyla bu gözlemler, Nano-IL- 12'nin tercihen tümörlerdeki iltihaplanma tepkisini teşvik ederek antitümöral etkinliği arttırabildiğini ve sağlıklı dokularda hedef dışı etkileri kısıtlayarak toksisiteyi azalttığını ve karşıt anti-inflamatuar tepkiyi azalttığını göstermektedir.

erkekler için cistanche faydaları-bağışıklık sistemini güçlendirir

Cistanche Enhance Immunity ürünlerini görüntülemek için buraya tıklayın

【Daha fazlasını isteyin】 E-posta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. Nano-IL-12 Tedavisi TME'de Antitümöral Bağışıklık Hücre Sızmasına Neden Olur

IL-12 aynı zamanda bir T hücresi uyarıcı faktör olarak da bilinir, çünkü T hücrelerinin büyümesini ve fonksiyonunu arttırılmış antitümöral bağışıklık reaksiyonlarını başlatmak üzere uyarabilir. Böylece, tekrarlanan Nano-IL-12 tedavisinden sonra tümörlerdeki CD8+ hücrelerinin infiltrasyonunu değerlendirdik. 1 ug IL-12 eşdeğerliğinde/enjeksiyonda iki iv serbest IL-12 veya Nano-IL-12 enjeksiyonu ile tedavi edilen B16F10 melanomunun akış sitometri analizi, Nano-IL{{13}'in }, serbest IL-12 ile karşılaştırıldığında tümördeki CD8+ T hücrelerinin infiltrasyonunu önemli ölçüde arttırdı (Şekil 4a). 4T1 TNBC tümörleri taşıyan bir farede bağışıklık hücresi tükenmesi deneyi yaparak, farklı bağışıklık hücresi popülasyonlarının Nano-IL-12 tedavisinden gelen tepkiye katkısını araştırdık. Nano-IL-12, 7, 9, 11, 13 ve 15. Günlerde beş kez iv olarak enjekte edildi (1 ug IL-12 eşdeğeri/enjeksiyon). Ayrıca farelere, CD4+, CD8+ veya Sırasıyla NK hücreleri. Sonuçlar, CD8+ sitotoksik T hücrelerinin, CD4+ T hücrelerinin ve NK hücrelerinin tükenmesinin, daha hızlı tümör büyümesinin gösterdiği gibi Nano-IL-12'nin terapötik etkinliğini önemli ölçüde azalttığını gösterdi. ve yalnızca Nano-IL-12 tedavisi alan farelerle karşılaştırıldığında tükenmiş gruplarda hayatta kalma oranının azalması (Şekil 4b). Bu sonuç, CD8 T hücrelerinin[42] ve NK hücrelerinin sitotoksik aktivitesinin arttırılması[43] ve saf T hücrelerinin T yardımcı (Th) hücrelerine farklılaşmasına aracılık etmek de dahil olmak üzere IL-12'nin biyolojik fonksiyonu ile tutarlıdır. .[44]

Ayrıca, tükenme deneyinden kaynaklanan antitümör aktivitesinin farklı hafifletme verimliliği, her hücre popülasyonunun Nano-IL-12'nin etkinliği ile ilişkisini ortaya koyar; CD8+ sitotoksik T hücreleri en önemli fraksiyondur . 4T1 TNBC tümör bölümlerinin immünohistokimya analizi, tümör sızan efektör hücrelerin mekansal dağılımını ortaya çıkardı (Şekil 4c). Serbest IL-12, tümörlerdeki CD8+ sitotoksik T hücrelerinin ve Tbet+ (Th1) hücrelerinin varlığını iyileştirmezken, Nano-IL-12, her iki hücrenin derinlere yüksek infiltrasyonunu teşvik etti tümör bölgeleri. Ayrıca, CD8+ Hücrelerinde Granzim B'nin yukarı regülasyonu, NanoIL-12 tedavisinden sonra sitotoksik T hücrelerinin aktivasyon seviyesinin daha yüksek olduğunu gösterdi (Şekil 4d). Ayrıca Nano-IL-12 tedavisinin, PBS ve serbest IL{{20}} ile tedavi edilen tümörlere kıyasla tümörlerde PD-L1 ekspresyonunu arttırdığını gözlemledik. Bu artan PD-L1 seviyesi, bir bağışıklık baskılama mekanizması olarak görev yapan, tümör dokusunda PD-L1 ekspresyonunu uyardığı bildirilen,[45] Nano-IL-12 tarafından indüklenen daha yüksek tümör IFN-𝛾'sinden kaynaklanıyor olabilir. Lenfosit infiltrasyonuna direnmek için. Bu tümör içi PD-L1 yukarı regülasyonu, Nano-IL-12'nin anti-PD-1 veya anti-PD-L1 ICI'ler ile birleştirilmesi yoluyla antitümör etkinliğini sinerjileştirme potansiyelini ortaya koymaktadır. Yukarıdaki gözleme dayanarak, Nano-IL-12'nin monoterapi olarak ve antiPD-1 antikorları ile kombinasyon halinde TME üzerindeki etkisini araştırdık (Şekil 4e). Deney, hemaglutinin (4T1-HA) eksprese eden 4T1 hücrelerinden hazırlanan ortotopik TNBC tümörlerinde yapıldı, çünkü hemaglutinin, bir fare modelinde antijene spesifik sitotoksik T-lenfosit tepkisini indükleyebilen iyi tanımlanmış bir immünojendir.[46 ,47] Fareler 0. ve 3. Günlerde iki kez 10 ug IL-12 veya eşdeğeri Nano-IL-12 ile tedavi edildi ve kombinasyon terapisi için farelere aynı anda iki kez 100 ug anti-PD enjeksiyonu yapıldı. -1 antikor. 7. günde tümör numuneleri akış sitometrisi için toplandı.

Sonuçlar, Nano-IL-12 tedavisinin tümörde IL-12'den daha yüksek lökosit (CD45+) infiltrasyonuna neden olduğunu doğruladı. Nano-IL-12'nin anti-PD-1 antikorlarıyla kombinasyonu da tümörlerde daha yüksek CD45+ hücreleri sergiledi. Lökositler arasında lenfoid hücreler ve T hücreleri, Nano-IL-12 ve Nano-IL- 12/anti-PD-1antikor kombinasyonu tarafından yukarı doğru düzenlendi. Nano-IL-12 tedavisi, NK hücre popülasyonunda mütevazı bir değişiklikle sonuçlandı ancak serbest IL-12 ile karşılaştırıldığında T hücresi alt grubunda önemli değişikliklere yol açtı. Özellikle, 4T1-HA tümörlerinde CD8+ T hücrelerinin infiltrasyonu, Nano-IL-12 tarafından serbest IL-12'ye göre açıkça yükseltilmiştir. Ayrıca, antijene özgü T hücrelerine karşılık gelen HA-tetramer+ T hücreleri, Nano-IL-12 artı anti-PD- 1 antikor kombinasyonunda önemli ölçüde arttı; bu da adaptif bir bağışıklık sisteminin teşvik edildiğini düşündürüyor Nano-IL-12 ve ICI'lerin sinerjisiyle yanıt. Genel CD4+ T hücreleri, NanoIL-12 ile tedavi edilen gruplarda yukarı regülasyon gösterdi. Tümörlerdeki CD4+ T hücrelerinin alt popülasyonunu daha ayrıntılı olarak belirlemek amacıyla, düzenleyici T hücrelerini (Treg'ler) araştırmak amacıyla hücreleri anti-Foxp3 ile boyadık. Anti-PD-1 monoterapisi, 4T1- HA tümör modelinde Treg'ler üzerinde herhangi bir baskılama göstermezken, Nano-IL-12 artı anti-PD-1 kombinasyonu önemli ölçüde Treg'leri tüketti. Üstelik Nano-IL-12 ile tedavi edilen tümörler, serbest IL-12'den daha yüksek Th hücreleri sundu. Bu sonuçlar, Nano-IL-12 tedavisinin, filtrelemede anti-tümör bağışıklık hücrelerini güçlendirdiğini ve bağışıklık baskılayıcı TME'yi aşmak için anti-PD-1 antikorlarıyla sinerji oluşturduğunu gösterir.

Şekil 3. Nano-IL-12 inflamatuar yanıtı uzay-zamansal olarak kontrol etti. a) 1{{14 enjekte edilen 4T1-taşıyan farelerde kandaki proinflamatuar (IFN-𝛾, TNF-𝛼, IL{-6) ve anti-inflamatuar (IL-10) sitokin seviyeleri }} ug IL-12 veya eşdeğeri Nano-IL-12, 0 ve 3. Günlerde iki kez. Sitokin seviyeleri ELISA ile ölçüldü. İki enjeksiyondan sonraki tepe değerleri (IFN-𝛾, TNF-𝛼 ve IL-10 için 2. ve 5. Günlerde; IL-6 için 2. ve 6. Günlerde) ekranda çubuk grafikler olarak görselleştirilir. sağ panel. b–f) 0. ve 3. Günlerde iki kez 10 ug IL-12 veya eşdeğeri Nano-IL-12 enjekte edilen 4T1-taşıyan farelerin organları ve tümörlerindeki sitokin seviyeleri. dokuları toplamak için 2. ve 5. Günlerde kurban edildi. (Veriler ortalama ± SD olarak gösterilmektedir; grup başına n=6 fare; p değerleri eşleştirilmemiş t-testi yoluyla hesaplanır.) g) Af'deki ortalama değerlerden kan, organlar ve tümörlerdeki sitokin seviyelerinin ısı haritaları Z skoruna dönüştürülür. h) 1 ug IL-12 veya eşdeğeri Nano-IL-12'nin tekrarlanan iv enjeksiyonunun (7, 9, 11, 13, 15 ve 25. Günlerde oklarla gösterilen şekilde enjekte edilmesi) anti-tümör aktivitesi fare TNBC'sine karşı. Bireysel tümör büyüme eğrileri sol panelde gösterilmektedir. Ortalama tümör hacmi eğrileri merkezi panelde gösterilir ve hayatta kalma eğrileri sağ panelde gösterilir (Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilir; grup başına n=6 fare, p değerleri log-rank analizi yoluyla hesaplanır) ).

Şekil 4. Nano-IL-12'nin anti-tümör etkisi, TME'deki efektör hücrelerin gelişmiş infiltrasyonundan üretilir. a) Nano-IL-12 tedavisinden sonra melanomda CTL infiltrasyonunun akış sitometri analizi. Fareler, 0. günde B16F10 hücreleriyle aşılandı. IL-12 (1 ug) veya eşdeğeri Nano-IL-12, 8. ve 11. Günlerde iki kez iv enjekte edildi. Tümör numuneleri 15. Günde toplandı ve analiz edildi (Veriler ortalama ± SD olarak gösterilmiştir; n {{ Grup başına 16}} fare; p değerleri tek yönlü ANOVA yoluyla hesaplandı). b) CD4+, CD8+ ve NK hücrelerinin tükenmesi üzerine Nano-IL-12'nin antitümör aktivitesi. 4T1 tümörleri taşıyan farelere 7, 9, 11, 13 ve 15. Günlerde Nano-IL-12 (1 ug IL-12 eşdeğeri) iv enjekte edildi. Ayrıca farelere anti-CD4 enjekte edildi. 6, 8 ve 10. Günlerde , anti-CD8 ve anti-asiago GM1 antikorları. Tümör büyüme eğrileri (Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilmiştir) ve hayatta kalma eğrileri kaydedildi (grup başına n=6 fare, p değerleri) log-rank analizi yoluyla hesaplanır). c) 4T1 tümör bölümlerinin IHC görüntüleri. 4T1 TNBC tümörleri (ortalama tümör hacmi: 200 mm3) taşıyan farelere, 0. ve 3. Günlerde iki kez iv PBS, 10 ug IL-12 veya eşdeğer Nano-IL-12 enjekte edildi. 7. Günde, tümörleri toplamak için fareler kurban edildi. Tümörlerdeki CD8+, Tbet veya PD-L1+ hücreleri sarı renkte görselleştirilmiştir. Hücre çekirdekleri Hoechst (mavi) ile boyandı. Ölçek çubuğu=1 mm. d) 4T1 tümör kesitlerinde Granzim B (yeşil) ve CD8'in (kırmızı) immüno-lekelenmesi. Hücre çekirdekleri Hoechst (mavi) ile boyandı. Sarı pikseller etkinleştirilmiş CD8+ T hücrelerini gösterir. Ölçek çubuğu=100 μm. e) PBS, anti-PD1 antikorları, IL-12, Nano-IL-12, IL-12 artı anti- ile tedavi edilen 4T1-HA tümörlerindeki lenfoid hücre infiltrasyonunun analizi PD1 antikorları ve Nano-IL-12 artı anti-PD1 antikorları. IL-12 ve Nano-IL-12, aşılamadan sonraki 7. ve 9. Günlerde 10 ug'de iv olarak enjekte edildi. Anti-PD{88}}, aşılamadan sonraki 8. ve 10. günlerde 100 ug'de ip enjekte edildi. 17. Günde fareler kurban edildi ve tümörler akış sitometri ölçümü için homojenleştirildi (Veriler ortalama ± SD, grup başına n=5 numune olarak gösterilir, p değerleri tek yönlü ANOVA yoluyla hesaplanır).

2.5. Nano-IL-12 Tedavisi, ICI Yanıtını Güçlendirmek İçin Transkripsiyon Düzeyinden TME'yi Etkinleştirir

Daha sonra gen ekspresyonu seviyesinden transkriptom analizi ile tedaviler sonrasında 4T1-HA tümörlerinin TME aktivasyonunu araştırdık. Tümör dokularından ekstrakte edilen toplam RNA örneklerinin dizilimi, PBS, anti-PD-1 antikorları, IL-12, Nano-IL-12 ve sitokinlerin kombinasyonları ile tedaviden sonra gerçekleştirildi. ICI'ler. Küresel gen ifadesinin ısı haritası, Nano-IL-12 alan tümörlerdeki farklılaşmış gen profillerini ve Nano-IL-12'nin anti-PD- 1 ile kombinasyonunu açıkça gösterdi (Şekil S11, Destekleyici Bilgiler) ). Nano-IL-12 tedavisiyle etkilenen biyolojik süreçleri belirlemek için, her gruptaki diferansiyel olarak eksprese edilen genleri analiz ettik ve yukarı regüle edilmiş ve aşağı regüle edilmiş genler üzerinde bir zenginleştirme analizi gerçekleştirdik (Şekil 5a,b). Hem GOBP hem de KEGG analizi, IL-12 ve PBS ile karşılaştırıldığında Nano-IL-12 tedavisinin, T hücresi gibi çeşitli efektör bağışıklık hücrelerinin çoğalmasının, farklılaşmasının ve fonksiyonel aktivasyonunun uyarılmasını belirgin şekilde yukarı düzenlediğini ortaya çıkardı. çoğalması, T hücrelerinin Th hücrelerine farklılaşması ve T hücresi aktivasyonu ve T hücresi reseptör sinyal yolu. Ayrıca, PD-L1 ekspresyonu ve PD-1 kontrol noktası yolu ile ilgili genlerin de Nano-IL-12 tedavisi sonrasında yukarı doğru düzenlendiği bulunmuştur. Bu sonuçlar, akış sitometrisi ve immünohistoloji çalışmalarında gözlemlenen NanoIL-12'nin T hücrelerine güçlü bir şekilde uyarılmasını desteklemektedir. Aynı zamanda monositler ve NK hücreleri gibi diğer bağışıklık hücreleriyle ilişkili genler de Nano-IL-12 tedavisinden olumlu yönde etkilendi. Ayrıca sitokin tepkisi ve antijen sunumu gibi diğer bağışıklık süreçleri de Nano-IL-12 tedavisinden yukarı doğru düzenlendi. Öte yandan, Nano-IL-12 hücre bölünmesiyle ilişkili yolakları aşağı regüle etti; bu da tedavinin tümör hücrelerinin çoğalmasını baskılayabildiğini ortaya koydu (Şekil S11, Destekleyici Bilgi). Bu sonuçlar, Nano-IL-12'nin tümör içi bağışıklığın hem doğuştan hem de uyarlanabilir kollarını aktive etmedeki avantajlarını göstermektedir.

Kombinasyon tedavileri üzerinde daha fazla araştırma, Nano-IL-12 artı anti-PD-1 antikorlarının kombinasyon tedavisinin, IL-12 artı anti-PD{{6} ile karşılaştırıldığında intratümöral bağışıklığı arttırdığını ortaya çıkardı. } antikorları veya anti-PD-1 monoterapisi, hem doğuştan hem de kazanılmış bağışıklık yollarını uyararak (Şekil 5b ve Şekil S11c, Destekleyici Bilgiler). Etkileyici bir şekilde, NanoIL-12 artı anti-PD-1 antikor kombinasyonu, mitozla ilişkili yollarda daha güçlü inhibisyonla sonuçlandı; bu kombinasyonun, sızmış efektör hücrelerin tümör hücrelerine karşı daha güçlü bir öldürme aktivitesine aracılık edebileceği sonucuna varıldı. RNA-seq sonuçlarına dayanarak, tümöre sızan bağışıklık hücrelerinin popülasyonlarını da analiz ettik (Şekil 5c,d). Akış sitometrisinden elde edilen sonuç gibi, Nano-IL-12 ile tedavi edilen gruplarda CD8+ T hücrelerinin artan infiltrasyonu görüldü. Ayrıca, sonuçlar aynı zamanda monositlerin ve granülositlerin yukarı regülasyonunu da ortaya çıkardı; bu da, güçlendirilmiş doğuştan gelen bağışıklık yollarından kaynaklanan tümörlerde artan inflamasyonu doğruladı. Bu sonuçlar, Nano-IL-12'nin tümörlere karşı güçlü bir bağışıklık tepkisi oluşturduğunu ve anti-PD-1 ile kombinasyonun bu süreci güçlendirebileceğini doğruladı.

Şekil 5. Nano-IL-12 tedavisi, anti-PD1 antikorlarını güçlendirmek için TME'deki bağışıklık aktivasyonunu artırır. a) Nano-IL-12 ile IL-12 ve Nano-IL-12 + anti-PD-1 ile IL{{12} arasındaki karşılaştırmayla diferansiyel olarak ifade edilen genlerin volkan grafikleri } anti-PD-1. Grafikler, farklı tedavilerle tedavi edilen 4T1-HA tümörlerinin RNA sekans analizinden elde edildi: 10 ug IL-12 ve eşdeğer Nano-IL-12, aşılamadan sonraki 7. ve 9. Günlerde iv olarak enjekte edildi . Anti-PD{25}}, aşılamadan sonraki 8. ve 10. günlerde 100 ug'de ip enjekte edildi. 17. günde tümör örneklerini toplamak için fareler kurban edildi. b) a'daki iki karşılaştırma çiftindeki yukarı regüle edilmiş yolları gösteren zenginleştirme analizi. c) TME'deki hücre popülasyonlarının RNA sekansı ile belirlenen ısı haritası. Şeklin çizilmesi için popülasyonlar Z puanlarına dönüştürüldü. d) Çoklu karşılaştırmalarda önemli farklılıklar gösteren hücre popülasyonlarının histogramları (Veriler ortalama ± SD olarak gösterilir; PBS grubu için, n=5 örnek; diğer gruplar için, grup başına n=4 örnek; p değerleri tek yönlü ANOVA yoluyla hesaplanır).

2.6. Nano-IL-12, Birincil ve Metastatik Tümörleri Etkili Bir Şekilde Ortadan Kaldırmak İçin ICI'lerle Sinerji Oluşturuyor

Nano-IL-12'nin ICI'lerle sinerji yaratma konusundaki terapötik potansiyelini araştırmak için, 4T1 hücrelerinin meme yağ yastığına aşılanmasıyla farelerde ortotopik primer TNBC tümörleri oluşturuldu. İlgili tedavilerin antitümoral etkinliğini test etmek için fareler, farklı doz programlarında ve ICI'lerle kombinasyon modellerinde Nano-IL-12 ile tedavi edildi. Düşük dozda (1 ug IL-12 eşdeğerliği/enjeksiyon) bile Nano-IL-12 ile tekrarlanan tedavinin, monoterapi olarak birincil TNBC tümörlerine karşı açık bir anti-tümör aktivitesi gösterdiğini bulduk. tümör büyüme hızının baskılanması ve uzun süreli hayatta kalma ile gösterilmiştir (Şekil S12, Destekleyici Bilgiler). Ancak bu doz altındaki ücretsiz IL-12 tedavisi, anti-PD{14}} terapisiyle birleştirildiğinde bile herhangi bir etkinlik göstermedi. Nano-IL- 12'nin anti-PD-1 ile kombinasyonu, etkinliği daha da artırdı ve CR elde edildi. Daha sonra daha yüksek bir Nano-IL-12 dozu (10 ug IL-12 eşdeğerliği/enjeksiyon) üzerinde çalıştık ve terapötik etkiyi sağlamak için bunu ICI kokteylleri (antiPD-1 ve anti-CTLA4 antikorları) ile birleştirdik. potansiyel. Özellikle, bu dozda Nano-IL-12'nin ICI'lerle kombinasyon terapisi, tümör büyümesini durdurdu ve tümörleri tamamen yok etti (Şekil 6a), bu tedavi grubunda tüm fareler CR gösterdi. Üstelik tedavi edilen fareler, 4T1 hücreleriyle tümörün yeniden mücadelesine karşı direnç gösterdi; bu da Nano-IL-12 ve ICI kombinasyon terapisiyle yapılan tedaviden elde edilen güçlü bir bağışıklık hafızasının varlığını destekledi.

cistanche bitkisi bağışıklık sistemini güçlendiriyor

TNBC, yüksek oranda uzak metastaz yapan agresif bir tümör olarak bilinmektedir.[48,49] Bu nedenle, daha sonra Nano-IL-12'nin metastatik bir TNBC modelindeki performansını araştırdık. Primer ortotopik 4T1 tümörlerin rezeksiyonu ile spontan metastatik TNBC modeli oluşturuldu ve bu model, başta akciğerler olmak üzere birçok organda metastaz gelişmesine yol açacaktır.[50] Bu modelde, Nano-IL-12'nin ICI'lerle kombinasyon tedavisi de tatmin edici sonuçlar ortaya çıkardı; bu, akciğer metastazının ilerlemesini durdurdu (Şekil 6b) ve tedavi edilen tüm farelerde CR'ye yol açtı. Ayrıca, 4T1 hücrelerinin intravenöz enjeksiyonu ile yeniden mücadele sonrasında, tedavi edilen farelerin çoğu güçlü bir direnç gösterdi; bu, Nano-IL-12 ve ICI kombinasyonundan gelen etkili bir bağışıklık hafızasına işaret ediyor. TNBC'nin yanı sıra, birincil B16F10 melanom modelinde Nano-IL-12'yi ICI ile birlikte test ettik (Şekil S13, Destekleyici Bilgiler). Sonuçlar, Nano-IL-12 (10 ug IL-12 eşdeğerliği/enjeksiyon) ile anti-PD-1 antikorunun kombinasyonunun gruptaki 6 fareden 4'ünde CR'ye yol açtığını gösterdi ve tedavi edilen fareler, B16F10 hücreleriyle yeniden mücadeleye karşı direnç gösterdi, bu da güçlü bir immünolojik hafızaya işaret ediyor.

3. Tartışma

pH 7,4'te IL-12'nin biyoaktivitesini susturabilen, ancak pH 7,4'te tamamen aktif sitokini geri alabilen hassas nanositokinler (Nano-IL-12) kullanan, tümörle aktifleşebilen bir IL-12 stratejisi geliştirdik. intratümöral pH. Sistemik enjeksiyon üzerine Nano-IL-12 kan dolaşımında stabil bir şekilde dolaşarak patolojik olmayan bölgelerdeki bağışıklık tepkisini ve tekrarlanan uygulamalardan sonra bile irAE vakalarını azalttı. Öte yandan, Nano-IL-12'nin tümörlerdeki yüksek birikimi ve aktivasyonu, ICI'ler ile etkinliğin ve sinerjinin önemli ölçüde artmasına yol açarak, ICI'lere dirençli soğuk tümör modellerinde CR elde edilmesine ve sağlam bir sonuç verilmesine yol açar. Tedaviden sonra bağışıklık hafızası.

Nano-IL-12, inflamatuar sitokinlerin güçlü salgılanmasını, efektör hücrelerin infiltrasyonunun artmasını ve immünosupresif hücrelerin varlığının azalmasını sağlayarak TME'yi derinden aktive etti. Üstelik Nano-IL-12, tümör hücrelerinde anti-PD-1 antikorlarının aktivitesini artırabilen PD-L1 seviyelerini yükseltti. Nano-IL-12'nin antiPD-1 antikorlarıyla işbirliği yaparak TME'de neden olduğu değişiklikler, antijen sunumunun arttırılması, efektör hücrelerin varlığının artması ve aktivitelerinin güçlendirilmesi yoluyla kanser bağışıklığını uyarmak ve bağışıklık hücresi etkileşimlerinin teşviki. Klinik çalışmalar, anti-PD1/anti-PD-L1 kontrol noktası blokajının, yüksek sayıda tümör infiltre eden lenfosite sahip PD-L1-pozitif TNBC hastalarında daha yüksek yanıt oranına sahip olduğunu göstermiştir.[51,52] Bununla birlikte, TNBC'ye karşı monoterapi olarak immün kontrol noktası blokajının genel performansı, TNBC'nin genel olarak düşük ekspresyonu ve önemli ölçüde heterojen TME'si nedeniyle tatmin edici değildi[53,54]. Aslında, yalnızca kemoterapiyle kombinasyon halinde PD-L1 blokajı (Nab-Paklitaksel), metastatik TNBC hastalarında onaylanmıştır ve bu, TNBC hastalarının küçük bir bölümünde mütevazı bir genel sağkalım faydası sağlar.[57] Bu nedenle, Nano-IL{30}}'nin bağışıklık baskılayıcı TME'yi geçersiz kılma ve TNBC'nin PD-L1 ifadesini artırma potansiyeli, kontrol noktası blokajının yanıt oranlarını artırmak için güçlü bir alternatif sağlayabilir. Nano-IL-12'nin gelişmiş güvenliği de terapötik uygulama açısından önemli bir avantajdır. Önceki klinik çalışmalar, sistemik olarak enjekte edilen IL-12'nin güçlü hematolojik ve hepatik toksisitelere neden olduğunu göstermiştir.[58,59] Bu tür yan etkiler esas olarak IL{{40} tarafından indüklenen IFN-𝛾 ve TNF-𝛼 üretimi ile ilişkilidir. } tedavisi.[42,60] Çalışmamızda Nano-IL-12, kanda ve organlarda, organ hasarını sınırlayan serbest IL-12'den önemli ölçüde daha düşük sitokin seviyeleri gösterdi. Böylece, Nano-IL- 12'yi fare başına 10 ug IL-12, yani yaklaşık 500 ug kg-1, yani yaklaşık {{52} olacak şekilde birkaç kez enjekte edebildik. }insanlarda IL'nin maksimum tolere edilen dozundan (MTD)-12 kat daha yüksektir, yani 500 ng kg-kg-1. [61] Sistemik IL-12 tedavisinin klinik çalışmalarda gözlemlenen bir diğer önemli yan etkisi, IL-12'nin ikinci bir uygulamasından sonra adaptif bir anti-inflamatuar yanıtın başlamasıdır ve bu da etkinliğin azalmasına neden olur. [20,21] Bu tür bir fenomen, anti-inflamatuar IL-10'nin aşırı üretimi ve IFN-𝛾, TNF-𝛼 ve IL{{{ gibi proinflamatuar sitokinlerin azalmasıyla ilişkili olumsuz geri bildirim mekanizmalarıyla ilişkilendirilmiştir. 67}}.[20,22] Nano-IL-12, ikinci uygulamadan sonra kanda ve organlarda IL-10 artışını önledi; bu, doz düşüşü olmadan tekrarlanan uygulama programlarının gerçekleştirilmesi için uygun olabilir. antitümör etkileri. Özellikle Nano-IL-12 ile tedavi, tümörlerdeki IL-10 konsantrasyonunu artırmadı; IFN-𝛾, TNF-𝛼 ve IL-6'nin tümör içi yüksek seviyelerini korudu.

Şekil 6. Nano-IL-12, göğüs tümörlerini yok etmek için bağışıklık kontrol noktası inhibitörleriyle sinerji oluşturur. Hem ortotropik hem de metastatik TNBC modellerinde fareler, PBS, IL-12 + ICI'ler (anti-CTLA4 ve anti-PD-1) ve Nano-IL-12 + ICI tedavilerini (doz) alacak şekilde gruplandırıldı ve tedavi programı sırasıyla üst panellerdeki şemada gösterilmiştir). a) Nano-IL-12 ve ICI'lerin kombinasyon tedavisi, tedavi edilen tüm farelerde ortotopik tümörlerin tamamen yok edilmesini sağladı. Bireysel tümör büyüme eğrileri sol panelde gösterilmektedir. Ortalama tümör hacmi ve hayatta kalma eğrileri sağ üst panelde gösterilmektedir. Tedavi edilen fareler, memeye 4T1 hücrelerinin yeniden enjeksiyonuna karşı güçlü bir savunma gösterdi; tedavi edilen farelerde tümör büyümesi görülmedi (sağ alt panel). b) Nano-IL-12 ve ICI'lerin kombinasyon tedavisi, metastatik tümör ilerlemesine karşı güçlü bir engelleme gösterdi. Tedaviden sonra (23. Gün), Nano-IL-12 + ICI kombinasyon terapisiyle tedavi edilen farelerin akciğerleri, temsili fotoğraflarla (yeşil oklar: makroskopik metastaz) ve histolojik değerlendirmeyle (Ölçek çubuğu {{21) gösterildiği gibi, açıkça daha az metastaz gösterdi. }} μm) sol panelde sunulur. Nano-IL-12 + ICI'lerin kombinasyon tedavisi, hayatta kalma eğrilerinin (sağ üst panel) gösterdiği gibi, sonunda tedavi edilen tüm farelerde tam bir yanıta yol açtı. Ayrıca tedavi edilen fareler, 4T1 hücrelerinin (sağ alt panel) enjeksiyonu yoluyla tümörün yeniden tehdit edilmesine karşı güçlü bir savunma gösterdi. (Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilmektedir; grup başına n=6 fare; p değerleri log-rank analizi yoluyla hesaplanır).

IL-12 en güçlü immün sistemi uyarıcı sitokinlerden biri olarak kabul edildiğinden, IL-12- kaynaklı toksisiteleri azaltmak ve etkinliğini güçlendirmek için çeşitli yaklaşımlar yoğun bir şekilde incelenmektedir. Sitokinleri yerinde üretmek için IL-12 ve adjuvanlar[62] ve plazmid DNA[63] veya IL-12'yi kodlayan haberci RNA[64] bazlı formülasyonlar gibi doğrudan tümör içi enjeksiyon kullanan stratejiler, terapötik indeksi maksimuma çıkarır.[8] Bununla birlikte, lokal uygulama klinikte, enjekte edilemeyen pozisyonlarda büyüyen tümörlerin tedavisi,[65] operatöre bağlı etkinlikler,[66] enjekte edilen ilaçların tümörde eşit olmayan dağılımı,[67] ve dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalarla karşılaşabilir. sızıntının neden olduğu hedef dışı teslimat.[68] Ayrıca, intratumoral olarak enjekte edilen formülasyonların uzak metastaza karşı antikanser aktivitesi, büyük ölçüde abskopal etkinin değişken etkinliğine dayanır;[69] bu, klinik çalışmalarda düşük oluşum oranları göstermiştir[70-72] ve immünosüpresif sinyallerin üstesinden gelemeyebilir. metastazda.[73] Standart bir klinik prosedür olan Nano-IL-12'yi sistemik intravenöz enjeksiyonla güvenli bir şekilde uygulama olasılığı, öngörülebilir farmakokinetiklere izin verebilir ve kan desteği yoluyla tüm tümör bölgelerine erişme potansiyeline sahiptir. IL-12-tabanlı Fc-füzyon proteinleri[14] ve immünositokinler[11–13] de bu avantajları NanoIL-12 ile paylaşır. Ancak bu bileşiklerdeki IL-12 bileşeni sistemik olarak aktiftir ve bu da güvenlik endişelerini artırmaktadır. Örneğin, IL-12'nin uzun dolaşımdaki füzyon proteinleri, yüksek seviyelerde serum IFN-𝛾[74,75] ve IL-12 immün sitokinlerinin hedef dışı bölgelerde birikimler gösterdiğini göstermiştir.[76, 77] Nano-IL-12'in uzay-zamansal aktivasyonu kontrol etme yeteneği, tümör hedeflemede spesifikliğe sahip güvenli ve güçlü bir strateji sağlayabilir.

Cistanche tubulosa'nın faydaları-Antitümör

Mevcut çalışmamızın bir sınırlaması, Nano-IL-12'nin fare IL-12'yi temel almasıdır. Fare IL-12 ile insan IL-12 arasındaki homolojinin %60-70 civarında olduğu göz önüne alındığında, insan IL-12- bazlı nanositokinin aktivite ve aktiviteye sahip formülasyonunu belirlemek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç duyulacaktır. Fare tabanlı sistemle karşılaştırılabilir güvenlik profilleri. Şans eseri, ön testler çalışmamızda kullanılan polimerlerin benzer pH duyarlılığıyla insan IL-12'sini de kaplayabildiğini gösterdi. Üstelik polimerler hassas bir şekilde tasarlanabildiğinden, insanların kullanımına yönelik uygun uzaysal-zamansal profillere sahip, insan IL{10}}tabanlı bir sistem geliştirmek mümkün olabilir. Sonuç olarak, nano sitokinler olarak Nano-IL-12, sistemik uygulama üzerine IL-12 aktivitesinin etkili uzay-zamansal kontrolünü sağlayarak primer ve metastatik soğuk tümörde tatmin edici güvenlik ve tedavi sonuçları elde etmek için intratumoral bağışıklığın hassas bir şekilde uyarılmasını sağladı. Kontrol noktası ablukasıyla sinerji oluşturan modeller. Nano-IL-12'yi birleştirmek için kullanılan polimerler, farklı moleküler ağırlıklara ve yüzey yüküne sahip geniş bir protein yelpazesini kapsüllemek üzere tasarlanabildiğinden, sistem, diğer terapötik sitokinlerin kapsüllenmesi veya hatta daha geniş uygulama olasılıkları için potansiyele sahiptir. sitokin kokteylleri. Dahası, polimerik sistemin pH'ın yanı sıra diğer uyarıları da algılayacak şekilde daha fazla tasarlanabileceği göz önüne alındığında,[78] nano sitokinler çeşitli tümör mikro ortamlarını hedef alacak şekilde tasarlanabilir. Son olarak, kullanılan polimerlerin ve nano sitokinlerin translasyon potansiyeli göz önüne alındığında, bu strateji kanser immünoterapisinin geleceği için umut vaat etmektedir.

Referanslar

[1] AJ Korman, SC Garrett-Thomson, N. Lonberg, Nat. Rev. İlaç Keşfi 2021, 21, 509.

[2] A. Ribas, JD Wolchok, Science 2018, 359, 1350.

[3] A. Haslam, V. Prasad, JAMA Network Open 2019, 2, e192535.

[4] P. Sharma, BA Siddiqui, S. Anandhan, SS Yadav, SK Subudhi, J. Gao, S. Goswami, JP Allison, Cancer Discovery 2021, 11, 838.

[5] JD Martin, H. Cabral, T. Stylianopoulos, RK Jain, Nat. Rahip Clin. Onkol. 2020, 17, 251.

[6] CM Fares, EM Van Allen, CG Drake, JP Allison, S. HuLieskovan, Am. Sos. Klin. Onkol. Eğitim Kitap. 2019, 39, 147.

[7] K. Chamoto, R. Hatae, T. Honjo, Int. J. Clin. Onkol. 2020, 25, 790.

[8] KG Nguyen, MR Vrabel, SM Mantooth, JJ Hopkins, ES Wagner, TA Gabaldon, DA Zaharoff, Ön. İmmünol. 2020, 11, 2510.

[9] EA Chiocca, AB Gelb, CC Chen, G. Rao, DA Reardon, PY Wen, WL Bi, P. Peruzzi, C. Amidei, D. Triggs, L. Seften, G. Park, J. Grant, K Truman, JY Buck, N. Hadar, N. Demars, J. Miao, T. Estupinan, J. Loewy, K. Chadha, J. Tringali, L. Cooper, R.V Lukas, Nöro-Onkoloji 2021, 24, 951.

[10] B. Mirlekar, Y. Pylayeva-Gupta, Kanserler 2021, 13, 167.

[11] A. Mansurov, J. Ishihara, P. Hosseinchi, L. Potin, TM Marchell, A. Ishihara, J.-MM Williford, AT Alpar, MM Raczy, LT Gray, MA Swartz, JA Hubbell, Nat. Biyomed. Müh. 2020, 4, 531.

[12] N. Pasche, D. Neri, Drug Discovery Today 2012, 17, 583.

[13] J. Strauss, CR Heery, JW Kim, C. Jochems, RN Donahue, AS Montgomery, S. McMahon, E. Lamping, JL Marte, RA Madan, M. Bilusic, MR Silver, E. Bertotti, J. Schlom, JL Gulley, Clin. Kanser Arş. 2019, 25, 99.

[14] K. Jung, JH Ha, JE Kim, JA Kim, YJ Kim, CH Kim, YS Kim, OncoImmunology 2018, 7, e1438800.

[15] A. Mansurov, P. Hosseinchi, K. Chang, AL Lauterbach, LT Gray, AT Alpar, E. Budina, AJ Slezak, S. Kang, S. Cao, A. Solanki, S. Gomes, J.- M. Williford, MA Swartz, JL Mendoza, J. Ishihara, JA Hubbell, Nat. Biyomed. Müh. 2022, 6, 819.

[16] HD Chang, A. Radbruch, Uzman Rev. Clin. İmmünol. 2014, 3, 709.

[17] H. Chang, A. Radbruch, D. Rheumaforschungszentrum, Ann. NY Acad. Bilim. 2007, 1109, 40.

[18] S. Tugues, SH Burkhard, I. Ohs, M. Vrohlings, K. Nussbaum, J. Vom Berg, P. Kulig, B. Becher, Cell Death Differ. 2014, 22, 237.

[19] C. Asselin-Paturel, M. Isabelle Vergnon, B. Hamid Echchakir, M. Guillaume Dorothé, M. Sé vrine Blesson, M. Franç oise Gay, B. Fathia Mami-Chouaib, S. Chouaib, Cancer 2001, 91, 113.

[20] JEA Portielje, CHJ Lamers, WHJ Kruit, A. Sparreboom, RLH Bolhuis, G. Stoter, C. Huber, JW Gratama, Clin. Kanser Arş. 2003, 9, 76.

[21] JP Leonard, ML Sherman, GL Fisher, LJ Buchanan, G. Larsen, MB Atkins, JA Sosman, JP Dutcher, NJ Vogelzang, JL Ryan, Blood 1997, 90, 2541.

[22] E. Bajetta, M. Del Vecchio, R. Mortarini, R. Nadeau, A. Rakhit, L. Rimassa, C. Fowst, A. Borri, A. Anichini, G. Parmiani, Clin. Kanser Arş. 1998, 4, 75.

[23] C. Corbet, O. Feron, Nat. Rev. Cancer 2017, 17, 577. [24] M. Bellone, A. Calcinotto, P. Filipazzi, A. De Milito, S. Fais, L. Rivoltini, Oncoimmunology 2013, 2, e22058.

[25] S. Damgacı, A. Ibrahim-Hashim, PM Enriquez-Navas, S. PilonThomas, A. Guvenis, RJ Gillies, Immunology 2018, 154, 354.

[26] J. Liu, H. Cabral, B. Song, I. Aoki, Z. Chen, N. Nishiyama, Y. Huang, K. Kataoka, P. Mi, ACS Nano 2021, 15, 13526.

[27] A. Tao, GLo Huang, K. Igarashi, T. Hong, S. Liao, F. Stellacci, Y. Matsumoto, T. Yamasoba, K. Kataoka, H. Cabral, Macromol. Biosci. 2020, 20, 1900161.

[28] Y. Mochida, H. Cabral, Y. Miura, F. Albertini, S. Fukushima, K. Osada, N. Nishiyama, K. Kataoka, ACS Nano 2014, 8, 6724.

[29] JS Suk, Q. Xu, N. Kim, J. Hanes, LM Ensign, Adv. İlaç Dağıtımı Rev. 2016, 99, 28.

[30] CY Sun, Y. Liu, JZ Du, ZT Cao, CF Xu, J. Wang, Angew. Kimya, Uluslararası Ed. 2016, 55, 1010.

[31] A. Ibrahim-Hashim, V. Estrella, Cancer Metastasis Rev. 2019, 38, 149.

[32] G. Trinchieri, F. Gerosa, J. Lökosit Biol. 1996, 59, 505.

[33] T. Starciuc, B. Malfait, F. Danede, L. Paccou, Y. Guinet, NT Correia, A. Hedoux, J. Pharm. Bilim. 2020, 109, 496.

[34] G. Egawa, S. Nakamizo, Y. Natsuaki, H. Doi, Y. Miyachi, K. Kabashima, Kök Hücreler Uluslararası. 2013, 3, 1932.

[35] S. Jayanthi, BP Koppolu, KG Nguyen, SG Smith, BK Felber, TKS Kumar, DA Zaharoff, Kök Hücreler Uluslararası. 2017, 7, 5360.

[36] MP Hwuang, RJ Fecek, T. Qin, WJ Storkus, Y. Wang, J. Kontrollü Sürüm 2019, 318, 270.

[37] Q. Wang, Y. Wang, J. Ding, C. Wang, X. Zhou, W. Gao, H. Huang, F. Shao, Z. Liu, Nature 2020, 579, 421.

[38] G. Trinchieri, Annu. Rev. Immunol. 1995, 13, 251.

[39] L. Meyaard, E. Hovenkamp, ​​SA Otto, F. Miedema, J. Immunol. 1996, 156, 2776.

[40] A. Cope, GLe Friec, J. Cardone, C. Kemper, Trends Immunol. 2011, 32, 278.

[41] SP Kerkar, RS Goldszmid, P. Muranski, D. Chinnasamy, Z. Yu, RN Reger, AJ Leonardi, RA Morgan, E. Wang, FM Marincola, G. Trinchieri, SA Rosenberg, NP Restifo, J. Clin . Yatırım. 2011, 121, 4746.

[42] W. Lasek, R. Zago˙zd˙zon, M. Jakobisiak, Cancer Immunol. Bağışıklık sistemi. 2014, 63, 419.

[43] C. Zhang, J. Zhang, J. Niu, Z. Zhou, J. Zhang, Z. Tian, ​​Hum. İmmünol. 2008, 69, 490.

[44] NG Jacobson, SJ Szabo, RM Weber-Nordt, Z. Zhong, RD Schreiber, JE Darnell, KM Murphy, J. Exp. Med. 1995, 181, 1755.

[45] K. Mimura, JL Teh, H. Okayama, K. Shiraishi, LF Kua, V. Koh, DT Smoot, H. Ashktorab, T. Oike, Y. Suzuki, Z. Fazreen, BR Asuncion, A. Shabbir , WP Yong, J. So, R. Soong, K. Kono, Cancer Sci. 2018, 109, 43.

[46] T. Watanabe, S. Watanabe, G. Neumann, H. Kida, Y. Kawaoka, J. Virol. 2002, 76, 767.

[47] AS Bergot, A. Durgeau, B. Levacher, BM Colombo, JL Cohen, D. Klatzmann, Cancer Gene Ther. 2010, 17, 645.

[48] ​​R. Dent, M. Trudeau, KI Pritchard, WM Hanna, HK Kahn, CA Sawka, LA Lickley, E. Rawlinson, P. Sun, SA Narod, Clin. Kanser Arş. 2007, 13, 4429.

[49] BG Haffty, Q. Yang, M. Reiss, T. Kearney, SA Higgins, J. Weidhaas, L. Harris, W. Hait, D. Toppmeyer, J. Clin. Onkol. 2006, 24, 5652.

[50] AV Paschall, K. Liu, J. Görselleştirilmiş Exp. 2016, 2016, 54040.

[51] A. Marra, G. Viale, G. Curigliano, BMC Med. 2019, 17, 90.

[52] R. Thomas, G. Al-Khadairi, J. Decock, Ön. Onkol. 2021, 10, 3464.

[53] S. Adams, P. Schmid, HS Rugo, EP Winer, D. Loirat, A. Awada, DW Cescon, H. Iwata, M. Campone, R. Nanda, R. Hui, G. Curigliano, D. Toppmeyer, J. O'Shaughnessy, S. Loi, S. Paluch-Shimon, AR Tan, D. Card, J. Zhao, V. Karantza, J. Cortés, Ann. Onkol. 2019, 30, 397.

[54] LY Dirix, I. Takacs, G. Jerusalem, P. Nikolinakos, HT Arkenau, A. Forero-Torres, R. Boccia, ME Lippman, R. Somer, M. Smakal, LA Emens, B. Hrinczenko, W Edenfield, J. Gurtler, A. von Heydebreck, HJ Grote, K. Chin, EP Hamilton, Meme Kanseri Res. Davranmak. 2018, 167, 671.

[55] EA Mittendorf, AV Philips, F. Meric-Bernstam, N. Qiao, Y. Wu, S. Harrington, X. Su, Y. Wang, AM Gonzalez-Angulo, A. Akçakanat, A. Chawla, M. Curran, P. Hwu, P. Sharma, JK Litton, JJ Molldrem, G. Alatrash, Cancer Immunol. Res. 2014, 2, 361.

[56] MT Barrett, E. Lenkiewicz, S. Malasi, A. Basu, JH Yearley, L. Annamalai, AE McCullough, HE Kosiorek, P. Narang, MA Wilson Sayres, M. Chen, KS Anderson, BA Pockaj, Breast Kanser Arş. 2018, 20,71.

[57] P. Schmid, S. Adams, HS Rugo, A. Schneeweiss, CH Barrios, H. Iwata, V. Diéras, R. Hegg, S.-A. Im, GS Wright, V. Henschel, L. Molinero, SY Chui, R. Funke, A. Husain, EP Winer, S. Loi, LA Emens, N. Engl. J. Med. 2018, 379, 2108.

[58] MK Gately, U. Gubler, MJ Brunda, RR Nadeau, TD Anderson, JM Lipman, U. Sarmiento, Ther. İmmünol. 1994, 1, 187.

[59] UM Sarmiento, JH Riley, PA Knaack, JM Lipman, JM Becker, MK Gately, R. Chizzonite, TD Anderson, Lab. Yatırım. 1994, 71, 862.

[60] VM Eng, BD Car, B. Schnyder, M. Lorenz, S. Lugli, M. Aguet, TD Anderson, B. Ryffel, VFJ Quesniaux, J. Exp. Med. 1995, 181, 1893.

[61] JA Gollob, KG Veenstra, RA Parker, JW Mier, DF McDermott, D. Clancy, L. Tutin, H. Koon, MB Atkins, J. Clin. Onkol. 2003, 21, 2564.

[62] Y. Agarwal, LE Milling, JYH Chang, L. Santollani, A. Sheen, EA Lutz, A. Tabet, J. Stinson, K. Ni, KA Rodrigues, TJ Moyer, MB Melo, DJ Irvine, KD Wittrup , Nat. Biyomed. Müh. 2022, 6, 129.

[63] ML Lucas, L. Heller, D. Coppola, R. Heller, Mol. Orada. 2002, 5, 668.

[64] SL Hewitt, D. Bailey, J. Zielinski, A. Apte, F. Musenge, R. Karp, S. Burke, F. Garcon, A. Mishra, S. Gurumurthy, A. Watkins, K. Arnold, J. Moynihan, E. Clancy-Thompson, K. Mulgrew, G. Adjei, K. Deschler, D. Potz, G. Moody, DA Leinster, S. Novick, M. Sulikowski, C. Bagnall, P. Martin, JM Lapointe, H. Si, C. Morehouse, M. Sedic, RW Wilkinson, R. Herbst, ve diğerleri, Clin. Kanser Arş. 2020, 26, 6284.

[65] RS Riley, CH June, R. Langer, MJ Mitchell, Nat. Rev. İlaç Keşfi 2019, 18, 175.

[66] I. Melero, E. Castanon, M. Alvarez, S. Champiat, A. Marabelle, Nat. Rahip Clin. Onkol. 2021, 18, 558.

[67] LM Wein, JT Wu, DH Kirn, Cancer Res. 2003, 63, 1317.

[68] J. Hong, C.-O. Yun, BMC Biomed. Müh. 2019, 1, 17.

[69] A. Mukhopadhyay, J. Wright, S. Shirley, DA Canton, C. Burkart, RJ Connolly, JS Campbell, RH Pierce, Gene Ther. 2018, 26, 1.

[70] MA Postow, MK Callahan, CA Barker, Y. Yamada, J. Yuan, S. Kitano, Z. Mu, T. Rasalan, M. Adamow, E. Ritter, C. Sedrak, AA Jungbluth, R. Chua , AS Yang, R.-A. Roman, S. Rosner, B. Benson, JP Allison, AM Lesokhin, S. Gnjatic, JD Wolchok, N. Engl. J. Med. 2012, 366, 925.

[71] EF Stamell, JD Wolchok, S. Gnjatic, NY Lee, I. Brownell, Int. J. Radiat. Oncol., Biol., Phys. 2013, 85, 293.

[72] EB Golden, S. Demaria, PB Schiff, A. Chachoua, SC Formenti, Cancer Immunol. Res. 2013, 1, 365.

[73] TY Seiwert, AP Kiess, J. Clin. Onkol. 2021, 39, 1.

[74] E. Gutierrez, M. Bigelow, C. LaCroix, P. Kirby, L. Markowitz, M. Naill, S. O'Neil, PA Hull, J. Engelhardt, J.-M. Cuillerott, A. Cheung, A. Grinberg, N. Wagtmann, Cancer Res. 2021, 81, 1714

[75] R. Varma, K. Liu, C. Bonzon, R. Rashid, N. Rodriguez, N. Hassanzadeh-Kiabi, C. Ardila, SY Chu, US Muchhal, JR Desjarlais, MJ Bernett, Cancer Res. 2020, 80, 5549.

[76] J. Sharifi, LA Khawli, P.Hu, S. King, AL Epstein, Hybrid Hybridomics 2001, 20, 305.

[77] C. Halin, S. Rondini, F. Nilsson, A. Berndt, H. Kosmehl, L. Zardi, D. Neri, Nat. Biyoteknoloji. 2002, 20, 264.

[78] S. Mura, J. Nicolas, P. Couvreur, Nat. Anne. 2013, 12, 991.

[79] E. Becht, NA Giraldo, L. Lacroix, B. Buttard, N. Elarouci, F. Petitprez, J. Selves, P. Laurent-Puig, C. Sautès-Fridman, WH Fridman, A. de Reyniès, Genom Biol. 2016, 17, 218