Bakteriyel Yüzey Proteinlerinin Ubikitinasyonunu İçeren Doğuştan Gelen Bir Patojen Algılama Stratejisi Bölüm 2

TARTIŞMA

Metazoanlar, sitosolik homeostazı sürdürmek, hasarlı proteinlerin/organellerin birikmesini önlemek ve istilacı patojenlere karşı savunma yapmak için çok yönlü bir mekanizma olarak ubiquitination'ı kullanır (40, 41). Karşılaşılan çeşitli patojenler ve çeşitli hasar görmüş protein grupları göz önüne alındığında, substrat tanıma ve ardından ubiquitination için ortak motiflerin tanımlanması, kaynak optimizasyonu için akıllı bir stratejiyi temsil eder. Ökaryotik hücrelerde proteolize giden proteinler tipik olarak üçlü bir degron motifi ile tanımlanır (24).

Bağışıklık, vücudun bakterilere, virüslere ve diğer zararlı maddelere verilen tepkiler dahil olmak üzere hastalıklarla savaşma yeteneğidir. Vücudun bağışıklık sistemi tehlikeye girerse, hastalık saldırısıyla başa çıkmak için yeterince güçlü olmayacaktır. Çalışmalar, yetersiz beslenmenin bağışıklık sisteminin işlevi üzerinde bir etkiye sahip olduğunu ve vücudu enfeksiyon ve hastalığa karşı daha duyarlı hale getirdiğini göstermiştir. Protein, bağışıklığı korumak için önemli maddelerden biridir.

Proteinler amino asitlerden yapılır, bazılarına esansiyel amino asitler denir, çünkü bunlar gıda ile sağlanmalıdır ve vücut tarafından sentezlenemezler. Bu esansiyel amino asitler arasında triptofan, lösin, fenilalanin, lizin, izolösin, metiyonin, valin ve histidin bulunur. Vücut yeterince esansiyel amino asit almazsa, bağışıklık sisteminin işlevini etkileyebilecek protein metabolizmasının bozulmasına neden olabilir.

Ek olarak, yüksek kaliteli protein alımı, normal bir bağışıklık sistemi ve vücut fonksiyonlarının korunmasına yardımcı olur. Vücutta protein bulunmadığında, bağışıklık sistemi zayıflayabilir ve vücut hastalığa karşı daha duyarlı hale gelebilir. İnsan vücudu uzun süre protein eksikliği yaşarsa, bağışıklık sisteminde uzun süreli hasara neden olarak insanları çeşitli hastalıklara karşı duyarlı hale getirebilir.

Bu nedenle, dengeli bir diyet ve uygun egzersiz, protein alımını sürdürmenin anahtarıdır. İnsanlar vücutlarının protein ihtiyaçlarını et, kümes hayvanları, balık, fasulye, yumurta, süt ürünleri, tahıllar, kabuklu yemişler ve tohumlar gibi protein açısından daha zengin besinler yiyerek karşılayabilirler. Ek olarak, orta düzeyde egzersiz, vücudun protein talebini ve emilim etkinliğini de artırabilir. Dengeli ve çeşitli beslenme ve sağlıklı bir yaşam tarzı, bağışıklığı korumanın, vücudu sağlıklı ve dengeli tutmanın ve hastalıkların istilasına direnmenin anahtarıdır. Bu açıdan bağışıklığımızı güçlendirmemiz gerekiyor. Cistanche, bağışıklığı önemli ölçüde artırabilir çünkü etteki polisakkaritler, insan bağışıklık sisteminin bağışıklık yanıtını düzenleyebilir, bağışıklık hücrelerinin stres yeteneğini geliştirebilir ve bağışıklık hücrelerinin bağışıklığını artırabilir. Bakterisidal etki.

Cistanche Deserticola takviyesine tıklayın

Bu, bizi, substrat tanıma için bir vekil olarak işlev görebilecekleri patojen yüzeylerinde benzer motiflerin bulunup bulunmadığını keşfetmeye sevk etti. Burada, konak ubikuitin ligazlarının filogenetik olarak farklı patojenleri algılamak için benzer moleküler imzalar kullandığını gösteriyoruz. Ortak moleküler modeller/motifler (PAMP'ler) aracılığıyla patojen tanıma, doğuştan gelen bağışıklığın iyi karakterize edilmiş bir özelliğidir (42). Sonuçlarımız, bakteriyel yüzey proteinleri içindeki degron benzeri dizilerin, hücre içi patojen sürveyansı vermek için PAMP'lere eşdeğer bir şekilde hareket ettiğini göstermektedir. Bu modus işleneni, hücre içi patojenlere karşı yönlendirilmiş güçlü bir CD8 tepkisini indüklemek için ana histo-uyumluluk kompleksi I üzerinde mikrobiyal protein antijenlerinin sunumu için konakçı tarafından daha fazla kullanılabilir.

Patojenlerin ubikuitin aracılı tespitinin konak savunmalarına yönelik potansiyel önemi, hem BgaA hem de PspA'dan yoksun mutant SPN'de tespit edilen önemli artık ubikitinasyon ile daha da vurgulanmaktadır. Bu, ubikuitin makinesinin tanımlanamayan daha başka substratları olduğunu gösterir ve sonuçta ortaya çıkan fazlalık, sağlam patojen müdahalesini garanti eder. Özellikle, degron motifi ve onun bakteriler için önemi (tanınabilir bir birim olması dışında) hakkında bazı acil sorular ilginç bir evrimsel açı sağlar.

Degron motifi in vivo olarak vazgeçilebilir ve eğer herhangi bir şey varsa, motifin mutasyona uğratılması veya silinmesi hücre içi kalıcılığı geliştirerek öldürücülüğün artmasına neden olur. Bu, degron motifindeki mutasyonun, SPN serotip 19F için görüldüğü gibi ubikuitin aracılı tanımadan kaçmak için patojenler tarafından kullanılabileceğine dair sonuçlarımızla doğrulanmıştır. Bununla birlikte, SPN serotiplerinin çoğu boyunca BgaA'daki degron motifinin korunmuş doğası, bakteriler tarafından konakçı için daha az öldürücü olacak şekilde benimsenen bir karşı stratejiyi akla getirebilir.

Bu, patojenin işgal edilebilir yaşam alanlarını artırması için bir fırsat sağlayabilir. Aynı zamanda, degron motifinde bakteri yüzeyinin veya salgılanan proteinlerin her yerde bulunması, nihai fayda için konak tepkisini azaltmak veya yeniden yapılandırmak için bunları işlevsel olarak modüle edebilir (43). Bu nedenle, ökaryotik benzeri işlevsel alanların veya motiflerin (degronlar gibi) varlığı veya yokluğu, patojenik bir nişe bağlı olabilir ve konakçı bağışıklık tepkilerinden kaçmak veya modüle etmek üzere uyarlanabilir.

Guanilat bağlayıcı proteinleri içeren benzer bir patojen algılama mekanizması da bakteriyel klirens ile ilişkilendirilmiştir; ancak her yerde bulunmanın aksine, rollerinin Gram-negatif patojenlerle sınırlı olduğu bildirilmektedir (44-47). Ubiquitination, Gram kökeninden bağımsız olarak patojeni hedefler, örneğin, RNF213'ün Listeria spp.'yi hedeflediği belgelenmiştir. LPS olmamasından bağımsız olarak (48). Bu nedenle, SPN'ye karşı antimikrobiyal etki olasılığını da ortadan kaldırmıyoruz.

Patojenik bir yüzey, zincirler arası etkileşimlere sahip farklı E3 ligazları tarafından çoklu zincir tipleri ile ubikitinleştirilebilir (41). Özellikle Mtb durumunda, Smurf1 ve Parkin'in patojeni parçalamak için sinerjistik olarak işlev gören K48 ve K63 zincir tiplerini oluşturduğu kanıtlanmıştır (12). Enfeksiyon senaryoları sırasında yer alan K48 ubiquitination ve E3 ligazlarının mekanik rolünü anlamak hala yeterince çalışılmamıştır. STm durumunda, tek bir E3 ligaz ARIH1'in, sistemden elimine edilmelerine yol açan K48 ubikuitin zincirleri ile sitozolik STm'yi hedeflediği gösterilmiştir (15). Bizim ve diğerlerinin bulgularına göre, K48-Ub etiketli patojenler, proteasomal mekanizma ile ilişkilendirilirken en sonunda bozulur.

Ancak bu çalışma, spesifik bakteriyel yüzey proteinlerinin K48-Ub dekorasyonunu göstermektedir. Bazı patojenlerin, yüzey proteinlerini aktif olarak değiştirdiği, onları ubikutinasyondan ve müteakip ölümden koruduğu, böylece ubikuitin substratının yüzey lokalizasyonunun önemini vurguladığı bilinmektedir (10). Ek olarak, çoklu zorunlu hücre içi patojenler, ubikuitin aracılı klerensten kaçınmak için kendilerini de-ubikuitinasyona veya düzenleyici bileşenleri barındırmaya yönelik stratejiler geliştirmiştir (5). Birlikte, bu bulgular, ubikuitin aracılı alarm uyarılmasının, konak savunmasında merkezi bir temel hücre içi patojen algılama mekanizması olarak önemini vurgulamaktadır.

Çalışmamız ayrıca, SCF E3 ligazın, özellikle FBXW7 ile, patojen bozunmasını artıran bakteriyel ubiquitination'daki merkezi rolünü göstermiştir. FBXW7'deki heterozigot mutasyonlar, özellikle R505C (substrat tanıma cebinde kritik bir kalıntı) varyantı, insanlarda çok sayıda karsinomu ve lenfositik lösemiyi tetikler (49, 50). Yakın tarihli bir kohort tabanlı çalışma, kronik lenfositik lösemili (KLL) hastaların yaklaşık yüzde 43'ünün bakteriyel pnömoni ve sepsise, ardından mantar enfeksiyonlarına yenik düştüğünü göstermiştir (51).

Bu, FBXW7 mutasyonu taşıyan konakçı hücrelerin patojenleri algılama ve ortadan kaldırma konusundaki iptal edilmiş yeteneklerine ilişkin gözlemimizi desteklemektedir. Bu nedenle bulgularımız, KLL'li hastalarda artan enfeksiyon riskinin beklenmedik bir moleküler açıklamasını sağlar. E3 ligaz genlerindeki genetik polimorfizm ile bakteriyel enfeksiyonlara yatkınlık arasındaki bağlantı, tifo ateşi veya cüzzam hastalığına karşı hassas olan Parkinson hastalığı olan hastalar tarafından da doğrulanmıştır (14), bu da E3 ligazlarının bakteriyel enfeksiyonlara karşı konak bağışıklığına ve idamesine kayda değer katkısını düşündürmektedir. hücresel sabit durum.

Sonuç olarak, sonraki eliminasyon için mikroorganizmaları tanımak üzere konakçı tarafından verimli bir şekilde uygulanabilecek, sitozolde yaşayan patojenleri algılamaya yönelik evrensel bir dili deşifre ettik. Toplu olarak, bu bulgular antibakteriyel bağışıklığı yoğunlaştırmak için kullanılabilecek ilkel hücresel bağışıklık süreçlerini anlamaya ışık tutuyor.

MALZEMELER VE YÖNTEMLER

Hücre kültürü

Hem insan akciğer alveoler karsinomu (tip II pnömosit) hücre dizisi A549 [Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC) no. CCL185)] ve servikal adenokarsinom hücre hattı HeLa (ATCC no. CRM-CCL-2), 37 derece ve 5°C'de yüzde 10 fetal sığır serumu (Gibco) ile takviye edilmiş Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamında (DMEM; HiMedia) kültürlendi. yüzde CO2.

Bakteri suşları ve büyüme koşulları

SPN (R6, serotip 2, Tim J. Mitchell'den hediye, Birmingham Üniversitesi, Birleşik Krallık), yüzde 5 CO2 içinde 37 derecede yüzde 1.5 maya ekstraktı ile takviye edilmiş Todd-Hewitt sıvısında büyütüldü. Gerektiğinde SPN kültürlerini büyütmek için şu antibiyotikler kullanıldı: kanamisin (200 ug/ml), spektinomisin (100 ug/ml) ve kloramfenikol (4.5 ug/ml). Dokuz yüz mikrolitre 0.4 OD600 (600 nm'de optik yoğunluk) büyütülmüş SPN kültürü, 600 ul yüzde 80 steril gliserol (yüzde 32 nihai gliserol konsantrasyonu) ile karıştırıldı ve -80 derece derin dondurucuda saklandı. Bu gliserol stokları, tüm deneyler için başlangıç ​​inokulumu olarak kullanıldı.

Escherichia coli DH5 ve STm (ATCC 14{10}}28) kültürleri, Luria-Bertani besiyerinde (LB) 37 derecede çalkalama koşullarında (200 rpm) büyütüldü ve gerektiğinde aşağıdaki antibiyotikler kullanıldı: kanamisin (50 ug/ml), spektinomisin (100 ug/ml), kloramfenikol (20 ug/ml) ve ampisilin (100 ug/ml). Tüm enfeksiyon deneyleri için, bakteriler OD600~0.4'e kadar büyütüldü, ardından konakçı hücreleri enfekte etmeden önce benzer bir yoğunluğa fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse edildi.

Varsayılan ubikuitin hedef proteinlerinin taranması

STm ve SPN proteomunda bulunan tüm yüzey proteinleri ilk olarak yayınlanmış literatürden tanımlandı. Yüzey proteinlerinin tam protein dizileri, daha sonra degron motiflerinin varlığını belirlemek için kullanılan UniProt'tan elde edildi. Yayınlanmış literatürden (24, 52, 53) ve Eukaryotic Linear Motif veritabanından derlenen 29 varsayılan degron motifi seti. Python'un normal ifade modülü, yüzey protein dizilerindeki tüm bu tür küratörlü motiflerin yerini belirlemek için kullanıldı. Belirlenen her degron motifine yakın bir lizin kalıntısının (8 ila 14 amino asit kalıntısı) varlığını belirlemek için ayrıca doğrusal bir araştırma yapıldı. Bu lizin tortusunun, ubikuitin kısmı için bağlanma yeri olarak hareket ettiği varsayılmaktadır. Son olarak, kısa listeye alınan protein dizileri, degron motifi ile proksimal lizin arasında düzensiz bir bölgenin varlığını tespit etmek için bir protein yapısı tahmin aracı olan IUPred'e (54) beslendi. Ortaya çıkan proteinler (SPN için BgaA ve PspA ve STm için RlpA), her yerde bulunma hedefleri olarak değerlendirilmek ve patojen klirensindeki rollerinin kodunu çözmek için seçildi.

Bakteri suşu yapısı

Homolog rekombinasyon yoluyla alelik değişim, hem SPN hem de STm'de mutant suşların üretilmesi için yerleştirilmiş bir antibiyotik kaseti taşıyan gen yan bölgeleri kullanılarak gerçekleştirildi (tablo S2).

SPN için, bgaA, pspA ve genlerinin 500-bp yukarı ve aşağı bölgeleri genomdan uygun primerlerle (tablo S3) büyütüldü ve pBKS vektöründe toplandı. Bu fragmanların klonlanmasının ardından, bu yapıya bir antibiyotik direnç kaseti (torba için spektinomisin yanı sıra pspA ve hysA için kloramfenikol) yerleştirildi. Doğrusallaştırılmış rekombinant plazmitler daha sonra yeterlilik uyarıcı peptit 1 (GenPro Biotech) kullanılarak WT SPN'ye dönüştürüldü, rekombinantlar ilgili antibiyotikler kullanılarak seçildi ve gen değişimi, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve ilgili gen lokuslarının sekanslanması ile doğrulandı. STm için, gen silme mutantlarının üretilmesi için λ-red rekombinaz yöntemi kullanılmıştır (55).

Kısaca, ip geninin uçlarına homolog diziler, kanamisin direnç kasetinin amplifikasyonu için kullanılan primer dizilerine eklenmiştir. Kaset daha sonra WT STm suşuna elektroporasyona tabi tutuldu ve homolog rekombinasyon tarafından üretilen nakavtlar, kanamisin direncine göre seçildi. Gen silinmesi, PCR ve gen lokusunun sekanslanması kullanılarak doğrulandı. Tam uzunluktaki pspA, hysA ve kesik bir bgaA-T (1 ila 3168 bp), mekik vektörü pIB166'da (56) P23 promotörü altında klonlandı ve tamamlama için kullanıldı.

Bu rekombinant plazmitler ayrıca bgaA-T (bgaA-TK96R, bgaA-TK97R, bgaA-TK96R, K97R ve bgaATΔDegron), pspA (pspAK314R, pspAK315R, pspAK314R, K315R ve pspAΔDegron)'nun farklı varyantlarını üretmek için bölgeye yönelik mutajenez için kullanıldı. ) ve onun (hysADegron-BgaA ve hysADegron-PspA) uygun primer setleri (tablo S3) kullanılarak ve ΔbgaA ve ΔpspA mutantlarına dönüştürüldü. Tüm klonlar, DNA dizilimi ile doğrulandı. BgaA, PspA ve HysA'nın farklı varyantlarının ekspresyonu, uygun antikorlar kullanılarak Western blot ile doğrulandı.

Antikorlar ve reaktifler

Anti-Enolaz ve anti-PspA serumu (S. Hammerschmidt, Greifswald Üniversitesi, Almanya); anti-BgaA serumu (S. King, The Ohio State University, ABD); ve His6'ya özgü antikorlar (Invitrogen, MA1-21315), K48-Ub bağı (Millipore, 05-1307), K63-Ub bağı (Millipore, 14-6077-80) ), Ply (Santa Cruz Biyoteknoloji, sc-80500), FBXW7 (Betil Laboratuvarları, A301-721A), SKP1 (Invitrogen, MA5-15928), Cullin1 (Invitrogen, {{15} }), gliseraldehit fosfat dehidrojenaz (Millipore, MAB374), GSK3 [Cell Signaling Technology (CST), D5C5Z], fosfotreonin (CST, 9381S), IgA, murin miyelomdan Kappa, klon TEPC-15 (Sigma-Aldrich, M1421) ve PSMB7 (Invitrogen, PA5-111404) tedarik edildi. Aşağıdaki ikincil antikorlar kullanıldı: yaban turpu peroksidaz (HRP) etiketli anti-tavşan (BioLegend, 406401), HRP etiketli anti-fare (BioLegend 405306), anti-tavşan Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A27206), anti-tavşan Alexa Fluor 555 (Invitrogen, A31572), biotin-konjuge anti-fare immünoglobülin A (Life Technologies, M31115), anti-fare Alexa Fluor (Invitrogen, A31570), anti-fare Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A21202), anti-keçi Alexa Flor 633 (Invitrogen, A21082) ve FM{48}} (Thermo Fisher Scientific, T13320).

Protein ekspresyonu ve saflaştırma

BgaA-T ve varyantları, Xba I/Not I kısıtlama siteleri kullanılarak pET28'de klonlandı. N-terminal His-etiketi ile BgaA-T'yi kodlayan rekombinant plazmidler, protein ekspresyonu için E. coli BL21 (DE3) hücrelerine dönüştürüldü. Yeni dönüştürülmüş koloniler, kanamisin (50 ug/ml) içeren LB içinde 37 derecede 12 saat çalkalayıcı inkübatör üzerinde büyütüldü. Birincil kültürün yüzde biri 1 litre LB suyuna ilave edildi ve OD600nm 0,6 ile 0,8 arasına ulaşana kadar bir çalkalayıcı inkübatöründe 37 derecede kuluçkalandı. Protein ekspresyonu, 100 uM izopropil- -D-tiogalaktopiranosid (IPTG) ilave edilerek ve kültür 150 rpm'de çalkalanarak 37 derecede 5 ila 6 saat daha büyütülerek indüklendi.

Hücreler, 6000 rpm'de 10 dakika 4 derecede santrifüjleme yoluyla toplandı. Hücre peleti, tampon A [25 mM tris (pH 8.0) ve 300 mM NaCI] içinde yeniden süspanse edildi ve sonikasyon ile parçalandı. Hücre birikintisi, santrifüjleme (14,000 rpm, 50 dakika, 4 derece) ile ayrıldı ve süpernatan, tampon A ile dengelenmiş bir Ni-NTA kolonuna uygulandı. Kolon, 10 kolon hacminde tamponla yıkandı A ve His-işaretli proteinler, tampon A içinde imidazol (250 mM) ile yıkandı. BgaA-T'nin tüm varyantları, aynı prosedür kullanılarak ifade edildi ve saflaştırıldı. FBXW7, Eco RI kısıtlama enzimi kullanılarak pCMV6-Entry-FBXW7 vektöründen bir N-terminal glutatiyon S-transferaz (GST) etiketine sahip pGEX-4 T-1 vektöründe alt klonlandı.

GST etiketli FBXW7, E. coli BL21 (DE3) hücrelerinde 0.1 mM IPTG ile protein ifadesinin indüklenmesinin ve 30 derecede 4 saat büyümenin ardından ifade edildi. E. coli ham ekstraktından GST-FBXW7, Glutatyon-Sefaroz (GE HealthCare) kolon kromatografisi kullanılarak saflaştırıldı. Saflaştırılmış proteinler içeren fraksiyonlar havuzlandı ve 4 derecede 4700 rpm'de santrifüjleme yoluyla bir 10-kDa moleküler ağırlık kesme filtresi (Amicon) kullanılarak 0,5 mg/ml'ye kadar konsantre edildi. Proteinlerin saflığı, SDS-poliakrilamid jel elektroforezinde (SDS-PAGE) kontrol edildi, ardından Coomassie mavisi ile boyandı.

Konak hücre transfeksiyonları

BgaA-T, bir infüzyon klonlama kiti (Takara) kullanılarak doksisiklin ile indüklenebilir vektör pAK_Tol2_TRE_Blast'ta (Addgene no. 130261) klonlandı. Pozitif bir klon, Sanger sekanslaması ile doğrulandı. FBXW7R505C mutasyonu, şablon olarak pMRX-GFP-FBXW7 kullanılarak bölgeye yönelik mutajenez ile gerçekleştirildi ve Sanger dizilimi ile doğrulandı. Tüm transfeksiyonlar, Lipofectamine 3000 reaktifi (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak yapıldı ve seçimler, blasticidin hidroklorür (2 ug/ml; HiMedia) varlığında yapıldı.

siRNA'ya yönelik gen yıkımı

Spesifik genlerin RNA etkileşimi aracılı yıkımı için aşağıdaki siRNA'lar kullanıldı: siFBW7 (Dharmacon ON-TARGET SMARTpool L-004246-00-0005), siCullin1 (Qiagen, 1027423), siSKP1 (Qiagen, SI00301819) ve siGSK3 (Dharmacon ONTARGET) SMARTpool L-003010-00-0005). Kısaca, kuyucuklu bir plakada büyütülen A549 hücreleri, üreticinin talimatlarına göre Lipofectamine 3000 kullanılarak gene spesifik siRNA'lar veya karıştırıcı (siControl) (150 pmol) ile geçici olarak transfekte edildi. Transfeksiyondan otuz altı saat sonra, hücreler Western lekeleme ve immünofloresan veya penisilin-gentamisin koruma deneyleri için işlendi.

Yapı tahmini ve modelleme

Tüm yapılar AlphaFold (Protein Homology/analogy Recognition Engine V 2.0) (57) tarafından tahmin edildi ve PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, sürüm 2.0 Schrödinger, LLC) kullanılarak görselleştirildi. Yapılar, düzenli (mavi) ile düzensiz (kırmızı) ve beyaz arasında değişen IUPred (54) puanlarına dayalı olarak PyMol'de renk kodluydu.

Batı lekesi

{{0}}.4 OD600nm'ye büyütülen SPN kültürleri, sonikasyonla parçalandı ve santrifüjlemenin (15,000 rpm, 30 dakika, 4 derece) ardından ham özütler toplandı. A549'lar için tek tabakalar birkaç kez PBS ile yıkandı ve buz gibi soğuk radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) tamponunda [50 mM tris-Cl (pH 7.89), 150 mM NaCl, yüzde 1 Triton X-100, yüzde 0.5 sodyum) deoksikolat ve proteaz inhibitör kokteyli (Promega), sodyum florür (10 mM) ve EDTA (5 mM) içeren yüzde 1 SDS]. Hücre süspansiyonu, hücre lizatlarını toplamak için kısaca sonike edildi ve santrifüjlendi. Bakteriyel veya A549 hücre lizatlarında (10 veya 20 ug) bulunan proteinler, yüzde 12 SDS-PAGE jelleri üzerinde ayrıldı ve aktifleştirilmiş bir poliviniliden diflorür membrana aktarıldı. Yüzde 5 yağsız sütte bloke edildikten sonra, membranlar uygun birincil ve HRP etiketli ikincil antikorlarla incelendi. Lekeler son olarak geliştirilmiş bir kemilüminesans substratı (Bio-Rad) kullanılarak geliştirildi.
Penisilin-gentamisin koruma testi

Yüzde 0,2 maya ekstraktı (THY) eklenmiş Todd-Hewitt suyu içinde OD600nm 0,4'e kadar büyütülen SPN suşları topak haline getirildi, PBS içinde yeniden süspanse edildi ( pH 7.4) ve çoklu enfeksiyon (MOI) 10 ile A549 tek tabakalarının enfeksiyonu için tahlil ortamında seyreltildi. 1 saatlik enfeksiyonun ardından, tek tabakalar DMEM ile yıkandı ve penisilin (10 ug/ml) içeren bir tahlil ortamı ile inkübe edildi ) ve gentamisin (400 ug/ml) hücre dışı SPN'yi öldürmek için 2 saat. Hücreler daha sonra yüzde 0,025 Triton X-100 ile parçalandı ve lizat, canlı SPN'yi saymak için Brain Heart Infusion agar plakalarına kaplandı. İnvazyon yüzdesi [enfeksiyon için kullanılan lizat/CFU'daki koloni oluşturan birimler (CFU)] × 100 olarak hesaplandı. Hücre içi sağkalımı değerlendirmek için, enfeksiyondan 9 saat sonra (penisilin-gentamisin tedavisinin başlangıcından itibaren), hücre lizatları şu şekilde hazırlandı: yukarıda bahsedilen ve yayılan plaka ve hayatta kalan bakteriler numaralandırıldı. Hayatta kalma verimliliği (yüzde), belirtilen zaman noktasında (0 saate normalize edilmiş) kontrole göre hayatta kalma yüzdesindeki bir kat değişim olarak temsil edildi.

immünofloresan

İmmünofloresan deneyi için A549 veya HeLa hücreleri, cam lamellerde büyütüldü ve MOI ~25'te 1 saat süreyle SPN veya STm suşları ile enfekte edildi, ardından 2 saat süreyle antibiyotik tedavisi uygulandı. Enfeksiyondan sonra istenen zaman noktalarında (A549'larda SPN enfeksiyonu için 9 saat ve HeLa'da STm enfeksiyonu için 3 saat), hücreler DMEM ile yıkandı ve 10 dakika boyunca -20 derecede buzla soğutulmuş metanol ile sabitlendi. Ayrıca, lameller, oda sıcaklığında (RT) 2 saat boyunca PBS içinde yüzde 3 sığır serum albümini (BSA) ile bloke edildi. Hücreler daha sonra 4 derecede PBS içinde yüzde 1 BSA içinde uygun bir birincil antikorla işlendi, PBS ile yıkandı ve oda sıcaklığında 1 saat PBS içinde yüzde 1 BSA içinde uygun bir ikincil antikorla inkübe edildi. Son olarak lameller, PBS ile yıkandı ve bir lazer taramalı konfokal mikroskop (LSM 780, Carl Zeiss) kullanılarak görselleştirme için 4',6-diamidino-2-fenilindol (Vector Laboratories) ile veya bunlar olmadan VECTASIELD ile birlikte cam slaytlara monte edildi ) 40× veya 63× yağ hedeflerinin altında. Görüntüler, optik kesitlemeden sonra elde edildi ve ardından ZEN lite yazılımı (sürüm 5.0) kullanılarak işlendi. Süper çözünürlüklü mikroskopi, SIM modunda Elyra 7 (Carl Zeiss) kullanılarak benzer şekilde gerçekleştirildi. Kolokalizasyon analizi için bakteriler, kopya başına n > 100 bakterinin görsel olarak sayılmasıyla skorlanmıştır.

transmisyon elektron mikroskobu

SPN ve STm ile enfeksiyonun ardından hücreler, {{0},1 M sodyum kakodilat tamponu ile yıkandı, 0,1 M sodyum kakodilat tamponu () içinde yüzde 2,5 glutaraldehit (Sigma-Aldrich) ile sabitlendi ( Sigma-Aldrich) 4 derecede 3 saat. Fiksasyondan sonra, hücreler bir hücre kazıyıcı aracılığıyla toplandı ve 10 dakika boyunca 2000 rpm'de topaklandı. Hücreler daha sonra 0.1 M sodyum kakodilat tamponu ile yıkandı ve 20 dakika 4 derecede 0.1 M sodyum kakodilat tamponu içinde yüzde 1 osmiyum tetroksit ile sonradan sabitlendi. Kakodilat tamponu ve damıtılmış su ile müteakip yıkamaların ardından hücreler, artan etanol (yüzde 50, 70, 95 ve 100) ve propilen oksit konsantrasyonlarında 30 dakika boyunca dehidre edildi ve son olarak epoksi reçinesine (Electron Microscopy Sciences, 14300) gömüldü. 75 derecede 45 dakika polimerizasyon. Daha sonra kapsüller 45 dakika 95 derecelik bir fırına aktarıldı. Ultra ince kesitler (70 nm), bir Leica EM UC7 Ultramicrotome üzerinde bir elmas bıçak kullanılarak kesildi ve yüzde 2 uranil asetat ve yüzde 1 kurşun sitrat ile boyandı ve 120 KV'de bir transmisyon elektron mikroskobu (Talos L120 C, Thermo Fisher Scientific) kullanılarak görüntülendi.

Ex vivo her yerde bulunma

A549-eksprese eden BgaA-T ve varyantları, MG132 (5 uM) ile işleme tabi tutuldu ve protein ifadeleri, 24 saat boyunca doksisiklin (100 ug/ml) ile indüklendi. Hücreler daha sonra RIPA tamponunda parçalandı ve örnekler SDS-PAGE (yüzde 8 ) ile elektroforeze tabi tutuldu. BgaA-T ve varyantlarının protein ekspresyonunun ve her yerde bulunmasının doğrulanması, sırasıyla anti-BgaA ve anti-K48-Ub antikorları ile yapılan araştırmayı takiben Western blot ile kanıtlanmıştır.

In vitro her yerde bulunma

İn vitro ubikitinasyon deneyleri için, rekombinant proteinler daha önce tarif edildiği gibi saflaştırıldı (58). SCFFBW7 E3 ligaz kompleksi, rekombinant 0.1 mM E1 (UBE1; Boston Biochem), 0.25 mM E2 (cdc34; Boston Biochem) ve ubikuitin (2.5 ug/ml; Boston) ile inkübe edildi Biochem) saflaştırılmış BgaA-T ve varyantlarının varlığında. Ubiquitylation reaksiyonları, 2 saat boyunca 25 derecede tahlil tamponunda [50 mM tris (pH 8), 5 mM MgCl2, 5 mM adenosin trifosfat (ATP), 1 mM -merkaptoetanol ve yüzde 0.1 Tween 20] içinde gerçekleştirildi. . Reaksiyonlar, 5x Laemmli tamponu ile durduruldu, SDS-PAGE jelleri üzerinde çözüldü ve bir anti-BgaA antikoru kullanılarak immünoblotlama yoluyla analiz edildi.

In vitro kinaz deneyi

İn vitro kinaz tahlilini gerçekleştirmek için GSK3 kinaz enzim sistemi (Promega), üreticinin protokolüne göre aşağıdaki modifikasyonlarla kullanıldı. Kısaca, 40 mM tris, (pH 7.5), 20 mM MgCl2'den oluşan reaksiyon tamponunda 400 uM ATP ile 0.5 ug aktif GSK3'e 3 ug rekombinant BgaA-T eklendi , BSA (0,1 mg/ml) ve 50 uM ditiyotreitol. Reaksiyon 30 derecede 2 saat inkübe edildi ve 1x Laemmli tamponu eklenerek durduruldu. Numuneler daha sonra kaynatıldı ve daha önce bahsedildiği gibi Western lekeleme için elektroforezlendi. Fosforile BgaA-T, bir anti-fosfotreonin antikoru ile tespit edildi.

in vivo model

All animal experiments were performed at the University of Liverpool in strict accordance with U.K. Home Office guidelines, under project license PP2072053, following approval from local animal welfare and ethics committees. For infection studies, 7- to 8-week female CD1 mice were purchased from Charles River Laboratories, United Kingdom, and allowed to acclimatize for 7 days before use. Briefly, mice were placed into a restraint tube, and S. pneumoniae was administered by intravenous injection into the tail vein (1 × 106 CFU in 100 μl of PBS). Mice were periodically scored for clinical signs of disease and culled when they showed signs of advanced pneumococcal disease or else at predetermined times after infection. Severity endpoints were defined as one or more of the following: substantially elevated or reduced respiratory rate, substantial reduction in natural behavior or moderate reduction in provoked behavior, loss of >Yüzde 20 başlangıç ​​vücut ağırlığı ve belirgin burun veya göz akıntısı. Terminal anestezi altında kardiyak ponksiyonla kan örnekleri alındı ​​ve bakteriyel sayım için ölümden sonra dalaklar çıkarıldı. Doku numuneleri, elle tutulan bir doku homojenleştirici ile işlendi ve homojenatlar, kanlı agar plakalarına lekelenmeden önce PBS içinde seri olarak seyreltildi. Plakalar gece boyunca 37 derece, yüzde 5 CO2'de inkübe edildi ve ertesi gün bakteri koloni sayıları değerlendirildi.

istatistiksel analiz

İstatistiksel analiz için GraphPad Prism sürüm 5 kullanıldı. Bireysel deneyler için gerçekleştirilen istatistiksel testler, ilgili şekil açıklamalarında belirtilmiştir. P < 0.05, istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Veriler normallik ve test edilen her grubun varyansını tanımlamak için test edildi. Tüm çok parametreli analizler, çoklu karşılaştırmalar için düzeltmeler içeriyordu ve veriler, aksi belirtilmedikçe ortalama ± SD olarak sunuldu.

REFERANSLAR VE NOTLAR

ME Bianchi, DAMP'ler, PAMP'ler ve alarminler: Tehlike hakkında bilmemiz gereken her şey. J. Leukoc. Biol. 81, 1–5 (2007).

2. TH Mogensen, Doğuştan gelen bağışıklık savunmalarında Patojen tanıma ve inflamatuar sinyalleşme. klinik Mikrobiyoloji. Rev. 22, 240–273 (2009).

3. K. Ray, B. Marteyn, PJ Sansonetti, CM Tang, İçerideki Yaşam: Sitozolik bakterilerin hücre içi yaşam tarzı. Nat. Rev. Mikrobiyoloji. 7, 333–340 (2009).

4. X. Jiang, ZJ Chen, Ubiquitylation'ın bağışıklık savunması ve patojen kaçırmadaki rolü. Nat. Bağışıklık. 12, 35–48 (2011).

5. V. Vozandychova, P. Stojkova, K. Hercik, P. Rehulka, J. Stulik, The ubiquitination system in bakteriyel konak-patojen etkileşimleri. Mikroorganizmalar 9, 638 (2021).

6. E. Fiskin, T. Bionda, I. Dikic, C. Behrends, Salmonella typhimurium enfeksiyonuna yanıt olarak konakçı ve bakteriyel ubiquitinome'un global analizi. Mol. Hücre 62, 967–981 (2016).

7. Q. Chai, X. Wang, L. Qiang, Y. Zhang, P. Ge, Z. Lu, Y. Zhong, B. Li, J. Wang, L. Zhang, D. Zhou, W. Li, W. Dong, Y. Pang, GF Gao, CH Liu, Bir mikobakteri tüberkülozu yüzey proteini, konakçı ksenofajiyi tetiklemek için ubikuitini işe alır. Nat. komün. 10, 1973 (2019).

8. EG Otten, E. Werner, A. Crespillo-Casado, KB Boyle, V. Dharamdasani, C. Pathe, B. Santhanam, F. Randow, Bakteriyel enfeksiyon sırasında RNF213 tarafından lipopolisakaritin Ubiquitylation'ı. Doğa 594, 111–116 (2021).

9. A. Yamada, M. Hikichi, T. Nozawa, I. Nakagawa, FBXO2/SCF ubikuitin ligaz kompleksi, bakteriyel yüzey glikanını tanıyarak ksenofajiyi yönlendirir. EMBO Rep. 22, e52584 (2021).

10. P. Engstrom, TP Burke, CJ Tran, AT Iavarone, MD Welch, Lizin metilasyonu, hücre içi bir patojeni her yerde bulunma ve otofajiden korur. bilim Av. 7, eabg2517 (2021).

11. J. Celli, LRSAM1, bakteri duyusuna sahip bir E3 ubikuitin ligaz. Cell Host Microbe 12, 735–736 (2012).

12. LH Franco, VR Nair, CR Scharn, RJ Xavier, JR Torrealba, MU Shiloh, B. Levine, ubiquitin ligaz Smurf1, mikobakteri tüberkülozu ve anti-tüberküloz konak savunmasının seçici otofajisinde işlev görür. Hücre Konağı Mikrop 21, 59–72 (2017).

13. J. Noad, A. von der Malsburg, C. Pathe, MA Michel, D. Komander, F. Randow, LUBAC sentezlenmiş lineer ubikuitin zincirleri, otofajiyi ve NF-κB'yi aktive ederek sitozolü istila eden bakterileri kısıtlar. Nat. Mikrobiyoloji. 2, 17063 (2017).

14. PS Manzanillo, JS Ayres, RO Watson, AC Collins, G. Souza, CS Rae, DS Schneider, K. Nakamura, MU Shiloh, JS Cox, Ubikuitin ligaz parkin, hücre içi patojenlere karşı dirence aracılık eder. Doğa 501, 512–516 (2013).

15. M. Polajnar, MS Dietz, M. Heilemann, C. Behrends, Sitozolik Salmonella'yı hedef alan konak hücre ubiquitylation mekanizmasını genişletmek. EMBO Rep. 18, 1572–1585 (2017).

For more information:1950477648nn@gmail.com