Bir MRNA Aşısı, STING'e Bağlı Antitümör Bağışıklık Yanıtlarını Ortaya Çıkarır

Soyut

Lipitle formüle edilmiş RNA aşıları, hastalıkların önlenmesi ve tedavisi için yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak bunların etki mekanizmaları ve bu tür eylemlere katkıda bulunan bireysel bileşenlerin henüz tanımlanması gerekmektedir. Burada, bir protamin/mRNA çekirdeği ve bir lipid kabuktan oluşan terapötik bir kanser aşısının, sitotoksik CD8+ T hücre yanıtlarını teşvik etmede ve anti-tümör bağışıklığına aracılık etmede oldukça etkili olduğunu gösteriyoruz. Mekanik olarak, dendritik hücrelerde tip I interferonların ve inflamatuar sitokinlerin ekspresyonunu tam olarak uyarmak için hem mRNA çekirdeğine hem de lipit kabuğuna ihtiyaç vardır. İnterferon-b ekspresyonunun uyarılması yalnızca STING'e bağlıdır ve mRNA aşısının antitümör aktivitesi, kusurlu Sting genine sahip farelerde önemli ölçüde tehlikeye girer. Böylece mRNA aşısı, STING'e bağımlı antitümör bağışıklığını ortaya çıkarır.

erkekler için cistanche faydaları-bağışıklık sistemini güçlendirir

1. Giriş

SARS-CoV-2 enfeksiyonunun önlenmesi için mRNA aşılarının hızlı gelişimi ve dünya çapında uygulanması, sağlık hizmetlerinde mRNA bazlı ilaçların gücünü göstermiştir1,2. Büyük moleküler ağırlıkları ve negatif yükleri nedeniyle mRNA moleküllerinin, memeli hücrelerine etkili bir şekilde girebilmesi için dağıtım araçlarına paketlenmesi gerekir. Nanometre boyutunda dağıtım araçlarına paketleme aynı zamanda mRNA moleküllerini enzimatik bozulmadan koruma avantajına da sahiptir. Lipid nanopartikül4, lipo polipleks (LPP)5, lipozom-protamin-RNA (LPR)6, RNA lipopleks (RNA-LPX)7 ve virüs benzeri aşı partikülü (VLVP) gibi amaca uygun çoklu dağıtım platformları geliştirilmiştir. )8. Her platformun kendine özgü yapısı ve bileşimi olmasına rağmen çoğu araç, mRNA paketlemesini ve mRNA moleküllerinin endozomlardan kaçmasını kolaylaştıran iyonik bir lipit molekülü içerir. Profilaktik aşıların başarısıyla birlikte, mRNA terapötiklerinin hastalık türlerinin hepsini olmasa da çoğunu tedavi etmek için kullanılabileceğine dair genel bir farkındalık vardır9e12. Aslında mRNA bazlı terapötik kanser aşıları üzerinde uzun yıllardır çalışılmaktadır13,14. Klinik araştırmalardaki son gelişmeler, seçilmiş kanser hastalarında da uygulanma potansiyellerini ortaya koymuştur15e17. Adjuvan moleküller18e20 ile hazırlanan peptit kanseri aşılarının aksine, mRNA aşı parçacıkları aynı zamanda kendi kendine adjuvan21 olarak da görev yapabilir.

Örneğin, serbest ve protamin kompleksli mRNA içeren iki bileşenli mRNA bazlı bir kanser aşısı, geçiş ücreti benzeri reseptör 7 (TLR7) sinyallemesini de aktive edebilir22. Bununla birlikte, çıplak mRNA'nın akut doğuştan gelen bağışıklık toksisitesine ilişkin artan endişe nedeniyle çoğu araştırmacı ve şirket, TLR'ler23 tarafından doğuştan tanınmayı önlemek için değiştirilmiş RNA kullanıyor. Sonuç olarak, lipit bileşenleri, tercihen TLR olmayan sinyallemeyi aktive ederek mRNA aşı partikülündeki adjuvan aktivitesinin arttırılmasında önemli bir rol oynamaktadır. 1,2- di-oktadesenil-3-trimetilamonyum (DOTMA, katyonik bir lipit)/ dioleoilfosfatidiletanolamin (DOPE, bir yardımcı lipit) lipozomdan oluşan, lipit formüllü, negatif yüklü RNA-LPX üzerine yakın zamanda yapılan bir çalışma, ortaya çıktı proinflamatuar sitokinlerin salgılanmasının düzenlenmesinde interlökin 1 (IL1)-interlökin 1 reseptör antagonisti (IL-1ra) ekseninin aktivasyonu ve monositlerdeki iki aşamalı inflamatuar yolun aktive edilmesinin temel rolü24. İlginç bir şekilde, ALC-0315 (iyonize bir lipit), 1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DSPC, bir yardımcı lipit) ile hazırlanan LNP bazlı BNT162b2 üzerinde yeni bir araştırma daha yapıldı. , polietilen glikol-2000-N, N-di tetradesil asetamid (PEG2000-DTA) ve kolesterol, her ikisini de uyarmada TLR'leri veya inflamatuarı değil, tip I interferona bağımlı MDA5 sinyallemesini etkinleştirmenin anahtar rolünü gösterdi. COVID{35}} aşısının doğuştan gelen ve uyarlanabilir bağışıklığı25. Bu çalışmalar, değişken lipit moleküllerinden oluşan dağıtım platformlarının, aşı aktivitesi için farklı sinyal iletim yollarına dayanabileceği ihtimaline işaret etmektedir. Bu nedenle, mRNA terapötiklerini daha da geliştirmek için anahtar moleküllerin ve bunların kombinasyonlarının fonksiyonunun tam olarak araştırılması önemlidir.

Bu çalışmada, terapötik bir kanser aşısındaki bireysel bileşenlerin işlevsel rolünü incelemek için deneyler kurduk. mRNA aşı partikülü (MVP), katyonik bir lipit, bir yardımcı lipit, pegile edilmiş bir lipit ve kolesterolden oluşan bir lipit kabuk içinde kapsüllenmiş bir protamin/mRNA çekirdeğinden oluşur (Şekil 1A). Yüklü lipidin dahil edilmesinin hedeflenen RNA dağıtımını kolaylaştırabileceği gösterilmiştir26 ve dioleoiletil fosfatidilkolin (EDOPC) ve dioleoil-3- trimetilamonyum propan (DOTAP), bu amaç için test edilen katyonik lipidlerden ikisidir5,27. İnterferon-b (IFN-b), IL-1b ve tümör nekroz faktörü-a (TNF-a) ekspresyonunun mRNA çekirdeği, mRNA içermeyen araç ve tüm MVP tarafından uyarılmasını inceledik ve bu aktiviteleri TLR7, mitokondriyal antiviral sinyalleme (MAVS, aynı zamanda IPS{12}} olarak da bilinir), IFN genlerinin uyarıcısı (STING) ve TIR alanı içeren adaptör indükleyen IFN-b (TRIF) sinyallemesi ile ilişkilendirdi. Daha sonra, IFN-b ve TNF-a ifadesinin uyarılmasında çekirdekteki protaminin ve kabuktaki katyonik lipidin rolünü araştırdık. Son olarak, vahşi tip ve gen nakavt farelerde MVP'den gelen antitümör bağışıklık tepkilerini karşılaştırdık.

Cistanche tubulosa'nın faydaları-Antitümör

2. Malzemeler ve yöntemler

2.1. Malzemeler

1,2-Dioleoil-sn-glisero-3-etilfosfokolin (EDOPC) (890704), 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfatidil-etanolamin (DOPE) (850725) ), 1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-[amino(polietilen glikol)-2000 (DSPE-PEG2k) (880128), 1,2- dioleoil-3-trimetilamonyum-propan (DOTAP) (890890), 1,2- dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC) (850375), Avanti Polar Lipids, Inc.'den satın alınmıştır ( Birmingham, AL, ABD). Kolesterol (C8667) Sigma-Aldrich'ten (Saint Louis, MO, ABD) elde edildi. Reaktifler, sırasıyla DSPE-PEG2k için 2 mg/mL, kolesterol ve DOPC için 10 mg/mL ve EDOPC, DOPE ve DOTAP için 20 mg/mL konsantrasyonda etanol içerisinde çözüldü. Protamin sülfat (P4020), Sigma Aldrich'ten elde edildi. Ovalbumin (OVA-mRNA) (L-7210), eGFP (eGFP mRNA) (L-7201) ve lusiferazı (Luc-mRNA) (L-7204) kodlayan mRNA molekülleri, şu adresten satın alınmıştır: TriLink Biyoteknolojileri (San Diego, CA, ABD). RNaz içermeyen su (W0805-010), GeneDEPOT'tan (Baker, TX, ABD) elde edildi. TLR7 agonisti imiquimod (tlrimq) ve Sting agonisti 20 30 - cGAMP (tlrl-nacga23), Invivogen'den (San Diego, CA, ABD) ürünlerdi. Lipofectamine 2000 (11668019) ve Quant-iT™ RiboGreen™ RNA tahlil kiti (R11490), Thermo Fisher Scientific'ten (Waltham, MA, ABD) satın alınmıştır. Rekombinant fare GM-CSF (554586), BD Biosciences'tan (San Diego, CA, ABD) satın alındı. 500 Protein taşıyıcı inhibitör kokteyli (00-4980-93), Invitrogen'in bir ürünüydü. Cytofix/Cytoperm kiti (AB_2869010) BD Biosciences'tan satın alınmıştır. EasySep™ Fare T Hücresi İzolasyon Kiti (19851), STEMCELL Technologies, Inc.'den (Vancouver, BC, CAN) elde edildi. Aşağıdaki antikorlar BioLegend'den (San Diego, CA, ABD) elde edilmiştir: anti-CD80-PE-Cy7 (104734), anti-CD86-FITC (105006), anti-CD11b-APC- Cy7 (101226), anti-CD8-BV510 (100752), anti-CD44-APC (103012), anti-CD69-APC (104514) ve anti-H{{89 }}Kb (SIINFEKL)-PE (141604), anti-CD64- PE-Cy7 (139314), anti-B220-APC (103212), anti-MHCII-BV711 (107643) ve anti-CD{105}}PE (121406). Anti-CD{108}}FITC (553723), anti-LY6C-AF700 (557979) ve anti-IFN-g-PE (554412), BD Biosciences'tan alınmıştır. OVA257e264-MHCI dekstramerPE (JD2163), ImmuDex'ten (Fairfax, VA, ABD) satın alınmıştır. IL-1b (EM2IL1B) ve TNF-a (BMS607-3) için ELISA kitleri Invitrogen'den satın alındı ​​ve CCL5 (DY478) ve IFN-b (DY8234) için ELISA kitleri R&D Systems'den satın alındı , Inc. (Minneapolis, MN, ABD). Anti-MAVS (4983), anti-STING (13647), anti-TBK1 (3504), antifosfo-TBK1 (5483), anti-b-aktin (4970) ve anti-GAPDH (5174) dahil olmak üzere Western blot analizine yönelik antikorlar Cell Signaling Technology, Inc.'den (Danvers, MA, ABD) satın alındı.

Şekil 1 mRNA parçacıklarının hazırlanması ve karakterizasyonu. (A) Aşı partikül hazırlığının şematik görünümü. (B) Agaroz jel elektroforezi, 1:1 ila 1:2 oranında mRNA/protamin ile hazırlanan numunelerde mRNA moleküllerinin numune yükleme kuyusunda tutulduğunu gösterir. (CeF) Kapsülleme yüzdesine, polidispersite indeksine, zeta potansiyeline ve boyuta dayalı olarak mRNA aşı parçacıklarının (MVP'ler) karakterizasyonu. (G) MVP2 parçacıklarının temsili TEM görüntüleri, ölçek çubuğu Z 50 nm. (H) DC2.4 hücreleri 16 saat boyunca eGFP-MVP'lerle tedavi edildikten sonra eGFP ekspresyonunun yüzdesi. (I) eGFP ifade eden DC2.4 hücrelerinin floresan görüntülemesi, ölçek çubuğu Z 400 mm. (J) 16 saat boyunca lusiferaz kodlayan mRNA ile kapsüllenmiş MVP'lerle tedavi edilen BMDC'lerde biyolüminesansın nicel analizi. (K) PBS, mRNA içermeyen araç, mRNA/protamin çekirdeği veya mRNA kapsüllü MVP2 ile tedavi edilen BMDC'lerin canlılığındaki değişiklikler. Tedavi konsantrasyonları mRNA'ya eşdeğerdi. Veriler ortalama SEM (nZ 3) olarak sunulmuştur. *P <0.05; **P < 0,01.

2.2. Hücre çizgileri ve hücre kültürü

DC2.4 fare dendritik hücre çizgisi ATCC'den (Manassas, VA, ABD) elde edildi ve %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin içeren RPMI-1640 içinde kültürlendi. Fare melanomu hücre dizisi B16-OVA, Dana-Farber Kanser Enstitüsü'nden (Boston, MA, ABD) Dr. Kenneth Rock'tan elde edildi. B16-OVA hücreleri, %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM'de kültürlendi. Fare kolonu adenokarsinomu hücre çizgisi MC38, ATCC'den satın alındı. Hücreler OVA ekspresyonuyla tasarlandı ve %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin içeren DMEM'de kültürlendi. Hücre kültürü %5 C02 ile 37°C'de tutuldu.

cistanche tubulosa-bağışıklık sistemini iyileştirir

2.3. mRNA aşısı partikül hazırlığı

Tüm mRNA aşı parçacıkları, Precision Nanosystems, Inc. (Vancouver, BC, CAN) firmasının NanoAssemblr Benchtop mikroakışkan aleti kullanılarak organik faz ve sulu fazın karıştırılmasıyla hazırlandı. Organik fazı hazırlamak için EDOPC (20 mg/mL), DOPE (20 mg/mL), kolesterol (10 mg/mL) ve bis-DSPE-PEG2k (2 mg/mL) etanol içerisinde çözüldü ve 34°C'de karıştırıldı. :30:35:1 M oranı ve 9 mL/dakika akış hızı. Sulu faz mRNA çekirdeğini hazırlamak için mRNA, mikroakışkan cihazda 9 mL/dakika akış hızında 1:1 (a/a) oranında protamin sülfatla karıştırıldı. 20°C'de 20 dakikalık inkübasyonun ardından sulu faz mRNA çekirdeği, mRNA aşı parçacıkları oluşturmak üzere organik fazla karıştırıldı. 20 dakika sonra, aşı partikülü süspansiyonu bir Amicon ultra santrifüj filtresine (MWCO 30 kDa) aktarıldı ve etanol konsantrasyonunu %25'ten %2,5'e seyreltmek için hacimsel moleküler kalitede su ilave edildi. Parçacık süspansiyonu daha sonra 2000 g'de (Multifuge X4, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) 4°C'de santrifüjleme yoluyla konsantre edildi. Ozmotik basıncı ayarlamak için konsantre ürüne eşit hacimde 2 PBS ilave edildi.

2.4. Jel geciktirme deneyi

MRNA/protamin çekirdeği ilk olarak jel geciktirme yoluyla analiz edildi. Kısaca, 0.5 mg mRNA içeren mRNA/protamin çekirdeği, 1 TBE çözeltisi içindeki %1 agaroz jelinin oyuğuna yüklendi ve 120 V'de 30 dakika süreyle elektroforez gerçekleştirildi (PowerPac™, BioRad Co., Ltd., Hercules, CA). RNA bantları Gelred (Biotium, Hayward, CA) ile boyandı ve bir GelDoc sistemi (Gel Doc XR+, BioRad Co., Ltd.) ile tespit edildi.

2.5. mRNA aşı parçacıklarının karakterizasyonu

Boyut dağılımı ve zeta potansiyeli, dinamik ışık saçılımı Zetasizer (Zetasizer Nano, Malvern Pananalytical, Inc., Westborough, MA, ABD) ile ölçüldü. Kapsülleme oranı bir Quant-iT™ RiboGreen™ RNA tahlil kiti kullanılarak belirlendi. Kısaca, 0,5 mg mRNA içeren bir aşı parçacığı örneği, bir { içinde %2 Triton-X100 içeren veya içermeyen bir TriseEDTA tamponu (10 mmol/L TriseHCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,5) ile seyreltildi. {10}}kuyu plakası. 37°C'de 10 dakikalık inkübasyonun ardından her bir kuyucuğa RiboGreen eklendi ve floresan yoğunluğu ölçüldü. Kapsülleme verimliliği Denklem 2'de gösterildiği gibi hesaplandı. (1): Aşı partiküllerinin transmisyon elektron mikroskobu (TEM) daha önce açıklanan prosedür9 takip edilerek gerçekleştirildi.

2.6. Hayvanlar

Tüm hayvan operasyonları Houston Methodist Hastanesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (protokol numarası AUP06200042) tarafından onaylandı. Fareler, Ulusal Sağlık Enstitüsü ve Amerikan Laboratuvar Hayvanları Bakım Birliği'nin düzenleyici standartlarını tamamen karşılayan bir ortamda barındırıldı. Yabani tip C57BL/6J fareleri ve Tlr7/, Sting/, Mavs/ ve Trif/ fareleri dahil olmak üzere genetiği değiştirilmiş fareler, Jackson Laboratuvarı'ndan satın alındı.

2.7. Fare kemik iliğinden türetilen dendritik hücrelerin (BMDC'ler) üretilmesi

Kemik iliği hücreleri, tam RPMI 1640 ile femur ve kaval kemiğinden temizlendi. Kırmızı kan hücreleri, bir ACK liziz tamponu ile parçalandı ve olgunlaşmamış kemik iliği hücreleri, 10 dakika boyunca 20 ng/mL rekombinant fare GM-CSF'si ile desteklenmiş RPMI 1640'ta kültürlendi. gün boyunca %5 CO2 ile 37°C'de. Hücre kültürü ortamı 3, 6 ve 8. Günlerde yenilendi ve yapışkan olmayan dendritik hücreler 10. Günde toplandı.

2.8. Sitokinlerin ve kemokinlerin ölçümü

BMDC'ler bir 24-kuyu plakasına, 5  105 hücre/oyuk yoğunluğunda ekilmiştir. 1 saatlik yerleşmeden sonra hücreler, 1 mg/mL imikimod, 20 mg/mL 20 30 -cGAMP, (1 mg/mL mRNA eşdeğeri) aşı parçacıkları veya kontrolleri ile işleme tabi tutuldu. Hücre kültürü ortamı 24 saat sonra toplandı ve TNF-a, CCL5, IFN-b ve IL-1b seviyeleri, üreticinin önerdiği prosedürler takip edilerek enzim bağlantılı immünosorbent tahlili (ELISA) kitleri kullanılarak ölçüldü.

cistanche bitkisi bağışıklık sistemini güçlendiriyor

2.9. DC transfeksiyonu, DC olgunlaşması ve stimülasyonuna ilişkin analizler

İn vitro DC transfeksiyon verimliliğini analiz etmek için DC2.4 hücreleri, bir 24-kuyu plakasına 2.5 105 hücre/oyuk olacak şekilde tohumlandı. Hücreler, 1 mg mRNA/mL'lik nihai konsantrasyonda eGFP veya lusiferaz kodlayan mRNA kapsüllü parçacıklarla işlendi. Hücreler 24 saat sonra toplandı, PBS çözeltisindeki %2 FBS ile yıkandı ve ardından bir BD LSR II akış sitometresi (LSR II, BD Biosciences, San Jose, CA) ile akış sitometrisi analizi için uygulanmadan önce aynı çözelti içinde yeniden süspanse edildi. . DC olgunlaşmasını ve antijen sunumunu in vitro ölçmek için, BMDC'ler bir 24-kuyu plakasına 2.5  105 hücre/kuyu oranında ekildi ve 24 saat boyunca 1 mg/mL OVA-MVP ile işlendi. BMDC'ler, DC olgunlaşması için CD11c, MHC I, MHC II, CD40, CD80 ve CD86'ye ve antijen sunumu için anti-H-2Kb'ye (SIINFEKL) özgü antikorlarla 30 dakika boyunca boyandı. İn vivo uyarıcı gücü belirlemek için C57BL/6J fareleri, ayak tabanındaki fare başına 10 mg OVA-MVP ile bir kez aşılandı ve drenajlı popliteal LN'ler toplandı24, 48 ve aşağıdaki hücre yüzeyi belirteçleri toplandı: CD11c, MHC I, CD11b, B220 , LY6C, CD64, CD8, CD103, CD86.

2.10. T hücresi aktivasyonu ve çoğalmasına ilişkin akış sitometri analizleri

T hücresi aktivasyonunu in vivo ölçmek için fareler bir kez 10 mg OVA-MVP ile aşılandı ve popliteal LN'ler 24 veya 48 saatte izole edildi. T hücreleri şu antikorlarla boyandı: CD45, CD3, CD4, CD8 ve CD69. Antijene özgü T hücrelerini saptamak için, ikinci aşılamadan 5 gün sonra tümörler, dalak ve popliteal lenf düğümleri toplandı. Dokular, tek hücreli süspansiyonlar oluşturmak üzere işlendi ve hücreler, üreticinin talimatları izlenerek T hücresine özgü antikorlar ve OVA257e264-MHCI dekstramer ile boyandı. Hücre içi IFN-g düzeyini ölçmek için, popliteal LN'lerden ve tümörlerden izole edilen 2  106 splenositler veya hücreler, 55 mmol/L b-merkaptoetanol ve 1 protein taşıyıcı inhibitörle desteklenen tam RPMI 1640 ortamında 10 mg/mL OVA257e264 peptidi ile uyarıldı. 18 saat boyunca kokteyl. Hücreler toplandı ve T hücresine özgü antikorlarla boyandı. Cytofix/Cytoperm kiti ile sabitleme ve geçirgenleştirmeden sonra hücreler, anti-IFN-g antikoru ile boyandı ve BD LSR II akış sitometresinde (BD Biosciences) analiz için uygulandı. T hücresi proliferasyonunu ölçmek için T hücreleri, bir fare T hücresi izolasyon kiti kullanılarak OT-I transgenik farelerin dalaklarından izole edildi. Bunlar, 200 mg/mL BSA içeren RPMI 1640'ta 1 mmol/L CFSE ile 37°C'de 10 dakika süreyle boyandı. CFSE etiketli T hücreleri, iki kez 5 hacim soğuk tam RPMI 1640 ile yıkandı. Bu arada olgun BMDC'ler, T hücresi izolasyonundan önce 24 saat boyunca 2 mg/mL OVA mRNA kapsüllü MVP. T hücreleri hazır olduğunda BMDC'ler ve T hücreleri, 72 saat boyunca 1:5 (DC: T) oranında birlikte kültürlendi. Hücreler toplandı ve T hücrelerine yönelik yüzey antikorlarıyla boyandı; çoğalma, bir BD LSR II akış sitometresi (BD Biosciences) kullanılarak test edildi ve analiz edildi. Tüm akış sitometri sonuçları FlowJo v10 yazılımı (Ashland, OH, ABD) ile analiz edildi.

2.11. Canlı farelerde protein ifadesinin izlenmesi

BALB/c fareleri, 10 mg Luc mRNA kapsüllü MVP ile ayak tabanı içi enjeksiyon yoluyla tedavi edildi. 6, 12, 24 veya 48 saat sonra fare başına 30 mg RediJect D-lusiferin intraperitoneal olarak enjekte edildi ve biyolüminesans, Xenogen IVIS-200 görüntüleme sistemi (Caliper Life Sciences, Inc., Hopkinton, MA, ABD).

2.12. ELISpot testi

IP filtre plakaları, 50 mL %35 etanol ile önceden durulandı ve etanol buharlaşmadan önce 3 kez PBS ile iyice yıkandı. Plakalar daha sonra gece boyunca 4°C'de anti-IFN-g yakalama antikorları ile kaplandı. Plakalar, 55 mmol/L b-merkaptoetanol içeren RPMI 1640 tam ortamı ile 2 saat boyunca 37°C'de bloke edildi. Hücreler (1  105 splenositler, 1  105 popliteal LN'den hücreler) her bir oyuğa ekildi ve 10 mg/mL OVA257e264 peptidi ile 36 saat süreyle uyarıldı. Ortam atıldı ve hücreler 4 kez PBST (%0,05 Tween 20 içeren PBS) ve iki kez PBS ile yıkandı. Son yıkamanın ardından bir anti-IFN-g saptama antikoru eklendi ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında, karanlıkta inkübe edildi. Plakalar 4 kez PBST ve iki kez PBS ile yıkandı ve avidin-HRP ilave edildi ve karanlıkta oda sıcaklığında 45 dakika daha inkübe edildi. Son olarak plakalar yukarıda açıklandığı gibi tekrar PBST ve PBS ile yıkandı ve 50 mL AEC substratı uygulanarak nokta reaksiyonu izlendi. Noktalar görünür hale geldiğinde, AEC substratı atılarak ve 5 kez çift damıtılmış suyla yıkanarak reaksiyon durduruldu. Gece boyunca havada kurutulduktan sonra plakalar tarandı ve CTL ImmunoSpot SeriesS5 Versa ELISpot Analizörü (S5Versa-02- 9038, CTL Inc., Cleveland, OH, ABD) kullanılarak analiz edildi.

2.13. Western blot analizi

Yabani tip, Mavs KO veya Sting KO farelerinden türetilen BMDC'ler toplandı ve hücreler, proteaz ve fosfataz inhibitörleriyle desteklenen RIPA hücre lizis tamponunda parçalandı. Hücre lizatındaki protein konsantrasyonu bir BCA protein tahlil kiti ile ölçüldü. Protein numuneleri, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile ayrıldı ve bir poliviniliden diflorür (PVDF) membranına aktarıldı. MAVS ve STING ekspresyonu, membranın 1:2000 seyreltmede bir anti-MAVS veya anti-STING antikoru ile inkübe edilmesinin ardından SuperSignal West Pico ve Femto Chemiluminescent Substrat ile immün algılamanın ardından tespit edildi. STING yolunun aktivasyonunu ölçmek için, vahşi tip farelerden türetilen BMDC'ler, 2 saat boyunca belirtilen konsantrasyonda araç veya OVA mRNA kapsüllü MVP ile tedavi edildi. Hücreler lize edildi ve 1:2000 seyreltmede anti-TBK1 ve antifosfo-TBK1 antikorları ile Western blot analizi için ilerletildi.

2.14. Antitümör tahlili

Fare tümör modelleri, fare başına 2  105 hücre B16-OVA melanom hücresi veya 5  105 MC38-OVA hücresinin deri altından 6 ila {{5}'in sol kanadına aşılanmasıyla oluşturuldu. } haftalık dişi C57BL/6J fareleri. Fareler rastgele olarak tedavi gruplarına ayrıldı ve 7 gün arayla iki kez 10 mg OVA MVP veya ayak tabanlarındaki kontrollerle tedavi edildi. Tümör büyümesi her 2 günde bir izlendi. Tümör hacmi Denkleme göre hesaplandı. (2):

Farelere ikinci aşılamadan 5 gün sonra ötenazi uygulandı ve tümör dokularının ağırlığı kaydedildi.

2.15. istatistiksel analiz

Tüm sonuçlar ortalama SEM olarak sunulmaktadır. İstatistikler, çoklu grup karşılaştırması için Tukey düzeltmesi ve iki grup karşılaştırması için eşleştirilmemiş iki kuyruklu t testi kullanılarak tek yönlü bir ANOVA testi ile değerlendirildi. Veriler GraphPad Prism v8.0.2 yazılımıyla analiz edildi. P < 0.{{10}}5 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi (*P < 0.05; **P < 0,01; ***P <0,005; ****P <0,001).

3. Sonuçlar

3.1. MVP, dendritik hücrelerde (DC) sağlam mRNA ifadesine aracılık eder

Çekirdek kabuklu aşı parçacıklarını iki aşamalı bir mikro-akışkan yaklaşımla hazırladık (Şekil 1A) ve DC'lerde yüksek stabiliteye, yüksek hücresel alıma ve yüksek ekspresyon potansiyeline sahip bir aşı parçacığını birleştirmek için nanoparçacıktaki tek tek bileşenleri sistematik olarak değerlendirdik. Jel elektroforezi, mRNA-protamin oranı 1 veya altında olduğunda stabil bir mRNA çekirdeğinin oluşabileceğini ortaya çıkardı (Şekil 1B). eGFP kodlayan mRNA'yı bir yedek işaretleyici olarak kullanarak, %34 EDOPC/%30 DOPE/%35 kolesterol/%1 DSPPEPEG2k molar oranındaki bir lipit bileşiminin ideal bir kapsülleme oranı ve en iyi ekspresyon verimliliğini sağladığını bulduk (Tablo 1, Destekleyici Bilgiler Şekil S1AeS1D). Yük oranının değiştirilmesi parçacıkların kapsülleme oranını, çoklu dağılım indeksini veya yüzey yükünü önemli ölçüde değiştirmedi (Tablo 2, Şekil 1CeE); bununla birlikte, oran aralığının dışına düştüğünde 120-130 nm'lik bir çapa kıyasla, oran 12 ile 16 arasındayken elde edilen parçacıkların boyutu 70 ile 80 nm arasındaydı (Şekil 1F ve G). En iyi ekspresyon, yük oranı 12 olan MVP2 ile tedavi edilen DC2.4 hücrelerinde tespit edildi (Şekil 1H ve I). Lusiferazı kodlayan mRNA ile parçacıklar hazırlandığında benzer bir model gözlendi ve doza bağlı ekspresyon tespit edildi (Şekil 1J). MRNA ile kapsüllenmiş parçacıklar, liyofilizasyon veya donma-çözülme sonrasında aktivitelerini kaybetmedikleri için arzu edilen stabiliteyi gösterdi (Şekil S1E ve S1F). Ek olarak, kemik iliğinden türetilen dendritik hücrelerin (BMDC'ler) tek başına mRNA çekirdeği, mRNA molekülleri olmadan hazırlanan bir araç partikülü veya mRNA içeren MVP2 ile işlenmesinden sonra sitotoksisite görülmedi (Şekil 1K). Böylece MVP2 en iyi ifade potansiyelini sergiledi. Çalışmadaki diğer tüm deneyler için kullanıldı ve metnin geri kalanında MVP olarak etiketlendi. MVP parçacıkları, mRNA moleküllerini in vivo olarak etkili bir şekilde iletebildi ve vücut ağırlığı değişikliklerine bağlı olarak mRNA kapsüllü MVP'den tespit edilebilir bir toksisite yoktu (Şekil S1GeS1I).

3.2. MVP, in vitro ve in vivo olarak antijen sunumunu ve T hücresi aktivasyonunu etkili bir şekilde indükler

MRNA çekirdeği, mRNA içermeyen araç ve OVA mRNA kapsüllü MVP'yi hazırladık ve bunları DC olgunlaşmasını ve antijen sunumunu test etmek için uyguladık (Şekil 2A). MVP ile tedavi edilen BMDC'ler, CD40, CD80 ve CD86 dahil olmak üzere DC olgunlaşma işaretleyicilerinin doza bağlı aşırı ifadesini sergiledi (Şekil 2BeD). MRNA'sız araç veya mRNA kapsüllü MVP ile tedavi, MHC I aşırı ekspresyonunu tetikledi (Şekil 2E), bu da etkinin mRNA kompleksi yerine araçla ilişkili olduğunu gösterir. Ek olarak, MVP tedavisi, bir anti-SIINFEKL-MHCI antikoru (Şekil 2F) ile tespit edilen OVA257e264 antijen epitopu-MHC I kompleksinin (SIINFEKL-MHC I) hücre yüzeyi gösterimi ile sonuçlandı ve BMDC'ler tarafından etkili antijen işleme ve sunumunu ortaya koydu. . Ayrıca, MVP ile tedavi edilen BMDC'lerin, OVA257e264 epitopunu spesifik olarak tanıyan bir CD8+ T hücre çizgisi olan B3Z ile veya OVA257e264-'ye özgü bir T hücresini eksprese eden bir OT-I farenin dalağından izole edilen T hücreleri ile birlikte inkübasyonu reseptörü, IL-2 salgısını tetikledi; bu sonuç, yalnızca araçla veya yalnızca mRNA/protamin çekirdeğiyle tedavi edilen DC'lerle birlikte kuluçkalanan T hücrelerinde gözlenmedi (Şekil 2G). Akış sitometri analizi, MVP ile birlikte inkübasyonun ardından %32,5 proliferatif CD8+ T hücreleri tespit etti (Şekil 2H ve I). OVA mRNA ile kapsüllenmiş MVP parçacıkları aynı zamanda intradermal enjeksiyon yoluyla fareleri tedavi etmek için de uygulandı. Boşalan lenf düğümlerindeki hücrelerin incelenmesi, ilk 48 saat boyunca hem klasik DC'ler (CD8+ DC, CD11b+ DC, CD103+ DC) hem de plazmasitoid DC'ler (pDC) arasında CD86 ekspresyonunda istikrarlı bir artış ortaya çıkardı; bu, DC'nin uyarıldığını gösterir olgunlaşma (Şekil 2J). Tedavi ayrıca lenf düğümlerinde CD8+ T hücrelerinin zenginleşmesini de destekledi; CD69+CD8+ T hücrelerinin popülasyonunda önemli bir artış oldu (Şekil 2K ve L), bu da tedaviyle T hücresi aktivasyonunu gösteriyor. T hücresi aktivasyonunu belirlemek için, MVP tedavisinden 3, 5 veya 7 gün sonra drenaj yapan lenf düğümlerindeki hücreleri topladık ve hücrelere OVA257e264 antijen peptidi yüklendikten sonra ELISpot analizleri yaptık (Destekleyici Bilgi Şekil S2). MVP tedavisi, bu süre zarfında IFN-g salgılayan hücrelerde büyük bir sıçramayı tetikledi ve aktivite 5. Günde zirveye ulaştı (Şekil 2M). Bu sonuçlar, MVP ile tedaviden sonra güçlü DC uyarımı, antijen sunumu ve T hücresi aktivasyonunu gösterdi.

Tablo 1 eGFP kodlayan mRNA ile kapsüllenmiş nanopartiküllerin bileşimi.

Tablo 2MVP'nin lipit bileşimi ve yük oranıparçacıklar.

3.3. MVP, kolorektal tümör ve melanomun fare modellerinde güçlü anti-tümör bağışıklığını ortaya çıkarır

MVP, MC38 kolon kanseri ve B16 melanomu olan fareleri tedavi etmek için uygulandı. Her iki modelde de MVP'yi kapsülleyen OVA mRNA ile tedavi, deri altından tümör büyümesini iki kez tamamen bloke etti; karşılaştırıldığında, eGFP mRNA kapsüllenmiş MVP veya tek başına araçla yapılan tedavinin, tümör büyümesi üzerinde tespit edilebilir herhangi bir önleyici etkisi yoktu (Şekil 3AeD, Destekleyici Bilgiler Şekil S3). Lenf düğümlerindeki CD4'ten CD8'e kayma modeliyle uyumlu olarak (Şekil 2), OVA mRNA kapsüllü MVP ile tedavi edilen farelerden alınan tümörlerde CD8+/CD4+ T hücresi oranında bir artış gözlemledik (Şekil 3E). Ek olarak, OVA mRNA kapsüllü MVP ile tedavi edilen ancak tek başına araç veya GFP mRNA kapsüllü MVP ile tedavi edilen farelerde dalaklarda, lenf düğümlerinde ve tümörlerde IFN-g+CD8+ T hücrelerinde yüksek düzeyler tespit ettik (Şekil 3FeH, Destekleyici Bilgiler). Şekil S4). Ayrıca, OVA mRNA ile kapsüllenmiş MVP tedavi grubundaki tümörlerdeki OVA257e264-MHCI dekstramer-pozitif CD8+ T hücrelerinde, antijene spesifik CD8+ T hücrelerinin proliferasyonunu gösteren önemli bir artış vardı (Şekil 3I). Dalaklardan ve lenf düğümlerinden izole edilen hücrelerle yapılan ELISpot tahlili, T hücresi aktivasyonuna daha fazla destek sağladı (Şekil 3JeM).

3.4. MVP, STING'e bağlı sinyali aktive ederek doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini uyarır

Tip I IFN ve inflamatuar sitokin ekspresyonunun uyarılmasından sorumlu anahtar faktörleri ve yolları belirlemek amacıyla BMDC'leri tedavi etmek için mRNA çekirdeği, mRNA içermeyen araç ve mRNA kapsüllü MVP'yi uyguladık. İlginç bir şekilde, MVP, IFN-b salgılanmasını tetiklemede Tlr7 agonisti imikimod kadar güçlüydü ve tek başına araç, IFN-b salgılanmasını desteklemede de aktivite gösterdi, ancak gücü MVP kadar yüksek değildi; ancak mRNA çekirdeği tek başına IFN-b salgısının uyarılmasında etkisizdi (Şekil 4A). Sonuç, IFN-b ekspresyonunu maksimuma çıkarmak için hem mRNA'nın hem de araçtaki bileşenlerin gerekli olduğunu ima etti. Bu arada, imiquimod ve araç, TNF-a ve IL{8}}b ifadesinin desteklenmesinde benzer aktivite gösterirken, MVP bunların her ikisinden de çok daha güçlüydü (Şekil 4B ve C). Yaygın olarak NF-kB ve IFN düzenleyici faktörlerle ilişkili bir sitokin olan CCL5'in ekspresyonu, imikimod, yalnızca araç veya MVP ile tedavi edilen hücrelerde eşit şekilde uyarıldı (Şekil 4D). TLR7, MAVS, STING ve TRIF, viral RNA'ya ve hasarlı DNA28e30'a hücresel yanıtlara aracılık eden ana sinyal iletim yollarında anahtar faktörlerdir. IFN-b ve TNF-a ifadesini incelemek için Tlr7, Mavs, Sting veya Trif gen nakavtına (KO) sahip farelerden BMDC'ler ürettik ve hücreleri mRNA çekirdeği, mRNA içermeyen araç veya mRNA kapsüllenmiş MVP ile tedavi ettik.

Şekil 2 MVP tarafından bağışıklık tepkilerinin uyarılması. (A) mRNA/protamin çekirdeğinin, mRNA içermeyen aracın ve tam MVP'nin şematik görünümü. (BeD) 24 saat boyunca OVA-MVP ile tedavi edildikten sonra BMDC'lerin olgunlaşması. (E ve F) 24 saat boyunca OVA-MVP ile tedavi edildikten sonra BMDC'lerde MHC I ekspresyonu ve OVA257e264 antijen epitop-MHC I kompleksi. (G) B3Z veya OT-I T hücreleriyle birlikte inkübe edilmiş işlenmiş BMDC'lerden elde edilen IL-2 düzeyi. (H ve I) Proliferatif T hücrelerinin akış sitometri analizi. T hücrelerinin temsili kromatogramları gösterilmektedir. (J) in vivo MVP tedavisinden sonra DC olgunlaşması. C57BL/6J fareleri OVA-MVP ile tedavi edildi ve popliteal lenf düğümlerindeki DC'ler analiz edildi. (K ve L) T hücre popülasyonu analizi. C57BL/6J fareleri, araç veya OVA-MVP ile tedavi edildi ve popliteal lenf düğümlerindeki T hücreleri, akış sitometrisi ile analiz edildi. (M) ELISpot tahlili. C57BL/6J fareleri OVA-MVP ile tedavi edildi ve belirtilen zaman noktalarında lenf düğümleri toplandı. IFN-g eksprese eden hücrelerin ölçümü için izole edilmiş hücreler uygulandı. Veriler ortalama SEM (nZ 3) olarak sunulmuştur. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P <0,005; ****P < 0,001; ns, anlamlı değil.

Şekil 3 MVP'den anti-tümör aktivitesi. (A) MC38-OVA tümör büyümesinin inhibisyonu. Dişi C57BL/6J fareleri, 0. günde deri altından 5  105 MC38-OVA tümör hücreleri/fare ile aşılandı ve 1. günde PBS kontrolü, araç kontrolü, GFP-MVP veya OVA-MVP ile tedavi edildi. 3. ve 1. Günler0. (B) B16-OVA tümör büyümesinin inhibisyonu. Dişi C57BL/6J fareleri 0. günde deri altından 2  105 B16-OVA tümör hücreleri/fare ile aşılandı ve PBS kontrolü, araç kontrolü, GFP-MVP veya OVA-MVP ile tedavi edildi 3. ve 1. Günlerde0. (C ve D) B16-OVA tümörlerinin 17. Gündeki görüntüsü ve ağırlığı. (E) Tedavi sonrası farelerin tümörlerindeki T hücre popülasyonu. Tedavi sonrası farelerin dalaklarında, lenf düğümlerinde (LN) ve tümörlerinde (FeH) IFN-g+CD8+ T hücreleri. (I) Tedavi sonrası farelerin tümörlerindeki OVA'ya özgü CD8+ T hücreleri. (JeM) Tedavi sonrası farelerden alınan dalak ve LN hücrelerinin ELISpot testinin görüntüleri ve kantitatif analizi. Veriler ortalama SEM (nZ 5) olarak sunulmuştur. *P < 0.05; **P < 0,01; ***P <0,005; ****P < 0,001.

BMDC'lerde Mavs ve Sting'in KO durumu Western blot analizi ile doğrulandı (Destekleyici Bilgi Şekil S5A). Şaşırtıcı bir şekilde Sting KO, hem tek başına araçtan hem de MVP'den IFN-b salgılanması üzerindeki uyarıcı aktiviteyi sildi (Şekil 4E), bu da MVP'nin STING yoluyla tip I IFN ekspresyonunu aktive ettiğini gösterdi. Bu fikri desteklemek için, genellikle STING aktivitesi31 ile ilişkilendirilen bir kinaz olan tank bağlayıcı kinaz 1'in (TBK1) (Şekil S5B) fosforilasyonunu tespit ettik. Ek olarak bu yol, TLR7 sinyallemesinden bağımsızdı çünkü imikimodla tedavi edilen hücrelerde IFN-b ekspresyonu tehlikeye girmedi (Şekil 4E). Karşılaştırıldığında Trif veya Mavs KO, MVP tarafından desteklenen IFN-b ifadesi üzerinde minimum etkiye sahipti. Beklendiği gibi imikimod, Tlr7 KO'dan türetilen BMDC'lerde IFN-b salgısının uyarılmasında etkisizdi; ancak Tlr7 KO, MVP'nin uyarıcı etkisi üzerinde olumsuz bir etkiye sahipti (Şekil 4E). İlginç bir şekilde aynı tedavilerden TNF-a salgılanmasında farklı bir profil gözlendi. Sting, Trif veya Tlr7'nin nakavtının, MVP ile uyarılan sitokin ekspresyonu üzerinde hiçbir etkisi olmadı veya minimum düzeyde oldu. Öte yandan Mavs'in nakavt edilmesi, tek başına araç veya MVP ile tedavi edilen hücrelerde TNF-a seviyelerini önemli ölçüde azalttı (Şekil 4F). Sonuç, MAVS'nin, MVP tedavisi üzerine DC'lerde TNF-a ifadesinin anahtar düzenleyicisi olduğunu gösterir.

3.5. MVP, IFN-I ve inflamatuar sitokinlerin salgılanmasını teşvik etmek için STING ve MAVS yollarını uyarır

Araçtaki STING ve MAVS sinyalinin uyarılmasından sorumlu bileşenleri belirlemek için, temel bileşenleri değiştirerek veya çıkararak araçlar ve MVP'ler hazırladık ve bunları BMDC'leri tedavi etmek için uyguladık. Sting agonisti siklik GMP-AMP (cGAMP), IFN-b salgısının uyarılmasında pozitif kontrol görevi gördü. Araçtaki katyonik lipit EDOPC'nin başka bir pozitif yüklü lipit olan DOTAP ile değiştirilmesi, IFN-b salgısını tamamen yok etti. Karşılaştırıldığında, aracın ve MVP'nin uyarıcı etkisi, protamin olsun veya olmasın muhafaza edildi ve bu tür uyarıcı aktivite, sağlam bir Sting genine bağlıydı (Şekil 4G). İlginç bir şekilde, EDOPC de dahil olmak üzere lipit kabuğunun ayrı ayrı bileşenleriyle tedavi edilen BMDC'ler, güçlü IFN-b salgılanmasını desteklemedi (Destekleyici Bilgiler Şekil S6). Dolayısıyla EDOPC, STING aktivasyonu için gerekliydi ve aktivitesi, bir lipit nanopartikülünün (yani araç veya MVP) oluşumuna bağlıdır. EDOPC veya DOTAP ile hazırlanan araç ve MVP, vahşi tip ve Mavs KO farelerinden türetilen BMDCS'yi tedavi etmek için de uygulandı ve hücre büyüme ortamındaki TNF seviyeleri belirlendi. Beklendiği gibi, EDOPC'nin DOTAP veya DOPC ile değiştirilmesi, araç ve MVP'nin uyarıcı çabasını ortadan kaldırdı. Ek olarak, TNF-a seviyesi, vahşi tip hücrelerle karşılaştırıldığında Mavs KO hücrelerinde önemli ölçüde azaldı, ancak azalmadı (Şekil 4H), bu, MVP ile uyarılan TNF-a ekspresyonuna aracılık etmede ek faktörlerin rol oynayabileceğini gösterir.

3.6. STING yolu, MVP aracılı anti-tümör immün tepkileri için gereklidir

Hem vahşi tip hem de nakavt fareler, OVA mRNA kapsüllü MVP ile tedavi edildi ve DC olgunlaşması ve T hücresi proliferasyonu incelendi. Sting KO, CD80+ ve CD86+ DC hücrelerinin ve CD69+ T hücrelerinin yüzdesini önemli ölçüde azalttı (Şekil 5AeD). ELISpot analizi, Sting KO farelerinin dalaklarında ve lenf düğümlerinde IFN-g üreten hücrelerin, aynı dozda MVP ile tedavi edildikten sonra vahşi tip farelere kıyasla önemli ölçüde azaldığını ortaya çıkardı (Şekil 5EeH). Mavs KO'nun etkisi minimum düzeydeydi; çünkü CD44+CD8+ bellek T hücreleri, OVA257e264-MHCI dekstramer-pozitif CD8+ T hücreleri veya lenf düğümlerindeki IFN-g üreten hücrelerin sayısı üzerinde, vahşi hücrelerle karşılaştırıldığında hiçbir fark izlenmedi. tip fareler (Şekil 5IeL). Sonuç, MVP'nin uyardığı inflamatuar sitokin ekspresyonunda MAVS'nin yanı sıra ek faktörlerin de rol oynayabileceği fikrini güçlendiriyor. B16-OVA tümörlerini aşılamak için hem vahşi tip hem de Sting KO fareleri uygulandı ve fareler, PBS kontrolü veya OVA mRNA kapsüllü MVP ile tedavi edildi. Aşılanmış farelerden toplanan lenf düğümü ve tümör numuneleri üzerindeki akış sitometri analizi, Sting KO farelerinde IFN-g üreten CD8+ T hücrelerinin sayısında önemli ölçüde azalma olduğunu ortaya çıkardı (Şekil 6A ve B). Sonuç olarak, Sting KO farelerindeki yalnızca kısmi inhibisyona kıyasla, MVP ile tedavi edilen vahşi tip farelerde tümör büyümesi tamamen inhibe edildi (Şekil 6C).

cistanche bitkisi bağışıklık sistemini güçlendiriyor

Cistanche Enhance Immunity ürünlerini görüntülemek için buraya tıklayın

【Daha fazlasını isteyin】 E-posta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

4. Tartışma

Bu çalışmada, MVP'deki bireysel bileşenlerin anti-tümör immün tepkilerinin uyarılması üzerindeki fonksiyonel rollerini sistematik olarak inceledik. Hücre bazlı çalışmamız, hem mRNA moleküllerinin hem de MVP'deki RNA içermeyen aracın, IFN-b'nin ve IL-1b ve TNF dahil bir dizi inflamatuar sitokinin ekspresyonunu teşvik etmedeki tam aktivitesi için gerekli olduğunu açıkça göstermiştir. -a dendritik hücrelerde. Bu tür sitokinlerin dendritik hücre aktivasyonunda ve aşı aracılı anti-tümör immünitesinde önemli roller oynadığı gösterilmiştir20. Çalışmamız ayrıca sitokin üretiminin uyarılmasının, STING ve MAVS'nin aracılık ettiği olanlar da dahil olmak üzere doğuştan gelen bağışıklık algılamasında yer alan bir dizi anahtar sinyal iletim yoluna bağlı olduğunu ortaya çıkardı. STING, IFN-b ekspresyonu için gerekli olsa da, MAVS esas olarak TNF-a ekspresyonunun düzenlenmesinde rol oynar (Şekil 6D). MVP aracılı anti-tümör immünitesi üzerinde STING sinyallemesinin önemi, Sting KO farelerinde T hücresi aktivitesinin azalması ve bunun sonucunda da tümör büyümesinin inhibisyonunun tehlikeye atılmasıyla da gösterilmiştir. Bu sonuç, STING aktivasyonunun sitotoksik T hücresi aracılı antitümör immünitesini belirlediğine dair diğer raporlarla uyumludur32. MAVS, viral enfeksiyona yanıt olarak RIG-I reseptörü (RLR) sinyallemesinde önemli bir aracıdır. Bu yolun aktivasyonu, bir dizi inflamatuar yanıta yol açar33. MAVS sinyalinin, TNF-a dahil inflamatuar sitokinlerin ekspresyonunun düzenlenmesinde açıkça büyük bir rol oynadığı göz önüne alındığında, Mavs KO farelerinde T hücresi aktivitesinin tehlikeye girmemesi ilgi çekicidir. Olası bir neden, bu tür sitokinlerin MVP tarafından uyarılmasına birden fazla yolun aracılık etmesi ve MAVS yolunun bozulmasının sitokin ekspresyonunu önemli bir etkiye neden olacak kadar düşük bir seviyeye düşürmemesidir. Alternatif olarak MAVS sinyalinin kaybı diğer yollarla telafi edilir. MVP aşısının etki mekanizmasının daha iyi anlaşılması için bu yolakların tanımlanmasına yönelik daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. TLR7 geleneksel olarak mRNA terapötikleriyle ilişkilendirilmiş olsa da21 TLR7 sinyali, MVP aktivitesine aracılık etmede önemli bir rol oynamıyor gibi görünüyor. Mevcut çalışmada tamamen metillenmiş mRNA moleküllerinin uygulanması, TLR7 sinyalini daha az alakalı hale getirmiş olabilir. RNA metilasyonunun TLR23 tarafından tanınmayı baskıladığı iyi bir şekilde gösterilmiştir. TRIF, TLR3/7/8 sinyallemesi için anahtar bir adaptör proteindir28. Trif'in devre dışı bırakılması, MVP aktivitesini de etkilemez; bu, TLR7 dahil yukarıdaki TLR'lerin, MVP'ye hücresel tepkilere aracılık etmede önemli bir rol oynamadığı fikrini güçlendirir. Siklik dinükleotidler ve küçük ve büyük moleküler bileşikler34e37 dahil olmak üzere kanser aşısının geliştirilmesinde birden fazla Sting agonisti uygulanmıştır. Bu tür Sting agonistlerinin aşı hazırlanması sırasında harici adjuvanlar olarak eklenmesi gerekir, bu da aşı bileşimine başka bir karmaşıklık katmanı ekler. Ayrıca dışarıdan eklenen Sting agonisti, mRNA kompleksinden ayrıldığında istenmeyen olumsuz etkilere neden olabilir. Karşılaştırıldığında, MVP'miz kendi kendine adjuvan görevi görüyor ve kanser aşısı bağlamında çalışıyor, çünkü EDOPC de dahil olmak üzere aşının tek tek bileşenlerinin hiçbiri sitokin ekspresyonunu destekleyemiyor. İlginçtir ki, katyonik fosfolipit EDOPC, yine pozitif yüklü olan fosfolipid olmayan DOTAP ile değiştirilemez. Bu iki katyonik lipit arasındaki farkın potansiyel mekanizmasını tahmin etmek ilgi çekicidir. Bununla birlikte, bir lipit molekülü bileşeninin hidrofobiklik gibi diğer özelliklerinin, bir nanopartikülün genel fonksiyonu ve bunun nükleik asitler için dağıtım etkinliği üzerinde derin bir etkiye sahip olabileceği belgelenmiştir38. Bu nedenle, tamamen işlevsel bir mRNA aşısı hazırlamak için uygun moleküllerin seçiminde dikkatli olunmalıdır. Özetle, güçlü bir mRNA bazlı terapötik kanser aşısı geliştirdik ve aşıdaki ayrı ayrı bileşenlere, işlevlerine göre atadık. Etki mekanizması profilaktik ve terapötik müdahaleler için kullanılan diğer mRNA platformlarından oldukça farklıdır. Mevcut çalışmadan elde edilen bilgiler, gelecekte ek mRNA terapötiklerinin geliştirilmesine kesinlikle rehberlik edecektir.

Şekil 4 Doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinin MVP tarafından desteklenmesi. (AeD) 24 saat boyunca 1 mg/mL imiquimod, 1 mg/mL mRNA eşdeğeri çekirdek, araç veya MVP ile tedavi edilen BMDC'ler. IFN-b, TNF-a, IL-1b ve CCL5 düzeyleri ELISA ile ölçüldü. (E ve F) Yabani tip ve gen nakavt (KO) farelerden türetilen BMDC'lerin IFN-b ve TNF-a ifadesi. BMDC'ler 24 saat boyunca belirtilen reaktiflerle tedavi edildi. IFN-b ve TNF-a ELISA ile ölçüldü. (G) Yabani tip ve Sting nakavt farelerden türetilen BMDC'lerdeki IFN-b. BMDC'ler 24 saat boyunca 20 mg/mL cGAMP, 1 mg/mL mRNA eşdeğeri çekirdek, araç veya MVP ile işlendi. Araç (DOTAP): EDOPC'nin DOTAP ile değiştirilmesiyle hazırlanmıştır; araç (protaminsiz): protamin çıkarılarak hazırlanır. ND: tespit edilemiyor. (H) Vahşi tip ve Mavs nakavt farelerden türetilen BMDC'lerdeki TNF-a. BMDC'ler 24 saat boyunca 1 mg/mL mRNA eşdeğeri çekirdek, araç veya MVP ile işlendi. Araç (DOTAP): EDOPC'nin DOTAP ile değiştirilmesiyle hazırlanmıştır; araç (DOPC): EDOPC'nin DOPC ile değiştirilmesiyle hazırlanır. Veriler ortalama SEM (nZ 3) olarak sunulmuştur. ***P < 0.005; ****P < 0,001; ns, anlamlı değil.

Şekil 5 Sting ve Mavs nakavt farelerinde antitümör bağışıklık tepkileri. (AeD) Sting nakavt farelerde azalmış DC ve T hücresi aktivasyonu. Hem vahşi tip hem de Sting nakavt fareler, OVA mRNA kapsüllü MVP ile tedavi edildi ve DC ve T hücresi ölçümü için 48 saat sonra lenf düğümleri toplandı. (EeH) Sting nakavt farelerden dalak ve lenf düğümlerinde IFN-g eksprese eden T hücrelerinde azalma. Hem noktaların görüntüleri hem de kantitatif analizler gösterilmektedir. (IeL) Mavs nakavt farelerde T hücresi aktivitesi üzerinde etki yok. Hem vahşi tip hem de Mavs nakavt fareler, PBS kontrolü veya OVA mRNA kapsüllü MVP ile tedavi edildi ve CD44+CD8+ bellek T hücrelerinin (I), OVA257e264-MHCI dekstramer-pozitif CD8+ ölçümü için 48 saat sonra lenf düğümleri toplandı. T hücreleri (J) ve IFN-g üreten hücrelerin sayısı (K ve L). Veriler ortalama SEM (nZ 3 veya 5) olarak sunulmuştur. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P <0,005; ****P < 0,001; ns, anlamlı değil.

Şekil 6 Sting'e bağlı anti-tümör bağışıklığı. (A ve B) B16-OVA tümörleri taşıyan vahşi tip ve Sting nakavt farelerin, OVA mRNA kapsüllü MVP ile tedavi edilmesinden sonra lenf düğümlerinde ve tümör dokularında IFN-g eksprese eden T hücrelerinin analizi. Fareler 3. ve 1. Günlerde tedavi edildi ve 15. Günde lenf düğümleri ve tümörler toplandı. Tek hücreler akış sitometrisi ile analiz edildi. (C) Yabani tip ve Sting nakavt farelerde tümör büyümesinin inhibisyonu. Farelere 3. ve 1. Günlerde PBS kontrolü veya MVP uygulandı0. Veriler ortalama SEM (nZ 5) olarak sunulmuştur. *P <0.05; ****P < 0,001; ns, anlamlı değil. (D) DC'lerde sitokin üretimine yol açan sinyal iletim yollarının MVP uyarılmasına ilişkin şematik görünüm. IFN-b ifadesinin uyarılmasına yalnızca STING aracılık ederken, TNF-a ve IL{19}}b ifadesine aracılık eden MAVS dahil birçok faktör vardır.

Referanslar

1. El Sahly HM, Baden LR, Essink B, Doblecki-Lewis S, Martin JM, Anderson EJ, ve diğerleri. mRNA-1273 SARS-CoV-2 aşısının körleme aşamasının tamamlanmasındaki etkinliği. N Engl J Med 2021;385:1774e85.

2. Moreira Jr ED, Kitchin N, Xu X, Dychter SS, Lockhart S, Gurtman A, ve diğerleri. BNT162b2 Kovid-19 aşısının üçüncü dozunun güvenliği ve etkinliği. N Engl J Med 2022;386:1910e21.

. Dowdy SF. RNA terapötikleri için hücresel engellerin aşılması. Nat Biotechnol 2017;35:222e9.

4. Cullis PR, Hope MJ. Gen tedavilerini mümkün kılan lipit nanopartikül sistemleri. Mol Ther 2017;25:1467e75.

5. Persano S, Guevara ML, Li Z, Mai J, Ferrari M, Pompa PP, ve diğerleri. Lipopolyplex, mRNA bazlı aşılamanın anti-tümör bağışıklığını güçlendirir. Biyomateryaller 2017;125:81e9.

6. Wang Y, Su HH, Yang Y, Hu Y, Zhang L, Blancafort P, ve diğerleri. Hedeflenen kanser gen tedavisi için herpes simpleks virüsü 1 timidin kinazı kodlayan modifiye mRNA'nın sistemik olarak verilmesi. Mol Ther 2013;21:358e67.

7. Kranz LM, Diken M, Haas H, Kreiter S, Loquai C, Reuter KC, ve diğerleri. Dendritik hücrelere sistemik RNA iletimi, kanser immünoterapisi için antiviral savunmadan yararlanır. Doğa 2016;534:396e401.

8. Meng C, Chen Z, Mai J, Shi Q, Tian S, Hinkle L, ve diğerleri. Kanser tedavisi için virüs taklitçisi mRNA aşısı. Adv Ther 2021;4:2100144.

9. Pardi N, Hogan MJ, Porter FW, Weissman D. mRNA aşıları aşı biliminde yeni dönem. Nat Rev İlaç Keşfi 2018;17:261e79.

10. Rurik JG, Tombacz I, Yadegari A, Mendez Fernandez PO, Shewale SV, Li L, ve diğerleri. CAR T hücreleri kalp hasarını tedavi etmek için in vivo olarak üretilir. Bilim 2022;375:91e6.

11. Esteban I, Pastor-Quinones C, Usero L, Plana M, Garcia F, Leal L. mRNA aşıları çağında, HIV'in işlevsel bir tedavisi için herhangi bir umut var mı? Virüsler 2021;13:501.

12. Krienke C, Kolb L, Diken E, Streuber M, Kirchhoff S, Bukur T, ve diğerleri. Deneysel otoimmün ensefalomiyelitin tedavisi için inflamatuar olmayan bir mRNA aşısı. Bilim 2021;371:145e53.

13. Miao L, Zhang Y, Huang L. Kanser immünoterapisi için mRNA aşısı. Mol Yengeç 2021;20:41.

14. Van Hoecke L, Verbeke R, Dewitte H, Lentacker I, Vermaelen K, Breckpot K, ve diğerleri. Kanser immünoterapisinde mRNA: bir antijen kaynağının ötesinde. Mol Yengeç 2021;20:48.

15. Şahin U, Derhovanessian E, Miller M, Kloke BP, Simon P, Lower M, et al. Kişiselleştirilmiş RNA mutanom aşıları, kansere karşı poli-spesifik terapötik bağışıklığı harekete geçirir. Doğa 2017;547:222e6.

16. Şahin U, Oehm P, Derhovanessian E, Jabulowsky RA, Vormehr M, Gold M, ve diğerleri. Bir RNA aşısı, kontrol noktası inhibitörü ile tedavi edilen melanomda bağışıklığı artırır. Doğa 2020;585:107e12.

17. Hilf N, Kuttruff-Coqui S, Frenzel K, Bukur V, Stevanovic S, Gouttefangeas C, ve diğerleri. Yeni teşhis edilen glioblastoma için aktif olarak kişiselleştirilmiş aşılama denemesi. Doğa 2019;565:240e5.

18. Carreno BM, Magrini V, Becker-Hapak M, Kaabinejadian S, Hundal J, Petti AA, ve diğerleri. Kanser immünoterapisi. Dendritik hücre aşısı, melanom neoantijenine özgü T hücrelerinin genişliğini ve çeşitliliğini artırır. Bilim 2015;348:803e8.

19. Keskin DB, Anandappa AJ, Sun J, Tirosh I, Mathewson ND, Li S, et al. Neoantijen aşısı, faz Ib glioblastoma denemesinde tümör içi T hücresi yanıtları üretir. Doğa 2019;565:234e9.

20. Mai J, Li Z, Xia X, Zhang J, Li J, Liu H, ve diğerleri. Parçacıklı bir terapötik aşı ile antitümör bağışıklığının sinerjistik aktivasyonu. Adv Sci 2021;8:2100166.

21. Kobiyama K, Ishii KJ. MRNA aşısının yardımcılığının doğuştan anlaşılması. Nat Immunol 2022;23:474e6.

22. Fotin-Mleczek M, Duchardt KM, Lorenz C, Pfeiffer R, Ojkic-Zrna S, Probst J, ve diğerleri. İkili aktiviteye sahip haberci RNA bazlı aşılar, dengeli TLR-7-bağımlı adaptif bağışıklık tepkilerini indükler ve antitümör aktivitesi sağlar. J Immunother 2011;34:1e15.

23. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Toll benzeri reseptörler tarafından RNA tanınmasının baskılanması: nükleosid modifikasyonunun etkisi ve RNA'nın evrimsel kökeni. Bağışıklık 2005;23:165e75.

24. Tahtinen S, Tong AJ, Himmels P, Oh J, Paler-Martinez A, Kim L, ve diğerleri. IL-1 ve IL-1ra, RNA aşılarına verilen inflamatuar yanıtın temel düzenleyicileridir. Nat Immunol 2022;23:532e42.

25. Li C, Lee A, Grigoryan L, Arunachalam PS, Scott MKD, Trisal M, ve diğerleri. PfizerBioNTech BNT162b2 aşısına karşı doğuştan gelen ve uyarlanabilir bağışıklık mekanizmaları. Nat Immunol 2022;23:543e55.

26. LoPresti ST, Arral ML, Chaudhary N, Whitehead KA. Yardımcı lipitlerin, lipit nanopartiküllerindeki yüklü alternatiflerle değiştirilmesi, dalak ve akciğerlere hedeflenen mRNA dağıtımını kolaylaştırır. J Kontrol Sürümü 2022;345:819e31.

27. Charbe NB, Amnerkar ND, Ramesh B, Tambuwala MM, Bakshi HA, Aljabali AAA, ve diğerleri. Kanser tedavisi için küçük müdahaleci RNA: Teslimattaki engellerin aşılması. Acta Pharm Sin B 2020;10:2075e109.

28. Fuertes MB, Woo SR, Burnett B, Fu YX, Gajewski TF. Tip I interferon tepkisi ve kanserin doğuştan gelen bağışıklık algılaması. Trendler Immunol 2013;34:67e73.

29. Harding SM, Benci JL, Irianto J, Discher DE, Minn AJ, Greenberg RA. DNA hasarını takiben mitotik ilerleme, mikronükleus içindeki modelin tanınmasını sağlar. Doğa 2017;548:466e70.

30. Hartlova A, Erttmann SF, Raffi FA, Schmalz AM, Resch U, Anugula S, et al. DNA hasarı, anti-mikrobiyal doğuştan gelen bağışıklığı teşvik etmek için sitozolik DNA sensörü STING aracılığıyla tip I interferon sistemini hazırlar. Dokunulmazlık 2015;42:332e43.

31. Zhang Z, Yuan B, Bao M, Lu N, Kim T, Liu YJ. Helikaz DDX41, dendritik hücrelerdeki adaptör STING'in aracılık ettiği hücre içi DNA'yı algılar. Nat Immunol 2011;12:959e65.

32. Sivick KE, Desbien AL, Glickman LH, Reiner GL, Corrales L, Surh NH, ve diğerleri. Terapötik STING aktivasyonunun büyüklüğü, CD8+ T hücre aracılı anti-tümör bağışıklığını belirler. Hücre Temsilcisi 2018;25: 3074e3085 e5.

33. Reikine S, Nguyen JB, Modis Y. RIG-I ve MDA5'in örüntü tanıma ve sinyal verme mekanizmaları. Ön Immunol 2014;5:342.

34. Fu J, Kanne DB, Leong M, Glickman LH, McWhirter SM, Lemmens E, ve diğerleri. STING agonisti ile formüle edilmiş kanser aşıları, PD-1 blokajına dirençli yerleşik tümörleri tedavi edebilir. Sci Transl Med 2015;7: 283ra52.

35. Corrales L, Glickman LH, McWhirter SM, Kanne DB, Sivick KE, Katibah GE, ve diğerleri. Tümör mikro ortamında STING'in doğrudan aktivasyonu, güçlü ve sistemik tümör gerilemesine ve bağışıklığa yol açar. Hücre Temsilcisi 2015;11:1018e30.

36. Miao L, Li L, Huang Y, Delcassian D, Chahal J, Han J, ve diğerleri. MRNA aşılarının heterosiklik lipidlerle birlikte verilmesi, STING aracılı immün hücre aktivasyonu yoluyla anti-tümör etkinliğini arttırır. Nat Biotechnol 2019;37:1174e85.

37. Luo M, Wang H, Wang Z, Cai H, Lu Z, Li Y, ve diğerleri. Kanser immünoterapisi için STING aktive edici bir nano aşı. Nat Nanoteknoloji 2017;12:648e54.

38. Wang L, Koynova R, Parikh H, MacDonald RC. Katyonik o-ikame edilmiş fosfatidilkolin türevlerinin ikili karışımlarının transfeksiyon aktivitesi: hidrofobik çekirdek, fiziksel özellikleri ve DNA dağıtım etkinliğini güçlü bir şekilde modüle eder. Biophys J 2006;91:3692e706.