Cistanches Herba'nın UPLC-QTOF/MS ve DNA Barkodlamasına Dayalı Kimyasal ve Genetik Ayrımcılığı

İletişim: emily.li@wecistanche.com

Sihao Zheng, Xue Jiang, Labin Wu, Zenghui Wang ve Linfang Huang *

Soyut

Cistanches"Çölün Ginseng'i" olarak bilinen Herba (Rou Cong Rong), özellikle yang'ı güçlendirmek için böbrek takviyesinde güç ve beslenme üzerinde çarpıcı bir iyileştirici etkiye sahiptir. Bununla birlikte, Cistanches Herba'nın iki bitki kökeni,cistanche çöl çiçeğiveCistanche tübüloza, farmakolojik etki açısından farklılık gösterir vekimyasalbileşenler. Bitki kökenini ayırt etmek içinCistanchesHerba, kombine bir yöntem sistemikimyasalvegenetik–UPLC-QTOF/MS teknolojisi ve DNA barkodlama– ilk olarak bu çalışmada kullanılmıştır. Sonuçlar, PCA ve OPLS-DA analizleri ile iki kaynağı ayırt etmek için üç potansiyel işaretleyici bileşiğin (campneosid II, cistanoside C ve cistanoside A'nın bir izomeri) elde edildiğini göstermiştir. DNA barkodlama, iki kaynağı doğru bir şekilde ayırt etmeyi mümkün kıldı. NJ ağacı, iki kökenin iki dalda toplandığını gösterdi. Bulgularımız, iki kökeninCistanchesHerba farklı sahipkimyasalkompozisyonlar vegenetikvaryasyonlar. Bu, iki kökenin rapor edilen ilk değerlendirmesidir.Cistanches Herbave bulgu kalite kontrolünü ve klinik uygulamasını kolaylaştıracaktır.

Cistanche hakkında daha fazla bilgi almak için buraya tıklayın

giriiş

Cistanches"Çölün Ginseng'i" olarak bilinen Herba (Rou Cong Rong), bitkinin kurutulmuş etli saplarından elde edilir.cistancheÇin Farmakopesi'ne (2010 baskısı) göre Deserticola YC Ma ve Cistanche tubulosa (Schrenk) Peruk ve böbrek-yin'i güçlendirmesi, yaşam özünden yararlanması ve bağırsakları rahatlatması ile popülerdir. Şu anda, Cistanches Herba, özellikle Çin'in kuzeybatısındaki kurak ve sıcak çöllerde, özellikle Sincan ve İç Moğolistan eyaletlerinde dağıtılmaktadır. Bununla birlikte, Cistanches Herba'nın iki kökeni, farmakolojik aktiviteleri vekimyasalbileşenler. Tu et al. üç kaynatma araştırdıcistanchetürleri (C. Deserticola, C. tubulosa, Cistanche salsa) ve C. tubulosa'nın Yang eksikliği olan fare modelinde en düşük etkiyi gösterdiğini buldu [1]. Zhang et al. C. Deserticola, C. tubulosa ve C. salsa arasındaki farmakolojik aktiviteyi karşılaştırmış ve bu türlerin anti-yorgunluk ve hipoksi toleransı gibi tıbbi işlevleri olduğunu, ancak aynı ölçüde olmadığını bulmuştur [2]. Önceki araştırmalar rapor ettikimyasalbileşen ve farkını belirttikimyasalbitki kökenleri için bileşen ve içerikCistanchesbitki [3]. Klinik uygulama ve pazar dolaşımına gelince, bir tonik olarak, C. tubulosa geleneksel olarak kan dolaşımını teşvik edici bir ajan olarak ve Japonya'da iktidarsızlık, kısırlık, bel ağrısı, vücut zayıflığının tedavisinde kullanılmıştır [4]–[8].

Sonuç olarak, iki kökeni ayırt etmek büyük önem taşımaktadır.CistanchesKalite kontrol ve klinik uygulama için Herba. Ancak, Cistanches Herba'nın iki kökeninin ayrımcılığına odaklanan bir araştırma bulunmamaktadır. Mikroskopi, ultraviyole ve kızılötesi algılama dahil olmak üzere birçok araştırılmış yöntem, basit dizi tekrarları yöntemi, Cistanches cinsini tanımlamak için kullanılmıştır, ancak yalnızca iki köken için değil, özellikle [9]–[20]. Burada birleşik olarak kullandıkkimyasalve moleküler tekniklerin iki kökenini ayırt etmek içinCistanchesHerba, UPLC-QTOF/MS (kuadrupol uçuş süresi kütle spektrometrisi ile birleştirilmiş ultra performanslı sıvı kromatografisi) ve DNA barkodlama. UPLC-QTOF/MS, diğer tekniklerle karşılaştırıldığında daha hızlı ve verimli bilgi sağlar. UPLC-QTOF/MS'nin yüksek seçiciliği ve duyarlılığı, hem nicel hem de nitel analizler için uygulanmasının yanı sıra, Geleneksel Çin Tıbbında metabolit analizi ve karmaşık bileşiklerin tanımlanmasıyla sonuçlanmıştır [21]–[22]. Ana bileşen analizi (PCA) ve gizli yapı diskriminant analizine ortogonal projeksiyon (OPLSDA) ayrıca potansiyel işaret bileşiklerini tanımlamak için geliştirilmiştir. Daha kolay ve daha evrensel bir moleküler markör teknolojisi olan DNA barkodlama, türleri veya cinsleri tanımlamak için bir DNA parçası kullanır. Geleneksel tanımlama yöntemlerine ve diğer moleküler markör teknolojilerine göre nesnel, daha doğru ve gerçekleştirilmesi daha kolaydır. Ayrıca, tıbbi bitkiler de dahil olmak üzere hayvanları ve bitkileri tanımlamak için DNA barkodu başarıyla uygulanmıştır [23]-[26].

Bu araştırmanın amacı, iki bitki kökeninin ayırt edilmesi için UPLC-QTOF/MS ve DNA barkodlama kombine bir bilimsel yöntem sistemi kurmaktır.Cistanchesbitki.

Malzemeler ve yöntemler

etik beyanı

Saha çalışmalarının nesli tükenmekte olan veya korunan türleri içermediğini onaylıyoruz. GPS koordinatları örnek bilgilere dahil edilmiştir, lütfen tablo 1'e bakın."

Tablo 1 Örneklericistancheçölikola ve Cistanche tubulosa.

WLMQ, Wu Lu Mu Qi şehri anlamına geliyordu; GJH, Gan Jia Hu'yu kastediyordu; HBKSEMG, Hoboksar Moğol Özerk İlçesi anlamına geliyordu; KLMY, Ke La Ma Yi şehri anlamına geliyordu; BDJLSM, Badain Jaran Çölü anlamına geliyordu; ALSZQ, Alxa Sol Bayrak anlamına geliyordu; DSX, Dong San ilçesi anlamına geliyordu; CL, Ce Le ilçesi anlamına geliyordu; MF, Min Feng ilçesi anlamına geliyordu; HT, He Tian ilçesi anlamına geliyordu.

Bitki materyalleri ve reaktifler

etli saplarıCistanchesHerba, Mayıs 2012'de İç Moğolistan, Qinghai Eyaletleri, Xinjiang Uygur Özerk Bölgesi, Çin Halk Cumhuriyeti'ndeki vahşi çöl bölgelerinden toplanmıştır (Tablo 1). Araştırma örneklerinin tamamı özel arazilerde değil, vahşi çöl bölgelerinde toplanmıştır, özel izinlerin gerekli olmadığı yerlerde. Sapların botanik kimlikleri Dr. Linfang Huang tarafından doğrulandı. Kupon örnekleri, Tıbbi Bitki Geliştirme Enstitüsü'ne yatırıldı. UPLC analizi için yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) dereceli asetonitril (Merck KGaA, Darmstadt, Almanya) ve formik asit (Tedia, ABD) kullanıldı. Deiyonize su, bir Milli-Q sistemi (Millipore, Bedford, MA, ABD) kullanılarak saflaştırıldı. Diğer tümkimyasallaranalitik dereceli idi.

örnek hazırlama

CistanchesHerba numuneleri (1.0 g, 65-ağ) bir 50-mL'lik konik şişeye aktarıldı ve 50 mL yüzde 70 metanol ilave edildi. 30 dakika beklettikten sonra oda sıcaklığında 30 dakika ultrasonikasyon (35 kHz) yapıldı. 10 dakika 000 devir/dakikada 10 dakika santrifüj edildikten sonra, süpernatan 4 derecede saklandı ve analiz için UPLC-QTOF/MS sistemine enjeksiyondan önce 0.22-um membrandan süzüldü.

UPLC-QTOF/MS

UPLC analizi için aşağıdaki sistemler/parametreler kullanıldı: Bir ikili solvent dağıtım pompası, otomatik numune alıcı ve bir Waters Empower 2 veri istasyonuna bağlı PDA dedektörü ile donatılmış Waters Acquity sistemi (Waters); ultrasonikasyon (250 W, 50 kHz, Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Zhejiang, Çin); ve bir elektronik analitik denge modeli AB135-2 (Mettler-Toledo., Greifensee, Zürih, İsviçre). Bir Waters Acquity UPLC BEH C18 kolonu (1.7 µm, 2.1×100 mm, Waters) ve bir Waters C18 koruma kolonu (aynı malzeme, sular) kullanıldı ve 30 derecede muhafaza edildi. Mobil faz, aşağıdaki gibi bir gradyan programı ile yüzde 0.1 formik asit sulu çözeltisi (A) ve asetonitril (B) idi: 0-3 dakika, yüzde 10-22 B; 3-4 dakika, yüzde 22-23 B; 4-6 dakika, yüzde 23-35 B; 6-8 dakika, yüzde 35-37 B; 8-11 dakika, yüzde 37-42 B; 11-12 dakika, yüzde 42-48 B; 0,3 mL/dk akış hızında 12–15 dakika, yüzde 48 – yüzde 50 B. Enjeksiyon hacmi 5 µL idi.

UPLC/MS analizi, negatif iyon modunda çalıştırılan bir elektrosprey iyonizasyon (ESI) kaynağı ile donatılmış bir QTOF Synapt G2 HDMS sistemi (Waters, Manchester, İngiltere) üzerinde gerçekleştirilmiştir. Desolvasyon gazı olarak N2 kullanılmıştır. Desolvasyon sıcaklığı 800 L/h akış hızında 45{{10}} dereceye ve kaynak sıcaklığı 120 dereceye ayarlanmıştır. Kılcal ve koni voltajları sırasıyla 2500 ve 40 V'a ayarlandı. Veriler, 0.1-s tarama süresi ve 0.01-s taramalar arası gecikme ile 15-dakikalık analiz süresi boyunca 50–1200 Da arasında toplandı. Çarpışma gazı olarak 7.06661023 Pa basınçta argon kullanıldı. Kütle doğruluğu ve tekrarlanabilirliği sağlamak için tüm MS verileri LockSpray sistemi kullanılarak toplandı. Lösin-enkefalinin m/z 554.2615'teki [MH]- iyonu, negatif ESI modunda kilit kütlesi olarak kullanıldı.

için UPLC-QTOF/MS verileriCistanchesPotansiyel ayırt edici değişkenleri belirlemek için herba örnekleri analiz edildi. ES ham verilerinin tepe noktası bulma, hizalama ve filtreleme, Marker Lynx uygulama yöneticisi, sürüm 4.1 (Waters, Manchester, İngiltere) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Kullanılan parametreler şu şekildeydi: alıkonma süresi (tR) 0–15 dakika, kütle 50–1200 Da, alıkonma süresi toleransı 0,02 dakika ve kütle 0.02 Da'lık tolerans Her coğrafi konumdan toplanan üç kopya numune kullanıldı (n = 3). Modeli oluşturmak için toplam 6.339 değişken kullanılmıştır.

DNA barkodlama: DNA ekstraksiyonu, PCR amplifikasyonu ve dizileme

C. Deserticola ve C. tubulosa'nın (30 mg) kurutulmuş etli gövdelerinden alınan numuneler, 30 r/s'lik bir sıklıkta 2 dakika boyunca ovalanmıştır. Üreticinin talimatlarına (Tiangen) göre DNA ekstrakte edildi. Spesifik olarak protokol, kloroformun bir kloroform: izoamil alkol (aynı hacimde 24 µl) ve izopropanol (aynı hacimde) ile tampon çözeltisi GP2 karışımı ile değiştirildiği şekilde değiştirildi. Ovuşturulan toz 1.5 ml eppendorf tüplere konuldu, 700 µL 65 derece önceden ısıtılmış GP1 ve 1 µL -merkaptoetanol ilave edilerek 10-20 s vorteks kullanılarak karıştırıldı ve 60 dakika 65 derecede inkübe edildi; 700 µL kloroform karışımı ekleme: izoamil alkol (24∶1), 5 dakika 12000 rpm'de (∼13400×g) santrifüjleyin; Süpernatantı yeni bir tüpe pipetleyin, 700 µL izopropanol ekleyin, 15-20 dakika karıştırın; Tüm karışımı döndürme kolonu CB3'e borulama ve 12000 rpm'de 40 saniye santrifüjleme; Süzüntü atılır ve 500 µL GD eklenir (kullanımdan önce kantitatif susuz etanol eklenir), 12000 rpm'de 40 s santrifüj edilir; süzüntüyü atmak ve membranı yıkamak için 700 uL PW eklemek (kullanımdan önce nicel susuz etanol ekleyerek), 12000 rpm'de 40 s santrifüjleyin; Süzüntü atılır ve 500 µL PW eklenir, 12000 rpm'de 40 s santrifüj edilir; Kalan yıkama tamponu PW'yi çıkarmak için süzüntünün atılması ve 12000 rpm'de 2 dakika santrifüj edilmesi; Döndürme kolonu CB3'ün 1,5 ml'lik temiz bir eppendorf tüpüne aktarılması ve oda sıcaklığında 3-5 dakika kurutulması; Toplam DNA'yı elde etmek için 12000 rpm'de 2 dakika santrifüjleyin. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için primerler daha önce bildirilen dizilere dayanıyordu [4], [5]. PCR reaksiyon karışımları 2-μL DNA şablonu, 8.5-μL ddH2O, 12.5-μL 2× Taq PCR Master Mix (Beijing TransGen Biotech Co., Çin), 1/{ {57}}μL ileri/geri (F/R) primerleri (2,5 μM), 25 μL'lik bir son hacimde. PCR amplifikasyonu Kress ve ark. [4]. PCR reaksiyonunun primeri, fwd PA: GTTATGCATGAACGTAATGCTC (5'-3') ve rev TH: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC (5'-3') idi. PCR ürünleri ayrıldı ve yüzde 1 agaroz jel elektroforezi ile saptandı. PCR ürünleri, üreticinin protokolü izlenerek saflaştırıldı ve doğrudan dizilemeye tabi tutuldu.

Sıra hizalama ve analizi

ITS ve ITS2 dizileri, GenBank veri tabanından toplandı. Örneklerin dizilenmesinden elde edilen diziler GenBank veri tabanına sunuldu (Erişim numaraları tablo 1'de listelendi), CodonCode Aligner 3.7.1 (CodonCode Co., ABD) ile birleştirildi ve ClustalW kullanılarak hizalandı. Kimura 2-Parametre (K2P) mesafeleri, tabanın GC içeriği ve Komşu birleştirme (NJ) ağaçları, Bootstrap yöntemi (1000 yeniden örnekleme) ve K2P modeli [27] ile MEGA 5.05 kullanılarak hesaplandı ve oluşturuldu. Barkodlama boşluğu (spesifik ve türler arası arasında oluşan boşluk bölgesigenetikvaryasyonlar) ve tanımlama verimliliği (farklı barkodları karşılaştırma için tanımlama yeteneği), Meyer ve Paulay [28] tarafından bildirilen yönteme göre çizilmiş ve hesaplanmıştır.

Sonuçlar

UPLC-QTOF/MS ile geçici tepe ataması

Farklı üretim alanlarından C. Deserticola ve C. tubulosa'nın temsili kromatogramları Şekil 1'de gösterilmektedir.CistanchesBitki örnekleri. Toplam 23 nitelikli kütle piki tespit edildi ve alıkonma süreleri ve kütle spektrumları daha önce bildirilenlerle eşleştirilerek 16 pik tanımlandı (Tablo 2) [29]–[35]. 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 21, 22 ve 23 pikleri geçici olarak cistanoside F, mussaenoside acid, cistanbuloside C1/C2, campneoside II olarak tanımlandı , campneosid II izomeri, echinacoside, cistanoside A, acteoside, isoacteoside, syringalide A-3′- -L-rhamnopyranoside, cistanoside C, 2′-acetylacteosid, osmanthusid B, cistanoside D, tubuloside B, ve sırasıyla cistancinenside A.Kimyasalbileşenlerinin öncelikle feniletanoid glikozitler (PhG'ler) olduğu belirlenirken, bir bileşik, mussaenosid asit, bir iridoid polisakaritti. PhG'ler, böbrek yetmezliğinin tedavisi, antioksidan ve nöroprotektif etkileri açısından başlıca aktif bileşiklerdir [36].

Şekil 1 C. Deserticola ve C. tubulosa'nın temsili kromatogramları.

Sol tarafta ise C. Deserticola'nın farklı yerlerden alınan kromatogramları; sağ taraf, farklı lokasyonlardan toplanan C. tubulosa'nın kromatogramlarıydı. Bu şekil, bu iki köken arasındaki farklılıkları göstermektedir.kimyasalprofiller.

Tablo 2 C. Deserticola ve C. tubulosa'dan geçici olarak tanımlanmış bileşikler.

C. Deserticola ve C. tubulosa'nın PCA'sı

PCA, farklı bitki türlerinin örneklerini ayırt etmek için kullanıldı. PCA, ikincil metabolit bileşiminin çok değişkenli verileri içindeki benzerlikleri ve/veya farklılıkları görselleştirmeyi amaçlayan denetimsiz çok değişkenli bir veri analiz yöntemidir [37]. İki bileşenli PCA modeli kümülatif olarak varyasyonun yüzde 46,04'ünü oluşturuyordu (PC1, yüzde 36,43; PC2, yüzde 9,61). Şekil 2, tür orijinine göre çizilen PCA skorlarında 24 örneğin iki gruba ayrıldığını gösterir, bu da C. Deserticola ve C. tubulosa'nın kimyasal bileşiminin önemli ölçüde farklı olduğunu gösterir.

Şekil 2 C. Deserticola ve C. tubulosa'nın PCA'sı.

Bu örnekler tür orijinlerine göre iki gruba ayrıldı, bu da C. Deserticola ve C. tubulosa arasındaki kimyasal bileşimin önemli ölçüde farklı olduğunu gösterdi.

OPLS-DA ve işaretleyici tanımlama

Potansiyeli belirlemek içinkimyasaliki türün ayırt edilmesi için belirteçler olarak, OPLS-DA'nın S grafiği oluşturuldu (Şekil 3). S grafiğinde her nokta bir tR–m/z iyon çiftini temsil eder. X ve Y eksenleri sırasıyla iyonun katkısını ve güvenini temsil eder; iyon t R–m/z çifti sıfırdan ne kadar uzaksa, bu iyonun iki grup arasındaki farka katkısı/güveni o kadar büyük olur. Böylece, 'S'nin iki ucunu işaret eden tR–m/z iyonu, her grupta en yüksek güvene sahip karakteristik işaretleri temsil eder.

Şekil 3 C. Deserticola ve C. tubulosa'nın OPLS-DA (S grafiği).

Bir çizim, bir tR–m/z iyon çiftini temsil eder. Bu kare parseller,kimyasalİşaret iyonlarının iki kaynağı ayırt ettiği bulundu. Üçüncü kadrandaki kare grafikler, C. Deserticola'ya daha yüksek katkı ve güvene sahip kimyasal marker iyonlarıydı ve birinci kadrandaki kare grafikler, C. tubulosa'ya daha yüksek katkı ve güvene sahip kimyasal marker iyonlarıydı.

OPLS-DA sonuçları, UPLC-QTOF/MS'nin C'yi ayırt etmek için kullanılabileceğini gösterdi.çöl çiçeğiC.'dentübüloza(Şek. 3). Bu grupların ayrımını kolaylaştırmak için toplam altı güvenilir ve anlamlı belirteç belirlenmiştir (Tablo 3). Üç potansiyel işaretçinin kimlikleri geçici olarak atanmıştır. Bu üç iyonla ilişkili bileşenler, geçici olarak kampneosit II, cistanosit C ve cistanosit A'nın izomerleri olarak tanımlandı. a, b ve c işaretleyici bileşikleri, a ve b'nin iyon yoğunlukları olarak iki bitki türünü ayırt etmek için kullanılabilir. C'deçöl çiçeğiC. tubulosa'dakinden daha yüksekti (Şekil 4A, 4B) ve c işareti C. tubulosa'da saptanabildi, ancak C. Deserticola'da bulunamadı (Şekil 4C).

Şekil 4 a, b ve c belirteçlerinin iyon yoğunlukları.

C. Deserticola'daki a ve b belirteç iyonlarının iyon yoğunlukları C. Tubulosa'dakinden daha yüksekti ve C. tubulosa'da belirteç iyon c saptanabildi, ancak C. Deserticola'da saptanamadı.

Tablo 3 S grafiğindeki Marer tR–m/z iyon çiftleri.

DNA barkodlama: dizi bilgisi ve tanımlama verimliliği

Sekans bilgileri Tablo 4'te gösterilmiştir. OrtalamagenetikpsbA-trnH (0.1732) uzaklığı diğer iki bölgeden (0.0740, 0.1197) önemli ölçüde daha büyüktü. psbA-trnH'nin ortalama GC içeriği (yüzde 20,64), diğer iki bölgeden daha küçüktü (yüzde 55.00, yüzde 55.00). Bu çalışmada ITS ve ITS2'nin başarı oranı elde edilmemesine rağmen, psbA-trnH bölgesi PCR amplifikasyonu ve dizilemede iyi performans gösterdi (yüzde 100, yüzde 87.23). Tanımlama verimliliği, BLAST1 analizi ve en yakın mesafe yöntemi ile sağlandı ve esas olarak barkodların başarı oranını yansıttı. psbA-trnH bölgesi, iki yönteme dayalı tanımlama verimliliğinde diğer iki barkoddan açıkça daha yüksekti. Dizilerin azlığı, ITS bölgesinin BLAST1 yöntemine göre yüzde 100 tanımlama etkinliği ve en yakın mesafe yöntemine göre 0 göstermesinin nedeni büyük olasılıkla budur.

Tablo 4 Tür tanımlaması için farklı yöntemler kullanan üç lokusun tanımlama etkinliği.

Altı parametre kullanarak genetik sapma analizi

Üç barkod kullanılarak tür içi varyasyonu ve türler arası farklılığı analiz etmek için altı parametre kullanıldı (Tablo 5). Spesifikler arası ve türler arası varyasyonlar arasındaki önemli fark, DNA barkodlarının faydasının göstergesiydi. Burada, üç barkodun minimum türler arası mesafesi, maksimum türler arası mesafeden daha yüksekti. Ayrıca, psbA-trnH bölgesinin diğer iki barkoddan daha büyük bir maksimum tür içi mesafeye ve ortalama türler arası mesafeye sahip olması, psbA-trnH bölgesinin, psbA-trnH bölgesinin iki orijin ayrımında iyi performans gösterdiğini gösterir.Cistanchesbitki.

Tablo 5 Üç barkodun türler arası spesifik sapma ve tür içi varyasyon analizi.

C. Deserticola ve C. tubulosa'yı tanımlamak için barkod boşluğunun analizi

Barkodlama boşluğu, türler arası ve türler arası dikkate değer varyasyonu sunar ve türler arası ve türler arası örnekler arasında ayrı, örtüşmeyen dağılımlar gösterir. Bu çalışmada (Şekil 5), mesafe aralığı 0–0.45'e ayarlanmıştır, çünkü psbA-trnH'nin C. Deserticola ve C. tubulosa arasındaki en büyük K2P mesafesi { yakın olmuştur. {11}}.45. Üç barkod, tür içi ve türler arası varyasyon dağılımlarında belirgin boşluklar sergiledi. Ayrıca, psbA-trnH boşluğu diğer iki barkoddan önemli ölçüde daha büyüktü. Bu nedenle, psbA-trnH bölgesi, iki kaynağı ayırt etmek için ideal bir barkod olabilir.Cistanchesbitki.

Şekil 5 Üç barkodda türler arası farklılık ve türler arası varyasyonun nispi dağılımı.

ITS2, ITS, psbA-trnH'nin üç barkodu, K2P'ye dayalı olarak C. Deserticola ve C. tubulosa arasındaki türler arası farklılık ve tür içi varyasyonun nispi dağılımı için analiz edildi.genetikmesafe.

Komşu birleştirme (NJ) ağacı

Bir NJ ağacı, türler arasındaki ilişkiyi gösterir ve kümelenmelerinin belirlenmesini kolaylaştırır. Bu çalışmada, K2P modeline dayalı olarak üç barkodlu NJ ağacı oluşturulmuştur (Şekil 6). Sonuçlar, iki kökeninCistanchesHerba ayrı ayrı iki kola ayrıldı. Böylece, NJ ağacı arasında açıkça ayırt edilir.C. Deserticola ve C. tubulosa.

Şekil 6 Üç barkodlu C. Deserticola ve C. tubulosa'nın NJ ağacı.

Üç barkodlu C. Deserticola ve C. tubulosa'nın NJ ağacı yapıldı. Her dal için önyükleme puanları (1000 tekrar) gösterilir (Yüzde 50'den büyük veya buna eşit). C. Deserticola ve C. tubulosa açıkça iki kola ayrıldı.

Tartışma ve sonuçlar

CistanchesHerba, Asya topluluğunu beslemek için yaygın olarak kullanılan önemli bir tıbbi malzemedir [38]. Bununla birlikte, Cistanches Herba'nın iki kaynağı olan C. Deserticola ve C. tubulosa, sırasıyla farklı kimyasal bileşimlere ve farmakolojik aktivitelere sahiptir. Aynı zamanda, iki kaynak klinik uygulama ve emtia piyasasında farklılık gösterir. sınıflandırmasıcistancheCistanches Herba için kaynak kıtlığı ve özel yetiştirme ortamı nedeniyle kafası karışık ve büyük ikameler ve zina maddeleri pazara sızıyor. Cistanche Cinsinin dört tür ve bir varyant içerdiği kabul edilmektedir: C. Deserticola, C. tubulosa, C. Sinensis, C. salsa ve C. salsa var. albiflora [39]. Japonya'daki araştırmacılar, Cistanches Herba'nın kökenini C. salsa [40]–[43] olarak kabul ederken, Tu [44]–[46] tarafından C. Deserticola olarak tanımlandı. Bu nedenle, Cistanche sınıflandırmasında karıştırılmaktadır ve Cistanches Herba'nın iki kökenini ayırt etmek zordur.

Kalite kontrolü için geleneksel yöntemlerCistanchesHerba, morfolojik tanımlama [47], [48], mikroskobik tanımlama [49] ve TLC (İnce Katmanlı Kromatografi) [50], [51], FTIR (Fourier Transform Kızılötesi Spektroskopisi) [14], HPLC (Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi) ) [52], [53]. Morfolojik ve mikroskobik yöntemler, morfolojik ve mikroskobik özelliklerde büyük farklılıklara sahip farklı cins veya familyalardan türleri kolaylıkla ayırt edebilirken, kardeş türleri ayırt etmek zordur. TLC ve FTIR, farklı kimyasal bileşimlere sahip türleri açıkça ayırt edebilirken,kimyasalbileşen ve içerik. HPLC, esas olarak farklı türlere sahip türleri ayırt etmek için kullanılır.kimyasaleleman içerikleri, bununla birlikte, analiz süresi daha uzundur ve UPLC'ye kıyasla duyarlılık nispeten daha düşüktür. Buna bağlı olarak, UPLC-QTOF/MS teknolojisi, kimyasal bileşimi belirlemede diğer kimyasal yöntemlere göre daha hızlı ve daha doğruydu. Moleküler tanımlama yöntemleri,genetikSDS-PAGE (Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi) [54], AFLP (Güçlendirilmiş Parça Uzunluğu Polimorfizmi) [55], [56] gibi varyasyonlar. Ancak, bu moleküler yöntemlerin kullanımı kolay değildir ve evrensel değildir. Buna uygun olarak, DNA barkodlama, türleri diğer moleküler yöntemlerden daha evrensel, hızlı ve doğru bir şekilde ayırt edebilir. Aynı cins ve yakın türler içingenetikilişki, bu yöntemler tek başına tanımlamada iyi performans göstermeyebilir. Burada, C. Deserticola ve C. tubulosa'yı tanımlamak için UPLC-QTOF/MS ve DNA barkodunu birleştirdik ve ayrımcılığa izin verecek kimyasal ve moleküler belirteçleri değerlendirdik. 23 nitelikli kütle tepe noktası tespit edildi ve UPLC-QTOF/MS kullanılarak 16 tanesi tanımlandı ve ilk olarak PCA ve OPLS-DA analizi ile iki kaynağın ayrımını kolaylaştırmak için üç potansiyel işaretleyici bileşik bulundu. Ayrıca, DNA barkodlama teknolojisi ile iki kaynağı ayırt etme yetenekleri açısından dört gösterge değerlendirildi: Tanımlama verimliliği, genetik verimlilik, barkodlama boşluğu ve NJ ağaç analizi. psbA-trnH bölgesi, C. Deserticola ve C. tubulosa'yı ayırt etmek için uygun bir DNA barkodu olarak desteklendi.

Sonuç olarak, öncelikle yeni bir moleküler vekimyasaliki kökeninde ayrım ve kalite kontrolü için analiz-kombine yöntemCistanchesbitki. DNA barkodu iki kaynağı ayırt edebilirgenetiktürleri evrensel ve doğru bir şekilde çeşitlendirmek ve doğrulamak; UPLC-QTOF/MS teknolojisi, tıbbi malzemelerin kalitesini hızlı ve doğru bir şekilde değerlendirmek için kimyasal bileşimi analiz edebilir. Kombine DNA barkodlama yöntemi ve UPLC-QTOF/MS teknolojisi, birden fazla tıbbi malzeme kaynağının daha doğru ve bilimsel olarak tanımlanmasını garanti eder ve sınıflandırmada diğer kafa karıştırıcı türlerin veya cinslerin tanımlanması için bir yöntem olarak hizmet edebilir.

Finansman Beyanı

Çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (No. 81274013, web sitesi:www.nsfc.gov.cn) sağlanan hibelerle desteklenmiştir. Finansörlerin çalışma tasarımında, veri toplamada ve analizde, yayınlama kararında veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Referanslar

1. Tu PF, Lou ZC, Li SC, Wang CS, Jiang WY, et al. (1996) Üç farklı bitki türünün etkinliğini güçlendiren böbrek besleyici ve yang üzerine karşılaştırmamesafeler. Çin tıbbi malzemeleri dergisi 19: 420–421. [Google Akademik]

2. Zhang Y, Wu H, Wang SN, Zheng HC (1994) Üç farklı bitki özsuyu türünün böbrek besleyici ve yang güçlendirme fonksiyonlarının karşılaştırılması. Çin Çin Materia Medica Dergisi 19: 169-171. [PubMed] [Google Akademik]

3. Lei L, Song ZH, Tu PF (2003) Araştırmalardaki gelişmelerkimyasalbitkilerde bulunan bileşenlercistancheHoffing. ve Bağlantı. Çin Geleneksel ve Bitkisel İlaçları 34: 473-476. [Google Akademik]

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S, et al. (2006) Cistanche tubulosa'dan vazorelaksan aktiviteye sahip feniletanoid oligoglikozitler ve açillenmiş oligoşekerler. Bioorg Med Kimya 14: 7468-7475. [PubMed] [Google Akademik]

5. Shimoda H, Tanaka J, Takahara Y, Takemoto K, Shan SJ, et al. (2009) Bir Çin geleneksel ham ilacı olan Cistanche tubulosa özütünün farelerde hipokolesterolemik etkileri. J Chin Med 37 miyim: 1125-1138. [PubMed] [Google Akademik]

6. Yamada P, Iijima R, Han J, Shigemori H, Yokota S, et al. (2010) İzole edilen ateozidin inhibitör etkisicistancheüzerinde tübülozkimyasalRBL-2H3 ve KU812 hücreleri tarafından mediatör salınımı ve inflamatuar sitokin üretimi. Planta Med, 1512-1518. [PubMed]

7. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Matsuda H, et al. (2010) Çöl bitkisinden hepatoprotektif aktiviteye sahip asillenmiş feniletanoid oligoglikozitlercistanchetübüloza. Bioorg Med Kimya 18: 1882-1890. [PubMed] [Google Akademik]

8. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, et al. (2010) Cistanche tubulosa'dan iridoid ve asiklik monoterpen glikozitler, kankanositler L, M, N, O ve P. Kimya Eczacı Boğası (Tokyo) 58: 1403–1407. [PubMed] [Google Akademik]

9. He YP, Yin ZZ, Tu PF, Lou ZC (1997) Herba cistanchis'in ticari ham ilacının tanımlanması ve araştırılması. Çin tıbbi malzemeleri dergisi 20: 117-122. [PubMed] [Google Akademik]

10. Zhu SY (2001) Karışık bir tür olan Cistanche tubulosa'nın farmakognostik tanımlamasıcistancheçölikola. Çin tıbbi malzemeleri dergisi 24: 24-25. [PubMed] [Google Akademik]

11. Xu XQ, Ni H, Wei HY, Jia XG, Zhang BG, et al. (2013) Xin Jiang'daki üç bitki saksısının mikroskobik tanımlaması. Shizhen Tıp ve Materia Araştırması 24: 881-883. [Google Akademik]

12. Zhang M, Fu XL, Wang SY (2004) Dijital görüntüleme tekniği ile ticari Herba Cistanches'in mikroskobik tanımlaması. Çin tıbbi malzemeleri dergisi 27: 400-402. [PubMed] [Google Akademik]

13. Li JS, Yao ZQ, Yu MX (2000) Herbanın tanımlanması üzerine çalışmasarnıçlarve zina yapanlar. Shizhen Tıp ve Materia Araştırması 11: 317–318. [Google Akademik]

14. Xu R, Sun SQ, Liu YG, Chen J, Liu TN, et al. (2010) Farklı herba kaynakları üzerinde FTIR ve 2D-IR spektroskopik çalışmalarsarnıçlar. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 30: 897-900. [PubMed] [Google Akademik]

15. Chen J, Sun SQ, Xu R, Liu YG, Yu J, et al. (2009) Boschniakla rossica ve Cynomorium songaricum'dan Cistanche Deserticola'nın FTIR ve iki boyutlu korelasyon IR spektroskopisi kullanılarak tanımlanması. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 29: 1502–1507. [PubMed] [Google Akademik]

16. Yang HC, Xia PX, Huang JX, Yuan HZ (2008)cistancheçölikola. Eczacılık Bakım ve Çözüm 8: 255–257. [Google Akademik]

17. Xie JN, Zhao MB, Wu FW, Tu PF (2005) HPLC ile Cistanche Deserticola'nın kromatografik parmak izi. Çin Geleneksel ve Bitkisel İlaçları 36: 268-271. [Google Akademik]

18. Han JP, Song JY, Liu C, Chen J, Qian J, et al. (2010) Tanımlanmasıcistanchetürler (Orobanchaceae) plastid psbA-trnH intergenik bölgenin dizilerine dayalıdır. Acta Pharmaceutica Sinica 45: 126-130. [PubMed] [Google Akademik]

19. Shi HM, Wang J, Wang MY, Tu PF, Li XB (2009) Cistanche Türlerinin TanımlanmasıKimyasalve Basit Diziler Arası Tekrar Parmak İzi. Biol. Eczacılık Boğa. 32: 142–146. [PubMed] [Google Akademik]

20. Han LF, Yiadom MB, Liu EW, Zhang Y, Li W, et al. (2012) Feniletanoid Glikozitlerin Yapısal Karakterizasyonu ve TanımlanmasıCistanchesUHPLC/ESI-QTOF-MS/MS tarafından Deserticola YC Ma. Fitokimyasal analiz 23: 668–676. [PubMed] [Google Akademik]

21. Jiang X, Huang LF, Wu LB, Wang ZH, Chen SL (2012) UPLC-QTOF/MS Geleneksel İşlenmiş Coptis Chinensis Franch'ta Alkaloidlerin Analizi. Kanıta Dayalı Tamamlayıcı Alternatif Med 2012: 942384. [PMC ücretsiz makale] [PubMed] [Google Akademik]

22. Wu LB, Jiang X, Huang LF, Chen SL (2013) Yenidünya (Eriobotrya japonica) Yaprağının Ultra-Performanslı Sıvı Kromatografisi- Kuadrupol Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi ve Kemometri ile Birleştirilmiş İşleme Teknolojisinin İncelenmesi. PLoS ONE 8: e64178. [PMC ücretsiz makale] [PubMed] [Google Akademik]

23. Hebert PD, Ratnasingham S, Waard JR (2003) Hayvan yaşamını barkodlama: yakından ilişkili türler arasında sitokrom c oksidaz alt birim 1 ayrışması. Proc. R. Soc. Londra. B. 270 Ek 1S96–99. [PMC ücretsiz makale] [PubMed] [Google Akademik]

24. Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, Waard JR (2003) DNA barkodları aracılığıyla biyolojik tanımlamalar. Proc Biol Sci., 270 313: 321. [PMC ücretsiz makale] [PubMed] [Google Akademik]

25. Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH (2005) Çiçekli bitkileri tanımlamak için DNA barkodlarının kullanımı. Proc Natl Acad Sci. 102: 8369-8374. [PMC ücretsiz makale] [PubMed] [Google Akademik]

26. Chen S, Yao H, Han J, Liu C, Song J, et al. (2010) Tıbbi bitki türlerinin tanımlanması için yeni bir DNA barkodu olarak ITS2 bölgesinin doğrulanması. PLoS One 5: e8613. [PMC ücretsiz makale] [PubMed] [Google Akademik]

27. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, et al. (2011) MEGA5: Moleküler EvrimselGenetikMaksimum Olabilirlik, Evrimsel Uzaklık ve Maksimum Parsimony Yöntemlerini Kullanan Analiz. Mol Biol Evol 28: 2731-2739. [PMC ücretsiz makale] [PubMed] [Google Akademik]

28. Meyer CP, Paulay G (2005) DNA barkodlama: kapsamlı örneklemeye dayalı hata oranları. PLoS Biol 3: e422. [PMC ücretsiz makale] [PubMed] [Google Akademik]

29. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Cistanchis Herba'nın Bileşenleri Üzerine Çalışmalar. IV. İki Yeni Fenilpropanoid Glikozit, Cistanosides C ve D'nin İzolasyonu ve Yapıları. Chem Pharm Bull 32: 3880–3885. [Google Akademik]

30. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Cistanchis Herba'nın Bileşenleri Üzerine Çalışmalar. VI. Yeni Bir İridoid Glikositin İzolasyonu ve Yapıları, 6-Deoxyeatalpol. Kimya Eczacı Boğa 33: 3645–3650. [Google Akademik]

31. Jiang Y, Li SP, Wang YT, Chen XJ, Tu PF (2009) Herba'nın FarklılaşmasıCistanchesyüksek performanslı sıvı kromatografisi-diyot dizisi algılama-kütle spektrometrisi ile parmak izi ile. Kromatografi Dergisi A 1216: 2156–2162. [PubMed] [Google Akademik]

32. Han LF, Boakye YM, Liu E, Zhang Y, Li W, et al. (2012) UHPLC/ESI–QTOF–MS/MS ile Cistanches Deserticola YC Ma'dan Feniletanoid Glikozitlerin Yapısal Karakterizasyonu ve Tanımlanması. Phytochem Anal 23: 668–676. [PubMed] [Google Akademik]

33. Li L, Tsao R, Yang R, Liu CM, Young JC, et al. (2008) Yüksek hızlı ters akım kromatografisi ile Cistanche Deserticola'dan feniletanoid glikozitlerin izolasyonu ve saflaştırılması. Gıda Kimyası 108: 702–710. [PubMed] [Google Akademik]

34. Lu DY, Zhang JY, Yang ZY, Liu HM, Li S, et al. (2013) Kantitatif analiziCistanchesHerba, diyot dizisi tespiti ile birleştirilmiş yüksek performanslı sıvı kromatografisi ve kemometrik yöntemlerle birleştirilmiş yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi kullanır. J Eylül Bilim 26: 1945–1952. [PubMed] [Google Akademik]

35. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Cistanchis Herba'nın Bileşenleri Üzerine Çalışmalar. V. İki Yeni Fenilpropanoid Glikozitin İzolasyonu ve Yapıları, Cistanoside E ve F. Chem Pharm Bull 33: 1452–1457. [Google Akademik]

36. Jiang Y, Tu PF (2009) AnalizikimyasalCistanche türlerindeki bileşenler. J Kromatogr A 1216: 1970–1979. [PubMed] [Google Akademik]

37. Masssart DL, Vandeginste BGM, Deming SN, Michotte Y, Kaufman L (1988) Bilim ve teknolojide veri işleme. Kemometri: bir ders kitabı.

38. Huang LF, Zheng SH, Wu LB, Jiang X, Chen SL (2014)cistancheçölikola dayalıkimyasalkompozisyon ve moleküler özellikler. SCIENTIA SINICA Özgeçmiş 44: 318–328. [Google Akademik]

39. Tu PF, Jiang Y, Guo YH (2011) bitki sarnıçları araştırma ve endüstri geliştirme. Çin ilaç dergisi 46: 882-887. [Google Akademik]

40. Kobayashi H, Oguchi H, Takizawa, Miyase T, Ueno A, et al. (1987) Yeni feniletanoid glikozitlercistanchetubulosa (SCHRENK) Kanca. f. I. Kimya Eczacı Boğa 35: 3309-3314. [Google Akademik]

41. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Cistanchis herba'nın bileşenleri üzerine araştırmalar III. Kimya Eczacı Boğa 32: 3009–3014. [Google Akademik]

42. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Cistanchis herba IV'ün bileşenleri üzerine araştırmalar. Kimya Eczacı Boğa 32: 3880–3885. [Google Akademik]

43. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Cistanchis herba VI'nın bileşenleri üzerine çalışmalar. Kimya Eczacı Boğa 33: 3645–3650. [Google Akademik]

44. Moriya A, Tu PF, Karasawa D, Arima H, Deyama T, et al. (1995) Cistanchis Herba'nın (I) farmakognostik çalışmaları. Nat Med 49: 383-393. [Google Akademik]

45. Moriya A, Tu PF, Karasawa D, Arima H, Deyama T, et al. (1995) Cistanchis Herba'nın (II) farmakognostik çalışmaları. Nat Med 49: 394-400. [Google Akademik]

46. ​​Liu XM, Jiang Y, Sun YQ, Xu XW, Tu PF (2011)kimyasalbileşenlericistancheçölikola. Çene Eczanesi J 46: 1053-1058. [Google Akademik]

47. Gu XY, Wang X (2013) RouCongRong'un Orijinal Bitkileri ile Karışık Çeşitler Arasındaki Tanımlama. Batı Geleneksel Çin Tıbbı Dergisi 26: 17-18. [Google Akademik]

48. Zhang HJ, Ding XF Cistanche Deserticola ve zina maddelerinin tanımlanması. Shizhen Tıp ve Malzeme Araştırması, 183.

49. Xu XQ, Ni H, Wei HY, Jia XG, Zhang BG, et al. (2013) Sincan eyaletinden gelen üç çeşit Cistanche'nin mikroskobik tanımlama araştırması. Shizhen Tıp ve Materia Araştırması 24: 881-883. [Google Akademik]

50. Huang M, Liu G (2004)cistancheDeserticola ve Cynomorium songaricum. Geleneksel Çin tıbbı HuBei dergisi. 26: 54-55. [Google Akademik]

51. Liu YG, Xu R, Wang W, Liu TN, Chen J (2009) Cistanche Deserticola YC Ma'nın kalite kontrolü ve değerlendirilmesi üzerine araştırma ilerlemesi. Dünya Bilimi ve Teknolojisi - Geleneksel Çin Tıbbının Modernizasyonu. 11: 439-444. [Google Akademik]

52. Ma ZG (2011) İşlenmiş Cistanche Sinensis G.Beck ve Herba Cistanches'in HPLC parmak izleriyle farklılaştırılması. Çene. Eczacılık J. 46: 899–902. [Google Akademik]

53. Huang LX, Wang YE, Shi MH, Jia XG, Xie X, et al. (2011) HPLC parmak izi araştırmasıcistanchetübüloza. Xinjiang geleneksel Çin tıbbı dergisi. 29: 54-56. [Google Akademik]

54. Chen P, Guo YH, Wang BM, Zhai ZX (2006) Cistanche Hoffing'in dört bitkisindeki çözünür proteinlerin SDS-PAGE. Et Bağlantısı. Çin Geleneksel ve Bitkisel İlaçları 37: 1399-1402. [Google Akademik]

55. Xu R, Chen J, Chen SL, Liu TN, Na R (2007) Ekili ve yabani Cistanche çöllerinde germplazm kaynağının çeşitliliği üzerine ÇKUP analizi. Çin Geleneksel ve Bitkisel İlaçları 38: 1703-1707. [Google Akademik]

56. Gan XY, Li M, Ma HA, Song YX (2011)cistancheÇKUP moleküler belirteçleri kullanılarak çölikola YCMa. Kuzey Bahçe Bitkileri, 141-143.

PLoS ONE'dan makaleler burada Public Library of Science'ın izniyle sağlanmaktadır.

PLoS Bir. 2014; 9(5): e98061.

22 Mayıs 2014 tarihinde çevrimiçi yayınlandı. doi: 10.1371/journal.pone.0098061

PMCID: PMC4031141

PMID: 24854031