Neferinin RBL-2H3 Hücreleri Üzerindeki Anti-Alerjik ve Anti-inflamatuar Etkileri

Lütfen iletişime geçinoscar.xiao@wecistanche.comdaha fazla bilgi için

Soyut:Mast hücreleri, atopik dermatit ve sedef hastalığı dahil olmak üzere cilt alerjisi ve iltihaplanmasında çok önemli bir rol oynar. Geçmişte, referansın cilt üzerinde anti-inflamatuar ve anti-aging etkileri olduğu bulunurken, mast hücreleri üzerindeki etkisi henüz detaylı olarak çalışılmamıştır. Bu çalışmada, referansın anti-alerjik ve inflamatuar etkilerini incelemek için mast hücreleri (RBL-2H3 hücreleri) ve fare modelleri kullandık. İlk olarak, referansın mast hücrelerinin degranülasyonunu ve sitokinlerin ekspresyonunu inhibe ettiğini bulduk. Ek olarak, mast hücreleri A23187/phorbol 12-miristat-13-asetat (PMA) tarafından uyarıldığında, hücre içi kalsiyum yükselmesinin referans olarak inhibe edildiğini gözlemledik. MAPK/NF-KB yolunun fosforilasyonu da referans ön işleme tabi tutularak azaltılır. In vivo çalışmaların sonuçları, referansın dinitroklorobenzenin (DNCB) neden olduğu dermatit ve mast hücre infiltrasyonunun görünümünü iyileştirebileceğini göstermektedir. Ayrıca ciltteki bariyer proteinlerin ifadeleri de yenilenir.sardunyaSon olarak, referansın 48/80 bileşiğinin neden olduğu çizilme davranışını azaltabileceği bulundu. Birlikte ele alındığında, sonuçlarımız referansın çok iyi bir anti-alerjik ve anti-inflamatuar doğal ürün olduğunu göstermektedir. Mast hücreleri üzerindeki etkisi farmakolojik mekanizmasına katkıda bulunur.

Anahtar Kelimeler:referans; doğal ürün; mast hücresi; dermatit; kaşıntı

Daha fazla bilgi için lütfen buraya tıklayın

1. Giriş

Birçok çalışma, alerjik hastalıkların sadece doğuştan gelen bağışıklık aktivasyonunun değil, aynı zamanda adaptif aktivasyonun da sonucu olduğunu doğrulamıştır. Bunlar arasında mast hücreleri, alerjik rinit, astım ve alerjik dermatit gibi çeşitli alerjik hastalıklarda çok önemli bir rol oynar. Mast hücreleri, hücre zarlarında IgE reseptörlerini (FceRI) eksprese eder ve FceRI reseptörleri, IgE antikorları için yüksek bir afiniteye sahiptir [1,2]. Antijene özgü IgE, FceRI'ye bağlandığında, bir etkileşim meydana gelir ve bir alerjik reaksiyon meydana gelir. FceRI'nin agregasyonu, reseptör tirozin kinazları aktive edebilir, akış aşağı reaksiyonları başlatabilir ve çeşitli anahtar proteinlerin (mitojenle aktive olan protein kinaz; MAPK'ler gibi) fosforilasyonunu teşvik edebilir, sonuçta kalsiyum iyonlarının akışına (Ca2 plus) yol açar. mast hücre degranülasyonunda anahtar olay [3].AvustralyaAktive edilmiş mast hücreleri, kimyasal aracıları degranüle eder ve serbest bırakır. Alerjik reaksiyonlarda kullanılan bu kimyasal aracılar iltihaplanmaya neden olabilir [4], bu nedenle alerjik semptomların tedavisi mast hücre degranülasyon inhibitörlerini içerir. Bu nedenle, IgE aracılı mast hücre degranülasyonunun inhibisyonu, alerjik hastalıkları önlemek ve tedavi etmek için yeni bileşikleri tanımlamak için sıklıkla kullanılır. Anti-dinitrofenil (DNP)IgE antikorlarının ve antijenlerinin, ani aşırı duyarlılığın tipik bir in vivo modeli olarak ve anti-antijenik alerjilerin potansiyeli için bir araştırma ilacı olarak pasif deri aşırı duyarlılığı (PCA) reaksiyonlarını indükleyebildiği tespit edilmiştir [5,6]. ]. Ek olarak, mast hücre degranülasyonu, bileşikler 48/80 ve A23187 gibi immün olmayan uyarıcılardan da kaynaklanabilir. A23187 kalsiyum iyonoforunun, granüllerinden histamin gibi önceden oluşturulmuş aracıların salınmasıyla mast hücre salgısını uyardığı uzun zamandır bilinmektedir, örnek teşkil etmektedir [4]Bileşik 48/80, p-metoksi-N-metilfenetilamin'in karışık bir polimeridir. mast hücrelerinin bağımsız stimülasyonu için yaygın olarak kullanılan formaldehit ile çapraz bağlanır [7,8]Bu nedenle, alerjik reaksiyonların mekanizmasını incelemek için reaktifler olarak uygun miktarlarda bileşik 48/80 ve A23187 yaygın olarak kullanılmıştır. İstatistiksel değerlendirmelere göre, nüfusun yaklaşık yüzde 15-20'ü atopik dermatitten muzdarip. Bu hastalıktan muzdarip olan çocuklar veya yetişkinler, uygun tedavi olmaksızın atopik dermatit, hastalarda psikolojik sıkıntıya neden olabilir ve aile ve sosyal sağlık maliyetlerini yükleyebilir [9]. Ne yazık ki, alerjik dermatiti tedavi etmek için uygun bir tedavi yöntemi yoktur. Mevcut tedavi seçenekleri hala hastalığa neden olan alerjenlerden kaçınmaktadır ve sürekli steroid kullanımı altın standart tedavidir. Kaçınılmaz alerjenler ve ilaçların yan etkileri, yeni terapötik ilaçların acil olarak geliştirilmesine yol açmıştır. Şifalı bitkilerden ve bitkilerden izole edilen doğal bileşikler, enflamatuar hastalıkları önlemek ve tedavi etmek ve alerjik rahatsızlıkları olan hastaların yaşam kalitesini iyileştirmek için potansiyel terapötik ajan kaynaklarıdır.

Cistanche yaşlanmayı geciktirebilir

Referans, Nelumbo nucifera bitkisinin lotus çekirdeğinden (tohumun embriyosu) gelir ve önemli bir bisbenzilizokinolin alkaloididir. Referansın birçok hastalıkta anti-kanser, antioksidan, anti-inflamatuar ve nöroprotektif etkiler gibi çok çeşitli farmakolojik özelliklere sahip olduğuna dair kanıtlar vardır [10-15].cistanche faydalarıKhan ve ark. referansın, insan keratinositlerinde ve fibroblastlarında ROS ve malondialdehit (MDA) seviyelerinde UV aracılı artışı engelleyerek anti-fotoyaşlanma etkileri ürettiğini bulduk. dermatit veya diğer ciltle ilgili inflamatuar hastalıklar[18]. Bununla birlikte, referansın mast hücrelerinde anti-cilt alerjisi etkisi gösterip göstermediği hala belirsizliğini koruyor. Bu çalışmada, insan mast hücre dizileri (RBL-2H3 hücreleri) ve bir bileşik 48/80- ve DNCB ile indüklenen anafilaksi kullanarak mast hücre aracılı alerjik hastalıklar üzerinde referansın etkilerini araştırmayı amaçladık. fare modeli.

En iyi şartlara tabidir. Mevcut kanıtların kanıtları, amplia gama de propiedades farmacológicas, como efectos anticancerígenos, antioksidanlar, antiinflamatorios y nöroprotektörler, en çok enfermedades [10-15]. Beneficios de la cistanche Khan ve ark. Encontró que la Referencia, efectos anti-fotoenvejecimiento al inhibir el aumento de los niveles de ROS ve malondialdehído (MDA) mediado por UV en queratinocitos y fibroblastos humanos [16,17] Recientemente, potansiyel parasal referanslar için alternatifler üretir. de atópica dermatitis ve otras enfermedades inflamatorias relacionadas con la piel[18]. Günah ambargosu, sigue siendo incierto si la referencia tiene un efecto contra la alergia cutánea en los mastocitos. En este estudio, en este estudio, nuestro objetivo fue Investigar los efectos de referencia en las enfermedades alérgicas mediadas por mastocitos, utilizando líneas de mastocitos humanos (células RBL-2H3) ve 48'in en iyi modelleriyle uyumlu 48 .

2. Sonuçlar

2.1.Sıçan Mast Hücrelerinde Neferin Sitotoksisite Testi(RBL-2H3)

Histamin salgılayan bir mast hücre analoğu olan sıçan bazofilik lösemi (RBL)-2H3 hücreleri, mast hücre aracılı inflamasyonun etkilerini incelemek için uygun hücreler olduğundan [19], bu hücreleri anti-alerjik araştırmak için kullandık. referans etkileri. İlk olarak, referansın mast hücrelerinde sitotoksisite üretip üretemeyeceğini test ettik. Hücreler, 24 saat boyunca 1 ila 30 μM referansla ön işleme tabi tutulduğunda, hücrelerin hücre canlılığı, referansın tedavisinden etkilenmeyecektir (Şekil 1).

2.2.Neferin Farklı Aktivatörler Tarafından Uyarılan RBL-2H3'ün Degranülasyon Etkisini Azaltır

RBL-2H3 hücreleri yaygın olarak in vitro degranülasyon çalışmaları için kullanılır [20-22]RBL-2H3 hücrelerinin anti-dinitrofenol (DNP)IgE ve DNP-konjuge insan serum albümini ile uyarılması (HSA) degranülasyonu tetikler. Ek olarak mast hücrelerinin, bileşik 48/80 ve kalsiyum iyonofor A23187 gibi sentetik bileşiklere yanıt olarak degranüle olduğu bilinmektedir ve bu bileşikler, in vitro alerji tepkilerinin mekanizmalarının doğrudan çalışmaları için uygun reaktifler olarak kullanılmıştır [23, 24]. Sonuçlar, aktivatör tarafından aktive edilmeyen RBL-2H3 sitoplazmasının sınırlı salgı granülleri içerdiğini gösterdi.cistanche kolesterolReferans （10μM）'nin tek başına tedavisi, RBL-2H3'ün aktivitesini etkilemedi (Şekil 2A, B). Bununla birlikte, bileşik 48/80, A23187 ve anti-DNP/IgE artı DNP/HSA dahil olmak üzere farklı aktivatörlerin eklenmesi, sitoplazmayı salgı granülleri ile açıkça doldurdu. Elektron mikroskobu altında sitoplazmada çok sayıda salgı granülü olduğu ve hatta bazı salgı granüllerinin hücre zarı ile birleşerek degranülasyona yol açtığı görülebilir (Şekil 2C-E). Referans 10 uM ile ön işlemden sonra sitoplazmadaki salgı granülleri önemli ölçüde azaldı (Şekil 2F-H). Bu sonuçlar, referansın, aktivatör tarafından uyarılan RBL-2H3'ün aktivasyonunu ve degranülasyonunu etkili bir şekilde engelleyebileceğini göstermektedir.

2.3.Neferin, PMA/A'yı Engeller23187-RBL'de İndüklenen Hücre İçi Kalsiyum Yükselmesini-2H3

Kalsiyum iyonları, hücre aktivasyon sürecinde ikincil haberci rolünü oynar. A23187, kalsiyum iyonlarının hücre zarlarından penetrasyonunu arttırmanın ve mast hücrelerinin aktivasyonunu uyarmanın en etkili yoludur. Phorbol miristat asetat (PMA), A23187'nin etkisini arttırmak için protein kinaz Cand'ı aktive edebilir ve hücre içi kalsiyum iyonlarını artırabilir. Mast hücrelerinde kalsiyum iyonlarındaki artış, mast hücrelerinin degranülasyonunu etkilemesi ve daha fazla inflamatuar sitokin ve kemokin salması için mast hücre aktivasyonunun indüklenmesinde de önemli bir faktör olarak kabul edilmiştir.cistanche Deserticola yan etkileri,Bu nedenle, bu çalışma, referansın iltihabı engellediğinde RBL-2H3'teki kalsiyum iyonu konsantrasyonunu engelleyip engelleyemeyeceğini keşfetmeye çalıştı. Deney grubu, 20 dakika boyunca referans ön muamelesi olan veya olmayan olarak ayrıldı ve RBL-2H3'ü uyarmak ve aktive etmek için 1 mM CaClz ve PMA/A23187 eklendi. Deneysel sonuçlar, RBL-2H3'ün farklı referans konsantrasyonları ile tek başına işlenmesinin hücre içi kalsiyum iyonu konsantrasyonundaki artışı etkilemediğini gösterdi. PMA/A23187-indüklenen Ca2t giriş grubunda, hücre içi kalsiyum iyonu konsantrasyonu önemli ölçüde arttı. RBL-2H3 hücreleri, （3 μM ve 10 μM） referansıyla 20 dakika süreyle ön işleme tabi tutuldu ve kalsiyum iyonu konsantrasyonu önemli ölçüde azaldı (Şekil 3).

2.4.Neferin, PMA/A23187'de Proinflamatuar Sitokinlerin mRNA Ekspresyonunu RBL Tarafından Uyarılmış-2H3 Azalttı

Cildin bağışıklık tepkisi vücuttaki mast hücrelerinin sayısını artıracak ve mast hücreleri daha sonra proinflamatuar sitokinler üretecek ve hastalığın ilerlemesini hızlandıracaktır. Pro-inflamatuar sitokinler, özellikle TNF-a, IL-6, IL-1 ve IL-8 sadece inflamasyonu indüklemekle kalmaz aynı zamanda lökosit infiltrasyonu, granülom oluşumu ve doku fibrozisine de neden olur. PMA/A23187, mast hücreleri üzerinde etki eder ve onları IL-16, IL-6, TSLP ve TNF- üretmeye teşvik ederek alerjiye bağlı iltihaplanmaya neden olur. Bu nedenle, referansın IL-1 , IL{{'nin mRNA ifadesini aşağı regüle edip edemediğini saptamak için RBL-2H3'ü 20 dakika referansla ön işleme tabi tuttuk ve 6 saat boyunca PMA/A23187 ile uyardık. 19}}, TSLP ve TNF-a. Sonuçlar, yalnızca referansla tedavi edilen grupta sitokin mRNA'sının ekspresyonunun etkilenmediğini ve PMA/A23187 ile inflamasyonu indükleyen grupta mRNA ekspresyonunun önemli ölçüde arttığını gösterdi. Referans ile tedavi edilen grupta IL-1, IL-6, TSLP ve TNF-a'nın mRNA ekspresyon seviyelerinin önemli ölçüde baskılandığı gözlendi (Şekil 4).

2.5.Neferin, PMA/A'yı Engeller23187-RBL'de MAPK Yolunun İndüklenmiş Fosforilasyonunu-2H3

Önceki çalışmalar, MAPK'yı etkinleştirmek için mast hücrelerinin hücre içi kalsiyum iyonlarını salması gerektiğine işaret etmişti. Ayrıca, MAPK sinyal yolu, monositlerin, T lenfositlerin, B lenfositlerin, sitokinlerin ve kemokinlerin ekspresyonunu düzenler ve otoimmüniteyi indükler. Bu mekanizma, PMA/A23187'nin aktivasyon yoluna benzer. Bu çalışmada, referansın MAPK yollarının düzenlenmesine katılıp katılamayacağını araştırdık. 20 dakika boyunca RBL-2H3'e farklı referans konsantrasyonlarını (1,3 ve 10 uM) tedavi ettik ve ardından iltihabı indüklemek için 30 dakika boyunca PMA/A23187 ile uyardık. Sonuçlar, RBL-2H3'ün tek başına farklı referans konsantrasyonları ile işlendiğinde, p38, JNK ve ERK proteinlerinin aktivasyonunun etkilenmediğini gösterdi. Yalnızca PMA/A23187 ile tedavi edilen grupta, p38, JNK ve ERK proteinlerinin aktive olduğunu ve önemli fosforilasyona sahip olduğunu bulduk. Referans ile ön işleme tabi tutulan grupta, daha yüksek referans konsantrasyonları için p38, JNK ve ERK proteinlerinin fosforilasyonunun önemli ölçüde azaldığı gözlemlendi (Şekil 5A-C).

2.6.Neferin, PMA/A'yı Engeller23187-RBL'de NF-B Yolunun İndüklenmiş Fosforilasyonunu-2H3

Proinflamatuar sitokinlerin ekspresyonu, mast hücrelerinde transkripsiyon faktörü NF-kB'nin aktivasyonuna bağlıdır. IKB proteini fosforile edildiğinde ve bozunduğunda, NF-kB serbest bırakıldı ve çekirdeğe göç etti, karşılık gelen DNA'ya cevap veren elementlerle bağlandı ve proinflamatuar mediatörlerin transkripsiyonunu teşvik etti. Bağışıklık tepkisini, farklılaşmayı ve iltihabı düzenleyen birçok sitokin ve kemokin üretildi. Bu nedenle, referansla ön işlemin PMA/A23187 tarafından indüklenen protein fosforilasyonunu etkileyip etkilemediğini araştırdık. Farklı referans（1,3 ve 10 μM） konsantrasyonlarını RBL-2H3'e uyguladık. 20 dakika sonra, PMA/A23187, iltihabı indüklemek için 1 saat veya 2 saat süreyle RBL-2H3'ü uyardı. Sonuçlar, RBL-2H3'ün farklı referans konsantrasyonları ile işlenmesinin tek başına IKBa ve NF-KB'nin fosforilasyonunu etkilemediğini gösterdi. Stimülasyon için PMA/A23187 kullanıldığında, IkBo ve NF-KB'nin fosforilasyonunda önemli bir artış gözlemlendi. Referans ile ön işleme tabi tutulan grupta, IkBa (Şekil 6A) ve NF-KB'nin (Şekil 6B) fosforilasyonunun önemli ölçüde azaldığı bulundu.

2.7.2,4-Dinitroklorobenzen(DNCB) İndüklenmiş Atopik Dermatit Üzerinde Neferinin Etkisi

Hastalık araştırması için bir hayvan modeli olan DNCB, atopik dermatite neden olan temsili bir tahriş edicidir[25]. Deneyimiz, duyarlılık tepkisinin ilk aşamasını başlatmak için yüzde 75 alkol içinde çözülmüş yüzde 1 dinitroklorobenzen (DNCB) kullanır. DMSO içinde çözülmüş referans (3 mg/kg ve 10 mg/kg) ve deksametazon (Dexa,{{1{15}}}.2 mg/kg), beşinci gün on gün boyunca intraperitoneal olarak uygulandı. . 8., 1. ve 14. günlerde, inflamasyonu indüklemenin ikinci aşaması olarak yüzde 0,5 DNCB uygulandı. Fareler, kontrol grubu, DNCB grubu, referansla tedavi edilen grup ve deksametazon ile tedavi edilen grup olmak üzere dört gruba ayrıldı ve ardından gruplar arasında karşılaştırma yapıldıktan sonra farklılıklar kaydedildi. DNCB'nin farelerin derisinde atopik bir cilt iltihabı reaksiyonunu indüklediğini gözlemledik. DNCB uygulandıktan sonra farelerin derisinin kızarıklığı ve pullanmayı arttırdığı bulundu. Bunların hepsi anormal keratinosit proliferasyonu, infiltrasyonu ve bağışıklık hücrelerinin toplanmasından kaynaklanır. Dört gün boyunca referans 3 mg/kg ve deksametazon 0.2 mg/kg ile tedavi edilen grup kızarıklığı azalttı. 15. güne kadar farelerin sırt derisinin durumunu gözlemlemeye devam ettik. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, DNCB grubunda ciddi derecede kırmızı ve şiş cilt durumları vardı ve kaşıntı ve ağrıdan kaynaklanmış gibi görünen kepek ve yaralar vardı. . Referans ve deksametazon tedavilerinden sonra azalan bir derece eğilimi bulabiliriz (Şekil 7A). Toplanan mast hücrelerinin sayısını gözlemlemek için toluidin mavisi boyası kullanıldı. Mast hücreleri mikroskop altında gözlendiğinde mor görünüyordu. DNCB deney grubunda birçok mast hücresinin dermise infiltre olduğu ve biriktiği, kontrol grubuna göre önemli ölçüde arttığı kantitatif olarak gösterilebilir. Referans ve deksametazon ile tedavi edilen grupta infiltrasyon, agregasyon ve mast hücrelerinin sayısı azaldı (Şekil 7B, C).

2.8.Neferin, DNCB Tedavisinden Sonra Bariyerle İlgili Moleküllerin mRNA İfadesini İyileştirir

AD'nin neden olduğu ciltle ilgili iltihaplanma, anormal cilt bariyeri işlevine neden olabilir. Cilt bariyeri kusurluysa, antijenlerin veya tahriş edici maddelerin cilt epidermisine nüfuz etmesi ve bağışıklıkla ilgili reaksiyonları indüklemek için vücuda girmesi daha kolaydır. Aynı zamanda filagrin, lorikrin ve involukrin dahil olmak üzere farklılaşma proteinlerinin üretimi de baskılanacaktır. Bu nedenle, AD'yi önlemek ve tedavi etmek için hasarlı cilt bariyerini eski haline getirmek çok önemlidir [26]. Çalışmamızda, DNCB'nin neden olduğu atopik dermatitin hayvan modeline müdahale etmek için referanslar kullandık. Fareler feda edildikten sonra, referansın DNCB tedavisinden sonra filagrin, lorikrin ve involukrin'deki mRNA ekspresyonu azalmasını iyileştirip iyileştiremeyeceğini değerlendirmek için sırt deri dokusu RI-qPCR analizi için topraklandı. Sonuçlar, DNCB deney grubunun kontrol grubuna kıyasla filagrin, lorikrin ve involukrin mRNA ekspresyonunu önemli ölçüde azalttığını gösterdi. Filagrin, lorikrin ve involucrin'in mRNA ekspresyonu, DNCB grubuna kıyasla referans ve deksametazon ile tedavi edilen grupta önemli ölçüde arttı (Şekil 8).

Ayrıca referansın anti-alerjik kaşıma etkisi olduğunu kanıtladık. BALB/c farelerinde kaşınma davranışını indüklemek için bir mast hücre degranülasyon maddesi, bileşik 48/80 kullandık. Şekil 9'da gösterildiği gibi, referans tedavisinin, bileşik 48/80~50 ug/site）'nin neden olduğu kaşınma davranışını engellediğini bulduk. Art arda 5 gün boyunca daha düşük ve daha yüksek referans dozlarının (3 ve 10 mg/kg) tekrar tekrar uygulanması, bileşik 48/80'in neden olduğu çiziklerin sayısını önemli ölçüde azalttı.