Sorghum Bicolor Etanolik Ekstraktının B16/F10 Melanom Hücrelerinde IBMX Tarafından İndüklenen Melanogenez Üzerinde Anti-Melanojenik Etkisi

İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com

Hye Ju Han, Seon Kyeong Park, Jin Yong Kang, Jong-Min Kim, Seul Ki Yoo ve Ho Jin Heo

Soyut:Bir cilt beyazlatma ajanı olarak olasılığını değerlendirmek içinsorgum bicolor(S. bicolor), onunantioksidanaktivite ve 3-izobütil-1-metilksantin (IBMX) ile indüklenen üzerinde anti-melanojenik etkimelanogenezB16/F10 melanom hücrelerinde araştırıldı. Toplam fenolik içeriğin (TPC) sonucu, yüzde 60 etanol özütü olduğunu gösterdi.S. iki renkli(ESB), diğer etanol ekstraktlarından daha yüksek içeriğe sahiptir.antioksidanaktivite 2,2'-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit) diamonyumtuz (ABTS)/1,1-difenil-2-pikril-hidrazil kullanılarak değerlendirildi (DPPH) radikal temizleme aktiviteleri ve malondialdehit(MDA) inhibitör etkisi. Bu sonuçlar, ESB'nin önemli olduğunu gösterdiantioksidanfaaliyetler. Tirozinaza karşı inhibitör etki, substratlar olarak L-tirozin (IC50 değeri=89.25 µg/mL) ve3,4-dihidroksi-L-fenilalanin (L-DOPA) kullanılarak da değerlendirildi. Ek olarak, ESB tedavisi, IBMX kaynaklı B16/F10 melanom hücrelerinde melanin üretimini etkili bir şekilde inhibe etti. ESB'nin anti-melanojenik etkisinin mekanizmasını doğrulamak için melanogenez ile ilgili proteinleri inceledik. ESB aşağı regülemelanogenezmikroftalmi ile ilişkili transkripsiyon faktörü (MITF), tirozinaz ve tirozinaz ile ilişkili proteinin (TRP) ekspresyonunu azaltarak-1. Son olarak, ESB'nin ana bileşikleri olan 9-hidroksioktadekadienoik asit (9-HODE),1,3-O-dikaffeoilgliserol ve trisin, ultra performanslı sıvı kromatografisi-iyon hareketlilik ayırma-dört kutuplu kullanılarak analiz edildi. uçuş süresi/tandem kütle spektrometrisi (UPLC-IMS-QTOF/MS2). Bu bulgular, ESB'nin cilt beyazlatma materyali olarak kullanılabilecek fizyolojik potansiyele sahip olabileceğini düşündürmektedir.

Anahtar Kelimeler:antimelanogenez; B16/F10 melanom hücresi; hidroksioktadekadienoik asit;sorgumbicolor; 3-izobütil-1-metilksantin

Cistanche melanin oluşumunu engeller.

1. Giriş

Melanin adı verilen bir süreçle üretilir.melanogenezmelanositlerin hücre içi melanozomlarında bulunur ve melanin üretimi ve dağılımı cilt, göz ve saç rengini belirler. Ek olarak, melanin cildi ultraviyole (UV) radyasyonu, reaktif oksijen türleri (ROS), -melanosit uyarıcı hormon (-MSH) ve siklik adenosin monofosfat (cAMP) yükseltici ajanlar gibi çeşitli moleküllerden ve uyaranlardan forskolinand dahil olmak üzere hayati bir rol oynar. IBMX [1]. Özellikle UV radyasyonu doğrudan ve dolaylı olarak hidroksil radikalleri, süperoksit anyonları ve hidrojen peroksit gibi ROS üretimi yoluyla cilt hücrelerine zarar verir [2]. Üretilen ROS, tek ve çift zincirli DNA kırılmalarına neden olur ve proteinler ve lipitler gibi önemli hücresel yapısal moleküllere saldırır [2]. Böylece melanin veantioksidanglutatyon peroksidaz, süperoksit dismutaz ve katalaz gibi enzimler, üretilen ROS'u uzaklaştırarak sabit bir seviyede tutar. Bununla birlikte, çeşitli faktörlerin sonucu olarak aşırı ROS üretimi, ciltte melanogenezi aktive eder ve anormal melanin birikimi olumsuz hiperpigmentasyon etkilerine neden olarak yaşlılık veya karaciğer lekelerine, lekelere ve çillere neden olur [3,4]. Günümüzde melanin sentez inhibitörleri olarak bilinen kojik asit, hidrokinon, arbutin, andaskorbik asit gibi doğal bileşikler cilt beyazlatıcı katkı maddeleri olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu bileşenler sadece cilde zayıf penetrasyona sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda uzun süreli uygulama ile sitotoksisite ve iltihaplanmaya da neden olur [5]. Bu bağlamda, insan derisi hiperpigmentasyonunu tedavi etmek için tahriş edici olmayan ve etkili bir beyazlatma maddesi geliştirmek ve bunun için doğal kaynak materyallerini incelemek gereklidir.

İnsan deri hücreleri genellikle bir fotokoruma reaksiyonu olarak melanin üretir. Melanogenez, çeşitli sinyal yollarıyla düzenlenen karmaşık bir süreçtir ve tüm sinyaller nihayetinde MITF'yi düzenler. Aktive MITF, tirozinaz gen ailesi (tirozinaz ve TRP'ler) ekspresyonunu desteklediğinden,melanogeneziçtenlikle başlar [6]. Genel olarak, melanogenezdeki ilk adım, tirozinazın L-tirozinin 3,4-dihidroksi-L-fenilalanin'e (L-DOPA) oksidasyonunu katalize etmesi ve ardından L-DOPA'yı DOPA kinon'a oksitlemesidir. Ve sonra TRP-2 DOPA kromunu 5,6-dihidroksiindol-2-karboksilik asit (DHICA) veya 5,6-dihidroksiindole (DHI) dönüştürür. Son olarak, DHICA ve DHI, TRP-1 tarafından oksitlenir ve sonunda melanin üretimine yol açar [6].

IBMX ve diğer metilksantinler, fosfodiesterazı inhibe ederek ve böylece cAMP seviyelerini artırarak melanogenezi uyarır [7]. IBMX tarafından aktive edilen cAMP, hücre dışı sinyalle düzenlenen kinaz (ERK) ve fosfoinositid 3-kinazlar/protein kinaz B (PI3K/Akt) sinyal yollarını fosforile eder ve sonuçta melanogenez süreçlerinde MITF'nin aktivasyonuna yol açar [7]. Bu nedenle, bu proteinlerin aşağı regülasyonu, beyazlatma karşıtı etki için önemli bir faktör olarak kabul edilebilir.

sorgum bicolorPoaceae familyasına ait olan (S. bicolor), Afrika, Orta Amerika ve kurak bölgeler dahil olmak üzere intropikal bölgelerde önemli bir ürün olarak kabul edilir ve buğday, pirinç ve mısırdan sonra dünyanın dördüncü en önemli tahıl ürünüdür [8]. ]. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, S. bicoloris'in fenolik bileşikler, tanenler ve antosiyaninler gibi fitokimyasallar içerdiğinden insanlar için faydalı olduğunu göstermiştir [9]. Bu fitokimyasallar, sahip oldukları özellikler nedeniyle artan bir ilgi görmüştür.antioksidan, anti-obezite, anti-diyabet ve anti-inflamatuar etkiler [10-14]. Çeşitli araştırma sonuçları olmakla birlikte S. bicolor'un cilt beyazlatma etkisine yönelik çalışmalar henüz yapılmamıştır. Bu nedenle, bu çalışma, antioksidan aktiviteyi ve anti-melanojenik etkilerini araştırmayı amaçladı.S. iki renklive IBMX kaynaklı etkilerini incelemek içinmelanogenezB16/F10 melanom hücrelerinde.

2. Malzemeler ve Yöntemler

2.1. kimyasallar

Folin–Ciocalteu reaktifi, L-DOPA, L-tirozin, L-askorbik asit, arbutin, akarboz, dimetilsülfoksit (DMSO), sığır serum albümini, -glukosidaz, mantar tirozinaz, sığır serum albümini,3-(4,{ {6}}dimetil-2-tiyazolil)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) ve IBMX, Sigma-Aldrich Chemical Co.'dan (St. Louis, MO, ABD) satın alındı. MITF (bsm-51339M) ve tirozinaz (bs-0819R), Bioss'tan (Pekin, Çin) satın alındı. TRP-1 (sc-166857) ve -aktin (sc-69879), Santa Cruz Biotechnology'den (Dallas, TX, ABD) satın alındı. Sekonder antikorlar (anti-tavşan ve anti-fare) Cell Signaling Technology'den (Danvers, MA, ABD) elde edildi.

2.2. Örnek hazırlama

S. iki renkli(20 g), bir geri akış kondansatörü kullanılarak 2 saat boyunca 40 derecede çeşitli etanol konsantrasyonları (0, 20, 40, 60, 80 ve 95; 1 ​​L) ile özütlendi. Özler, filtre kağıdı (WhatmanInternational Limited, Kent, UK) kullanılarak süzüldü ve bir vakumlu buharlaştırıcı (N-1000; EYELA Co.,Tokyo, Japonya) kullanılarak konsantre edildi. Özler, bir vakumlu dondurarak kurutucu (Il Shin Lab Co., Ltd., Yangju, Kore) kullanılarak liyofilize edildikten sonra, kurutulmuş özler, kullanılıncaya kadar -20 derecede saklandı.

2.3. In Vitro Antioksidan Aktivite

2.3.1. Toplam Fenolik İçerik (TPC)

Toplam fenolik içerikler, Folin-Ciocalteu reaktiflerinin alkali koşullar altında mavi bir reaksiyon ürününe indirgenmesi ilkesine dayalı olarak incelenmiştir. Folin–Ciocalteu reaktifi ve yüzde 7 sodyum karbonat ile karıştırılmış bir numune (1 mL). Karışım 2 saat aktive edildi ve ardından absorbans, bir spektrofotometre (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japonya) kullanılarak 760 nm'de ölçüldü. TPC, gallik asidin standart eğrisinden hesaplandı ve sonuçlar mg GAE g-1 olarak ifade edildi.

2.3.2. Radikal Temizleme Etkinliği

ABTS radikal katyon çözeltisi, 2.45 mM potasyum persülfat ve 7 mMABTS'nin 150 mM içeren 10{{10}} mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.4) ile karıştırılması ve oda sıcaklığında 24 saat reaksiyona girerler. ABTS solüsyonu daha sonra 734 nm'de 0.700 ± 0.020 absorbans elde etmek için distile su ile seyreltildi. Numunenin 980 µL ABTS çözeltisi ile 37 derecede 10 dakika reaksiyona girmesine izin verildi ve ardından 734 nm'de absorbans bir spektrofotometre (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japonya) kullanılarak ölçüldü. 0.1 mM DPPH'nin yüzde 80 metanol içinde çözülmesi. DPPHsolüsyonu, 517 nm'de 1.000 ± 0.020'lik bir absorbansa seyreltildi. 50 uL numune 1.45 mL DPPH solüsyonu ile karıştırıldı ve karanlıkta 30 dakika reaksiyona sokuldu. Reaksiyondan sonra karışım 517 nm'de belirlendi.

2.3.3. Lipid Peroksidasyonu Üzerine İnhibitör Etkisi

Beyin dokusunda lipid peroksidasyonu üzerindeki inhibitör etkiyi ölçmek için tiyobarbitürik asit (TBA) reaktif madde yöntemi kullanıldı. Beyin dokusu 20 mM Tris-HCl tamponu (pH7.4) içinde homojenleştirildi ve 6000 x g'de 20 dakika santrifüjlendi. Süpernatan, 0.1 mM L-askorbik asit ve 10 uM demir sülfata 37 derece 1 saat inkübasyon için ilave edildi. Daha sonra karışıma yüzde 30 trikloroasetik asit ve yüzde 1 TBA ilave edildi ve ardından 80 derecede 20 dakika su banyosunda inkübe edildi. Daha sonra, TBA-MDA kompleksi, 532 nm'de bir spektrofotometre (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japonya) kullanılarak ölçüldü.

2.4. Tirozinaz İnhibitör Etkisi

Tirozinaz inhibitör etkisi, bir substrat olarak L-tirozin kullanılarak belirlendi. Bir 96-kuyulu plakaya bir numune eklendi ve 37 derecede reaksiyona girecek şekilde 0.1 M sodyum fosfat tamponu, tirozinaz ve 0.1 mML-tirozin substratı ile karıştırıldı. İnkübasyondan sonra enzim aktivitesi, 490 nm'de bir mikroplaka okuyucu (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, ABD) kullanılarak ölçüldü. Ayrıca, tirozinaz inhibe edici aktiviteyi ölçmek için bir substrat olarak L-DOPA kullanıldı. 67 mM sodyum fosfat tamponu, tirozinaz ve 10 mML-DOPA substratı, 37 derecede 10 dakika reaksiyona girecek şekilde numuneye ilave edildi. Tirozinaz aktivitesi 415 nm'de ölçüldü.

Cistanche melanin oluşumunu engeller

2.5. -Glukozidaz İnhibitör Etkisi

-glukozidaz inhibitör etkisi, 0.1 M sodyum fosfat tamponu ve -glukosidazın 37 derecede 10 dakika karıştırılmasıyla ölçüldü. Aktive edildikten sonra karışım, tampon içinde 5 mM4-nitrofenil- -D-glukopiranozide 37 derecede 5 dakika ilave edildi ve daha sonra absorbans bir mikroplaka okuyucu (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, ABD).

2.6. Hücre Canlılığı Testi

Numunenin sitotoksisitesi, bir MTT tahlili kullanılarak tahmin edildi. B16/F10 melanom hücreleri, 24 saat boyunca bir 96-kuyu plakasında 1x104hücre/kuyuda kültürlendi. Daha sonra numuneler 1, 2, 5 ve 10 µg/mL konsantrasyonlarda işleme tabi tutulmuştur. Örnekler 48 saat süreyle işleme tabi tutuldu, ardından hücreler 10 ug/mL MTT stok çözeltisi ile 3 saat süreyle işleme tabi tutuldu. Son olarak ortam çıkarıldı ve formazanı çözündürmek için DMSO eklendi. Formazan miktarı, 570 nm'de (uyarma dalga boyu) ve 655 nm'de (emisyon dalga boyu) bir mikroplaka okuyucu (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, ABD) kullanılarak ölçülmüştür.

2.7. Hücresel Melanin İçeriğinin Ölçülmesi

Melanin miktarını ölçmek için, B16/F10 melanom hücreleri, bir 24-kuyucuklu plakada, 24 saat boyunca 4x104hücre/kuyu üzerinde yoğunlukta kültürlendi. Daha sonra hücreler, ilave bir 48 saat boyunca 100 mM IBMX ve ESB veya pozitif kontrol (arbutin) ile işlendi. İşlemden sonra hücreler yıkandı ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) kullanılarak toplandı. Hasat edilen hücreler daha sonra 16,{9}}xg'de 10 dakika santrifüjlendi ve elde edilen topak, 20 dakika boyunca 90 derecede yüzde 10 DMSO içeren 1 N sodyum hidroksit ile çözündürüldü. Melanin içerikleri, bir mikroplaka okuyucu (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, ABD) kullanılarak 490 nm'de ölçüldü.

2.8. Western Blot Analizi

Ön işleme tabi tutulmuş B16/F10 melanom hücreleri, PBS ile yıkandı ve buz üzerinde yüzde 1 proteaz inhibitörleri içeren RIPA tamponu kullanılarak parçalandı. Protein konsantrasyonları Bradford protein tahlili ile belirlendi ve eşit proteinler, 95 derecede 10 dakika boyunca bir Laemmli tamponu ile denatüre edildi. Denatüre proteinler, yüzde 10 sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile ayrıldı ve daha sonra poliviniliden diflorür (PVDF) membranlarına (Millipore, Billerica, MA, ABD) aktarıldı. Daha sonra, membranlar 1 saat boyunca yüzde 0.1 Tween20 (TBST) içeren Tris tamponlu tuzlu su içinde yüzde 5 yağsız süt ile bloke edildi ve daha sonra gece boyunca 4 derecede primer antikorlarla reaksiyona sokuldu. Zarlar, 1 saat boyunca ikincil antikorlarla reaksiyona sokuldu ve bağışıklık kompleksleri, güçlendirilmiş kemilüminesans reaktifi (Bionote, Hwaseong, Kore) kullanılarak görselleştirildi. Bant görüntüleri Chemi-doc (iBright Imager, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) tarafından tespit edildi ve analiz edildi.

2.9. UPLC-IMS-QTOF/MS2 Analizi

Yüzde 60 etanolik özütlerdeki ana bileşiklerS. iki renkliUPLC-IMS QTOF/MS2 (Vion, Waters Corp., Milford, MA, ABD) ile analiz edildi. Kromatografik ayırma, bir Acquity UPLC BEH C18 kolonu (2.1 × 10{{10}} mm, 1.7 um partikül boyutu; Waters Corp.) kullanılarak 0.35 mL/dakika akış hızında gerçekleştirildi. Mobil fazlar, solvent A (damıtılmış suda yüzde 0.1 formik asit) ve B'den (asetonitril) oluşuyordu ve analiz koşulları aşağıdaki zaman gradyanını içeriyordu: 0-1 dakikada yüzde 1 B, 1-7 dakikada yüzde 1-100 B, 7-8 dakikada yüzde 100 B, 8-8,2 dakikada yüzde 100-1 B, 8,2-10 dakikada yüzde 1 B. Kütle spektrometrisi, elektrosprey iyonizasyon (ESI) negatif modunda aşağıdaki koşullar altında gerçekleştirilmiştir: kaynak sıcaklığı, 100 ◦C; desolvasyon hattı sıcaklığı, 400 ◦C; rampa çarpışma enerjisi, 10–30 V; kılcal voltaj, 2.5 kV. Fenolik bileşikler, m/z 50 ila 1500 arasında değişen bir tam tarama ile tespit edildi.

2.10. İstatistiksel analiz

Tüm sonuçlar ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunuldu. Gruplar arasındaki istatistiksel fark, Duncan'ın yeni çoklu aralık testi (p < 0.05)="" ve="" sas="" yazılım="" sürümü="" 9.4="" (sas="" institute,="" cary,="" nc,="" abd)="" kullanılarak="" tek="" yönlü="" bir="" varyans="" analizi="" (anova)="" ile="" belirlendi.="" .ve="" arasındaki="" karşılıklı="">antioksidanetkileri (ABTS/DPPH radikal süpürme aktivitesi ve MDA inhibitör etkisi) ve inhibisyon etkisimelanogenez-aracılı enzimler (tirozinaz ve -glukosidaz) Pearson korelasyon analizi ile değerlendirildi.

3. Sonuçlar

3.1. Toplam Fenolik İçerikler

karşılaştırmak içinantioksidanher etanolik özütün aktivitesiS. iki renkli, TPC araştırıldı. Şekil 1'de gösterildiği gibi, TPC etanolik ekstraktlar arasında farklıydı; yüzde 60 etanolik ekstrakt (150.08 ± 1.13 mg GAE/g) diğer ekstraksiyonlardan önemli ölçüde daha yüksekti (yüzde 0 ; 70.83 ± 1.18, yüzde 20 ; 100.42 ± 0.72, yüzde 40) 114.67 ± 1.46, yüzde 80; 118.33 ± 3.17 ve yüzde 95; 73.67 ± 1.46 mg GAE/g). Bu nedenle, daha ileri deneysel analizler için yüzde 60 etanolik özüt kullanıldı.

3.2. Radikal Temizleme Etkinliği

buantioksidanyüzde 60 etanolik özütün aktivitesiS. iki renkli(ESB), ABTS/DPPH testi ve MDA testi kullanılarak ölçüldü ve sonuçlar Şekil 2'de gösterildi. ESB'nin ABTS radikal süpürme aktivitesi 1000 ug/mL konsantrasyonda yüzde 97.98 ve vitamin C'de (yüzde 99.82) sergilendi. pozitif kontrol olarak kullanılan ve aynı konsantrasyonda benzer radikal süpürücü aktiviteye sahip olan (Şekil 2A). Ve ESB, 409.71 ug/mL konsantrasyonda ABTS radikalinin yüzde 50'lik bir inhibisyon etkisi (IC50 değeri) gösterdi. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, ESB'nin DPPH radikal süpürme aktivitesi 1000 ug/mL konsantrasyonda yüzde 79.44 ve IC50 değeri 612.53 ug/mL olarak gösterildi. ESB'nin MDA üretiminin inhibitör etkisi, 50 ug/mL konsantrasyonda yüzde 89.54'lük bir inhibitör etki gösterdi ve aynı konsantrasyonda pozitif kontrol olan kateşinden (yüzde 71.03) daha yüksek bir inhibitör etki gösterdi (Şekil 2C). Ek olarak, ESB'nin 16.56 ug/mL konsantrasyonlarında MDA'nın IC50 değeri gözlendi.

3.3. Melanogenez Aracılı Enzimlerin İnhibitör Etkisi

engelleyici etkisimelanogenez-aracılı enzimler, tirozinaz ve -glukosidaz kullanılarak değerlendirildi (Şekil 3). Tirozinazın melanin sentezine karşı inhibitör aktivitesini ölçmek için, hücresiz koşullar altında bir substrat olarak L-tirozin ve L-DOPA kullanılarak deneyler yapıldı. Sonuç olarak, L olduğunda IC50 değeri 89.25 µg/mL idi. -tirozin bir substrat olarak kullanıldı (Şekil 3A), ancak L-DOPA, inhibitör etkinin yüzde 50'ından fazlasını gözlemleyemedi (Şekil 3B). Şu anda, L-tirozin için pozitif kontrolün (arbutin) IC50 değeri, ESB'den daha yüksek olan 74.35 µg/mL idi. ESB'nin, substrat olarak L-DOPA kullanmaktan ziyade L-tirozin kullanarak tirozinaz üzerinde daha iyi bir inhibitör etkiye sahip olduğu bulundu. Bu nedenle, iki substrat kullanan tahlilin sonuçlarına dayanarak, ESB'nin tirozinaz inhibitör etkisinin, melanogenezde L-DOPA'nın DOPA kinon'a oksidasyonundan ziyade L-tirozinin L-DOPA'ya oksidasyonu ile ilgili olduğu düşünülmektedir. Substrat olarak L-DOPA kullanan tirozinaz inhibitör etkisi ve radikal süpürücü aktivite (ABTS; 0.943, p < 0.05,="" dpph;="" 0.952,="" p="">< 0.05),="" tablo="" 1'deki="" pozitif="" güçlü="" korelasyonları="">

engelleyici etkisini ölçmek içinmelanogenez-aracılı enzim, ESB'nin -glukosidaza karşı inhibitör aktivitesi ölçüldü. Şekil 3C'de gösterildiği gibi, ESB -glukosidazı 200 µg/mL konsantrasyonda yüzde 33,72 oranında inhibe etti. Ve ESB'nin IC50'si 46.29 µg/mL idi, bu da akarbozdan (216.05 µg/mL) yaklaşık beş kat daha yüksekti. Bu sonuçlar, ESB'nin pozitif kontrol olarak akarbozdan daha iyi -glukozidaz inhibitör aktiviteye sahip olduğunu gösterir. Ve -glukozidaz inhibitör etkisi, Tablo 1'de MDA inhibitör etkisi (0.966, p < 0.05)="" ile="" güçlü="" pozitif="" korelasyonlar="" ortaya="">

3.4. Hücre Canlılığı ve Hücresel Melanin Sentezi

ESB'nin sitotoksisitesini doğrulamak için B16/F10 melanom hücreleri, 1, 2, 5, 10 ve 20 µg/mL konsantrasyonlarda 24 saat boyunca ESB ile tedavi edildi. Sonuçlar, kontrol ile karşılaştırıldığında ESB'nin belirtilen konsantrasyonlarda hücre canlılığını etkilemediğini gösterdi (Şekil 4A). Bu nedenle 2, 5 ve 10 µg/mL konsantrasyonları seçilerek deneyler yapılmıştır. Ardından, ESB'nin melanin üretimi üzerindeki etkisini analiz etmek için B16/F10 melanom hücreleri IBMX ile tedavi edildi. Şekil 4B'de gösterildiği gibi, melanin içeriği seviyesi IBMX ile tedavi edildiğinde yüzde 316,85'e yükseldi. Öte yandan, 10 ug/mL konsantrasyonda ESB ile tedavi edilen grup (yüzde 108.60), IBMX ile tedavi edilen gruba kıyasla önemli ölçüde azalmış melanin içeriği ve pozitif kontrol olarak arbutin grubuna (yüzde 101.79) kıyasla benzer melanin içeriği gösterdi.

3.5. B16/F10 Melanom Hücrelerinde Melanogenez Yolu

melanogenezinsan cildini dış uyaranlardan korumak için gerekli bir süreçtir ve bu süreç çeşitli mekanizmalar tarafından düzenlenir. Bu çalışmada, ESB'nin B16/F10 melanom hücrelerinde IBMX ile indüklenen melanin üretimi üzerindeki potansiyel inhibitör mekanizmasını doğrulamak için melanogenezi düzenleyici moleküllerin ekspresyon seviyesini ölçtük (Şekil 5). Sonuçlar, ESB'nin IBMX kaynaklı MITF ifadesini etkili bir şekilde azalttığını gösterdi (Şekil 5A, B). Böylece, tirozinaz(Şekil 5A, C) ve TRP-1 (Şekil 5A, D) ifadesi, ESB tedavisi ile azaltılmış MITF ile aşağı regüle edildi. Sonuç olarak, ESB tedavisi, B16/F10 melanom hücrelerinde IBMX ile indüklenen melanogenezde ilgili proteinlerin ekspresyonunu aşağı regüle etti.

3.6. UPLC-IMS-QTOF/MS2 Analizi

ESB'nin ana bileşiklerinin bir profili LC/MS ile m/z 50-1500 aralığında tarandı ve baz tepe kromatogramları Şekil 6'da gösterilmektedir. MS2 parçalanma verileri (Tablo 2). Önceki literatürdeki fragmanlara dayanarak, pik 2 1-O-caffeoilgliserol(m/z 253.07, 179.03, 161.02 ve 135.04) olmuştur [15]; zirve 3, dikaffeoilgliseritler (m/z 415.10, 253.07, 179.03 ve 135.04) [16]; pik 4, 1,3-O-dicaffeoylglycerol (m/z 415.10, 253.07, 179.03, 161.02 ve 135.04) [16];pik 5, p-coumaroyl-caffeoylglycerol (m/z 399.10, 253.07, 179.03, 161.02 ve 135.04) [17]; zirve 6,feruloil-kafeoilgliserol (m/z 429.12, 253.07, 193.05, 161.02 ve 134.03) [18]; tepe 7, trisin (m/z 329.23,314.04, 299.01 ve 271.02) [19]; ve pik 9, 9-hidroksioktadekadienoik asit (9-HODE) (m/z 295.22, 277.21 ve 171.10) [20]. Bunlar arasında 1,3-O-dicaffeoylgliserol (Şekil 6B), trisin (Şekil 6C) ve9-HODE (Şekil 6D) ana bileşikler olarak tanımlandı.

cistanche'nin etkileri:oksidasyon önleyici

4. Tartışma

melanogenezdış uyaranlardan kaynaklanan artan oksidatif stresin neden olduğu bildirilmektedir. Oksidatif stres, DNA ve proteinlerin oksidasyonuna, lipid peroksidasyonuna ve doymamış yağ asitlerinin artmasına neden olur. Bu stres de derideki melanositlerde gereksiz yere melanin sentezinin artmasına neden olur. Böylece üretilen aşırı melanin pigmentasyona neden olabilir ve cilt kanserine yol açabilir. IBMX, fosfodiesterazı inhibe ederek ve böylece cAMP düzeylerini artırarak melanogenezi uyarır [7]. Hücrelerdeki cAMP düzeyi arttıkça, melanogenez ile ilişkili proteinlerin oluşumunu destekleyen ERK ve PI3K/Akt sinyal yollarının aktivasyonuna neden olur. Bu nedenle, ESB'nin B16/F10 melanom hücrelerinde IBMX kaynaklı melanogenez üzerindeki beyazlatma etkisini araştırdık.

Bitkilerin ikincil metabolitleri olan fenolik bileşikler, radikallerle reaksiyona girdiklerinde bir rezonans yapısı ile stabilize olma özelliğine sahiptir [21]. Ayrıca fenolik bileşikler, L-tirozin [22,23] gibi bir kimyasal yapıya sahip oldukları için ABTS/DPPH radikal süpürme aktivitesi ve aktas pigment oluşumunun inhibitörleri gibi antioksidan aktivite için önemli faktörler olarak hareket ederler. in vitro tahmin için en yaygın ve en basit yöntemantioksidanaktivite. Bu çalışmada, ESB yüksek bir TPC (Şekil 1) ve ABTS/DPPH radikal süpürme aktivitesi göstermiştir(Şekil 2A, B). Özellikle, ABTS radikal süpürme aktivitesinde ESB, DPPH radikal süpürme aktivitesinden daha yüksekti. DPPH testi hidrofobik bileşiklerin radikal süpürme aktivitesini ölçmek için kullanılırken ABTS testi hidrofobik ve hidrofilik bileşiklere karşı radikal süpürme aktivitesini ölçmeyi mümkün kılar [24]. Bu nedenle, ESB'nin radikal süpürücü aktivitesinin hidrofilik bileşikten daha fazla etkilendiği doğrulandı.

UV radyasyonuna maruz kalma, ROS üretimine neden olur ve cilt üzerinde doğrudan ve dolaylı etkileri vardır. Özellikle ROS, hücre zarlarının bileşenleri olan doymamış yağ asitlerine saldırarak lipid peroksidasyonunu indükler [2]. Lipid peroksitlerin birikmesi, cildin antioksidan sisteminin tahrip olmasına, pigmentasyona, iltihaplanmaya ve yaşlanmaya neden olur [25]. Bu çalışmada, ESB, lipid peroksidasyonunu mükemmel bir şekilde engellediğini gösterdi (Şekil 2C). Doğal bitkilerde bulunan fenolik bileşiklerin radikal süpürücü aktivite ile ilişkili olduğu bildirilmiştir [26]. Ayrıca, Maresca ve ark. [27] antioksidanlarla ROS'un uzaklaştırılmasının melanin biyosentezini inhibe etmede etkili olduğunu bildirmiştir. Yakın tarihli bir çalışma, Dendropanax morbifera yaprağının etil asetat ve aglikon fraksiyonlarının, HaCaT hücrelerini oksidatif strese karşı koruyarak cilt hücresi koruyucuları ve doğal antioksidanlar olarak hareket edebileceğini bildirdi [28]. Ayrıca, aynı fraksiyonlarla tedavi, B16/F10 melanom hücrelerinde -MSH ile indüklenen aşırı melanin oluşumuna karşı apozitif kontrol olarak kullanılan arbutinden daha iyi bir anti-melanojenik etki göstermiştir [28].

Birkaç mekanizma ile ilişkilidirmelanogenezve cilt beyazlatıcıların ortak amacı, melanogenezde önemli bir enzim olan tirozinazın düzenlenmesidir. Bakır içeren bir enzim olan tirozinaz, bu yolda iki reaksiyonu katalize eder: L-tirozinin L-DOPA'ya hidroksilasyonu ve L-DOPA'nın DOPA kinon'a oksidasyonu [6]. Büyük miktarlarda UV veya ROS'a maruz kaldığında, tirozinaz aktivitesi artar ve melanin sentezi de artar. Bu nedenle, tirozinazın melanin sentezi ile ilişkili olarak inhibe edici etkisinin ölçülmesinin sonuçları, ESB'nin L-tirozin kullanarak tirozinaz üzerinde substrat olarak L-DOPA kullanmaktan daha iyi bir inhibitör etkiye sahip olduğunu göstermiştir(Şekil 3A,B). Yakın tarihli bir çalışma, fenolik bileşiklerin, bir tirozinaz substratı olan L-tirozininkine benzer bir kimyasal yapıya sahip olması nedeniyle, TPC ve tirozinaz inhibisyonu arasındaki korelasyonu bildirmiştir. Choi ve ark. [29] tarafından yapılan bir çalışmada, Cheonggukjang'ın fermentasyon süresi ile orantılı olarak serbest radikal süpürücü aktivite ve tirozinaz inhibitör etkisinin etkinliğinin arttığı gözlemlenmiştir, bu da fermantasyon süresi ile artan TPC miktarından kaynaklanmaktadır. Im & Lee [30], Taraxacum core num'dan elde edilen yüzde 75 etanolik özütün etil asetat fraksiyonunun bol miktarda TPC ve antioksidan aktiviteye sahip olduğunu ve tirozinaz inhibitör etkisinin diğer fraksiyonlardan (heksan, kloroform, bütanol ve sulu) üstün olduğunu gözlemledi.

Glikoproteinlerden biri olan tirozinaz, polipeptit zincirleri endoplazmik retikuluma yer değiştirdiğinde glikosile edilir. Bu süreçte çeşitli enzimler yer alır ve bunların arasında -glukosidazın inhibisyonu, bakır olmadan inaktif bir yapı oluşturmak için tirozinazın katlanmasını engelleyebilir. Sonuç olarak, tirozinaz melanozoma taşınamaz ve melanin üretimini engeller. Mevcut polifenol bitkilerde sadece oksidatif stresi azaltmakla kalmaz, aynı zamanda proteinlere bağlanarak -glukosidaz gibi karbonhidratları hidrolize eden enzimleri de inhibe eder [31]. Önceki bir çalışma, glikosilasyon inhibitörlerinin varlığında B16/F10 melanom hücrelerinin, toplam tirozinaz içeriğini azaltarak melanogenezin azalmasına neden olduğunu göstermiştir [32]. Ve Choi et al. [33] -glukosidaz inhibitörlerinden biri olan deoksinojirimisinin, tirozinazın glikozilasyonunu bloke ettiğini ve melanozomlara tirozinaz göçünü engellediğini bildirdi. Ando et al. [34], glutatyon, ferritin ve geldanamisin gibi -glukosidaz inhibitörleri tarafından tirozinazın glikozilasyonunu kontrol ederek melanom hücrelerinde melanin sentezini inhibe etmenin mümkün olduğunu göstermiştir. Kim et al. [35] Arı Poleni için iyi korelasyonları doğal olarak bildirmiştir.antioksidanTPC ve tirozinaz inhibitör etkisi arasında ({{0}}.973,p < 0.05)="" ve="" ayrıca="" tpc,="" dpph="" radikal="" süpürme="" aktivitesi="" ile="" pozitif="" korelasyon="" verdi="" (0.897,="" p="">< 0.05).="" sonuçlar,="" doğal="" antioksidanlar="" olarak="" polifenollerin,="" mükemmel="" antioksidan="" aktivitelerine="" dayalı="" olarak="" cilt="" beyazlatma="" için="" potansiyel="" olarak="" etkili="" olabileceğini="" göstermektedir.="" çalışmamızda,="" esb'nin="" tirozinaz="" etkisini="" inhibe="" etme="" sürecindeki="" antioksidan="" etkisinin,="" l-dopa'nın="" dopa="" kinon'a="" oksidasyonunun="" inhibisyonu="" ve="" tirozinazın="" glikozilasyonu="" ile="" yüksek="" oranda="" ilişkili="" olduğu="" belirtilmiştir="" (tablo="" 1).="" esb'nin="" etkisinin="" inhibisyonunu="" etkileyerek="" cilt="" beyazlatma="" etkisi="" üzerinde="" etkisi="">melanogenez- aracılı enzimler.

doğal antioksidan: cistanche tubulosa

PKA sinyal yolu, melanogenezde yer alan ana süreçtir ve bu, bir cAMP yükseltici ajan olan IBMX tarafından aktive edilir. PKA sinyal yolu, ekspresyonunda yer alan MITF ve cAMP'ye yanıt veren element bağlayıcı protein gibi transkripsiyon faktörlerini düzenleyebilir.melanogeneztirozinaz, TRP-1 ve TRP-2 gibi düzenleyiciler. Sonuç olarak, IBMX tedavisi, cAMP aktivasyonu yoluyla MITF ve tirozinaz gen ailesinin (tirozinaz ve TRP-1) ekspresyonunu arttırır [7]. Park et al. [36], 40 µg/mL konsantrasyonda PapenfusiellaCuomo etanolik ekstraktından (yüzde 65.17 ± 13.40) melanin sentezi miktarının pozitif kontrol olarak kojik aside (yüzde 72.30 ± 3.92) benzer olduğunu gösterdi ve potansiyel gösterdiğini bildirdi. doğal bir beyazlatma malzemesi olarak. Bu çalışmada, ESB, düşük konsantrasyonlarda pozitif kontrolünkine benzer şekilde melanin sentezi üzerinde etkili bir inhibitör etki göstermiştir (Şekil 4). Bundan sonra, ESB'nin ayrıntılı anti-melanojenik etkisini değerlendirmek için, B16/F10melanom hücreleri kullanılarak melanogenez aracılı protein üzerinde western blot analizi yapıldı.

Çeşitli mekanizmalarda yer alan Akt, apoptoz, glikoz ve cilt metabolizması gibi çoklu hücresel süreçlerde anahtar rol oynar. Özellikle, IBMX tedavisi ile cAMP'nin artması, Akt fosforilasyonunu ve aktivasyonunu azaltır. Ayrıca, inaktive edilmiş Akt, GSK-3 aktivasyonunu indükler, bu da fosforilasyonun sağlanmadığı, yani p-GSK-3 seviyesinin düşürüldüğü anlamına gelir [7]. Önceki literatüre göre, Pueraria thunbergia'nın hava kısmı, B16/F10 melanom hücrelerinde Akt/GSK-3 sinyal yolunu aktive ederek MITF'yi düşürür [37]. Ayrıca, Huang et al. [38], [6]-okulunun p-Akt ekspresyonunu desteklediğini ve B16/F10 melanom hücrelerinde melanogenez sinyalleşmesini inhibe ettiğini gösterdi. Aktive edilmiş GSK-3, MITF'nin Ser289'unu fosforile ederek tirozinaz gen ailesini yukarı regüle eder ve sonuç olarak melanogenezi teşvik eder. MITF, bir tirozinaz gen promotörüne bağlanan önemli bir transkripsiyon faktörüdür ve daha sonra melanosit proliferasyonu ve proliferasyonu ile ilgili enzimlerin ekspresyonunu arttırır.melanogenez[7]. Tirozinaz ekspresyonu MITF tarafından teşvik edildiğinde, daha sonra TRP-1 ve TRP-2 düzeylerinde bir artışa yol açar ve sonuç olarak bu melanojenik enzimler melanin üretir [6]. UV ışığının neden olduğu oksidatif stres, ciltte melanin pigmentasyonunu uyarır. Bu nedenle, radikallerin veya ROS'un temizleme aktivitesi, melanin üretimini baskılamak için etkilidir ve antioksidan aktiviteye sahip polifenollerin mükemmel beyazlatma etkileri olabilir [38]. Choi et al. [39], Kore bambu saplarının (Phyllostachys nigra varyete henosis) ABTS/DPPH radikallerini süpürme yoluyla PKA/CREB aracılı MITF'yi aşağı regüle ettiğini gösterdi. Ve Nelumbo nucifera G. Leaf'in yüzde 70 etanolik özütü, MITF, tirozinaz ve TRP'lerin ekspresyonunu, elektron bağışlama yeteneği ve ksantin oksidazın inhibisyonu gibi antioksidan aktivitelerle inhibe etti [40]. Bu deneyde, ESB tedavisinin, melanogenez yolunda DHICA'nın DHI'ya oksidasyonunu destekleyen MITF ve tirozinaz gen ailesinin (tirozinaz ve TRP-1) ekspresyonunu azalttığı gösterilmiştir (Şekil 5). Bu sonuçlara dayanarak, ESB'nin, IBMX aracılı melanogenezi, üstün performansına dayalı olarak aşağı regüle ettiği gösterilmiştir.antioksidanEtkileri.

Önceki literatüre dayanarak, ESB'deki ana fenolik bileşiklerin 1,3-O-di-kafeoil gliserol (Şekil 6B), trisin (Şekil 6C) ve 9-HODE (Şekil 6D) [16] olduğu belirlendi. ,19,20]. Bunlar arasında, ESB'de en bol bulunan bileşik olan 9-HODE, linoleikasit metabolitlerinden biridir ve tirozinazı inhibe ederek tahriş olmuş cilt üzerinde beyazlatıcı etki gösterir [41]. Ayrıca, diğer alifatik bileşiklerden farklı olarak, 9-HODE'nin tüm oksidasyon deneylerinde kararlı olduğu ve ROS hasarı üzerinde beyazlatıcı bir etkiye sahip olduğu bildirilmektedir [41]. Bu arada, trisin (5,7-dihidroksi- 2-(4-hidroksi-3,5-di-metoksifenil)-4H-kromen{{24 }}bir) antioksidan, antiviral ve antitümör/antikanser aktiviteleri gibi yararlı sağlık etkileriyle uzun zamandır bilinmektedir [42-44]. Mü et al. [45], pozitif kontrol olarak arbutin ile karşılaştırıldığında tirozinaz aktivitesi üzerinde daha iyi bir inhibitör etki gösterdiğini bildirdi. Ayrıca, Meng ve ark. [46], genç yeşil arpanın (Hordeum vulgare L.) metanol ekstraktından izole edilen trisinin, B16/F10melanom hücrelerinde melanin biyosentezini ve tirozinaz aktivitesini C-4' pozisyonundaki hidroksil grubu ve pozisyondaki metoksi grupları aracılığıyla inhibe ettiğini bildirmiştir. Trisin iskeletinin C-3',5' pozisyonları. 1-O-caffeoilgliserol, dikaffeoilgliseritler ve 1,3-O-dikaffeoilgliserol gibi fenilpropanoidler, bitkiler tarafından fenilalanin ve tirozinden sentezlenen organik bileşiklerdir. Fenilpropanoid ve bunların glikosillenmiş formlarının, ya doğrudan ROS'u süpürerek ya da zincir kırıcı peroksil radikal süpürücüleri olarak hareket ederek güçlü antioksidan oldukları rapor edilmiştir [47].

L-tirozine benzer bir kimyasal yapıya sahip olan p-kumarik asit, tirozinaz üzerindeki aktif bölgeler için L-tirozin ile rekabet eder [48]. Güçlü bir tirozinaz inhibitörü olarak bilinir ve anti-melanogenez etkisinin sinnamik asit gibi yapısal olarak benzer bileşiklerden daha güçlü olduğu bildirilmiştir [48]. Ayrıca An ve ark. [48], Sasa quelpaertensisNakai'nin bir bileşeni olan p-kumarik asidin, substrat olarak L-DOPA kullanarak tirozinaz aktivitesini inhibe ettiğini ve B16/F10 melanom hücrelerinde melanin üretimini azalttığını bildirdi. Bu nedenle, ESB'nin p-kumarik asit aracılığıyla mükemmel bir beyazlatma etkisine sahip olduğu düşünülebilir. Ayrıca, 1-O-kafeoilgliserol ve 1-3-O-dikaffeoilgliserolün MS spektrumları, m/z 179, 161 ve 135'te benzer parçalanma modelleri gösterdi ve bu parçalar kafeik asit kalıntısı olarak rapor edildi. Yaklaşık 326 nm'de bir λmax ile bir kafeik asit türevininkine benzer bir UV spektrumuna sahiptirler ve bu nedenle bir kafeik asit türevi olarak kabul edilirler [48]. Çeşitli bileşiklerin bir türevi olan kafeik asidin in vitro/in vivo güçlü bir antioksidan olduğu ve tirozinaz aktivitesini azalttığı vemelanogenezB16/F10 melanom hücrelerinde. Sonuç olarak, ESB'nin anti-melanojenik etkisinin aşağıdakilerden kaynaklandığı düşünülebilir.antioksidanlarve alifatik ve fenolik bileşikler gibi cilt beyazlatıcı maddeler.

cistanche'nin etkileri: anti-oksidasyon

5. Sonuçlar

Bir cilt beyazlatma ajanı olarak olasılığını değerlendirmek içinsorgum bicolorESB'nin IBMX kaynaklı melanogenez üzerindeki , antioksidan ve anti-melanojenik etkileri B16/F10 melanom hücrelerinde değerlendirildi. ESB önemli bir performans sergilediantioksidanABTS/DPPH radikal süpürme aktivitesindeki aktiviteler ve MDA inhibitör etkisi. ESB ilk adımı engelledimelanogenezsubstratlar olarak L-tirozin ve L-DOPA kullanılarak -glukozidaz ve tirozinaz inhibe edilerek. ESB'nin IBMX kaynaklı anti-melanojenik etkilerimelanogenezB16/F10 melanom hücrelerinde değerlendirildi ve sonuçlar ESB'nin B16/F10 melanom hücrelerinde IBMX kaynaklı melanogenezi inhibe ettiğini gösterdi. Melanin birikimi, IBMX ile indüklenen melanogenezde MITF ve tirozinaz gen ailesinin (tirozinaz ve TRP-1) ekspresyonunun aşağı regülasyonu ile inhibe edildi. ESB'nin ana bileşikleri1,3-O-di-kafeoil gliserol, trisin ve 9-HODE olarak analiz edildi. Sonuç olarak, ESB in vitro gösterdiantioksidanB16/F10 melanom hücrelerinde aktivite ve anti-melanojenik etki sağlar ve bu nedenle kozmetik pazarında cilt beyazlatıcı olarak kullanılabilir.

oksidasyon önleyicicistanche tabletleri