Farklı Zerdeçal Türlerinin Anti-tirozinaz Özellikleri ve Curcuma Amada'dan Aktif Bileşiklerin İzolasyonu

Jesmin Akter1 ● Md. Zahorul Islam1,2 ● Md. Amzad Hossain1 ● Kensaku Takara1

1 Ziraat Fakültesi, Ryukyus Üniversitesi, Okinawa, Japonya

2 Farmakoloji Anabilim Dalı, Veterinerlik Fakültesi, Bangladeş Ziraat Üniversitesi, Mymensingh, Bangladeş

Daha fazla bilgi için:Scotty.Wang@wecistanche.com

Soyut

Zerdeçal, geleneksel olarak Hint alt kıtasındaki bazı dini ve kültürel durumlarda cilt kozmetiği olarak kullanılır. Bu çalışmada, C. xanthorrhiza, C. aromatic, C. amada ve C. zedoaria olmak üzere dört Curcuma spp.'nin tirozinaz inhibitör özelliklerini karşılaştırdık. Silika jel kolonu ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanılarak tirozinaz inhibitörlerinin biyo-tahlil kılavuzluğunda izolasyonu ve saflaştırılması. Bileşiklerin yapısal tanımlaması 1H NMR, 13C kullanılarak yapıldı.

NMR ve sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi. C. amada, 53.4 ug/mL'lik bir IC50 ile en yüksek tirozinaz inhibe edici aktiviteyi göstermiştir. Bu nedenle, tirozinaz inhibitörlerinin izolasyonu ve saflaştırılması için seçilmiştir. Saflaştırılan bileşikler zederon (1), furanodienon (2), 1,5-epoksi-3-hidroksi-1-(3,4-dihidroksi-5-metoksifenil){ idi. {13}}(4-hidroksifenil) heptanlar (3), 3,5-dihidroksi-1-(3,4-dihidroksi fenil)-7-({{22) }}hidroksi-3-metoksifenil) heptanlar (4) ve 1,5- epoksi 3-hidroksi-1-(3,4-dihidroksi-5-metoksifenil) -7-(4-hidroksi-3-metoksifenil) heptanlar (5). Mantar için IC50 değerlerianti-tirozinazbileşik 1, 2, 3, 4 ve 5'in aktivitesi sırasıyla 108.2, 89.2, 92.3, 21.7 ve 41.3 uM idi. Bu bileşikler ayrıca hücre içi tirozinaz aktivitesini de inhibe ederek B16F10 melanom hücrelerinde melanin sentezini azaltır. Bileşik 4 önemli ölçüde daha güçlü gösterdianti-tirozinazarbutinden (pozitif kontrol ilacı) daha fazla aktivite. Bileşik 5 ve arbutin arasında tirozinaz inhibitör etkisinde önemli bir fark gözlenmedi. Bulgularımız, C. Amanda'nın melanogenezi önlemek için umut verici bir doğal tirozinaz inhibitörleri kaynağı olduğunu ve beyazlatıcı bir kozmetik olarak kullanılabileceğini kuvvetle göstermektedir.

Anahtar kelime: Curcuma amada ● Aktif bileşikler ● NMR ● Anti-tirozinaz ● Antimelanojenik

Canti-tirozinaz için Cistanche'ı yalayın

giriiş

Melanin, saç ve ciltteki siyah pigmenttir ve cildi UV ışınlarına karşı korumak için gereklidir. Pigment, melanogenez adı verilen fizyolojik bir süreçle dermisin bazal tabakasında bulunan melanosit hücreleri tarafından üretilir. Ancak anormal melanin üretimi, çiller, melazma, mercimek, yaşlılık lekeleri, efelidler ve postinflamatuar hiperpigmentasyon gibi dermatolojik bozukluklara neden olur [1]. Gıda endüstrisinde, meyve ve sebzelerin hiperpigmentasyonu, besin kalitesi ve piyasa değerinde önemli kayıplara yol açar [2]. Melanogenez, memelilerde, bitkilerde, mikroorganizmalarda ve mantarlarda melanin sentezi için hız sınırlayıcı bir enzim olan tirozinazın aktivitesini inhibe ederek kontrol edilebilir [3]. Bu nedenle tirozinaz aktivitesinin inhibisyonu hiperpigmentasyonu önler ve cilt beyazlamasına yol açar. Ayrıca sebze ve yiyeceklerin istenmeyen esmerleşmesini düzenleyerek sebze ve meyvelerin kalitesini kontrol eder. Hidrokinon, azelaik asit, kojik asit ve arbutin gibi çoğu cilt aydınlatıcı ajan, güçlü tirozinaz inhibitörleridir. Ancak sitotoksisite, okronozis, vitiligo, tahriş, deri soyulması ve kızarıklık gibi çeşitli istenmeyen etkileri vardır [4]. Ayrıca, kojik asit ve -arbutin, zayıf formülasyon stabilitesi ve cilt penetrasyon kabiliyeti ve in vivo düşük etkinlik gösterir [5]. Bazı organik ve inorganik cıva tuzları, anti-melanojenik etkilere sahiptir ve cilt beyazlatıcı ajanlarda kullanılır. Bununla birlikte, kutanöz absorpsiyon yoluyla cıva bileşikleri ciltte renk değişikliği, böbrek hasarı, alerjik reaksiyon ve yara izi gibi toksik etkilere neden olabilir [6]. Bu nedenle, daha az toksik ve daha etkili tirozinaz inhibitörlerinin araştırılmasına ihtiyaç vardır. Zerdeçal (aile: Zingiberaceae; cins: Curcuma), ağırlıklı olarak Asya ve Afrika'nın tropikal ve subtropikal bölgelerinde yetişen geleneksel bir tıbbi bitkidir, geniş bir farmakolojik işlev yelpazesine sahiptir. Hint yarımadasında binlerce yıldır evlilik öncesi ritüellerde cilt aydınlatma maddesi olarak geleneksel olarak kullanılmaktadır. Zerdeçalın yüzdeki kıl büyümesini, akneyi ve cilt yaşlanmasını azaltarak cilt rengini iyileştirdiğine inanılmaktadır [7, 8]. Bu nedenle zerdeçal ile takviye edilmiş cilt bakım ürünleri piyasada ticari olarak mevcuttur [9]. Farklı kimyasal ve farmakolojik özelliklere sahip 70'den fazla zerdeçal türü/çeşidi tanımlanmıştır. Bununla birlikte, farklı zerdeçal türlerinin anti-melanojenik özellikleri ve zerdeçalda bulunan potansiyel aktif bileşenler hakkında bilimsel bilgi eksikliği vardır. Kurkuminoidler, zerdeçalın biyolojik aktivitelerinin çoğundan sorumlu olan ana aktif bileşiklerdir. Curcuminoidler, kozmetikte potansiyel bir potansiyele sahiptir.antioksidan, antienflamatuvar,ve cilt rengi açıcı ajan [7, 8]. Bununla birlikte, önceki bir çalışmada, zerdeçaldaki kurkuminoid içeriğinde önemli farklılıklar bulduk ve bazı türler (C. amada, C. zedoaria) kurkumin bile içermedi [10]. Ayrıca mantar önleyiciyi de bildirdik,antioksidan, ve farklı tür ve zerdeçal çeşitlerinin vazodilatör aktiviteleri [10-13]. Bu nedenle bu çalışmada, zerdeçalın farklı türleri olan C. xanthorrhiza, C. aromatica, C. amada ve C. zedoaria'nın tirozinaz enzimi üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi ve bu enzimden sorumlu spesifik kimyasal bileşiklerin belirlenmesi amaçlanmıştır.anti-tirozinazaktivite. Ayrıca saflaştırılmış aktif bileşiklerin B16F10 melanom hücrelerinde melanin sentezi üzerindeki tirozinaz inhibitör aktivitesini ve anti-melanojenik etkilerini de değerlendirdik.

sonuçlar ve tartışma

Dört farklı zerdeçal türü arasında, C. amada'nın MeOH özütü, 53.4 ± 2.7 IC50 değeri ile maksimum mantar tirozinaz inhibitör etkisini gösterdi, ardından C. xanthorrhiza, C. aromatic ve C. zedoaria (Şekil 1a). Curcumin, zerdeçalın (Curcuma longa) ana aktif bileşenidir ve kanser önleyici, iltihap önleyici, bakteri önleyici, mantar önleyici ve antioksidan aktiviteler dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik aktivitelere sahiptir. Arbutin ve kojik asitten 75-kat daha güçlü anti-tirozinaz aktivitesi gösterdi [14]. Bununla birlikte, daha önceki bir çalışmada, farklı zerdeçal türlerinde kurkumin içeriğinde önemli farklılıklar olduğunu bildirmiştik [10].

Curcumin, C. xanthorrhiza ve C. aromatic'te mevcuttu, ancak C. zedoaria ve C. amada'da yoktu [10]. Bu çalışmanın ilginç bulguları, kurkumin olmadan C. amada'nın güçlü tirozinaz inhibitör aktivite göstermesidir. Bu sonuç, güçlü anti-tirozinaz etkisine atfedilen C. amada'nın bazı aktif bileşiklerinin olması gerektiğini göstermektedir. C. xanthorrhiza ve C. aromatica'nın anti-tirozinaz aktivitesi, içeriğindeki kurkumin nedeniyle olabilir. Ancak, diğer bileşiklerin mevcudiyeti olasılığını dışlayamadık. C. amada'nın MeOH özütü, su, n-heksan ve EtOAc ile fraksiyonlandı. Bu üç fraksiyon arasında EtOAc, su ve n-heksandan önemli ölçüde daha güçlü bir inhibitör etki gösterdi (Şekil 1b). Bu nedenle, daha fazla fraksiyonlama için EtOAc kısmı alındı. Altı fraksiyonun anti-tirozinaz aktiviteleri [n-heksan:EtOAc; 100:0 (F1), 80:20 (F2), 60:40 (F3), 40:60 (F4), 20:80 (F5) ve 0:100 (F6)] elde edildi C. amada'nın EtOAc kısmından karşılaştırılmıştır. Bu altı fraksiyon arasında, F6 ve F3, diğerlerinden önemli ölçüde daha yüksek anti-tirozinaz aktivitesi gösterdi (Şekil 1c). Daha sonra, F3 ve F6 fraksiyonlarından beş bileşiğin kimyasal yapıları,1H NMR ve 13C NMR spektrumlarına göre tanımlandı. Tepe verileri şu şekildeydi:

Bileşik 1:

Renksiz iğne şekli kristali; UV λmax: nm 234, 285. ESI-MS (artı) m/z: 247.3 [M artı H] artı , 229.4 [ M artı H-H2O] artı . 1H-NMR (CD30D): δ 7.22 (1H, s, H-12), 5.59 (1H, br d, J=12 Hz, H{{20}}) , 3.99 (1H, s, H-5), 3.85 (1H, d, J=16 Hz, H-9a), 3.69 (1H, d, J=16 Hz, H-9b), 2.57 (1H, dddd, J=13, 13, 12, 4 Hz, H-2a), 2.26 (1H, m, H{{46 }}a), 2.20 (1H, m, H{{50}}b), 2.09 (3H, s, H-13), 1.57 (3H, s, H-15), 1.32 (1H, ddd, J=13, 13, 4 Hz, H-3b), 1.28 (3H, s, H-14). 13C-NMR (CD30D): δ 194.2(C-6) 160.2(C-8), 139.7(C12), 132.8 (C-1), 132.0(C-10 ), 124.3(C-11), 123.0(C-7), 67.8(C-5), 65.2(C-4), 42.5(C-9 ), 39.0(C-3), 25.4(C-2), 15.7 (C-15), 15.4(C-14), 10.7(C-13 ) (Yardımcı veriler). Bu verilerin literatürde [15, 16] bildirilenlerle karşılaştırılmasından, madde zederon olarak tanımlandı (Şekil 2). Bir seskiterpendir, daha önce C. amada ve C. zedoaria'dan izole edilmiştir ve analjezik, anti-inflamatuar, anti-fungal ve sitotoksik etkileri bildirilmiştir [12, 17-20].

Bileşik 2:

Renksiz yağ; UV λmax: nm 243, 280. ESIMS ( artı ) m/z: 231.0 [M artı H] artı , 223.3 [M artı H-H2O] artı . 1H-NMR (CD30D): 8 7.16 (1H, s, H-12), 5.83 (1H, s, H-5), 5.21 (1H, dd, J=12 Hz , 5 Hz, H-1), 3,73 (1H, d, J=16 Hz, H-9a), 3,63 (1H, d, J=16 Hz, H -9b), 2.45 (1H, ddd, J=15 Hz, 11 Hz, 4 Hz, H-3a), 2.31 (1H, m, H-2a ), 2.20 (1H, dddd, J=12 Hz, 12 Hz, 12 Hz, 4 Hz, H-2b), 2.06 (3H, s, H{{57} }), 1,92 (3H, s, H-14), 1,89 (1H, m, H-3b), 1,25 (3H, s, H-15). 13C-NMR (CD30D): 8 191.8 (C-6), 158.6 (C-8), 147.6 (C-4), 140.0 (C-12), 136.1 ( C-10), 133.3 (C-5), 132.0 (C-1), 124.6 (C-11), 123.1 (C-7), 42.4 ( C-9), 41.4 (C-3), 27.3 (C-2), 19.3 (C-14), 15.9 (C-2), 9.9 ( C-13) (Ek Veriler). Bu verilerin literatürde [21] bildirilenlerle karşılaştırılmasından, madde furanodienon olarak tanımlandı (Şekil 2). Lindera pulcherrima (Nees.) Benth'den izole edilmiştir. eski kanca. f [22], Curcuma zedoaria [19], Curcuma amada [12] ve Curcuma wenyujin [23]. Anti-fungal [12], anti-inflamatuar [19], anti-kanser [24], anti-bakteriyel ve anti-oksidan aktiviteler [22] sergileyen bir furanoseskiterpenoiddir.

Bileşik 3:

Sarımsı yağ; UV λ max: nm 275. ESIMS (artı) m/z: 383.3 [M artı Na] artı , 361.3 [M artı H] artı , 343.2 [M artı H-H2O] artı . 1H-NMR (CD30D): δ 6.99 (2H, dd, J=9, 2 Hz, H-2´´, -6´´), 6.67 (2H, d, J=9 Hz, H-3´´, -5´´), 6,52 (2H, s, H-2´, -6´), 4,63 (1H , br b, J=12 Hz, H-1), 4.21 (1H, m, H-3), 3.89 (1H, m, H-5), 3.85 ( 3H, s, 5´-OCH3), 2.63 (2H, m, H-7), 1.82 (1H, m, H-2a), 1.78 (1H, m, H{{6{ {107}}}}a), 1,73 (1H, m, H-2b), 1,69 (1H, m, H-4a), 1,68 (1H, m, H{{72} }b), 1.53 (1H, m, H-4b). 13C-NMR (CD3OD): δ 156.3 (C-4´´), 149.5 (C-5´), 146.4 (C-3´), 134.5 (C-4 ´), 134.44 (C-1´), 134.41 (C-1´´), 130.4 (C-2´´, -6´´), 116.1 (C{ {104}´´, -5´´), 108.0 (C-2´), 102.8 (C-6´), 75.2 (C-1), 72.6 ( C-5), 65.6 (C3), 56.6 (5´-OCH3), 41.1 (C-2), 39.5 (C-4), 39.2 (C-6) 31.8 (C-7) (Ek Veriler). Bu verilerin literatürde [25] bildirilenlerle karşılaştırılmasından, madde 1,5-epoksi-3-hidroksi-1-(3,4-dihidroksi{5-epoksi-3- olarak tanımlandı. {145}} metoksifenil)-7-(4-hidroksifenil) heptanlar (Şekil 2). Zingiber officinale'nin rizomlarından izole edilmiş ve antioksidan özellikleri incelenmiştir [25].

Bileşik 4:

viskoz şurup; UV λ max: nm 281. ESIMS (artı) m/z: 385.3 [M artı Na] artı , 363.3 [M artı H] artı , 345.2 [M artı H-H2O] artı . 1H-NMR (CD30D): δ 6.75 (1H, d, J=2 Hz, H-2´), 6.68 (1H, d, J=8 Hz, H{{21) }}´), 6.64 (1H, J=8 Hz, H-5´´), 6.61 (1H, J=2 Hz, H-2´´), 6.60 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H-6´), 6.49 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H-6´´), 3.80 (3H, s, 3´-OCH3), 3.73 (2H, m, Y-3, -5), 2.64-2.47 (4H, m, H{{59) }}a, -1b, -7a, -7b), 1.71-1.65 (4H, m, H-2a, {{ 68}}b, -6a, -6b), 1,61 (2H, m, H-4a, -4b). 13C-NMR (CD3OD): 8 148.8 (C-3´), 146.1 (C-3´´), 145.4 (C-4´), 144.2 (C-4 ´´), 135.24 (C-1´ veya C-1´´), 135.22 (C-1´ veya C-1´´), 121.8 (C{{101 }}´), 120,6 (C-6´´), 116.5 (C-2´´), 116.3 (C-5´´), 116.1 (C-5´ ), 113.2 (C-2´), 70.94 (C-3 veya C-5), 70.92 (C-3 veya C-5), 56.4 (3 ´-OCH3), 44.9 (C-4), 40.8 (C-2, -6), 32.3 (C-1), 32.1 (C-7) (Yardımcı veriler). Bu verilerin literatürde [26, 27] bildirilenlerle karşılaştırılmasından, madde, yağ 3,5-dihidroksi-1-(3,4-dihidroksifenil){{150 olarak tanımlandı. }} (4-hidroksi-3-metoksifenil) heptanlar (Şekil 2). Tacca chantrieri [26] ve Curcumalonga L.'nin [27] rizomlarından izole edilmiştir. Bunlar sitotoksik [26] ve anti-tümör [27] aktiviteler sergileyen diarilheptanoidlerdir.

Bileşik 5:

Renksiz yağ; UV λ max nm: 279. ESI-MS (artı) m/z: 413.3 [M artı Na] artı , 391.3 [M artı H] artı , 373.3 [M artı HH2O] artı . 1H-NMR (CD30D): δ 6.76 (1H, s, H-2´´), 6.67 (1H, d, J=8 Hz, H{{20}} ´´), 6.21 (1H, dd, J=8, 2 Hz, Y-6´), 6.53 (2H, s, H-2´, -6´´ ), 4.63 (1H, br d, J=12 Hz, H-1), 4.21 (1H, m, H-3), 3.83 (3H, s, 5´-OCH3) , 3.78 (3H, s, 3-OCH3), 2.65 (2H, m, H-7), 1.84 (1H, m, H-2a), 1.79 (1H, m, H-6a), 1,74 (1H, m, H-2b), 1,69 (1H, m, H-4a), 1,68 (1H, m, H{{ 75}}b), 1.53 (1H, m, H-4b). 13C-NMR (CD30D): δ 149.5 (C-5´), 148.8 (C-3´´), 146.4 (C-3´), 145.4 (C-4 ´´), 135.3 (C-1´), 135.2 (C-1´´), 134.4 (C-4´), 121.9 (C-6´´), 116.1 (C-5´´), 113.4 (C-2´´), 108.0 (C-2´), 102.7 (C-6´), 75.2 (C{ {121}}), 72.5 (C-5), 65.6 (C-3), 56.6 (5´-OCH3), 56.3 (3´´-OCH3), 41.2 (C{{140} }), 39.4 (C-4), 39.3 (C-6), 32.2 (C-7) (Ek Veri). Bu verilerin literatürde [20] bildirilenlerle karşılaştırılmasından, madde 1,5-epoksi-3-hidroksi-1-(3,4-dihidroksi{ olarak tanımlandı. {157}}metoksifenil)- 7-(4-hidroksi-3-metoksifenil) heptanlar (Şekil 2) ve biyolojik aktiviteleri hakkında bilgi yoktur. Bileşik 3, 4 ve 5'i ilk kez C. amada'dan izole ettik. Tüm bileşikler mantar tirozinazına karşı inhibitör aktivite göstermiştir.

Beş bileşik, yani zederon, furanodienon, 1,5-epoksi-3-hidroksi-1-(3,4-dihidroksi-5-metoksifenil)- 7-( 4-hidroksifenil) heptanlar, 3,5-dihidroksi-1-(3,4-bulaşık hidroksifenil)-7-(4-hidroksi-3- metoksifenil) heptanlar ve 1,5-epoksi-3-hidroksi-1-(3,4-dihidroksi-5-metoksifenil)- 7-(4- hidroksi-3-metoksifenil) heptanlar, F3 ve F6 fraksiyonlarından izole edildi. İzole edilen bileşikler, konsantrasyona bağlı bir şekilde anti-tirozinaz aktivitesi gösterdi. Beş bileşik arasında, bileşik 4, arbutinden önemli ölçüde daha güçlü anti-tirozinaz aktivitesi gösterdi. Bileşik 5 ve arbutin arasında anti-tirozinaz etkilerinde önemli farklılıklar yoktu (Şekil 3). İzole edilen bileşiğin hücresel canlılık üzerindeki etkileri, B16F10 murin melanom hücreleri üzerinde incelenmiştir. Hücreler, 48 saat boyunca 50, 100, 200 ve 400 uM bileşik konsantrasyonları ile işlendi. İzole edilen bileşikler 200 μM'ye kadar sitotoksik etkiler göstermedi, ancak tüm durumlarda 400 μM konsantrasyonda hücresel ölümlerin yaklaşık yüzde ellisi gözlendi (Şekil 4). Bu nedenle, hücre içi antitirozinaz ve anti-melanojenik etkilerini değerlendirmek için 200 μM'ye kadar konsantrasyonlar kullanıldı.

İzole edilen bileşiklerin anti-melanojenik ve anti-tirozinaz aktivitelerini belirlemek için, B16F10 melanom hücrelerinde melanin içeriği ve tirozinaz aktivitesi üzerindeki etkileri değerlendirildi. Tablo l'de gösterildiği gibi, izole edilmiş bileşiklerimiz doza bağlı olarak hücre içi melanin içeriğini ve tirozinaz aktivitesini inhibe etti. Bileşik 4, hem melanin hem de tirozinaz inhibe edici etkilerde pozitif kontrol ilacı arbutinden önemli ölçüde daha güçlüydü. Bileşik 5 ve arbutin arasında önemli bir fark gözlenmedi. Hücresel tirozinaz, melanin üretimini arttırdığından, tirozinaz aktivitesinin azaltılması, anti-melanojenik ajanların geliştirilmesi için etkili bir stratejidir. Bunun için B16F10 melanom hücrelerinde hücre içi tirozinaz aktivitesinin ve melanogenezin inhibitör özelliklerini değerlendirdik. Mantar tirozinaz inhibitör aktivitesinin bulgularına benzer şekilde, izole edilmiş bileşikler, hücre içi tirozinaz aktivitesini ve melanogenezi doza bağlı bir şekilde inhibe eder. İzole edilen bileşiklerin anti-tirozinaz etkileri, onların anti-melanojenik özellikleri ile sonuçlanmıştır. Bu bileşiklerin anti-tirozinaz ve anti-melanojenik aktivite sırası, bileşik 4 > arbutin > 5 > 2 > 3 > 1 şeklindeydi. Bileşik 4'ün hesaplanan IC50 değeri, arbutininkinden önemli ölçüde düşüktü. Bileşik 4'ün etkinliği, diğer dört bileşiğe göre 1.9- ila 5-kat daha yüksekti. Bileşik 5 ayrıca arbutininkiyle karşılaştırılabilir olan güçlü anti-tirozinaz aktivitesi gösterdi. Sonuçlarımız, bileşik 4 ve 5'in potansiyel doğal tirozinaz inhibitörleri ve cilt beyazlatıcı kozmetikler olarak kullanılabileceğini gösterdi. Melanin aşırı üretiminin altında yatan mekanizmada oksidatif stresin rol oynadığı öne sürülmüştür [28]. Bu nedenle, fotokarsinogenez veya melanom dahil olmak üzere çok çeşitli cilt bozukluklarında antioksidan rolü araştırılmıştır [9]. Biz ve diğerleri, izole bileşiklerin antimelanojenik etkilerinden sorumlu olabilecek C. amada'nın [13, 29] antioksidan özelliklerini daha önce bildirmiştik. Bu çalışmada, izole edilen bileşiklerin hücre içi melanin sentezi ve -MSH tarafından indüklenen tirozinaz aktivitesi üzerindeki inhibitör etkilerini tespit ettik. Bu nedenle, izole edilmiş bileşiklerimiz, etkili cilt beyazlatma tedavileri geliştirmek için fonksiyonel kozmetiklerde ajanlar olarak kullanılabilir.

Çözüm

C. amada'nın etkili bir tirozinaz inhibitörü olarak önemli bir rol oynayabileceğini kuvvetle öneriyoruz. C. amada ve biyoaktif bileşikleri kozmetik endüstrisinde doğal beyazlatıcı ajanlar olarak, gıda endüstrisinde kahverengileşmeyi önleyici ajanlar olarak ve hiperpigmentasyon tedavisi için tıbbi alanda kullanılabilir. Bununla birlikte, hayvan modellerinde izole edilen bileşiklerin anti-melanojenik etkilerini araştırmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.

Malzemeler ve yöntemler

kimyasallar

Mantar ve arbutinden elde edilen tirozinaz, Sigma–Aldrich Chemical Co.'dan (St. Louis, MO, ABD) satın alındı. L-Tirozin, Wako saf kimya sanayi Ltd.'den (Osaka, Japonya) idi. Metanol (MeOH), etil asetat (EtOAc) ve n-heksan, Nacalai Tesque'den (Kyoto, Japonya) satın alındı. Silika jel (63–200 um, Kanto Chemical Co. Tokyo, Japonya) ve MeOH-d4 (CD3OD, Merck KGaA, Almanya) satın alındı.

Bitki materyali hazırlama Dört farklı zerdeçal türü, C. xanthorrhiza, C. aromatica, C. amada ve C. zedoaria, gri topraklı bir tarlada yetiştirildi (kaba kum yüzde 3,6, ince kum yüzde 30%0,9 , silt yüzde 24,3 , kil yüzde 32,8 , pH 7,4, NO{{10}}N yüzde 0,07 , NH4-N yüzde 0,08 , P 4.6 ng/g, K 42.9 ng/g) Subtropikal Alan Bilim Merkezi, Ryukyus Üniversitesi, Okinawa, Japonya. Ekim döneminde ortalama aylık sıcaklık, nem ve yağış sırasıyla 17-29 derece, yüzde 61-83 ve 22-369 mm idi. Gübreleme ve sulama dahil olmak üzere ortak agronomik uygulamalar sağlandı. Türlerin tüm sürgünleri tamamen kuruduğunda rizomlar hasat edildi. Rizomlar yıkandı, dilimlendi ve 72 saat boyunca 50 derecede sıcak hava fırınında kurutuldu.

Örneklerin çıkarılması

Ekstraksiyonlar, farklı zerdeçal tozunun (300 g) MeOH (3 L) içinde oda sıcaklığında (25 derece) ve atmosfer basıncında çözülmesiyle gerçekleştirildi ve hava ile oksidasyonu ve güneş ışığından korunmayı önlemek için sürekli manyetik karıştırma ile iki gün tutuldu. Çözücüde çözünür bileşikler, filtre kağıdı (No. 2, Advantec, Tokyo Roshi Kaisha Ltd., Tokyo, Japonya) kullanılarak süzüldü. Kullanılan bitki materyaline taze çözücüler (MeOH) eklenmiş ve işlem üç kez tekrarlanmıştır. Bitki bileşiklerini içeren filtrelenmiş çözeltiler, 40 derecede düşük basınç altında döner buharlaştırıcı ile kurutuldu. Tüm ekstraktların verimi deneysel analizler için buzdolabında 4 derecede muhafaza edilmiştir.

Tirozinaz inhibisyon deneyi

Tirozinaz önleme aktivitesi, tirozinaz enziminin tirozin substratı üzerindeki etkisiyle üretilen DOPA kromunun konsantrasyonunu ölçen önceki yönteme [30] göre belirlendi. Kısaca, farklı konsantrasyonlar (25, 50 ve 100 µg/mL) elde etmek için test numunesi yüzde 80 MeOH içinde çözündürüldü. 96-kuyu plakası şu sırayla kuruldu: 120 μL fosfat tamponu (20 mM, pH 6.8), 20 μL numune ve 20 μL mantar tirozinaz (20 mM fosfatta 500 U/mL). tampon). 25 derecede 15 dakika inkübasyondan sonra 20 µL 0.85 mM L-tirozin solüsyonu eklenerek reaksiyon başlatıldı ve ardından 25 derecede 10 dakika inkübe edildi. Tirozinaz aktivitesi, bir mikroplaka okuyucu (Biotek Powerwave XS2 spektrofotometre) kullanılarak 470 nm'de absorbans ölçülerek belirlendi. Pozitif kontrol olarak Arbutin kullanılırken, negatif kontrol olarak yüzde 80 MeOH kullanıldı. Tirozinaz inhibisyon yüzdesi aşağıdaki gibi hesaplandı:

burada C, negatif kontrolün absorbansı, B, körün absorbansı ve S, test numunesinin absorbansıdır.

Curcuma amada'nın ham özünden biyoaktif bileşiklerin izolasyonu

Dört zerdeçal özütünün sonuçları göz önüne alındığında, C. amada, diğerlerinden önemli ölçüde daha yüksek anti-tirozinaz aktivitesi gösterdi. Bu nedenle, C. amada'nın ham özünden aktif bileşiklerin biyo-tahlil kılavuzluğunda saflaştırılması gerçekleştirilmiştir. Anti-tirozinaz bileşiklerini belirlemek için, C. amada'nın ham özünden fraksiyonlama, Şekil 5'te tarif edildiği gibi gerçekleştirildi. Ham özüt, damıtılmış su ile seyreltildi ve daha sonra n-heksan ile özü çıkarıldı, ardından EtOAc ile özümlendi. Her bir çözücünün eşit hacimleri ve ham özüt çözeltisi daha sonra bir ayırma hunisinde 3 dakika çalkalanarak karıştırıldı. Tüm fraksiyonlar, 40 derecede döner bir buharlaştırıcı ile kuruyana kadar konsantre edildi. Bu üç fraksiyonun anti-tirozinaz aktiviteleri, yukarıdaki prosedüre göre belirlendi. EtOAc fraksiyonu en yüksek anti-tirozinaz aktivitesini gösterdiğinden, biyoaktif bileşiğin izolasyonu ve saflaştırılması için seçildi. Aktif EtOAc fraksiyonu kuruyana kadar buharlaştırıldı ve bir silika jel (75 g) kolonu (30 x 3 cm) üzerinde kromatografiye tabi tutuldu. Elüsyon, artan miktarlarda EtOAc [100:0 (F1), 80:20 (F2), 60:40 (F3), 40:60 (F4), 20:80 (F5) ile birlikte n-heksan ve EtOAc kullanılarak gerçekleştirildi. ve 0:100 (F6)]. Bu altı fraksiyonun anti-tirozinaz aktivitesi yukarıdaki prosedüre göre gerçekleştirildi ve çoğu aktivite F3 ve F6'da bulundu. Fraksiyonlar F3 ve F6, 2.5 mL akış hızı ile mobil faz olarak su ve asetonitril ile donatılmış C18 ters fazlı HPLC (COSMOSIL 5C18-AR-II; Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japonya) ile saflaştırıldı. min-1, 280 nm'de tespit edildi.

F3'ten gelen üç tepe noktası 9.55, 13.66 ve 16.47 dakikada ayrıştırıldı ve F6'dan dört tepe noktası 11.56, 12.20, 12.75 ve 15'te ayrıştırıldı.03 dakikada renksiz beyaz maddeler olarak ayrıştırıldı, bunların inhibitörü aktivite, F3'ten 9.55 ve 16.47 dakikada ve F6'dan 11.56, 12.75 ve 15.03 dakikada (Ek Veri) ayrıştırılan beş tepe fraksiyonunda tespit edildi (Şekil 5). İzole edilen bileşikler (~10 mg) MeOH-d4 içinde çözündürüldü ve daha sonra spektral analize tabi tutuldu. Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektrumları, oda sıcaklığında BRUKER NMR spektrometrelerinde (1H için 500 MHz ve 13C için 125 MHz) kaydedildi. Kimyasal kaymalar (δ), dahili standart olarak tetrametilsilana (TMS) göre milyonda parça (ppm) olarak kaydedildi. Kütle spektrometrisi deneyleri, aşağıdaki aletsel koşullar altında bir elektrosprey iyonizasyon (ESI - MS) probu kullanılarak bir Waters Kütle Spektrometresi üzerinde gerçekleştirilmiştir: Sütun: COSMOSIL 5C18-AR-II, (2 x 150) mm. Solvent A: Su (yüzde 0.1 formik asit), Solvent B: asetonitril, akış hızı: 4 mL/dk, enjeksiyon hacmi: 100 µL, çalışma süresi: 35 dak, F3 için zaman programı: yüzde 75 B (0 dak) → 75 yüzde B (20 dak) → yüzde 100 B (20,1 dak) → yüzde 100 B (27 dak) → yüzde 75 B (27,1 dak) → yüzde 75 B (35 dak). F6 için zaman programı: yüzde 45 B (0 dak) → yüzde 45 B (14 dak) → yüzde 100 B (14,1 dak) → yüzde 100 B (20 dak) → yüzde 45 B (20,1 dak) → yüzde 45 B (25 dk). Pompa modu: İkili gradyan. Fırın detayları: CTO-20AC, sıcaklık 40 derece . MS iyonizasyon modu: ES (artı), kılcal voltaj: 4.0 kV, koni voltajı: 20 V, kaynak sıcaklığı: 120 derece, desolvasyon sıcaklığı: 350 derece, koni gaz akışı: 100 L/h, desolvasyon gazı akışı: 800 L /h (Ek Veriler).

İzole edilen bileşiklerin anti-tirozinaz aktivitesi

İzole edilmiş bileşikler, her bir bileşik için 5, 10, 30, 50, 100 ve 200 uM konsantrasyonlarda MeOH içinde çözülmüştür. Anti-tirozinaz aktivitesi, daha önce açıklanan prosedür kullanılarak belirlendi.

İzole bileşikler tarafından tirozinaz ve melanogenezin hücre içi inhibisyonu

Hücre kültürü

B16F10 melanom hücreleri, yüzde 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ve yüzde 1 penisilin (10,000 U/mL)/streptomisin (100 ug/mL) ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle's ortamında (DMEM) kültürlendi. yüzde 5 CO2 içeren nemli bir atmosferde 37 derecede.

Hücre canlılığı

B16F10 hücreleri, bir 96-kuyu plakasında 5 x 104 hücre/kuyu yoğunluğunda kaplandı. 24 saat sonra hücreler, izole edilmiş bileşiğin çeşitli konsantrasyonlarına maruz bırakıldı ve 48 saat daha 37 derecede inkübe edildi. İnkübasyonun ardından hücre canlılığı MTS tahlili ile belirlendi. Yirmi mikrolitre MTS solüsyonu eklendi ve 60 dakika inkübe edildi. İnkübasyondan sonra, hücrelerin absorbansı bir mikroplaka okuyucu (Benchmark Plus) kullanılarak 490 nm'de belirlendi.

İzole edilen bileşiklerin anti-tirozinaz ve anti-melanojenik aktiviteleri

Hücresel melanin içeriğinin belirlenmesi ve tirozinaz aktivite deneyleri, hafif modifikasyonlarla daha önce tarif edildiği gibi [31] yapıldı. B16F10 melanom hücreleri, bir 96-yuvalı plakada 5 x 104 hücre/kuyu yoğunluğunda kaplanmıştır. 24 saat sonra hücreler, izole edilmiş bileşik veya arbutinin çeşitli konsantrasyonlarına maruz bırakıldı. 1 saat sonra, 100 nM -melanosit uyarıcı hormon (-MSH) ilave edildi ve hücreler, 37 derecede 48 saat daha inkübe edildi. Anti-tirozinaz aktivite çalışması için hücreler daha sonra buz gibi soğuk fosfat tamponu ile yıkandı ve yüzde 1 Triton-X (90 uL/kuyucuk) içeren fosfat tamponu (pH 6.8) ile parçalandı. Plakalar -80 derecede 30 dakika donduruldu. Çözüldükten ve karıştırıldıktan sonra, her bir kuyucuğa 10 μL yüzde 1 L-DOPA ilave edildi. 37 derecede 2 saat inkübasyonun ardından absorbans 490 nm'de ölçüldü. Melanin içeriği tahlili için hücreler iki kez fosfat tamponu ile yıkandı ve daha sonra yüzde 10 DMSO içeren 100 uL NaOH (1 N) içinde çözüldü. Örnekler 80 derecede 1 saat inkübe edildi ve melanini çözündürmek için karıştırıldı. Karışık homojenatın optik yoğunluğu 490 nm'de ölçülmüştür.

istatistiksel analiz

Sonuçlar ortalama ± SEM olarak ifade edilir. İki ortalama arasındaki istatistiksel farklar Student t-testi ile değerlendirildi. Tek yönlü bir varyans analizi ve ardından Bonferroni testi kullanılarak çoklu karşılaştırmalar yapıldı. Farklılıklar P < 0.05'te="" önemli="" kabul="">

Bu bizim yorgunluk önleyici ürünümüz! Daha fazla bilgi için resme tıklayın!

Referanslar

1. Solano F, Briganti S, Picardo M, Ghanem GH. Hipopigmente ajanlar: biyolojik, kimyasal ve klinik yönler hakkında güncellenmiş bir inceleme. Pigment Hücresi Araş. 2006;19:550–71.

2. Loizzo MR, Tundis R, Menichini F. Esmerleşme önleyici maddeler olarak doğal ve sentetik tirozinaz inhibitörleri: Bir güncelleme. Compr Rev Gıda Bilimi Gıda Saf. 2012;11:378–98.

3. Lin YS, Chen HJ, Huang JP, Lee PC, Tsai CR, Hsu TF, et al. Viti'nin vinifera yaprağı ekstrelerini kullanarak tirozinaz inhibitör aktivitesinin kinetiği. Biomed Arş. 2017:5232680.

4. Manini P, Napolitano A, Westerhof W, Riley PA, d' Ischia M. Cilt depigmentasyon ajanı monobenzonun tirozinaz katalizli oksidasyonu ile üretilen reaktif bir orto-kinon: self-coupling ve tiyol-konjugasyon reaksiyonları ve melanosit için olası çıkarımlar toksisite. Kimyasal Res Toksikol. 2009;13:1398–405.

5. Couteau C, Coiffard L. Cilt beyazlatma ajanlarına genel bakış: ilaçlar ve kozmetik ürünler. Makyaj malzemeleri. 2016;3:27.

6. Al-Saleh I, Shinwari N, El-Doush I, Billedo G, Al-Amodi M, Khogali F. İki farklı marka cıva cilt aydınlatıcı kremle tedavi edilen albino ve pigmentli farelerin çeşitli dokularındaki cıva düzeylerinin karşılaştırılması. Biyometaller: Int J rolü Met iyonları Biol, Biochem, Med. 2004;17:167–75.

7. Gopinath H, Karthikeyan K. Zerdeçal: bir çeşni, kozmetik ve tedavi. Hint J Dermatol Venereol Leprol. 2018;84:16–21.

8. Vaughn AR, Branum A, Sivamani RK. Zerdeçalın (Curcuma longa) cilt sağlığı üzerindeki etkileri: klinik kanıtların sistematik bir incelemesi. Fitoter Araş. 2016;30:1243–64.

9. Baliga MS, Katiyar SK. Seçilmiş diyet botanikleriyle fotokarsinogenezin kemoprevensiyonu. Photochem Photobio Sci. 2006;5:243–53.

10. Akter J, Hossain MA, Sano A, Takara K, İslam MZ, Hou DX. Çeşitli tür ve zerdeçal türlerinin (Curcuma spp.) Fusarium Solani Sensu Lato'ya karşı antifungal aktivitesi. Pharm Chem J. 2018;52:292–7.

11. Akter J, Islam MZ, Hossain MA, Kawabata S, Takara K, Nguyen H, et al. Domuz serebral arterinin farklı zerdeçal türleri ve suşları tarafından endotelden bağımsız ve kalsiyum kanalına bağlı gevşemesi. J Gelenek Tamamlayıcı Med. 2018;9:297–303.

12. Akter J, Takara K, İslam MZ, Hossain MA, Sano A, Hou DX. Curcuma amada'dan antifungal bileşiklerin izolasyonu ve yapısal aydınlatılması. Asya Pac J Trop Med. 2019;12:123–9.

13. Akter J, Hossain MA, Takara K, İslam MZ, Hou DX. Farklı tür ve zerdeçal çeşitlerinin (Curcuma spp) antioksidan aktivitesi: Aktif bileşiklerin izolasyonu. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharm. 2019;215:9–17.

14. Khunlad P, Tundulawessa Y, Supasiri T, Chutrtong W. Zerdeçal tozundan (Curcuma longa Linn.) curcuminoidlerin tirozinaz inhibe edici aktivitesi. J SWU Sci. 2008;24:125–39.

15. Giang PM, Oğlu PT. Vietnam Curcuma aromatik Salisb'in rizomlarından seskiterpenoidlerin izolasyonu. J Chem. 2000;38:96–9.

16. Asem SD, Laitonjan SW. Curcuma caeca Roxb rizomundan zederonun yapı-doğrusal olmayan ilişkisinin araştırılması. Ind J Chem. 2012;51:1738–42.

17. Faiz Hossain C, Al-Amin M, Rahman KM, Sarker A, Alam MM, Chowdhury MH, et al. Curcuma amada'dan analjezik prensip. J Etnofarmakol. 2015;163:273–7.

18. Ahmed Hamdi OA, Syed Abdul Rahman SN, Awang K, Abdul Wahab N, Looi CY, Thomas NF, Abd Malek SN. Curcuma zedoaria'nın rizomlarından sitotoksik bileşenler. Bilim Dünyası J. 2014;2014:321943.

19. Makabe H, Maru N, Kuwabara A, Kamo T, Hirota M. Curcuma zedoaria kaynaklı antiinflamatuar seskiterpenler. Nat Prod Arş. 2006;20:680–5.

20. Kikuzaki H, Nakatani N. Zingiber officinale rizomlarından siklik diarilheptanoidler. Fitokimya. 1996;43:273–7.

21. Dekebo A, Dagne E, Sterner O. Commiphora sphaerocarpa'dan Furanosesquiterpenes ve gerçek mür ile ilgili katkı maddeleri. Fitoterapi. 2002;73:48–55.

22. Joshi SC, Mathela CS. Yaprak esans yağının antioksidan ve antibakteriyel aktiviteleri ve Lindera pulcherrima'dan (Nees.) Benth'in bileşeninin furanodienone ve curzerenone. eski kanca. f. Farmakogn Arş. 2012;4:80–4.

23. Yang FQ, Li SP, Zhao J, Lao SC, Wang YT. Üç tür Curcuma rizomunda dokuz seskiterpenoidin aynı anda belirlenmesi için analitlerin çözünürlüğüne ve stabilitesine dayalı GC-MS koşullarının optimizasyonu. J Pharm Biomed Anal. 2007;43:73–82.

24. Li YW, Zhu GY, Shen XL, Chu JH, Yu ZL, Fong WF. Furanodienon, insan meme kanseri MCF-7 hücrelerinde ER sinyalini baskılayarak hücre çoğalmasını ve hayatta kalmasını engeller. J Hücre Biyokimyası. 2011;112:217–24.

25. Tao QF, Xu Y, Lam RY, Schneider B, Dou H, Leung PS, et al. Zingiber officinale'nin rizomlarından diarilheptanoidler ve bir monoterpenoid: antioksidan ve sitoprotektif özellikler. J Nat Prod. 2008;71:12–17.

26. Yokosuka A, Mimaki Y, Sakagami H, Sashida Y. Tacca chantrieri rizomlarından yeni diarilheptanoidler ve diarilheptanoid glukozitler ve sitotoksik aktiviteleri. J Nat Prod. 2002;65:283–9.

27. Jiang JL, Jin XL, Zhang H, Su X, Qiao B, Yuan YJ. Bileşim-aktivite ilişkisine dayalı olarak Curcuma longa L. kaynaklı kurkuminoidlerdeki antitümör bileşenlerinin tanımlanması. J Pharm Biomed Anal. 2012;70:664–70.

28. Marrot L, Meunier JR. Cilt DNA fotohasarı ve biyolojik sonuçları. J Am Acad Dermatol. 2008;58:139–48.

29. Policegoudra RS, Abiraj K, Channe Gowda D, Aradhya SM. Mango zencefili (Curcuma amada Roxb.) köksapından antioksidan ve antibakteriyel bileşiğin izolasyonu ve karakterizasyonu. J Chromatogr B Anal Technol Biomed Life Sci. 2007;852:40–8.

30. Tadtong S, Viriyaroj A, Vorarat S, Nimkuntat S, Suksamrarn S. Mangosten perikarp ekstraktının antitirozinaz ve antibakteriyel aktiviteleri. J Sağlık Arş. 2009;23:99–102.

31. Li X, Guo L, Sun Y, Zhou J, Gu Y, Li Y. Baicalein, ERK sinyal yolunun aktivasyonu yoluyla melanogenezi engeller. Int J Mol Med. 2010;25:923–7.