Kazakistan Cumhuriyeti'nde Büyüyen Cistanche Salsa Stolons'un Antinosiseptif Aktivitesi

Bitki materyali

Cistanche salsa(CAMey.) Beck, Orobanchaceae,Temmuz 2014'te Almatı'da Bakanas Köyü, Moinkum çölünde stolonlar toplandı. Bitki materyali, 01-04/306 numarası altında depolandığı Kazakistan Cumhuriyeti Eğitim ve Bilim Bakanlığı Botanik ve Bitkisel Giriş Enstitüsünden Dr. G. Sitpayeva tarafından tanımlandı.

Kimyasal analiz

Stolons ofsalsa(2 g) bir mikrodalga ekstraksiyonuna tabi tutuldu. Başlangıçta malzeme 0.001–2.{4}} mm'ye öğütüldü ve daha sonra yüzde 80 etanol ( oran 1:10). Hidroetanol özütü (CSHE), HPLC-MS ile analiz edildi. Ham öz, metanol (9.6 mg/ml) içinde çözüldü ve 0.45'lik bir filtreden süzüldü.mm Teflon membran analizden önce. Akan vakumlu gaz giderici, dört kanallı düşük basınçlı gradyanlı pompa ve otomatikenjektör. Fenolik bileşikler, bir kolon Zorbax Eclipse XDB-C18, 2.1 ile kromatografik olarak ayrıldı.× 50 mm, oktadesilsilil silika jelpolimer (1.8) ile doldurulmuşu). Kromatografik analiz, 0.2 mobil faz akışıyla gerçekleştirildi.ml/dak, eluent çalışma basıncı 175–200 kPa, kolon fırın sıcaklığı 30 derece, 2 ml numune hacmi, gradyan eluent besleme modu: 0–36 dak yüzde 10 A – yüzde 90 B; 36 dakika – yüzde 100 B (eluent A: metanol, eluent B: yüzde 0,2 formik asit solüsyonu). Tespit UV ile 254, 334, 350, 410, 450 ve 550 dalga boylarında gerçekleştirildi.nm. Elde edilen alıkonma süreleri, UV ve kütle spektrumlarının referans bileşiklerinkilerle karşılaştırılması, ekstrakttaki kimyasal bileşiklerin tanımlanmasında kullanılmıştır. Kantitatif analiz, standart verbascoside kullanılarak yapıldı.ve ekinakozit aynı kromatografik koşullar altında analiz edilmiştir. Kalibrasyon eğrileri fenilpropanoidlerin birbiri ile miktarının hesaplanmasına olanak sağlamıştır.Bu bitkinin etanol ekstraktındaki glikozit. Yöntem doğrulanmadı.

Hayvanlar

İsviçre Webster fareleri (20–25g, iki aylık) bu çalışmada kullanılmıştır (Instituto Vital Brezilya, Niterói, RJ, Brezilya tarafından bağışlanmıştır). Hayvanlar standart koşullarda (12 saat aydınlık-karanlık döngüsü, 22 ± 2 derece ve yüzde 70-80 nem) tutuldu. Yem ve suistenildiği kadar). Madde emilimi ile gıda etkileşimini önlemek için hayvanlara sadece su verildi 12deneylerin başlamasından önce h. Laboratuvar koşullarına alışma en az 1 kez olmuştur. Her testten önce h. Tüm protokoller, Hayvanlarda Deneysel Ağrının İncelenmesi için Etik Standartlara İlişkin Kılavuz İlkelere uygun olarak yürütüldü ve Ulusal Kontrol Konseyi tarafından kabul edilen ilke ve yönergeleri takip etti.tarafından onaylanan Hayvan Deneyleri (CONCEA),Biyomedikal Bilim Enstitüsü/UFRJ, Hayvan Araştırmaları Etik Kurulu ve DFBCICB015-04/16 numarasını aldı. Tüm deney protokolleri, ışık fazı sırasında gerçekleştirildi. Grup başına hayvan sayısı minimumda ve CONCEA kurallarına göre tutuldu. Her deneyin sonunda fareler, ketamin/ksilazin aşırı dozu ile öldürüldü.

Tedaviler

Bu çalışmada CSHE 10, 30 ve 100'de değerlendirildi mg/kg. Ekstrakt, 100°C'de bir stok çözelti hazırlamak için dimetil sülfoksit (DMSO, Fisher Biotech) içinde çözüldü. mg/ml. Farklı dozların hazırlanmasında seyreltici olarak PBS kullanıldı. 10, 30 ve 100 içeren çözümlermg/kg hidroetanol ekstresisalsahazırlandık. Kullanılan standart ilaçlar morfin 2.5 idi.mg/kg (Merck, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde seyreltilmiş), asetilsalisilik asit 200mg/kg (Sigma Aldrich, 5 ile çözülmüşM sodyum hidroksit(NaOH) 0,9 yüzde salin) ve kapsazepin 10 Pençe başına nMol. Negatif kontrol grubuna salin artı DMSO (özüt ile en yüksek muameledekiyle aynı konsantrasyonda) verildi. Tüm tedaviler (test edilen ekstrakt ve standartlar) oral yoldan uygulandı. Tek istisna, intraplantar enjeksiyonla uygulanan kapsazepindi.

Formalin kaynaklı akut ağrı

Yüzde 2,5 formalin (% 37 formaldehit) solüsyonu enjekte edildi (20ul) farelerin sağ arka ayağının plantar bölgesinde 60işlemden dakika sonra (hidroetanol ekstraktısalsaveya asetilsalisilik asit 200 mg/kg veya morfin 2,5 mg/kg) (Matheus ve diğerleri, 2005). Hayvanlar ayrı ayrı şeffaf bir cam odaya yerleştirildi ve formalin enjeksiyonundan sonra pençelerini yalamak için harcadıkları saniye cinsinden süre kaydedildi ve iki ayrı dönem boyunca analiz edildi, erken faz-nörojenik ağrı (enjeksiyondan 0-5 dakika sonra) ve geç faz enflamatuar ağrı (enjeksiyondan 15-30 dakika sonra).

Kapsaisin tarafından indüklenen nosisepsiyon

Bu test, Sakurada ve diğerleri tarafından açıklanan yönteme dayanıyordu. bazı değişikliklerle (Sakurada ve diğerleri, 1992). Kapsaisin (20 ul) C18H27HAYIR3(Galena, Campinas, SP), tedaviden (hidroetanol ekstraktı) bir saat sonra farelerin sağ arka ayağının plantar bölgesine (1.6 ug/pati) enjekte edildi.salsaveya kapsazepin 10 nMol/pençe). Hayvanlar ayrı ayrı cam bir odaya yerleştirildi ve 0 ile 5 arasında pati yalama süresi/süreleri kaydedildi.kapsaisin enjeksiyonundan dakika sonra analiz edildi.

Glutamatın neden olduğu nosisepsiyon

Beirith ve arkadaşları tarafından açıklanan yöntemde. (2002), PBS (20 ul) içindeki glutamat solüsyonu (l-glutamik asit, Sigma-Aldrich, 3.7 ng/pati), tedaviden bir saat sonra farelerin sağ arka ayağının plantar bölgesine enjekte edildi (hidroetanol ekstresisalsaveya morfin 2.5 mg/kg). Hayvanlar ayrı ayrı bir cam odaya yerleştirildi ve glutamat enjeksiyonundan 0 ile 15 dakika sonra pati yalama süresi (saniyeler) kaydedildi ve ardından analiz edildi.

istatistiksel analiz

Kimyasal veriler, beş deneyin ortalama ± SD'si olarak sunulur. Tüm farmakolojik deney grupları en az altı fareden oluşuyordu. Tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Dunnett testi, GraphPad Prism 5.0 yazılımı kullanılarak gruplar arasındaki istatistiksel anlamlılığın görselleştirilmesine olanak sağladı.pdeğerler, 0,05'ten () küçük olduklarında anlamlı kabul edildip < 0.05).

Tartışma

Toplamda on fenilpropanoid glikozit tanımlanmıştır.salsa(Kazakistan'da yetişen) hidroetanol özü. Echinacoside (10.98 mg/g), acteoside (9.44 mg/g) ve tubuloside B (7.94 mg/g) tanımlanan başlıca bileşiklerdi. Elde edilen veriler, türler için mevcut literatür ile ilişkilendirildi.CistancheAsya'nın farklı bölgelerinde yetişmektedir (Zhou ve diğerleri, 2014, Xie ve diğerleri, 2005, Jiang ve diğerleri, 2009). Echinacoside ve acteoside, resmi türlerin standardizasyonu için temel oluşturan ana bileşenlerdir.C. DeserticolaveC. tubulosa2005 yılında Çin Farmakopesinde listelenmiştir. Bu bileşiklerin standardizasyon için de kullanılabileceğini öneriyoruz.salsaincelenen hidroetanol ekstraktında başlıca olanlar olduğu için Kazakistan'dan gelen stolonlar.

Bu çalışmanın farmakolojik sonuçlarına göre CSHE'nin formalin testinde de görüldüğü gibi nörojenik ağrı ve inflamasyona karşı etkili bir ajan olduğunu söylemek mümkündür. Bizim bildiğimiz kadarıylasalsaantinosiseptif etkileri açısından hiç test edilmemiştir. 2002 yılında yapılan bir araştırmaC. Deserticola(Lin ve diğerleri, 2002) bu bitkinin, toplam kıvranma, formalin ve pençe ödemi gibi modellerde analiz edildiğinde antinosiseptif ve antiinflamatuar aktiviteler gösterdiğini göstermiştir.. Aktif olan ekstraktlardaki ana bileşenleri araştırmak için herhangi bir girişimde bulunulmamasına rağmen, bütanol ekstraktı ve su tabakasını aktif olarak kabul ettiler. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, bu çözücüler, fenilpropanoid ile eşleşen polarite ölçeğindedir.bulunan glikozitlersalsa. Ayrıca, Lin ve arkadaşları, antinosiseptif etkisininC. Deserticolaekstraktlar, opiat reseptöründeki bileşiğin etkisinden kaynaklanmamıştır.veya bağışıklık sistemi ile ilgili. Çalışmamızda fenilpropanoid açısından zengin ekstrakt, formalin testinin her iki fazında da aktivite göstermiştir. Gözlemlenen aktivite aslında araştırılan farmakolojik hedefe bağlıydı ve rota çubuk testi ile kanıtlandığı gibi herhangi bir olası motor değişikliğinden kaynaklanmıyordu. Formalin test sonuçları, nörojenik ağrının yanı sıra neden olduğu ağrı potansiyelini gösterir.enflamatuar mediatörler. Başlangıçta nörojenik ağrı yolunu araştırmaya karar verdik. Daha önce çalışılan diğer türlerden benzer bileşikler herhangi bir opiat reseptör aktivitesi göstermediğinden, Glutamat ve kapsaisin modelleri gibi diğer modelleri test etmeye karar verdik.

Glutamat uyarıcı bir nörotransmiterdirperiferik ve merkezi sinir sistemi boyunca ağrıyı modüle etmede önemli bir role sahiptir. Bu eyleme ligand kapılı iyonotropik glutamat reseptörleri aracılık eder(iGluR'ler) ve metabotropik glutamat reseptörleri. iGluR'ler ayrılabilirN-metil-d-aspartat (NMDA) ve -amino-3-hidroksi-5-metilizoksazol-4-propiyonik asit (AMPA) (Kolber, 2015)). Araştırmalar, NMDA ve AMPA reseptörlerini ketamin ile antagonize ederken vekainat, sırasıyla, bir antinosisepsiyon etkisi gözlenir. Ancak şimdiye kadar bu reseptörleri hedef alan antagonistler önemli bir yan etki oluşturmuş ve bu nedenle bu reseptör aracılığıyla sağlanan ilaçların daha az yan etkiye neden olacağı umuduyla mGluR'ler üzerine yeni bir araştırma yapılmıştır.Palazzo ve diğerleri, 2014). CSHE testinin sonuçları, bu tedavinin glutamatın neden olduğu ağrıyı azaltmada etkili olduğunu gösterdi. Bununla birlikte, bu etkinin iyonotropik ve/veya metabotropik reseptörler aracılığıyla olup olmadığı hala bilinmemektedir. Morfin, glutamaterjik geçiş üzerinde etkisi olan mevcut ilaçlardan biridir (Deyama ve ark., 2007).). Literatürde glutamat reseptör aktivasyonunun TRPV1 yanıtlarını arttırdığı bildirilmektedir (Szteyn ve diğerleri, 2015). Bu nedenle, CSHE için gözlemlenen etkinin, glutamat reseptörleri üzerindeki doğrudan bir yanıt yoluyla değil, TRPV1 üzerindeki aktiviteden kaynaklanması mümkündür.

Bu araştırmanın bir sonraki adımı, aljezik ajan olarak bir TRPV1 reseptörü agonisti olan kapsaisin kullanılarak bir pati yalama testi gerçekleştirmekti. Sonuçlar, CSHE'nin gerçekten de TRPV1 reseptörü aracılığıyla ağrıyı azalttığını gösterdi.

CSHE durumunda, test edilen neredeyse tüm metodolojilerde, 30 mg/kg'lık dozun 100 mg/kg'dan daha iyi sonuçlar verdiğini gözlemleyebildik. Bunun nedeni, çökeltilmiş bileşiklere yol açan çözeltinin doygunluğu ve etkili bir şekilde daha az miktarda ilacın biyoyararlılığı olabilir.

Kazak özü CSHE için belirlenmiş kimyasal bileşimin onaylanması önemli bir adımdı çünkü içinde bulunan ana bileşenlerin antinosiseptif/antiinflamatuar etkileri bir şekilde zaten onaylanmıştır. Örneğin, ekinacoside, antinosiseptif etkiden sorumlu aktif prensiplerden biri olarak kurulmuştur.Ekinezyagiller(Hostettmann, 2003). Ayrıca, Schapoval ve arkadaşları tarafından yapılan önceki bir çalışma (Schapoval ve diğerleri, 1998), akteositin, akteosit ile hazırlanan bir etanol ekstraktındaki ana aktif prensiplerden biri olduğuna işaret etmiştir.Stachytarpheta cayennensispençe ödemi ve sıcak plaka modelleri ile değerlendirildiği gibi. Backhouse ve arkadaşları (Backhouse ve diğerleri, 2008) ayrıca akteozidi aktif madde olarak kabul ettiler.Buddlejaglobosaformalin testi de dahil olmak üzere çeşitli ağrı değerlendirme modelleri kullanarak. Akteozidin stabilitesini artırmak ve antinosiseptif etkisini uzatmak için en son teknoloji bilgisi kullanılarak yeni formülasyonlar geliştirilmektedir (Isacchi ve ark., 2016).

Çözüm

Kazak dışkılarında fenolik yapıdaki 10 madde tespit edildisalsaHPLC/MS analizi ile. Bu bileşikler, burada gerçekleştirilen deneysel modellerde gözlenen antinosiseptif aktiviteden sorumlu olabilir. Kazakistan topraklarında cinsin olduğu dikkate alındığındaCistancheesas olarak türler tarafından temsil edilirsalsa, Geleneksel Çin Tıbbı için kaliteli bir hammadde kaynağı olarak standart bileşikler olarak echinacoside ve acteoside kullanılarak hasat edilmesini ve standardizasyonunu önerebiliriz.