Yaşlanmış Hücrelerin Apoptoz Direnci, Kardiyak Glikozitlerin Neden Olduğu Senoliz İçin İçsel Bir Bariyerdir

Lütfen iletişime geçinoscar.xiao@wecistanche.comdaha fazla bilgi için

SoyutYaşlanan hücrelerin hedefli olarak ortadan kaldırılması, analiz, yaşlanma karşıtı tedavideki temel eğilimlerden biridir. Kardiyak glikozitlerin yakın zamanda geniş spektrumlu senolitikler olduğu kanıtlanmıştır. Burada kardiyak glikozitlerin senolitik özelliklerini insan mezenkimal kök hücrelerine (hMSC'ler) doğru test ettik. Kardiyak glikozitler, çeşitli kökenlerden yaşlanmış hMSC'lere karşı hiçbir senolitik yeteneğe sahip değildi. Biyolojik ve biyoinformatik yaklaşımları kullanarak 'kardiyak glikozitlere duyarlı' A549 ve 'duyarsız' hMSC'lerde yaşlanma gelişimini karşılaştırıyoruz. Analizin yokluğunun, yaşlanan hMSC'lerde etkili potasyum ithalatı ve artan apoptoz direncinin aracılık ettiği bulundu. Zayıflama "antiapoptotik savunma", hMSC'leri analiz etmeye yatkın hale getirir. Daha önce yaşlanmanın ortak bir özelliği olarak kabul edilen apoptoz direncinin aslında yaşlanan hücrelerin genel bir özelliği olmadığını ortaya koyduk. Ayrıca, yalnızca apoptoz-prolin yaşlanan hücreler, kardiyak glikozit kaynaklı analize duyarlıdır. Bu nedenle, analizin etkinliğinin, yaşlanan hücrelerin çoğalan muadillerine kıyasla gerçekten apoptoza dirençli olup olmadığına bağlı olabileceğini tahmin edebiliriz.

anahtar kelimelerKök hücreler. Senoliz·Yaşlanma·Apoptozis·Stres direnci

Daha fazla bilgi için lütfen buraya tıklayın

giriiş

Günümüzde hücresel yaşlanma, kanser ve kök hücreler de dahil olmak üzere hemen hemen tüm çoğalan hücrelerin ve ayrıca bazı post-mitotik hücrelerin çeşitli stresli uyaranlara karşı ortak bir tepkisi olarak kabul edilir [1-3]. Aşağıdaki hücresel yaşlanma türleri, indükleyici faktörün kökenine göre ayırt edilebilir: replikatif (kısaltılmış telomer uçlarındaki DNA hasarı nedeniyle), onkojen kaynaklı (onkojenik sinyallemenin anormal aktivasyonuna yanıt olarak), stres kaynaklı ( oksidatif stres, ısı şoku, UV ve y radyasyonu vb.'nin neden olduğu DNA hasarının aracılık ettiği ve kemoterapinin neden olduğu (kemoterapötik ilaçlara yanıt olarak kanser hücrelerinde aktive olan)[4-7]. Hem hücre tipine hem de yaşlanmayı indüklemek için kullanılan bir hakarete bağlı olarak yaşlanan hücreler tarafından ifade edilen belirteçlerde heterojenlik vardır. Bununla birlikte, çoğu yaşlanan hücre tipi için tipik olan birkaç ortak özellik vardır. Her tür bölünen hücre için yaşlanmanın temel özelliği, geri dönüşümsüz çoğalma kaybıdır [8].cistanche tubulosa özüHücre döngüsü durmasının geri döndürülemezliği, sikline bağımlı kinaz (CDK) inhibitörleri pl6 ve p21 tarafından kontrol edilir ve sıklıkla tümör baskılayıcı protein p53 tarafından düzenlenir [8,9]. Yaşlanmış hücrelerin diğer önemli özellikleri, kalıcı bir DNA hasar yanıtının aktivasyonudur; genellikle bozulmuş ribozomal biyogenez ve protein sentezinin bir sonucu olarak ortaya çıkan hücre hipertrofisi; lizozomal bozulmanın bozulması ve dinlenme bozunma sistemlerinin işlevsizliği; spesifik lizozomal enzim yaşlanma ile ilişkili- -galaktosidazın artan aktivitesi; çeşitli mitokondriyal değişiklikler; proinflamatuar faktörlerden, matrisi parçalayan enzimlerden, reaktif oksijen türlerinden vb. oluşan yaşlanmayla ilişkili salgı fenotipinin (SASP) edinimi; yaşlanma ile ilişkili heterokromatik odakların oluşumu ve yaşlanma ile ilişkili uyduların şişmesi [8-10] dahil epigenetik ve kromatin peyzaj değişiklikleri. Başka bir deyişle, yaşlanan hücreler metabolik aktiviteyi ve canlılığı korur, ancak işlevleri, köken hücreleri.

Cistanche yaşlanmayı geciktirebilir

Artık yaşlanan hücrelerin, hem komşu hücreleri hem de hücresel nişleri etkileyen çevredeki mikro-ortamı değiştirebildiği ve bunun da doku fonksiyon bozukluğuna yol açabileceği ve bu nedenle yaşlanma ve yaşa bağlı hastalıkların ilerlemesi ile ilişkili olabileceği açıktır [11,12]. Bunu akılda tutarak, günümüzde yaşlanan hücrelerin[13-15] hedeflenen "öldürülmesine" yönelik stratejilere daha fazla odaklanılmaktadır. Bu amaçla, senolitik olarak adlandırılan yeni bir ilaç sınıfı aktif olarak geliştirilmektedir. Senolitikler, yaşlanan hücrelerin apoptoza karşı direncine katkıda bulunan sinyal yollarını hedefler, böylece tercihen yaşlanmış hücrelerde apoptozu indükler[16]. Senolitiklerin listesi sürekli olarak yeni ajanlarla yenileniyor. Belirtilen senolitik aktiviteye sahip en bilinen bileşikler, navitoclax (Bcl-2 ailesi inhibitörü), dasatinib(birçok tirozin kinaz inhibitörü) ve kersetin (doğal bir flavonol), Hsp90 inhibitörleri, MDM2 inhibitörleri, FOXO{ kombinasyonudur. {8}}p53 engelleyici peptit, bir BET ailesi protein indirgeyici, uPAR'a özgü CAR-T, galakto-konjuge navitoklaks ve çeşitli senolitik doğal bileşikler[16-24]. Son zamanlarda, yüksek verimli ilaç taraması kullanarak, iki bağımsız araştırma grubu, kardiyak glikozitleri, özellikle ouabain, digoksin ve bufalini geniş spektrumlu senolitikler olarak tanımladı [25,26].cistanche tubulosa incelemeleriBildirilen neredeyse tüm senolitiklerin, istenmeyen yan etkiler veya bazı hücre tiplerine karşı etkisizlik gibi sınırlamaları olduğunu belirtmekte fayda var. Hemen hemen tüm doğum sonrası organlarda/dokularda bulunan mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), kendini yenileme (simetrik bölünmeler) ve farklılaşma kapasitesi ile karakterize edilir, böylece kalıcı dokunun korunmasına ve yenilenmesine katkıda bulunur [27]. Güçlü anti-inflamatuar ve immünosupresif fonksiyonların yanı sıra bu benzersiz özellikler nedeniyle, MSC'ler, diyabet Mellitus, multipl skleroz, miyokard enfarktüsü ve benzeri gibi çeşitli hastalıkların tedavisi için hücre replasman tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır [28]. Bununla birlikte, farklılaşmış soylarına ve diğer unipotent hücrelerine benzer şekilde, MSC'ler, onkogenlerin aktivasyonuna ve stresli uyaranlara yanıt olarak replikatif veya zamanından önce yaşlanabilirler [29, 30]. MSC'lerin yaşlanması, aralarında tükenmenin de bulunduğu pek çok istenmeyen sonuçlara sahiptir. kök hücre havuzunda azalma, doku bakımı ve rejenerasyonunun azalması, farklılaşma kapasitesinin bozulması, SASP aracılı yaşlanma yayılması, azaltılmış anjiyojenik özellikler, kök hücre nişinin modifikasyonu [29,31-33]. Uygun MSC'lerin işleyişinin biyolojik önemi göz önüne alındığında, yaşlanan MSC'ler analiz için çok önemli bir hedef olarak düşünülebilir. Bu öneri doğrultusunda, geçen yıl içinde yaşlanan MSC'lerin çıkarılmasının olası avantajlı sonuçlarını vurgulayan bir dizi inceleme yayınlanmıştır [29, 31,34,35]. Bununla birlikte, bu konuyla ilgili yalnızca birkaç deneysel veri vardır [36-40].

Bu çalışmada, kardiyak glikozitlerin, yani ouabain ve bufalin'in, endometriumdan (END-MSC'ler), yağ dokusundan (AD-MSC'ler) türetilen insan MSC'lerine (hMSC'ler) karşı hemolitik aktivite göstermediğini ilk kez gösterdik. dental pulpa (DP-MSC'ler) ve Warton jöle (WJ-MSC'ler). Ayrıca, daha önce açıklandığı gibi, her iki kardiyak glikozitin de yaşlanmış A549 ve SK-HEP-1'de tercihen apoptozu indükleyebildiğini onaylıyoruz. pilot çalışmalarda [25,26]. Nat/K artı -ATPase blokajının neden olduğu iyonik homeostazdaki değişiklikleri ve ilgili genlerin ekspresyon seviyelerini değerlendirerek, ouabain ile indüklenen analizin yokluğunun, yaşlanan END-'de telafi edici K artı ithalatının arttırılmış etkinliğine aracılık edebileceğini ortaya koyuyoruz. Yaşlanan A549 ile karşılaştırıldığında MSC'ler. Ayrıca, gelişmiş biyoinformatik kullanarak, ouabain kaynaklı analize dirençli END-MSC'lerin yaşlanmasına apoptoza dirençli fenotip ediniminin eşlik ettiğini, oysa ouabain duyarlı A549'un yaşlanmasının olmadığını gösterdik. Önemli olarak, kardiyak glikozit tedavisinden önce antiapoptotik protein MCL-1 aktivitesinin bloke edilmesi, apoptoza dirençli yaşlanan END-MSC'lerin analiziyle sonuçlandı. Bu nedenle, apoptoz direncinin yaşlanan hücrelerin genel bir özelliği olmadığına dair net kanıtlar sunuyoruz. Elde edilen verilere dayanarak, analitik yaklaşımların etkinliğinin, hücrelerin yaşlanma gelişimi sırasında gerçekten apoptoza dirençli olup olmadığına bağlı olabileceği sonucuna vardık.

Malzemeler ve yöntemler

hücreler

END-MSC'ler, WJ-MSC'ler, DP-MSC'ler, AD-MSC'ler, A549 ve SK-Help, Rus Hücre Kültürleri Koleksiyonundan (Sitoloji Enstitüsü, Saint-Petersburg, Rusya) elde edildi. A549 ve SK-Help hatları, karyoloji, tümörijenite, izoenzim (LDH ve G6PD) testleri ve STR analizi ile doğrulandı. Hücreler, yüzde 10 FBS (HyClone), yüzde 1 penisilin-streptomisin (Gibco BRL) ve yüzde 1 glutamik (Gibco BRL) ile desteklenen tam ortam DMEM F12(Gibco BRL) içinde kültürlendi. Tüm hücreler rutin olarak mikoplazma kontaminasyonu için test edildi.

Yaşlanma ve strese neden olan koşullar

Oksidatif stres kaynaklı yaşlanma için, END-MSC'ler/WJ-MSC'ler 1 saat boyunca 200 uM/100 uM HO(Sigma) ile işlendi. Doksorubisin kaynaklı yaşlanma için DP-MSC'ler/A549, 3 gün boyunca 1 uM doksorubisin （Veropharm） ile tedavi edildi. Her durumda, hücreler tedaviden 14 gün sonra yaşlanmış olarak kabul edildi. Replikatif yaşlanma için 4. pasajdan önceki AD-MSC'ler kontrol hücreleri olarak ve 10. pasajdan sonra yaşlanmış olanlar olarak tanımlandı. Etoposide bağlı yaşlanma için A549/END-MSC'ler/SK-Help, 3 gün boyunca 2 uM/5 uM/3 uM etoposid (Veropharm) ile tedavi edildi ve yaşlanma indüksiyonundan en az 7 gün sonra analiz edildi. Bu durumda, tedavi tasarımı, RNA-seq verilerinin kaynaklandığı çalışmada açıklananlarla tamamen örtüşmüştür (Wang ve diğerleri, 2017). Senolitik bileşikler olarak uyguladığımız iki kardiyak glikozit——Ouabain (Sigma) ve Bufalin(Calbiochem).

Kontrol ve yaşlanmış END-MSC'ler veya A549 arasındaki stres direncini karşılaştırmak için hücreler, 1 saat boyunca 400/800 uM H02(Sigma) veya 0.3/1 uM staurosporin (Sigma) ile işleme tabi tutuldu. Hücre canlılığı, stres indüksiyonundan 48 saat sonra analiz edildi.

MCL-1 aktivitesini engellemek için END-MSC'ler 3 gün boyunca 10 uM A-1210477(Sigma) ile ön işleme tabi tutuldu.

Akış sitometrisi analizi

Hücre canlılığı, proliferasyon, hücre boyutu, oto-floresans, apoptoz oranları, kaspaz 3/7 bölünmesi, mitokondriyal membran potansiyeli ve membran depolarizasyonunun ölçümleri akış sitometrisi ile gerçekleştirilmiştir. Akış sitometrisi CytoFLEX (Beckman Coulter) kullanılarak yapıldı ve elde edilen veriler CytExpert yazılım versiyonu 2.0 kullanılarak analiz edildi. Yapışkan hücreler, iki kez PBS ile durulandı ve tripsinizasyon ile toplandı. Ayrılan hücreler havuzlandı ve taze ortamda yeniden süspanse edildi ve daha sonra sayıldı ve otofloresan için analiz edildi. Hücre canlılığına erişmek için, analizden hemen önce her numuneye 50 ug/ml propidium iyodür (Life Technologies) eklenmiştir. Hücre boyutu, PI-negatif hücrelerin sitometrik ileri ışık saçılımı ile değerlendirildi. Apoptoz indüksiyonu, üretici talimatları izlenerek Annexin-V-APC (Invitrogen) ve DAPI (Sigma) birlikte boyama kullanılarak doğrulandı. Kaspaz aktivitesi, üretici protokolü izlenerek CellEventTM Caspase-3/7 Green Flow Sitometri Test Kiti (Invitrogen) kullanılarak değerlendirildi. Mitokondriyal membran potansiyeli kaybı, oransal boya JC-1 (Invitrogen) kullanılarak değerlendirildi. Boyama prosedürü, üreticinin protokolüne uygun olarak gerçekleştirildi. Membran depolarizasyonu için bir DiBAC4(3)floresan probu (Invitrogen) kullandık.

Senesans ile ilişkili -galaktosidaz boyama

Yaşlanmayla ilişkili -Galaktosidaz (SA- -Gal) boyaması, üreticinin talimatlarına göre bir yaşlanma -galaktosidaz boyama kiti (Hücre Sinyalleme Teknolojisi) kullanılarak yapıldı. MatLab paketinin uygulanmasıyla görüntülerin nicel analizi, daha önce açıklanan algoritmaya göre üretildi[41]. Her deney noktası için, rastgele seçilmiş 50'den az olmayan hücre analiz edildi.

Western blotlama

Western blotlama daha önce tarif edildiği gibi yapıldı [41]. SDS-PAGE elektroforezi, bir nitroselüloz membrana transfer ve ECL (Thermo Scientific) ile immünoblotlama tespiti, standart üretici protokollerine (Bio-Rad Laboratories) göre yapıldı. Aşağıdaki proteinlere karşı antikorlar kullanıldı: gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH)(klon 14C10), fosfo-p53(Ser15), p21(klon 12D1), fosfo-Rb (Ser807/811) , HMGB1(klon D3E5) ve ayrıca yaban turpu peroksidaz konjuge keçi antitavşan IgG'si. Seyreltme oranları, tüm birincil antikorlar için 1:1000 ve ikincil olanlar için 1:7000 idi. Tüm antikorlar Cell Signaling'den satın alındı. Scion Image 4.0 (Scion Corporation), tüm jeller ve lekelerdeki bantların arka plandan çıkarılan yoğunluğunu seçmek ve belirlemek için kullanıldı.

transkriptomik analiz

Aşağıdaki üç Gene Expression Omnibus (GEO)RNA-seq veri setinden örnekler analizde kullanıldı: buna göre GSE102639(GSM2742113-GSM2742114 ve GSM2742121-GSM2742122kontrol ve senescentA549cells); GSE122081(GSM3454482-GSM3454484 ve buna göre kontrol ve yaşlanma IMR-90 hücreleri için GSM3454500-GSM3454502); ve veri kümemiz GSE160702 (sırasıyla kontrol ve yaşlanan END-MSC'ler için GSM4877895-GSM4877898 ve GSM4877907-GSM4877910). Tüm veri setleri için veriler aynı şekilde işlendi.

Ham okuma verileri, varsayılan seçenekler kullanılarak BBtools paketinden (sürüm 38.75) FilterByTile ve BBDuk komut dosyaları aracılığıyla kaliteli filtreleme ve adaptör kırpma işleminden geçmiştir. Kalan okumalar ayrıca FastqPuri paketinden (sürüm 1.0.7) bir trimester komut dosyası kullanılarak filtrelendi ve kırpıldı.cistanche İngiltereKırpma işlemi, N'ler içeriyorsa veya kaliteleri 27'ye ayarlanan kalite eşiğinin altındaysa, okumaların her iki ucu için uygulandı, 25 bazdan daha kısa olan tüm okumalar atıldı. Kırpmanın kalite kontrolü FastQC yazılımı (sürüm 0.11.7) ve FastqPuri komut dosyaları ile yapıldı. Tüm işlemleri geçen okumalar, ilk verilerin en az yüzde 90'ını oluşturur.

Transkript bollukları, seçici hizalama modunda çalışan Somon hafif haritalaması (versiyon 1.1.0) kullanılarak tahmin edildi. Tuzakların listesi, Gencode insan referans genomu GRCh38.p13'e (sürüm 33) dayalı olarak oluşturuldu ve ayrıca, 21'lik bir kmer boyutu kullanılarak birleştirilmiş transkriptom ve genom Gencode referans dosyaları (sürüm 33) üzerinde indeks oluşturmak için kullanıldı. Eşleme işlemleri yürütüldü. ek bayraklarla——numBootstraps 30——sequins——gcBias—— eşlemeleri doğrular. Ortaya çıkan haritalama oranları yüzde 70 civarındaydı.

Daha fazla veri işleme, Tidyverse paket koleksiyonuyla (sürüm 1.3.0) R sürüm 3.6.3 kullanılarak gerçekleştirildi. Tahmini gen sayıları, meta veriler ve transkript aralıkları R'ye yüklendi ve tximeta (versiyon 1.4.5) kullanılarak bir gen seviyesinde özetlendi. Elde edilen sayım matrisi, tüm numunelerde en az 5 tahmini sayıma sahip satırlar içerecek şekilde filtrelendi, sonuçtaki matris 20,400 gen içeriyordu.

PCA ve ısı haritası gösterimi için, okuma sayıları DESeq2 paketinden (sürüm 1.26.0) log dönüşümü kullanılarak normalleştirildi.cistanche wirkungIsı haritaları, gen filtresi(versiyon 1.38.0) ve ısı haritası(versiyon 1.0.12)R paketleri kullanılarak oluşturulmuştur. Bölünme örneklerinin yaşlanma değişkenine göre doğrulanması, Gen Ontolojisi terimi "Hücresel yaşlanma" (GO 0090398) ile ilgili genler tarafından normalleştirilmiş okuma sayılarının alt kümelenmesi yoluyla gerçekleştirilmiştir. Diferansiyel ifade analizi ve log kat değişiklikleri tahmini, hücre yaşlanma durumu, ouabain tedavi reaksiyonu ve belirtilen faktörlerin etkileşimi için tasarım formülündeki son değişken için DESeq2 kullanılarak hesaplandı. Diferansiyel ifade testini güçlendirmek için, avuç içi paketinden (sürüm 1.8.0) uyarlanabilir büzülme tahmin edicisinin bir kombinasyonunu kullanarak ve 0,667'ye eşit ek bir günlük kat değişiklik eşiği belirterek log katlama değişikliği düzeltmesi uygulandı. Elde edilen küçültülmüş tahminler, gen sıralaması ve küme profili (versiyon 3.14.3) ve sigorta (versiyon 1.12.0)R paketleri kullanılarak, Benjamin-Hochberg yöntemine göre çoklu karşılaştırmalar için ayarlanmış p değerleri ile gen sıralaması ve çalıştırılması için kullanıldı. Kontrol ve yaşlanan AD-MSC'ler için afymetrix mikrodizi örnekleri GEO veri tabanından (GSE66236) elde edildi ve log2 ve kantil sayım normalizasyonu ile Phantasus web uygulaması ile işlendi. Gen Seti Zenginleştirme Analizi, bir sigorta (versiyon 1.12.0)R paketi kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

RNA ekstraksiyonu, ters transkripsiyon ve gerçek zamanlı PCR

RNA ekstraksiyonu, ters transkripsiyon ve gerçek zamanlı PCR, önceki çalışmamızda tarif edildiği gibi yapıldı [32]. RNA ekstraksiyonu (ExtractRNA reaktifi), ters transkripsiyon (MMLV RT kiti) ve gerçek zamanlı PCR (HS SYBR kiti) için reaktifler Evrogen'den elde edildi. Gen ekspresyon seviyeleri, gerçek zamanlı PCR BioRad CFX-96 amplifikatörü (BioRad) ve araştırılan tüm genler için aşağıdaki çalışan program kullanılarak değerlendirildi: 95 derecede 10 saniye boyunca 40 döngü eritme, 57.5 derecede 15 saniye tavlama , ve 72 derecede 15 sn sentezleme . Reaksiyonların özgüllüğünü kontrol etmek için erime eğrileri analizi uygulandı. Elde edilen verilerin aşağıdaki analizi, referans olarak GAPDH ifadesi kullanılarak standart 2deltaCt niceleme yöntemiyle Bio-Rad CFX Manager yazılımı (BioRad) kullanılarak yapıldı. Primer dizileri Tablo 1'de listelenmiştir.

istatistiksel analiz

İki grup arasındaki farkı anlamlı kılmak için Student's t-testi veya Welch's t-testi uygulandı. Gruplar arasında çoklu karşılaştırmalar için Tukey's HSD ile ANOVA kullanıldı. Aksi belirtilmedikçe, tüm nicel veriler ortalama±SD olarak gösterilir ve yıldız işaretleri aşağıdaki gibi önemli farklılıkları gösterir: ns, önemli değil,*p<0.05,><><0.001. statistical="" analysis="" was="" performed="" using="" r="">

Sonuçlar

H2O2-tedavi edilmiş END-MSC'ler erken yaşlanmaya girer

Bu çalışmada, ISCT tarafından hMSC'leri tanımlamak için önerilen minimum kriterleri karşılayan, dökülen endometriumdan (END-MSC'ler) izole edilen insan mezenkimal kök hücrelerini kullandık [41]. Daha önce, END-MSC'lerin erken yaşlanmasının çeşitli yönlerini incelemek için güvenilir bir deneysel model geliştirdik [30]. Yani, öldürücü olmayan oksidatif strese maruz kalan END-MSC'lerin, kalıcı DNA hasar odakları ve aktif DNA hasar yanıtı, klasik p53/p21/Rb'nin aracılık ettiği geri dönüşümsüz hücre döngüsü durdurma dahil olmak üzere yaşlanan hücrelerin tüm tipik özelliklerini yavaş yavaş edindiğini gösterdik. yol, proliferasyon kaybı, hücre hipertrofisi, SA- -Gal boyamasının görünümü ve yaşlanma ile ilişkili salgı fenotipinin gelişimi [30, 32, 42]. Burada, ouabainin senolitik etkisini incelemek ve iyon homeostazındaki altta yatan hücre içi değişiklikleri ortaya çıkarmak için tasarlanan modeli uyguladık. Başlangıçta, en yaygın parametreleri tahmin ederek, END-MSC'lerde yaşlanmayı indüklemek için tek doz（1 saat, 200 μM）H2O tedavisinin yeterli olduğunu doğruladık. Önemli olarak, stresli END-MSC'ler oksidatif stresten iki hafta sonra yaşlanmış olarak kabul edildi; bu nedenle, tüm yaşlanma belirteçleri, H-Oz tedavisinden en geç 14 gün sonra değerlendirildi. Gerçekten de, END-MSC'lerin H-Oz tedavisi, çoğalma bloğuna, artan hücre boyutuyla gösterildiği gibi hücre hipertrofisine, otofloresansın yükselmesiyle tespit edilen lipofusin birikimine, SA- -Gal'in görünümüne, p21/Rb yolu ve HMGB1 kaybı birlikte seçilen deneysel koşullar altında yaşlanma oluşumunu destekler (Şekil ac,e,f).

Yaşlanan hücrelerin doku ve organizma düzeyindeki en zararlı etkilerinin, uzun süreli canlılıklarının sonucu olduğuna inanılmaktadır. Bu nokta doğrultusunda, HO? ile muamele edilmiş END-MSC'ler, yaşlanma gelişiminin geç aşamalarında bile yüksek canlılığı korudu (yaşlı END-MSC'lerin canlılığı, ilk oksidatif stresten 17 gün (14 gün ＋ 3 gün) sonra değerlendirildi)(Şekil 1d) ). Özetlemek gerekirse, END-MSC'lerin öldürücü olmayan HO2-tedavisi, erken yaşlanmanın uygun modelidir ve senolitik bileşiklerin END-MSC'ler üzerindeki etkilerini araştırmakla ilgilidir.

Kardiyak glikozit ouabain, geniş bir konsantrasyon aralığında yaşlanan END-MSC'lere karşı hiçbir senolitik aktiviteye sahip değildir.

Son kanıtlar, ouabain, digoksin ve bufalin dahil olmak üzere kardiyak glikozitlerin hemolitik aktiviteye sahip bir bileşikler ailesini temsil ettiğini göstermektedir [25,26]. Günümüzde kardiyak glikozitler geniş spektrumlu senolitikler olarak kabul edilse de, bunların yaşlanmış hMSC'ler üzerindeki etkilerine ilişkin veriler eksiktir. Bu nedenle, burada ouabainin yaşlanmış END-MSC'lerde seçici olarak ölümü indükleme potansiyeline sahip olup olmadığını test ettik. Bunu yapmak için, geniş konsantrasyon aralığında (10-' ila 10~M) ouabain ile muameleden sonra kontrol ve yaşlanan END-MSC'lerin canlılığını değerlendirdik. İlginç bir şekilde, uygulanan hiçbir konsantrasyon, ouabain uygulamasından sonraki ilk günde hem kontrol hem de yaşlanan hücrelerin canlılığında gözle görülür bir azalmaya yol açmadı (Şekil 2 ve Ek Şekil S1).

Bununla birlikte, ouabain tedavisinden sonraki üçüncü günde, kontrol END-MSC'lerinin yaşayabilirliğinde doza bağlı önemli bir düşüş ortaya çıkardık (Şekil 2a ve Ek Şekil S1). Beklenmedik bir şekilde, yaşlanan hücrelerin test edilen her konsantrasyonda ouabain'e karşı daha dirençli olduğu ortaya çıktı. Bu sonuç doğrultusunda,10-M ouabain, kontrol hücrelerinde (yüzde 20,75 An artı /PI- ve yüzde 36,47 An artı /PI artı) yaşlanan hücrelere (%15,01 An＋/PI) göre daha eğilimli apoptotik ölüme yol açtı. -ve yüzde 12.15 An artı /PI artı )(Şek.2b). Elde edilen sonuçlar, yaşlanan END-MSC'ler bağlamında ouabain'in hiçbir senolitik aktiviteye sahip olmadığını açıkça göstermektedir.

Ouabainin senolitik etkisi üzerindeki yaşlanmaya neden olan uyaranların değişkenliği ile ilişkili olası etkileri dışlamak için ek bir deney seti gerçekleştirdik. Yani, erken yaşlanmayı indüklemek için END-MSC'leri oksidatif stres yerine etoposid ile tedavi ettik.narenciye biyoflavonoidleriEtoposid ile muamele edilmiş END-MSC'ler, yaşlanan hücreler için tipik olan tüm özellikleri sergiledi (Şekil 3a-e).

Önemli olarak, ouabain, etoposid ile tedavi edilen yaşlanmış END-MSC'lere karşı hemolitik etkiye sahip değildi (Şekil 3f ve Ek Şekil S2). Bu veriler, yukarıdaki sonuçlar için ek doğrulama ve ouabain kaynaklı analiz eksikliğinin, yaşlanmayı indüklemek için kullanılan somut yaşlanma tetikleyicisinin sonucu olmadığına dair kanıt sağlar.

Şekil.1 Oksidatif stres kaynaklı END-MSC'lerin erken yaşlanma modelinin doğrulanması. Yaşlanmış END-MSC'ler gevşek bir çoğalma, b hipertrofiye uğrar, c yüksek otofloresan elde eder, yüksek hücre canlılığını korur d ve e, kontrol olanlara kıyasla SA- -Gal aktivitesi gösterir. f Kontrol ve yaşlanan END-Ouabain'de p53 ve Rb'nin fosforilasyon seviyeleri ve p21 ve HMGBI proteinlerinin ekspresyon seviyeleri, çeşitli kökenlerden insan mezenkimal kök hücrelerine karşı hemolitik etkiye sahip değildir. , yağ dokusu, diş özü ve Wharton's jöle dahil olmak üzere diğer kaynaklardan izole edilen hMSC'ler üzerindeki ouabain etkilerini analiz ettik. Verilerimizi ek olarak güçlendirmek için, farklı yaşlanma modelleri uyguladık —— AD-MSC'ler için replikatif yaşlanma, DP-MSC'ler için doksorubisin kaynaklı yaşlanma ve WJ-MSC'ler için oksidatif stres kaynaklı yaşlanma (Şekil 4a-f).

Şekil 4g'de gösterildiği gibi, çeşitli hMSC türleri, ouabain tedavisi üzerine canlılık açısından farklılık göstermiştir, örneğin, hem kontrol hem de yaşlanmış DP-MSC'ler, ouabain etkisine WJ-MSC'lerden çok daha dirençliydi (Şekil 4g ve Ek Şekil S3b, c). Bununla birlikte, ouabain, yaşlanan hMSC'lerin her iki türünde de senolizi indükleyemedi (Şekil 4g ve Ek Şekil S3). Birlikte, elde edilen veriler, ouabain kaynaklı analizin yokluğunun çeşitli hMSC türleri için ortak bir özellik olduğunu göstermektedir. MSC'ler. Sunulan değerler ortalama±SD'dir. a ve d noktalarında çoklu grup karşılaştırmaları için tek yönlü ANOVA uygulandı, n=3, ns anlamlı değil,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="">

GAPDH yükleme kontrolü olarak kullanıldı

Kardiyak glikozit bufalin, yaşlanan END-MSCS'yi öldürmede başarısız oldu

Kardiyak glikozitlerin hMSC'lere karşı senolitik etkisinin olmadığını doğrulamak için, kardiyak glikozitler ailesine ait belirtilen senolitik aktiviteye sahip başka bir bileşik olan bufalin uyguladık [25]. Bufalin, geniş bir konsantrasyon aralığında (10-7 ila 10-5 M) kontrol ve H2O2- ile muamele edilmiş yaşlanmış END-MSC'lerin yaşayabilirliği üzerinde neredeyse hiçbir etkiye sahip değildi (Şekil 5a ve Ek Şekil S4a).

Ouabain tedavisi için gözlemlediğimize benzer şekilde, bufalin üzerinde analizin olmaması, yaşlanmayı indükleyen uyaranlardan bağımsızdı, çünkü oksidatif strese veya etoposide yanıt olarak yaşlanan ESC'lerin yaşayabilirliği etkilenmedi (Şekil 5a, b, Ek Şekil 5a). S4a, b). Yukarıda açıklanan sonuçlar, kardiyak glikozitlerin yaşlanan END-MSC'lerde hedeflenen ölüm indüksiyonu için etkisiz olduğunu doğrulamaktadır. MSC'ler. Sunulan değerler ortalama±SD'dir. a ve d noktalarında çoklu grup karşılaştırmaları için tek yönlü ANOVA uygulandı, n=3, ns anlamlı değil,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" um.="" gapdh="" was="" used="" as="" a="" loading="">

Kardiyak glikozit bufalin, yaşlanan END-MSCS'yi öldürmede başarısız oldu

Kardiyak glikozitlerin hMSC'lere karşı senolitik etkisinin olmadığını doğrulamak için, kardiyak glikozitler ailesine ait belirtilen senolitik aktiviteye sahip başka bir bileşik olan bufalin uyguladık [25]. Bufalin, geniş bir konsantrasyon aralığında (10-7 ila 10-5 M) kontrol ve H2O2- ile muamele edilmiş yaşlanmış END-MSC'lerin yaşayabilirliği üzerinde neredeyse hiçbir etkiye sahip değildi (Şekil 5a ve Ek Şekil S4a).

Ouabain tedavisi için gözlemlediğimize benzer şekilde, bufalin üzerinde analizin olmaması, yaşlanmayı indükleyen uyaranlardan bağımsızdı, çünkü oksidatif strese veya etoposide yanıt olarak yaşlanan ESC'lerin yaşayabilirliği etkilenmedi (Şekil 5a, b, Ek Şekil 5a). S4a, b). Yukarıda açıklanan sonuçlar, kardiyak glikozitlerin yaşlanan END-MSC'lerde hedeflenen ölüm indüksiyonu için etkisiz olduğunu doğrulamaktadır.

Şekil 2 Ouabain, geniş bir konsantrasyon aralığında HO2- ile muamele edilmiş yaşlanmış END-MSC'lere karşı hemolitik aktiviteye sahip değildir. 1077,10~6,10-5 Mouabain ile tedaviden 3 gün sonra kontrol ve yaşlanan END-MSC'lerin nispi hücre canlılığı (yüzde). b Annexin V/DAPI çift boyama ile değerlendirilen 10-6 M ouabain üzerine END-MSC'lerde apoptoz indüksiyonu. n=3 bağımsız deney. Tüm veriler ortalama±SD'ye karşılık gelir. İstatistiksel anlamlılık, Welch'in t-testi ile değerlendirildi:ns anlamlı değil,***p<>

Hem kardiyak glikozitler ouabain hem de bufalin yaşlanan A549 ve SK-Hep1 hücrelerinde seçici olarak hücre ölümünü indükleyebilir

Sonuçlarımızın kardiyak glikozitlerin geniş spektrumlu senolitik etkisine ilişkin yakın zamanda yayınlanan kanıtlarla uyuşmadığı gerçeğini dikkate alarak, ilgili çalışmalarda [25,26] açıklanan hücresel modeli kullanarak bu etkiyi yeniden oluşturmaya karar verdik. Bu nedenle, kontrol ve yaşlanan A549 akciğer karsinomu hücrelerini kullanarak bir dizi deney gerçekleştirdik. A549 hücrelerinde yaşlanma, etoposid tedavisi ile indüklendi. A549 hücrelerinin etoposid kaynaklı yaşlanması sıklıkla kullanılan ve bu nedenle iyi karakterize edilmiş bir terapi kaynaklı yaşlanma modelidir [4]. Ayrıca, ouabain'in etoposid ile muamele edilmiş yaşlanmış A549 hücrelerini seçici olarak öldürdüğü gösterildi[25]. A549'da yaşlanmayı kanıtlamak için proliferasyon oranını, hücre boyutunu, lipo-ince birikimini, SA- -Gal boyamasını, aktivasyon durumunu değerlendirdik. p53/p21/Rb yolu ve HMGB1 ekspresyon seviyesi (Şekil 6a-e).

Ouabainin yaşlanmış kanser hücrelerine karşı hemolitik aktivitesini doğrulamak için önce doza bağlı hücre canlılığını tahmin ettik. Yukarıda açıklanan sonuçlarımızla uyumlu olarak, ouabain uygulamasından sonraki 24 saat içinde canlı kontrol veya yaşlanan A549 hücrelerinin sayısında önemli bir düşüş tespit edemedik (Ek Şekil S5a). Bununla birlikte, tedaviden 3 gün sonra ouabain, yaşlanan A549 hücrelerinin yaşayabilirliğini doza bağlı bir şekilde önemli ölçüde azaltırken, kontrol A549 hücrelerinin sayısı çok daha az bir ölçüde azaldı (Şekil 7a ve Ek Şekil S5a). Yani, aynı dozla tedavi edilen yaşlanmış A549 hücrelerinin yüzde 50'sine kıyasla, kontrol hücrelerinin yaklaşık yüzde 90'ı 10- M ouabain'de canlılığını korumuştur (Şekil 7a). Ayrıca, yaşlanmış A549 hücreleri, kontrol muadillerine göre bufalin kaynaklı hücre ölümüne daha yatkındı (Şekil 7b) (Şekil 5b ve Ek Şekil S5b).

Yayınlanan verilere göre, ouabain yaşlanan A549 hücrelerinde kaspaz-3-bağımlı apoptozu tetikledi [26]. Gerçekten de, 10-6Mouabain ile tedavi edilen yaşlanmış kanser hücrelerinde çift pozitif ve/veya PI fraksiyonunda önemli bir artış ortaya çıkardık (Şekil 7c). Ayrıca, floresan tahlili kullanarak, ouabain ile muamele edilmiş yaşlanmış A549 hücrelerinde kaspaz-3 aktivasyonunu gözlemledik (Şekil 7d). Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar diğer yazarlar tarafından açıklanan verilerle tamamen tutarlıdır ve ouabainin A549'a yönelik hemolitik aktivitesini doğrular.

Ayrıca A549'da yaşlanmaya neden olmak için etoposid yerine doksorubisin kullandık (Şekil 8a-e). Beklendiği gibi, doksorubisin ile muamele edilmiş yaşlanmış A549 ve ayrıca etoposid ile muamele edilmiş, kontrol muadillerine kıyasla hem ouabain hem de bufalin için daha yüksek hassasiyet göstermiştir (Şekil 8g ve Ek Şekil S6). İkincisi, kardiyak glikozitlerin senolitik etkilerinin, yaşlanmayı indükleyen uyaranlardan bağımsız olduğunu doğrular. Böylece, kardiyak glikozitler gerçekten de senolitik

Şekil 3 Ouabain, etoposid ile tedavi edilen yaşlanmış END-MSC'lerde senolizi indükleyemez. END-MSC'ler için epizod kaynaklı yaşlanma modelinin doğrulanması: a proliferasyon yeteneği, b hücre boyutu, c otofloresan seviyeleri ve d SA- -Gal aktivitesi, e Rb fosforilasyon seviyesi ve p21 ve HMGBI proteinlerinin ekspresyon seviyeleri. f 10-6 ouabain ile tedaviden sonra kontrol ve yaşlanan hücrelerin nispi hücre canlılığı (yüzde). Değerler ortalama±SD'dir. Çoklu grup karşılaştırmaları için tek yönlü ANOVA uygulandı,n=3, ns anlamlı değil,***p<0.001.for pair="" comparisons="" at="" b,c,d,f="" welch's="" t-test="" was="" used,="" n="3" for="" b,="" c,f="" n="50" for="" d,="" ns="" not="" significant,=""><0.05,><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" μm.="" gapdh="" was="" used="" as="" loading="" control="" activity="" towards="" a549,="" but="" these="" compounds="" turned="" out="" to="" be="" ineffective="" for="" targeted="" death="" induction="" in="" senescent="">

Son olarak, Guerrero et al. çalışma [25] (Şekil 9a-e). Etoposid ile muamele edilmiş yaşlanmış SK-Help, kontrol emsallerine kıyasla her iki ajana karşı daha yüksek hassasiyet göstererek, kardiyak glikozitlerin bu hücre tipine karşı hemolitik etkisini kanıtlamıştır (Şekil 9f ve Ek Şekil S7).

Birlikte bu veriler, kardiyak glikozitlerin neden olduğu hemolizin seçiciliğinin, somut yaşlanma tetikleyicisinden çok hücre doğasına dayandığını kanıtlar.

Bu makale Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x adresinden alınmıştır.