Aristolochic Asit Farelerde Renal Fibrozis ve Yaşlanmayı İndükler
Mar 23, 2022
Soyut:Böbrek, yaşa bağlı bozukluklara en duyarlı organlardan biridir. Genellikle böbrek yaşlanmasına, kronik hastalığın son ortak yolu olan renal fifibrozis eşlik eder.böbrek hastalıkları. Nefrotoksik bir ajan olan aristolokik asit (AA), ilerleyici renal fifibrozis ve fonksiyonel azalma ile karakterize olan AA nefropatisine (AAN) neden olur. Renal fifibrozis renal yaşlanma ile ilişkili olmasına rağmen, AA'nın renal yaşlanmaya neden olup olmadığı belirsizliğini koruyor. Bu çalışmanın amacı, renal yaşlanmanın bir modeli olarak AAN'ın potansiyel kullanımını araştırmaktır. Burada, AA'yı C57BL/6 farelerine kronik olarak uygulayarak AAN modellerinde yaşlanma ile ilgili faktörleri inceledik. Kontrollerle karşılaştırıldığında, AA grubu yaşlanma gösterdiböbrekrenal atrofi, renal fonksiyonel düşüş ve tubulointerstisyel fifibroz gibi fenotipler. Ek olarak, AA özellikle hücresel yaşlanmayı teşvik etti.böbreklerve artan renal p16 mRNA ekspresyonu ve yaşlanma ile ilişkili -galaktosidaz aktivitesi. Ayrıca, AA ile tedavi edilen fareler, proksimal tübüler mitokondriyal anormallikler ve ayrıca reaktif oksijen türleri birikimi sergiledi. Yaşlanma karşıtı bir gen olan Klotho da önemli ölçüde azalmıştır.böbreklerAA ile tedavi edilen farelerin Toplu olarak, bu çalışmanın sonuçları, AA'nın yaşlanma ile ilgili faktörleri değiştirdiğini ve böbrek fifibrozunun böbrek yaşlanması ile yakından ilişkili olduğunu göstermektedir.
Anahtar Kelimeler:kronik böbrek hastalığı; böbrek fifibrozu; aristoloşik asit; yaşlanma; hücresel yaşlanma
CISTANCH BÖBREK/BÖBREK HASTALIĞINI İYİLEŞTİRECEK
giriişİnsanlarda sürekli artan yaşam süresi ile birlikte, daha fazla birey yaşa bağlı bozukluklardan muzdariptir.böbreklertipik olarak yaşa bağlı doku hasarından ve kronik hastalık insidansından etkilenirler.böbrek hastalığıyaşla birlikte artar [1]. Böbrek yaşlanması, genel yaşlanmayı hızlandırır ve bu da daha kısa bir yaşam süresi ile sonuçlanır. Bu nedenle, uygun hayvan modelleri tam olarak geliştirilmemiş olmasına rağmen, böbrek yaşlanması üzerine araştırmalar gereklidir. Renal yaşlanmaya renal atrofi, glomerüloskleroz ve tubulointerstisyel fifibrozis gibi çeşitli patolojik değişiklikler eşlik eder [2]. Renal tubulointerstisyel fifibroz, progresif böbrek hastalığının çoğu formundaki son ortak yoldur ve bu, renal fifibrozun yaşlılık ile yakından ilişkili olduğunu düşündürür.böbrek. Yaşlanma araştırmalarında fareler, insanlara genetik yakınlıkları, genomlarını genetik olarak manipüle etme yetenekleri ve yaşamları boyunca insanlara benzer yaşlanma ile ilgili fenotipleri sunmaları gerçeği nedeniyle güvenilir bir araçtır [3]. Kendi içinde yetiştirilmiş farelerin kullanıldığı boylamsal gözlemler, fareleri tam ömürleri boyunca takip etmek zaman alıcı olsa da, bir yaşlanma modeli olarak idealdir. Ek olarak, yaşlanmanın birkaç genetiği değiştirilmiş fare modeli vardır. Klotho eksikliği olan fare, yaşlanma araştırmalarında kullanılan bir erken yaşlanma modelidir. Ancak bu modelde böbrek fonksiyonu etkilenmez ve böbrekler dışındaki bazı organlar bozulur [4]. Bu nedenle, bu fare modeli böbrek yaşlanması üzerine araştırmalar için uygun olmayabilir.Aristolokik asit (AA) uygulaması, yaygın interstisyel fibrozis ile karakterize edilen AA nefropatisi (AAN) olarak bilinen spesifik bir böbrek hasarı tipine neden olur [5,6]. AA renal tübüler epitel için toksiktir çünkü böbrek dokularında DNA eklentilerinin oluşumunu teşvik eder [7]. AA'nın üriner sistem dışındaki organları etkilemesi olası değildir ve aşağıdakilerin değerlendirilmesinde faydalı olabilir.böbrek-spesifik değişiklikler. Bu nedenle AA, farelerde renal fifibroz modellerini oluşturmak için yaygın olarak kullanılır [8,9]. Bununla birlikte, AA kaynaklı değişikliklerin vücuttaki yaşlanma ile ilişkili olup olmadığı belirsizliğini koruyor.böbrekler. Bu çalışmada, farelerde AAN'da yaşa bağlı fenotipleri ve moleküler faktörleri inceledik.
Sonuçlar 2.1. AA Yönetimi Önemli Kilo Kaybına, Renal Atrofiye ve Renal Fonksiyonda Düşüşe Neden OlduTemel vücut ağırlığı (BW) ve sistolik kan basıncı (BP), araç-kontrol ve AA grupları arasında aynıydı. Araç-kontrol grubundaki BW, 8 hafta boyunca tutarlı bir şekilde arttı. Bununla birlikte, kilo alımı AA uygulaması tarafından engellendi ve AA grubu, AA uygulamasının başlatılmasından 4 ve 8 hafta sonra önemli ölçüde daha düşük BW'ye sahipti (Şekil 1A). Araç-kontrol ve AA grupları arasında sistolik KB veya kalp hızında anlamlı bir fark yoktu (Şekil 1B,C). Kalp ağırlığı/BW oranı, AA uygulamasının başlamasından 8 hafta sonra gruplar arasında hiçbir fark göstermedi (Şekil 1D), oysaböbrekağırlık/BW oranı, AA uygulamasının başlatılmasından 8 hafta sonra AA grubunda önemli ölçüde daha düşüktü (Şekil 1E). Daha sonra araç-kontrol ve AA gruplarında böbrek fonksiyonunu inceledik. Plazma kreatinin ve üre nitrojen (UN) konsantrasyonları, AA uygulamasının başlatılmasından 8 hafta sonra AA grubunda araç-kontrol grubundan önemli ölçüde daha yüksekti. Ek olarak, AA tedavisi, AA uygulamasının başlamasından 8 hafta sonra araç kontrol grubu ile karşılaştırıldığında kreatinin klirensini önemli ölçüde azalttı (Şekil 1F–H).
2.2. AA İdaresinin İndüklediği Açık Tubulointerstisyel Fibrozis ve Böbreklerde Fibrozis İlişkili Gen Ekspresyonunun Önemli ArtışıPeriyodik asit-Schiff (PAS) boyaması kullanılarak yapılan histolojik inceleme, araç kontrol grubuna kıyasla AA grubunda glomerüler alanın önemli ölçüde azaldığını ortaya çıkardı (Şekil 2A). Masson'un trikrom (MT) boyaması kullanılarak değerlendirilen kapsamlı tubulointerstisyel fifibroz, AA grubunda (Şekil 2B) ve ayrıca renal fifibroz ile ilişkili genlerin, kollajen I ve III'ün mRNA seviyelerinin ve dönüştürücü büyüme faktörünün yukarı regülasyonu ile gözlendi ( TGF)- (Şekil 2C–E).
2.3.AA Yönetim Hızlandırılmış Hücresel Yaşlanma, Mitokondriyal Disfonksiyon ve Böbreklerde Reaksiyon Oksijen/gen Türlerinin (ROS) BirikimiHücresel yaşlanmayı değerlendirmek için, p53, p21, p16 ve glutaminazın (GLS) renal mRNA ekspresyonunu inceledik, AA grubu bu yaşlanma ile ilgili genlerinböbrekler(Şekil 3A-D). Ayrıca, yaşlanmayla ilişkili -galaktosidaz(SA- -gal) boyama yoğunluğuböbreklerAA grubunda arttı ve araç kontrol grubunda neredeyse yoktu (Şekil 3E). AA grubunda, elektron mikroskobu, proksimal tübüler hücrelerde mitokondriyal cristae, mitokondriyal parçalanma, sitoplazmik vakuolizasyon ve otolizozomların kaybolduğunu ortaya çıkardı. mitokondri ile ilgili bir gen olan BCL2/adenovirüs E1B 19-kDa etkileşimli protein 3(Bnip3)'ün aşağı regülasyonu (Şekil 3FG). Nox2'nin renal mRNA ifadesi. nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) oksidazın bir bileşeni, araç kontrol grubu ile karşılaştırıldığında AA grubunda önemli ölçüde arttı (Şekil 3H). Ayrıca, western blot analizi, renal 4-hidroksi-2-nominal(4-HNE) seviyesinin AA grubunda önemli ölçüde arttığını ortaya koydu (Şekil 3I). Bu sonuçlar, AA uygulamasının hücresel yaşlanmayı, mitokondriyal disfonksiyonu ve ROS birikimini indüklediğini gösterdi.böbrekler.
2.4. AA Azaltılmış Renal Klotho Protein İfadesiAraç-kontrol ve AA gruplarında yaşlanma karşıtı proteinlerin renal ekspresyonunu inceledik. Klotho ekspresyonu, araç kontrol grubu ile karşılaştırıldığında AA grubunda önemli ölçüde azalırken (Şekil 4A), nikotinamid fosforibosiltransferaz (NAMPT) ve sirtuin1'in (SIRT1) renal ekspresyonları gruplar arasında benzerdi (Şekil 4B,C).
3. TartışmaBildiğimiz kadarıyla, bu çalışma, p16 ve SA- -gal aktivitesi gibi yaşlanma belirteçlerini kullanarak AAN'da renal yaşlanma ile ilişkili değişikliklerin değerlendirilmesine odaklanan ilk çalışmadır. AA tedavisi renal atrofiyi, tubulointerstisyel fibrozisi ve renal p16 mRNA'nın yukarı regülasyonu ve SA- -gal-pozitif boyamanın eşlik ettiği renal fonksiyonel düşüşü destekledi. Ayrıca, AA grubu, mitokondriyal anormallikler, artan oksidatif stres ve yaşlanma karşıtı gen Klotho'nun aşağı regülasyonu gibi renal yaşlanma ile ilgili mekanizmaların özelliklerini göstermiştir. Birlikte ele alındığında, gözlemlerimiz kronik AA uygulamasının böbrek yaşlanmasını kısmen taklit ettiğini göstermektedir.
Hücresel yaşlanma, DNA hasarı gibi çeşitli stres faktörlerine yanıt olarak hücre çoğalmasının kalıcı olarak durmasıdır ve yaşlanmaya ve yaşlanmayla ilgili hastalıklara katkıda bulunur. Sikline bağımlı bir kinaz inhibitörü olan p16'nın ekspresyonu, böbrekler de dahil olmak üzere çeşitli organlarda yaşlanma ile ilişkilidir. Kalori kısıtlaması, pl6 ifadesini [10] inhibe ederek ömrü uzatır. Ek olarak, bir FK506-bağlayıcı protein dimerizörü olan AP20187 enjeksiyonu yoluyla INK-ATTAC farelerinde p16-eksprese eden yaşlanan hücrelerin ortadan kaldırılması, glomerüler skleroz ve renal fonksiyonel düşüş Bu nedenle, p16, yaşlanma ile ilgili en önemli faktörlerden biridir. Yaşlanmış hücreler, pH 6.0'da artmış -galaktosidaz aktivitesi gösteren SA- -gal boyaması kullanılarak saptanabilir [12] ve yaşlanmış ve yaşlı hücrelerin yaygın olarak kullanılan bir biyobelirtecidir. Yaşlı sıçanda pl16'nın renal mRNA ekspresyonu artarböbreklerve buna renal epitelyumda artan SA- -gal aktivitesi eşlik eder [13I. Bu çalışmada, artan renal p16 mRNA ekspresyonu ve SA- -gal boyaması gösterdik, bu da AA'nın renal yaşlanmayı indüklediğini gösterir. GLS'nin yakın zamanda, gelişmiş glutaminoliz ve hücre içi pH nötralizasyonu yoluyla yaşlanan hücrelerin hayatta kalması için gerekli olduğu bildirildi [14]. Yaşlı farelerde GLS'ye bağlı glutaminolizin inhibisyonunun, yaşlanmış hücreleri ortadan kaldırdığı ve yaşa bağlı organ fonksiyon bozukluğunu iyileştirdiği gösterilmiştir. Bu çalışmada, renal GLS mRNA'sının yukarı regülasyonu, grupta yaşlanan hücrelerin renal birikimini gösterdi. Böylece, kronik AA uygulaması böbreklerde hücresel yaşlanmaya neden oldu.
CISTANCH BÖBREK/BÖBREK FONKSİYONUNU İYİLEŞTİRECEK
Hücresel yaşlanmaya ek olarak, mitokondriyal disfonksiyon, yaşa bağlı doku hasarının altında yatan temel bir mekanizmadır ve buna ROS birikimi eşlik eder [15,16. Mitokondriyal disfonksiyon, hücresel yaşlanmayı sürdürür ve sürdürür [17], oysa hücresel yaşlanma, mitokondriyal disfonksiyona doğrudan katkıda bulunur [18]. Öncelikle dış mitokondriyal membranda bulunan Bnip3, oksidatif stres ve hipoksiye yanıt olarak kültürlenmiş renal proksimal tübüler hücrelerde mitofajinin düzenlenmesinde rol oynayabilir. Yaşlı farelerde kalori kısıtlaması, Bnip3'ün yukarı regülasyonu yoluyla tübüler hücrelerde otofajiyi arttırır ve yaşa bağlı böbrek fonksiyonunun dejenerasyonunu iyileştirir [19]. Bu çalışmada, elektron mikroskobu, azalmış renal Bnip3 ekspresyonu veya hücresel yaşlanmadan etkilenebilecek mitokondriyal anormalliklerin özelliklerini ortaya çıkardı. Mitokondri, ROS'un ana hücre içi kaynağıdır. Mitokondriyal anormalliklerin renal ROS üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, 4-HINE'ın renal birikimini inceledik veböbrekler.NADPH oksidazlar önemli bir ROS kaynağıdır. Farelerde AAN'ın akut fazı sırasında, Nox2'nin renal mRNA ekspresyonu yükseldi ve nitrik oksit mevcudiyeti azaldı, bu da sürekli hipoksi ve iskemiye yol açtı [20. yaşlı sıçandaböbrekler, ROS birikimine artan Nox2 ekspresyonu eşlik eder [21]. Bu bulgular, AA'nın, mitokondriyal işlev bozukluğunun neden olduğu ROS birikimi ve NADPH oksidazların yukarı regülasyonu yoluyla yaşa bağlı fenotipleri indükleyebileceğini düşündürmektedir.
Renal Klotho gen ekspresyonu AA grubunda azalırken, NAMPT ve SIRTl ekspresyonu gruplar arasında benzerdi. Klotho, yaşlanma baskılayıcı olarak işlev gören tek geçişli bir transmembran proteini kodlayan yaşlanma karşıtı bir gendir. Klotho eksikliği olan farelerdeki yaşlanma süreci, daha kısa bir yaşam süresi, kısırlık, damar sertliği, cilt atrofisi, osteoporoz ve amfizem dahil olmak üzere insanlardakine benziyordu [22]. Hipomorfik mutant Klotho fareleri ayrıca, p16 ablasyonu ile restore edilen bir hızlandırılmış yaşlanma fenotipi sergiledi [23]. Klotho yaşlanmada önemli bir faktör olduğundan, Klotho geni ile modifiye edilmiş fareler, yaşlanma araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, Klotho geni ile modifiye edilmiş fareler, bu farelerin sistemik yaşlanma ile ilişkili bozuklukları ve böbrek fonksiyonunun kanıtlanmamış olması (yani, kreatinin seviyeleri) nedeniyle böbrek yaşlanması üzerine araştırmalar için uygun olmayabilir. Buna karşılık, AAN fare modeli, göreceli uygulama kolaylığı ve müdahalelerin böbrek fonksiyonel düşüşü üzerindeki etkilerini tahmin etme yeteneği gibi çeşitli avantajlara sahip olduğundan, araştırma amaçları için ilaca bağlı böbrek yaşlanması modeli olarak kullanılabilir. .
Mevcut çalışmanın bazı sınırlamaları vardı. Esas olarak hücresel yaşlanma, mitokondriyal morfoloji ve yaşlanma ile ilgili gen ekspresyonuna odaklanarak renal yaşlanmayı değerlendirdik. Bununla birlikte, yaşlanma mekanizmaları karmaşıktır ve tam olarak anlaşılamamıştır. Ek olarak, AA'ya yanıt olarak Klotho gen ekspresyonu azalmış olsa da, AAN'daki patolojik değişikliklerle nedensel bir ilişki gösteremedik. AAN'ın gelişiminde rol oynayan çeşitli moleküllerin rollerini belirlemek için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, bu çalışma, Avan'ın bir renal yaşlanma modeli olarak kullanımına ilişkin yeni bilgiler sunmaktadır. fenotipik değişikliklere dikkat etmek önemlidir.böbrekyaşam süresi ile güçlü bir şekilde ilişkilidir. rağmenböbrekYaşlanmayla ilişkili değişikliklerden kolayca etkilenir, böbrek yaşlanmasının inhibisyonu genel ömrü uzatabilir. Bu nedenle, AAN modellerini kullanarak böbrek yaşlanması üzerine daha fazla araştırma, gelecekte uzun ömürlülüğe yol açabilir.
4. Malzemeler ve Yöntemler4.1. HayvanlarBu çalışma, deney hayvanlarının kullanımına ilişkin Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine uygun olarak yürütülmüştür. Tüm hayvan deneyleri, Yokohama Şehir Üniversitesi Hayvan Çalışmaları Komitesi tarafından onaylandı (onay Numarası: FA20-027) ve ARRIVE yönergelerine uygun olarak yapıldı. Kullanılan hayvan sayısını ve acılarını en aza indirmek için çaba gösterildi. Fareler, 25 derece C sıcaklıkta 12-saat ışık/12-saat karanlık döngüsü altında kontrollü bir ortamda barındırıldı. Farelerin yiyecek ve suya serbest erişimi vardı.
CISTANCH BÖBREK/BÖBREK ENFEKSİYONUNU İYİLEŞTİRECEK
Sekiz haftalık erkek C57BL/6 fareleri, Charles River Laboratories'den (Wilmington, MA, ABD) satın alındı ve 1 haftalık iklimlendirmenin ardından araç-kontrol veya AA gruplarına atandı, farelere intraperitoneal olarak araç veya AA (Sigma) uygulandı. -Aldrich, St.Louis, MO, ABD), az miktarda dimetil sülfoksit içinde çözülmüştür. Bu çalışmadan önce, birkaç protokol kullanarak bir ön çalışma yaptık. İlk protokol, yeniden şekillenme süresi olmadan 4 hafta boyunca haftada iki kez C57BL/6 farelerine intraperitoneal olarak AA (3 mg/kg) verilmesini; bu protokolde AA, fırça kenarlığı kaybı olan dilate proksimal tübüller gibi açık akut böbrek lezyonlarına neden oldu (Ek Şekil S1). İkinci protokolde, C57BL/6 farelerine 4 hafta boyunca haftada bir kez AA (2.5 mg/kg) intraperitoneal olarak uygulandı, ardından 4 hafta boyunca yeniden şekillenme süresi; bu farelerde plazma kreatinin 0.19 ± {{20}} idi.080 mg/dL'ye karşılık 0.18 ± 0.010 mg/dL (sırasıyla araç kontrolüne karşı AA; ortalamanın ortalama ± standart hatası (SEM), p=0.86, eşleştirilmemiş Student t-testi, grup başına n=4 ve plazma UN değeri 31.3 ± 5.95 mg/dL idi. 30,4 ± 3,87 mg/dL (sırasıyla AA'ya karşı araç kontrolü; ortalama ± SEM, p=0.90, eşleştirilmemiş Student t-testi, grup başına n=4). Bu nedenle, AA önemli renal fonksiyonel düşüşe neden olmadığı için bu protokolün renal hasar modeli için uygun olmadığını belirledik. Üçüncü protokolde, C57BL/6 farelerine yeniden şekillenme süresi olmadan 10 hafta boyunca haftada iki kez intraperitoneal olarak AA (3 mg/kg) uygulandı; bu farelerde, AA grubundaki ölüm oranı yüzde 83 iken (n=6), araç-kontrol grubundaki farelerin hiçbiri ölmedi (n=4). Bu protokolde, yüksek mortalite nedeniyle AA'nın neden olduğu renal fenotipi istatistiksel olarak değerlendiremedik. Dördüncü protokolde, C57BL/6 farelerine 4 hafta boyunca haftada iki kez intraperitoneal olarak AA (3 mg/kg) uygulandı, ardından 4 hafta boyunca yeniden şekillenme süresi; bu farelerde tubulointerstisyel fifibroz gibi kronik renal lezyonlar ve renal fonksiyonel düşüş gözlenmiştir [9]. Bu nedenle, bu ön araştırmaların sonuçlarına dayanarak, bu çalışmada deneyleri yürütmek için dördüncü protokolü kabul ettik.
4.2.BP ÖlçümüSistolik KB ve kalp hızı, daha önce açıklanan tail-cuff yöntemi (BP-Monitor MK-2000; Muromachi Kikai Co., Tokyo, Japonya)[24,25] kullanılarak ölçüldü. Tüm ölçümler 9:00 ile 14:00 arasında yapıldı. Her farede en az 10 ölçüm yapıldı ve analiz için ortalama değer kullanıldı.
4.3. Real-Time Quantitatiose Ters-Transkripsiyon PCR Analizi Total RNA, ISOGEN (Nippon Gene, Tokyo, Japonya) kullanılarak böbrek dokularından ekstre edildi ve tamamlayıcı DNA (cDNA), SuperScript IⅢFirst-Strand System (Invitrogen, Waltham, MA, ABD) kullanılarak sentezlendi. Gerçek zamanlı kantitatif ters transkripsiyon PCR analizi, CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, ABD) kullanılarak yapıldı ve ters transkripsiyon ürünleri TaqMan PCR Master Mix ve özel bir TaqMan ile inkübe edildi. prob (Applied Biosystems, Waltham, MA, ABD), daha önce tarif edildiği gibi [26]. Aşağıdaki genlere karşı TaqMan probları kullanıldı: kollajen I(Mm00801666_g1), kollajen II (Mm01254476_m1), TGF- (Mm01178819 m1),p53(Mm00441964 g1),p21( Mm04205640 g1).p16(Mm00494449 m1)GLS (Mm01257297_m1), Bnip3 (Mm01275600_g1) ve Nox2 (Mm00627011_m1).mRNA seviyeleri, 18S ribozomal RNA.
4.4. Western Blot Analizi Protein ekspresyonu, daha önce tarif edilen bir yöntem [27,28] kullanılarak doku homojenatlarının western blot analizi ile analiz edildi. Sodyum dodesil sülfat içeren numune tamponu kullanılarak dokulardan toplam protein ekstraktları hazırlandı. Her numunenin protein konsantrasyonu, Deterjan Uyumlu Protein Test Kiti (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, ABD) ve NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) kullanılarak sığır serum albümini ile ölçüldü. standart. Doku örneklerinden eşit miktarlarda protein özütleri, yüzde 5-20 poliakrilamid jeller (ATTO Corp., Tokyo, Japonya) üzerinde fraksiyonlara ayrıldı. Ayrılan proteinler daha sonra Yarı Kuru Transfer Sistemi (ATTO Corp., Tokyo, Japonya) kullanılarak poliviniliden diflorür membranlara aktarıldı. Zarlar, yüzde 5 yağsız süt tozu içeren fosfat tamponlu tuzlu su ile oda sıcaklığında 1 saat bloke edildi. Zarlar, Klotho (ab181373 1:1000; Abcam, Cambridge, UK), NAMPT(sc-67020 1:5000; Abcam), SIRT1(07-131 1:1000, MilliporeSigma'ya karşı birincil antikorlarla inkübe edildi. , Burlington, MA, ABD), 4-HINE(MHN-100P 1:1000; JaICA, Fukuroi, Japonya) ve gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH) (2118, 1:2000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, ABD). Zarlar yıkandı ve sekonder antikorlarla oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edildi. Antikor-antijen reaksiyonları için alanlar, güçlendirilmiş kemilüminesans substratı (Merck, Kenilworth, NJ, ABD) kullanılarak görselleştirildi. Yükleme kontrolü olarak GAPDH kullanıldı. Görüntüler, ChemiDoc Touch (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, ABD) kullanılarak nicel olarak analiz edildi.
4.5. Histolojik Analiz daha önce tarif edildiği gibi yapıldı [29]. Farelerden alınan böbrek dokuları yüzde 4 paraformaldehit ile sabitlendi ve ardından parafine gömüldü. Kesitler (4 um kalınlığında) PAS ve MT boyaları ile boyandı. Glomerüler alanı değerlendirmek için fare başına 50 glomerül ölçüldü ve ortalaması alındı. Tüm görüntüler BZ-9000 mikroskobu (Keyence Corp., Osaka, Japonya) kullanılarak elde edildi.
CISTANCHE BÖBREK/BÖBREK DİYALİZİNİ İYİLEŞTİRECEK
4.6. SA- -al Boyama Farelerden alınan böbrek dokuları hızla donduruldu ve bir Optimal Kesme Sıcaklığı bileşiği (Sakura FinetekJapan, Co., Ltd., Tokyo, Japonya) içine yerleştirildi. Kesitler (4 um kalınlığında) bir kriyostat (HM550-VPD; Thermo Fisher Scientific) ve cam slaytlara monte edilmiştir. SA- -gal aktivitesi, üreticinin protokollerine göre bir yaşlanma tespit kiti (Bio Vision Inc., Milpitas, CA, ABD) kullanılarak ölçüldü. Örnekler, BZ-9000mikroskopu (Keyence Corp.. 4.7.Electron Microscopy) kullanılarak ×100 büyütmede parlak alan altında görüntülendi.Elektron mikroskopi analizi, daha önce tarif edildiği gibi [30] yapıldı. Farelere izofluran ile anestezi uygulandı ve pH 7.4'te 0.1 mol/L fosfat tamponu içinde heparinize (5 U/mL) fizyolojik tuzlu su ve yüzde 2.5 glutaraldehit ile sağ aortik arktan perfüze edildi. Transmisyon elektron mikroskobu için numuneler 2 saat boyunca yüzde 1 osmiyum tetroksite daldırıldı, seri olarak etanol içinde kurutuldu ve bir Epon karışımına gömüldü. Ulitratin kesitleri uranil asetat ve kurşun sitrat ile boyandı ve 80 kV'da çalışan Hitachi H-7500 transmisyon elektron mikroskobu (Hitachi, Ltd., Tokyo, Japonya) kullanılarak incelendi. Kesitler x5000 büyütmede gözlendi ve şarj bağlantılı bir cihaz kamerası kullanılarak fotoğraflandı.
4.8.Biyokimyasal AnalizKan örnekleri, tok haldeyken kardiyak ponksiyonla toplandı. Tam kan örnekleri plazmayı ayırmak için 3000 rpm'de (MR-150; Tomy Seiko Co., Ltd., Tokyo, Japonya) 10 dakika 4 derecede santrifüjlendi. Elde edilen plazma numuneleri -80 derecede saklandı. Plazma kreatinin, UN ve idrar kreatinin seviyeleri Hitachi 7180 otoanalizörü (Hitachi, Ltd., Tokyo, Japonya) kullanılarak ölçüldü.
4.9. İstatistiksel analiz İstatistiksel analizler GraphPad Prism yazılımı (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, ABD) kullanılarak yapıldı. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. Araç-kontrol ve AA grupları arasındaki farkları karşılaştırmak için eşleştirilmemiş Student f-testi kullanıldı.p<0.05 was="" considered="" statistically="">
5. SonuçlarAA uygulaması nedenleriböbrektübülointerstisyel fibroz ve renal atrofi ile birlikte yaşlanma. Sonuçlar böbrek fibrozunun böbrek yaşlanması ile yakından ilişkili olduğunu ve AAN'ınböbrek-spesifik yaşlanma modeli.
