Atriplex Canescens, Cistanche Deserticola'nın Yeni Sunucusu

İletişim: emily.li@wecistanche.com

Fangming Wang, et al

Soyut

cistanche çöl çiçeğiTarihsel olarak geleneksel Çin tıbbında böbrek (yang) işlevini desteklemek, kan ve özden faydalanmak ve dışkıyı geçmek için bağırsakları nemlendirmek için kullanılmıştır. Ev sahibi Haloxylon ammodendron, çölleşmeyi kontrol etmek için kullanılan stratejiler olan rüzgar siperleri ve kumul sabitleme için kullanılan önemli bir öncü bitkidir. Uzun zamandır C. Deserticola'nın sadece H. ammodendron'u parazitleştirebileceği düşünülüyordu. Bu çalışmada, morfolojik tanımlama, gen barkod tanımlama ve aşılama deneyleri yapıldı ve sonunda C. Deserticola'nın Atriplex canescens'i de parazitleştirebildiğini bulduk. A. canescens, çok çeşitli uyarlanabilirliğe sahip bir Chenopodiaceae türüdür. H. ammodendron ile karşılaştırıldığında, daha fazla biyokütleye ve daha geniş bir ekolojik uyum aralığına sahiptir, bu da onu C. Deserticola'nın endüstriyel üretimi için daha uygun hale getirir. Ayrıca, A. canescens üzerinde parazitlenen C. Deserticola'da aktif bileşenlerin konsantrasyonunun H. ammodendron üzerinde parazitlenenlere göre daha yüksek olduğunu bulduk; bu bulgu ayrıca, C. Deserticola'nın daha büyük ölçekte uygulanmasının daha fazla araştırmayı garanti ettiğini göstermektedir.

Anahtar Kelimeler:cistanche çöl çiçeği, Parazitlik, DNA barkod tabanlı tanımlama, Geleneksel Çin tıbbı, Cistanche salsa

cistanche hakkında daha fazla bilgi için buraya tıklayın

1. Giriş

Cistanche'nin geleneksel Çin tıbbında kullanımı ilk olarak Shennong Bitkisel Kutsal Yazılarında kaydedilmiştir.tonlamaböbrekyang, artırmaenöznın-ninkan, venemlendirmeenbağırsaklardışkı geçişini kolaylaştırmak için. Eski bitkisel tıbbın eserlerinde de 'olarak kaydedilmiştir.çölginseng'. Cistanche Deserticola YC Ma ve Cistanche tubulosa (Schenk) Wight'ın kuru etli gövdeleri ve pullu yaprakları, 2005 yılında Çin Farmakopesinde açıklanan ilk eklem olmuştur. Cistanche esas olarak Çin'in Xingjiang, İç Moğolistan ve Gansu'da yetiştirilir ve küresel olarak Avrupa İber Yarımadası, Kuzey Afrika, Arabistan, İran, Afganistan, Pakistan, Kuzey Hindistan, Moğolistan ve diğer bölgelerdeki yarı kurak ve kurak bölgelerde bulunur. al. [1]. Aşırı kurak iklimler, şiddetli sıcaklık değişimleri ve çürümüş topraklar gibi zorlu çevre koşullarına dayanıklıdır [2]. Çin Yüksek Bitkilerinin Taksonomik İndeksine göre, Çin'de altı Cistanche türü vardır. Bununla birlikte, başka bir çalışma, Cistanche'nin sadece dört türünün ve bir varyantının, yani C. Deserticola YC Ma, C. tubulosa (Schenk) R. Wight, C. salsa (CA Mey.) G. Beck, C. sinensis G. Beck ve C. salsa var. albiflflora PF Tu ve diğerleri, [3].

C. Deserticola, Cistanche'nin tek geleneksel kaynağı olarak kabul edilir ve Doğu Han Hanedanlığı'ndan (MS 25-220) beri tıpta uzun bir kullanım geçmişine sahiptir [4]. Materia Medica'nın Özeti'nde (Ming Hanedanlığı'ndan Li Shizhen tarafından yazılmıştır), yang'ı yumuşak bir şekilde tonlamak için belgelenmiştir (daha güçlü bir etkiye sahip diğer bitkilerin aksine). Feniletanoid glikozitler, iridoidler, lignanlar, alditoller, oligosakkaritler, polisakaritler ve alkaloidler dahil olmak üzere bir dizi etkili kimyasal bileşen, modern fitokimyasal yöntemlerle C. Deserticola'dan izole edilmiştir [5]. Farmakolojik çalışmalar, fenetil glikozitin ana aktif bileşen olduğunu göstermiştir vegeliştirmekcinselişlev, çabalamaksinir koruyucuEtkileri, geliştirmeköğrenmevehafıza, vekorumakenkaraciğer. Demansa karşı da tedavi edici etkiler gösterir,Alzheimerhastalık, Parkinson hastalık, tükenmişlik, vetümörlersergilerle birlikteanti-iltihaplıvebağışıklık düzenleyiciözellikler [6, 7].

C. Deserticola, yalnızca Haloxylon ammodendron'un kökleri üzerinde yaşayan zorunlu bir parazit bitkidir [8]. Bir çalışma, C. Deserticola'nın Haloxylon persicum'da bile bulunmadığını bildirmiştir [9]. Son yıllarda, C. Deserticola'ya, yalnızca tıbbi değeri olan bileşenlerin bir kaynağı olduğu için değil, aynı zamanda çölleşmenin kontrolüne de büyük ölçüde katkıda bulunduğu için artan miktarda ilgi gösterilmiştir [10]. H. ammodendron, C. Deserticola ile ilgili çalışmalarda kullanılan tek konakçıdır. Nisan 2017'de, Zhejiang Quheng Kamu Refahı Fonu'nun bir çalışanı olan Wang Shuai, Gansu Eyaleti, Minqin Çöl Botanik Bahçesi'ndeki Atriplex canescens'e C. Deserticola tohumlarını aşıladı ve C. Deserticola'nın Mayıs 2018'de çiçek açtığı tespit edildi ve devam etti. Mayıs 2019'a kadar çiçeklenecek. Ancak tohumlar piyasadan satın alındı ​​ve gerçekten C. Deserticola tohumları olup olmadığı şüpheli. Ayrıca, bu fenomen geleneksel bilgiyi kırar ve daha fazla çalışılması gerekir.

A. canescens, Güneybatı Amerika'nın çöllerine özgü C4 çok yıllık bir çalıdır ve tuzluluk, ağır metaller, kuraklık ve yüksek sıcaklık koşullarına hızla uyum sağlar [11]. Oldukça lezzetli ve besin açısından zengin olduğu için çoğu çiftlik hayvanları ve büyük hayvanlar için yem olarak kullanılır [12]. Ayrıca, mükemmel adaptasyon kabiliyeti ve geniş kök sistemi nedeniyle özellikle erozyon kontrolü ve marjinal arazilerin ıslahı için yararlıdır. İlk olarak 1989'da Amerika Birleşik Devletleri'nden Çin'de tanıtıldı ve toprak ve su koruma, kum sabitleme ve tuzlu arazi restorasyonu için yaygın olarak kullanıldı [13]. A. canescens üzerinde C. Deserticola'nın büyümesini bildiren çalışma, C. Deserticola'nın özel parazit anlayışını altüst etse de, bu, A. canescens'in büyümesi için daha uygun olduğu için devrim niteliğinde bir bulgu olabilir. H. ammodendron ile karşılaştırıldığında daha fazla biyokütleye ve daha geniş bir ekolojik uyum aralığına sahiptir.

Tesadüfi keşfin doğruluğunu sağlamak için bitki tanımlama ve yapay aşılama deneyleri yapılmıştır. Geleneksel bitki tanımlaması, organoleptik değerlendirmeyi (dokunma, koku, görme ve tat gibi), morfolojik özelliklerin analizini (mikroskobik ve makroskopik gibi) ve kimyasal profillemeyi (yüksek performanslı sıvı kromatografisi, ince tabaka kromatografisi ve gaz gibi) içerir. kromatografi) [14]. Gövdedeki damar demetlerinin boyut, renk ve dizilişindeki farklılık nedeniyle C. tubulosa ve C. Sinensis'i dışlamak nispeten basittir. Asıl zorluk, C. Deserticola ve C. salsa arasında ayrım yapmaktır. Çin Florasına göre, C. salsa'nın braktesinin uzunluğu korollanın yaklaşık 1/3'ü kadar iken, C. Deserticola'da eşittir. Etli gövdelerin kesiti C. Deserticola ve C. salsa arasında benzerdir ve epidermis, korteks, damar demetleri ve özden oluşur. Ana fark, C. Deserticola için kaudat ve C. salsa için üçgen veya yarım daire olduğu için vasküler demet kılıfındadır.

Son yıllarda, tür tanımlaması için DNA barkodlama teknolojisi sıklıkla kullanılmaktadır. Genellikle korunan ve yaş ve bitki dokusunun türü gibi dış faktörlerden etkilenmeyen standart genomdan kısa bir DNA dizisi kullanan bir işlemdir. Bitki DNA barkodları için popüler aday diziler rbcL, matK, psbA-trnH, ITS ve ITS2'dir [15]. Birkaç çalışma, ITS/ITS2'nin bitkiler için en etkili tanımlama aracı olduğunu göstermiştir. Ayrıca, plastid barkodlardan daha yüksek ayırt edici gücü nedeniyle ITS2 bölgesinin çekirdek barkodlara dahil edilmesi önerilmiştir. ITS2'nin çok çeşitli bitki taksonlarının tanımlanması için yeni bir evrensel barkod olarak kullanılabileceği kabul edilmiştir [16, 17, 18, 19, 20, 21]. Birçok çalışma evrensel bir bitki barkodu tanımlamaya çalışsa da, mevcut lokusların hiçbiri tüm türler arasında çalışmaz, bu nedenle bitki türleri arasında ayrım yapmak için çok lokuslu bir yöntem gereklidir [22, 23, 24, 25, 26, 27, 28] . Bu çalışmada barkod olarak ITS2, rbcL, psbA-trnL kullanılmıştır.

Morfolojik ve moleküler tanımlama tekniklerine ek olarak, aşılama deneylerinden doğrudan kanıtlar gelir. C. Deserticola'nın A. canescens'i parazitleştirebileceğini göstermek için aşılama deneylerinin yapılması gerekir. Tanımlamaya ek olarak, kalite kontrol de birincil düşünce haline gelir. H. ammodendron kökü üzerinde parazitlenen C. Deserticola'nın kalitesi ile A. canescens üzerinde parazitlenen arasındaki farkı belirlemek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.

2. Malzemeler ve yöntemler

2.1. Bitki malzemeleri

Cistanche, genellikle konağın 30-100 cm derinliğindeki yan köklerinde parazit yapan, hafif tuzluluk gösteren yumuşak kumlu topraklarda yetişir. Uygun yetiştirme alanındaki iklim kurak, daha az yağışlı, büyük buharlaşma, uzun güneşlenme saatleri ve gece ile gündüz arasında büyük bir sıcaklık farkı var. Minqin ilçesi ve Baiying şehri bu numuneler için toplama yerleridir, Coğrafi olarak yakındırlar ve ılıman bir karasal kurak iklime sahiptirler, yıllık ortalama 113,2 mm yağış ve yıllık ortalama bağıl nem yüzde 44'tür. Spesifik ve ayrıntılı numune toplama bilgileri Tablo 1'de gösterilmektedir. Tüm numuneler donduruldu ve -20 C'de Doğal ve Biyomimetik İlaçlar Laboratuarı Eyalet Anahtar Laboratuvarı, Pekin, Çin'de muhafaza edildi.

2.2. Doku boyama ve gözlem

Taze numuneler elde edildi ve 90:5:5 oranında yüzde 70 etanol, buzlu asetik asit ve formaldehitten oluşan bir çözelti içinde saklandı ve bir etanol gradyanı kullanılarak kurutuldu (yüzde 75, yüzde 95, yüzde 100, yüzde 100) 1 saat için. Susuz kesitler, şeffaf kesitler elde etmek için 1 saat boyunca bir ksilen gradyanına (yüzde 25, yüzde 50, yüzde 75, yüzde 100, yüzde 100) tabi tutuldu. Saydam kesitler, numuneyi içeren ksilene ksilen hacmine eşit bir hacimde parafin eklendiği, daha sonra elde edilen çözeltinin yarısı aspire edildiği ve tekrar eşit hacimde parafin eklendiği parafin infiltrasyonuna tabi tutuldu. Bu işlem 10 kez tekrarlandı ve son olarak tüm solüsyonlar aspire edildi ve yerine eşit hacimde parafin konuldu; bu son adım iki kez tekrarlandı ve her adımdan sonra elde edilen solüsyon 1 saat 75°C'de inkübe edildi. Parafin infiltrasyonundan sonra kesitler gömmeye tabi tutuldu, burada numuneler sıvı parafin içeren bir demir tanka yerleştirildi ve ilave sıvı parafin tüm tankı doldurmak için hızla eklenir ve katılaşmaya bırakılır. Elde edilen mum bloğu kesilmiş ve kesitlere ayrılmıştır. Gömülü kesitler ılık suya yerleştirildi, tamamlandı, bir lam üzerine yerleştirildi ve 45°C'de 30 dakika inkübe edildi. Slayt üzerindeki bölümlerin mumu yüzde 100 ksilen, yüzde 100 ksilen, yüzde 50 ksilen, yüzde 50 ksilen, yüzde 100 etanol, yüzde 100 etanol, yüzde 95 etanol ve yüzde 75 etanol içinde seri olarak ıslatılarak ve daha sonra safranin O'da 40 dakika süreyle ıslatılarak mumu alındı. dk. Bunu, yüzde 75 etanol ve yüzde 95 etanolde seri, hızlı ıslatma başka bir turu izledi ve ardından slaytlar 1 dakika boyunca hızlı yeşile batırıldı. Son olarak, kesitler yüzde 95 etanol, yüzde 95 etanol, yüzde 100 etanol, yüzde 100 etanol, yüzde 50 ksilen, yüzde 50 ksilen ve yüzde 100 ksilen içinde son bir seri ıslatma işlemine tabi tutuldu. Kesitler boyandıktan sonra lam üzerine bir damla reçine tutkalı yerleştirildi ve üzerine bir kapak camı yerleştirildi. Slaytlar bir hafta boyunca rahatsız edilmedi ve doku kesitleri Olympus optik mikroskobu kullanılarak gözlendi ve görüntülendi.

2.3. DNA ekstraksiyonu ve PCR amplifikasyonu

Üreticinin protokollerine göre bir bitki genomik DNA ekstraksiyon kiti (Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, Çin) kullanılarak çiçek örneklerinden toplam genomik DNA ekstrakte edildi. Gen amplifikasyonu ve dizileme için primerler ve reaksiyon koşulları Tablo 2'de gösterilmektedir. Her gen amplifikasyonu, her numune için üç kez tekrarlandı.

2.4. Sıralama analizi

Kesin diziler elde etmek için, nihai PCR ürünleri, Transgene Hızlı Jel Ekstraksiyon Kitleri kullanılarak saflaştırıldıktan sonra, üreticinin talimatlarına göre ayrı ayrı pEASY®-Kör Klonlama Vektörlerine klonlandı. Klonlamadan sonra, kimyasal olarak yetkin Trans5ɑ hücrelerine dönüştürüldüler. Her numuneden üç koloni rastgele seçildi ve M13 primerleri kullanılarak dizildi. Bu koloniler, ABI Prism 3700 DNA Analizörlerinde BigDye Terminator V3.1 Döngü Dizileme Kitleri kullanılarak Sanger dizilimi ile iki yönlü olarak dizilendi. Elde edilen diziler, Clustal X (v1.8.7) [29] kullanılarak hizalandı ve BioEdit (v7.1.3.0) [30]'da manuel olarak senkronize edildi. Hizalanmış dizi verilerini kullanarak, komşu birleştirme (NJ) yöntemini kullanarak MEGA 7 yazılımını kullanarak filogeniyi yeniden yapılandırdık, Kimura 2-parametre (K2P) modeli kullanıldı ve önyükleme 1000 tekrardı [31].

2.5. C. Deserticola'nın aşılanması

Kumlu toprak içeren saksılara (çap yüksekliği taban çapı ¼ 20 cm- 20 cm-12 cm) üç gram C. Deserticola tohumu eklenmiş ve eşit dağılması için karıştırılmıştır. Kontrol grubu ise kumlu toprak içeren benzer saksılara ilave edilen 3 gr C. salsa tohumlarından oluşturuldu. Son olarak her saksıya A. canescens dikilmiş ve saksılar dış mekana yerleştirilmiştir. Toprak nem içeriği yüzde 13'ten (g/g) az olduğunda, saksılar sulanmıştır. Deney, Mayıs-Temmuz ayları arasında Zhongguancun Yaşam Bilimleri Parkı, Pekin, Çin'de (enlem 39-560 K, boylam 116 200 D; deniz seviyesinden 20m yukarıda) yapıldı. Gündüz sıcaklığı 16 ile 35 C arasında, gece sıcaklığı 12 ile 16 -C arasında değişiyordu. Havanın bağıl nemi yüzde 50'den fazladır. Güneş ışığı bol. Yaklaşık 80 gün sonra saksılardan toprak alınarak aşılama oranı belirlendi.

2.6. Tıbbi bileşenlerin konsantrasyonunun belirlenmesi

Tıbbi bileşenlerin konsantrasyonunun belirlenmesi iki bölümden oluşur, biri sıvı kromatografisi prosedürü, diğeri ise referans maddesi ve test maddesinin hazırlanmasıdır, daha fazla ayrıntı aşağıdaki gibidir:

i). Ekinakozit ve verbakozit-ekinakozit ve verbaskosit tayini tartıldı ve referans çözelti olarak kullanılan 0.2 mg/ml'lik bir çözelti verecek şekilde yüzde 50 metanol içinde eklendi. Birincisi, kuru C. Deserticola'yı toz haline getirmektir, toz, 100 ml'lik kahverengi bir ölçülü balonda 50 ml yüzde 50 metanol ile karıştırılmıştır ve karışım çalkalanarak, ıslatılarak test sıvısı elde edilmiştir. , sonikasyon, ayakta durma ve filtreleme. Kromatografik kolon, mobil faz olarak Metanol (A) - 0.1 yüzde Formik asit solüsyonu (B), gradyan elüsyonu (0-17 dakika, yüzde 26,5 A; 17–20 dakika, yüzde 26,5 → yüzde 29,5 A; 20–27 dakika, yüzde 29,5 A), akış hızı 1,0 mL/dak, kolon sıcaklığı 35°C, saptama dalga boyu 330 nm, enjeksiyon hacmi 10ul.

ii). Betain, mannitol, fruktoz, glukoz ve sakarozun belirlenmesiBetain, mannitol, fruktoz, glukoz ve sakaroz hassas bir şekilde tartılarak suya ilave edilerek {{0}}.25 mg/ml'lik bir çözelti elde edildi. referans çözümü olarak kullanılır. Yukarıda bahsedilen Cistanche test çözeltisinin beş mililitresi, 25 ml'lik bir ölçülü balonda yüzde 50 metanol ile karıştırıldı, iyice çalkalandı ve 0.2 um mikro gözenekli bir zar ile süzüldü. Kromatografik kolon SHODEXASHAIPAK NH2P-50 4E polimerize jel kolonu (250 mm 4.6 mm, 5um), mobil faz asetonitril-su (77:23), akış hızı 0.7 mL/dak, kolon sıcaklığı 25°C, Evaporatif ışık saçılım detektörü (ELSD) kullanılarak, sürüklenme tüpü sıcaklığı 100°C, taşıyıcı gaz akış hızı 3 L/dak, referans madde ve numunenin enjeksiyon hacmi 5ul idi.

3. Sonuçlar

3.1. Çiçeklerin morfolojik tanımlaması

A. canescens'i parazitleyen Cistanche türlerini doğrulamak için çiçek örneklerinin morfolojik analizi yapılmıştır (Şekil 1 ve Şekil S1). Parazitik bitkinin çiçeklerinin genel morfolojisi, C. Deserticola'nınkine benzerdi. Ayrıca korolla, farklı konakçılarda C. salsa'nınkinden daha kalındı. Flora of China'ya göre, C. Deserticola ve C. salsa, çiçeklerin bractında bariz farklılıklara sahiptir. C. Deserticola'da, ayraçlar korollaya eşitken, C. salsa'nın bract'ı taç uzunluğunun 1/3'ü kadardır. İstatistiksel analizimize dayanarak, A. canescens üzerinde parazitlenen Cistanche ve C. Deserticola'nın brakteleri korolla alt eşitlendi (Şekil S2). A. canescens üzerindeki Cistanche, C. Deserticola'nın morfolojik özelliklerini sergiledi, bu da C. Deserticola'nın A. canescens üzerindeki parazit olabileceğini düşündürdü.

Şekil 1. Cistanche çiçeklerinin morfolojik özellikleri. (A) Cistanche Deserticola (ev sahibi: Haloxylon ammodendron); (B) Cistanche (ev sahibi: Atriplex canescens); (C) Cistanche salsa (ev sahibi: Sympegma regelii); (D) Cistanche salsa (ev sahibi: Salsola passerina).

3.2. Lekeli doku örneklerinin mikroskobik olarak tanımlanması

C. Deserticola'nın etli sapının kesiti, C. salsa'nınkine çok benzer ve her ikisi de epidermis, korteks, damar demeti ve özden oluşur. Her iki bitkinin damar demetleri dalgalı veya derin dalgalı halkalar halinde düzenlenmiştir ve özler açıkça görülebilir. Ana fark, damar demeti kılıfının lateral şeklindedir; C. Deserticola'da kaudat, C. salsa'da üçgen veya yarım daire şeklindedir. A. canescens üzerinde parazitlenmiş Cistanche üzerinde bir mikro yapı analizi gerçekleştirdiğimizde, bunun C. Deserticola'ya benzeyen kaudat şeklinde bir damar demeti kılıfına sahip olduğunu bulduk (Şekil 2).

Şekil 2. Farklı Cistanche türlerinde etli gövdenin mikroskobik özellikleri. (A) Cistanche Deserticola'nın etli sapının mikroskobik özellikleri: 1. epidermis, 2. korteks, 3. yaprak iz demeti, 4. damar demeti, 5. medüller ışın, 6. damar demeti kılıfı, 7. floem, 8. ksilem , 9. öz. (B) Cistanche Deserticola'daki damar demetinin büyütülmüş görünümü: 1. damar demeti kılıfı, 2. lif, 3. prolin hücreleri, 4. bast lifi, 5. floem, 6. ksilem, 7. damar, 8. naylon. (C) Cistanche salsa'nın etli sapının mikroskobik özellikleri: 1. epidermis, 2. yaprak iz demeti, 3. korteks, 4. damar demeti, 5. medüller ışın, 6. öz. (D) Cistanche salsa'nın damar demetinin büyütülmüş görünümü: 1. damar demeti kılıfı, 2. prolin hücreleri, 3. Lif, 4. floem, 5. damar, 6. ksilem. (E) Atriplex canescens üzerinde parazitlenmiş Cistanche'nin etli sapının mikroskobik özellikleri 1. epidermis, 2. korteks, 3. damar demeti, 4. medüller ışın, 5. öz. (F) Atriplex canescens 1. damar, 2. ksilem, 3. kambiyum, 4. floem, 5. damar demeti kılıfı üzerinde parazitlenmiş Cistanche damar demetinin büyütülmüş görüntüsü.

3.3. moleküler tanımlama

Morfolojik tanımlamaya ek olarak, ayrıca bir moleküler tanımlama gerçekleştirdik ve ITS2, rbcL ve psbA-trnL olmak üzere üç gen fragmanı seçtik. Her parçanın dizi bilgisi kullanılarak bir evrim ağacı oluşturuldu (Şekil 3) ve üç filogenetik ağacın tümü, A. canescens üzerinde parazitlenen Cistanche'nin C. Deserticola ile yakın bir filogenetik ilişkiye sahip olduğunu gösterdi. Bu sonuçlar, C. Deserticola'nın A. canescens üzerinde parazit olabileceğini göstermektedir. Farklı Cistanche türleri arasında ayrıntılı gen farklılıkları, çoklu dizi hizalaması üzerine gözlendi (Şekil 4). C. Deserticola ve C. salsa arasındaki ITS2 gen gövdesinde 139, 295 ve 472 bazlarında üç tek nükleotid polimorfizmi (SNP) bulduk. rbcL gen gövdesinde, C. Deserticola ve C arasında dört gen farklılığı vardı. salsa, iki SNP ve iki ekleme ve silme (indel) mutasyonu içerir. ITS2 ve rbcL ile karşılaştırıldığında, C. Deserticola ve C. salsa arasındaki psbA-trnL gen gövdesindeki farklılıklar, dördü SNP ve üçü InDel mutasyonu olan yedi dizi farklılığı ile daha belirgindi. Özellikle, hizalanmış dizinin 414 tabanından başlayan bir dizi timin tekrarı, C. Deserticola ve C. salsa'yı ayırt etmek için basit dizi tekrarı (SSR) işaretlerini geliştirmek için kullanılabilir.

3.4. C. Deserticola'nın aşılanması

C. Deserticola'nın veya C. salsa'nın A. canescens'i parazitleştirip parazitleyemediğini test etmek için bir aşılama deneyi yapıldı ve aşılama oranı neredeyse yüzde 100 olan tüm C. Deserticola aşılı saksılarda parazitlik kanıtı bulduk (Şekil 5). Kontrol gruplarında parazitlik gözlenmedi. Bu sonuç, C. Deserticola'nın A. canescens'i kolayca parazitleştirdiğini, buna karşın C. salsa'nın yapamadığını doğrudan kanıtlamaktadır.

3.5. Önemli tıbbi bileşenlerin konsantrasyonunun belirlenmesi

A. canescens üzerinde parazitlenen C. Deserticola'daki önemli tıbbi bileşenlerin konsantrasyonunu tahmin ettik. Spesifik kromatogram ek materyalde gösterilmektedir. Doğru sonuçlar elde etmek için dört bağımsız deney kuruldu. Ölçümlerimize dayanarak (Tablo 3), verbascoside ve echinacoside konsantrasyonunun Çin Farmakopesinde bildirilenden 20 kat daha yüksek olduğunu bulduk (Çin Farmakopesine göre, echinacoside konsantrasyonlarının toplamının yüzdesi). ve C. Deserticola'daki verbascoside 0.30 yüzdesinden az olmalıdır). Konsantrasyonlar ayrıca H. ammodendron üzerinde parazitlenen C. Deserticola'dakinden (genellikle yüzde 0.2-1.5) önemli ölçüde daha yüksekti [32]. Mannitol, betain, fruktoz ve diğer karbonhidrat bileşenlerinin konsantrasyonu da çok yüksekti ve genel kalite, H. ammodendron üzerinde parazitlenen C. Deserticola'dakinden daha iyiydi. Dolayısıyla, bu sonuçlar A. canescens'in endüstriyel düzeyde C. Deserticola yetiştirmek ve nesli tükenmekte olan vahşi kaynakları korumak için kullanılabileceğini göstermektedir.

4. Tartışma

Daha önce, C. Deserticola'nın yalnızca H. ammodendron'u parazitleştirdiği düşünülüyordu. Ancak bu çalışmada, morfolojik ve moleküler tanımlama tekniklerini kullanarak, C. Deserticola'nın A. canescens'i de parazitleştirebileceğini gösterdik. H. ammodendron, A. canescens ve H. persicum'un tümü Chenopodiaceae familyasına ait olsa da, C. Deserticola'nın muhtemelen konakçı tarafından salgılanan sinyal molekülleri tarafından yönetilen tür seçiciliğine sahip olması ilginç ve tuhaftır. Amerika Birleşik Devletleri menşeli A. canescens, çevresel bozulmalara karşı güçlü direnç gösterir ve nispeten büyük biyokütleye sahiptir. A. canescens, çeşitli nedenlerle C. Deserticola için uygun bir konakçıdır. İlk olarak, çok çeşitli çevresel koşullarda hayatta kalabilir. İkincisi, C. Deserticola'nın biyokütlesi ve büyüme hızı, sırasıyla A. canescens üzerinde H. ammodendron'dan daha büyük ve daha hızlı olabilir. Üçüncüsü, A. canescens'in geniş adaptasyon kabiliyeti nedeniyle ekim alanı daha da genişletilebilir. Bu nedenle, A. canescens, ev sahibi olarak H. ammodendron'a göre belirgin avantajlara sahiptir ve C. Deserticola'nın endüstriyel üretimine yardımcı olacaktır.

C. Deserticola ve C. salsa'yı ayırt etmek zordur ve geçmişteki morfolojik tanımlama kafa karıştırıcı sonuçlar doğurmuştur. Moleküler biyoloji alanındaki gelişmelerle birlikte, Çin bitkisel tıbbında molekül bazlı tanımlama teknikleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Çin bitkisel ilaçlarının çoğu çok az genomik bilgi sunduğundan, DNA barkodlama teknolojisi çığır açan bir tanımlama tekniği olarak ortaya çıkmıştır. Bu çalışmada, bilinmeyen Cistanchetürlerini tanımlamak için morfolojik ve DNA barkodlama teknolojisi kapsamlı bir şekilde uygulandı; bu daha önce denenmemiştir ve sonuçlarımız bu yaklaşımın uygulanabilir olduğunu göstermektedir.

C. Deserticola, A. canescens'i parazitleştirdiği için, A. canescent'in kökleri üzerindeki ve H. ammodendron'un kökleri üzerindeki C. Deserticola'nın kalitesindeki farklılıkları belirlemek önemlidir. Sonuçlarımıza göre, aktif bileşenlerin konsantrasyonu, A. canescens üzerinde parazitlenen C. Deserticola'da, H. ammodendron üzerinde parazitlenene göre daha yüksekti. Bu nedenle, sonuçlarımız A. canescens üzerinde parazitlenmiş C. Deserticola'nın büyük ölçekli üretimi için sağlam bir teorik temel oluşturuyor.

5. Sonuçlar

Uzun bir süre boyunca, C. Deserticola'nın yalnızca H. ammodendron'u parazitleştirdiği düşünülmüştür. Daha önce piyasadan satın alınan C. Deserticola tohumlarının A. canescens'i parazitleştirebildiği tespit edilmişti.

Chenopodiaceae bitkisi. Morfolojik ve moleküler tanımlama yöntemlerini kullanarak, A. canescens'i parazitleyen Cistanche türünün C. Deserticola olduğunu doğruladık. Bu sonuç, aşılama deneyi ile daha da doğrulandı. Önemli tıbbi bileşenlerin konsantrasyonunu belirledik ve sonuçlarımız, bileşenlerin konsantrasyonu ve kalitesinin A. canescens üzerinde parazitlenen C. Deserticola'da H. ammodendron üzerinde parazitlenenden daha yüksek olduğunu gösteriyor. Yeni konakçıların keşfi, C. Deserticola'nın endüstriyel üretimini teşvik edebilir ve ayrıca vahşi kaynakları ve ekolojik çevreyi etkili bir şekilde koruyabilir.

Referanslar
[1] DY Tan, QS Guo, CL Wang, Cistanche Deserticola'nın mevcut durumu ve Çin'deki sömürüsü ve kullanımı üzerine çalışma, For. Kaynak. Yönet 33 (2004) 29–32.
[2] XY Qiao, HL Wang, YH Guo, Cistanche'nin tohum çimlenmesi koşulları üzerine çalışma, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 32 (2007) 1848-1850.
[3] PF Tu, YP He, ZC Lou, Cistanche, Chin'in kökeni ve kaynaklarının korunması üzerine bir araştırma. gelenek. bitki. İlaçlar 25 (1994) 205–208.
[4] LD Karalliedde, CT Kappagoda, Geleneksel Çin ilaçlarının allopatik uygulayıcılar için zorluğu, Am. J. Physiol. Kalp Çemberi. Fizol. 297 (2009) 1967–1969.
[5] Y. Jiang, PF Tu, Cistanche türlerinde kimyasal bileşenlerin analizi, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 1970-1979.
[6] T. Wang, XY Zhang, WY Xie, Cistanche Deserticola YC Ma, "çöl ginsengi": bir inceleme, Am. J.Çin. Med. 40 (2012) 1123-1141.
[7] Pharmacopoeia NCOC, Pharmacopoeia of the China People's Republic, The Chemical Industry Press, Pekin, 2020.
[8] GX Meng, XS Cui, Y. Wu, YH Guo, Leveillula saxaouli'nin Haloxylon ammodendron'un büyümesi, klorofil ve karbonhidratı üzerindeki etkileri, Kuzey. Hortik. 14 (2012) 141–143.
[9] YC Chen, M. Li, MZ Wu, YX Song, Haloxylon Bunge, Plant Physiol'ün iki türündeki köklerin yapısı ve bileşimi. 49 (2013) 1273–1276.
[10] PF Tu, Y. Jiang, YH Guo, YZ Tian, ​​ve diğerleri, Batı çöl bölgesinin ekolojik medeniyetini teşvik etmek için Cistanches herba'nın ekolojik endüstrisini geliştirmek, Mod. Çene. Med. 4 (2015) 297–301.
[11] SC Sanderson, HC Stutz, Mojavean ve Sonoran çölünde yüksek kromozom sayıları Atriplex canescens (Chenopodiaceae), Am. J. Bot. 81 (1994) 1045–1053.
[12] JL Peterson, DN Ueckert, RL Potter, JE Huston, Batı Teksas'ta seçilmiş dört kanatlı tuzlu çalı popülasyonlarında ekotipik varyasyon, J. Range Manag. 40 (1987) 361-366.
[13] DS Kong, Atriplex canescens'in morfolojik özellikleri ve eko-fizyolojik uyarlanabilirliği: bir inceleme, Çene. J. Ecol. 32 (2013) 210–216.
[14] MA Bashir, MS Faezah, SSO Mohd, W. Alina, İnceleme: Bitkisel tıbbi ürünlerde botaniklerin doğrulanması için DNA barkodlama ve kromatografi parmak izleri. Kötü. Temelli Tamamlayıcı, Alternatif. Med. 2017 (2017) 1-28.
[15] XW Li, Y. Yang, ve diğerleri, Bitki DNA barkodlama: genden genoma, Biol. Rev. 90 (2015) 157–166.
[16] SL Chen, H. Yao, JP Han, ve diğerleri, Doğrulama of ITS2 bölgesinin tıbbi bitki türlerinin tanımlanması için yeni bir DNA barkodu olarak, PloS One 5 (2010), e8613.
[17] K. Luo, SL Chen, KL Chen ve diğerleri, Rutaceae familyası kullanılarak aday bitki DNA barkodlarının değerlendirilmesi, Sci. Çin Yaşam Bilimi. 53 (2010) 701–708.
[18] T. Gao, H. Yao, JY Song, ve diğerleri, Fabaceae familyasındaki tıbbi bitkilerin potansiyel bir DNA barkodu kullanılarak tanımlanması ITS2, J. Ethnopharmacol. 130 (2010) 116–121.
[19] T. Gao, H. Yao, JY Song, ve diğerleri, Büyük Asteraceae familyasının ayırt edici türlerinde aday DNA barkodlarının kullanılmasının fizibilitesinin değerlendirilmesi, BMC Evol. Biol. 10 (2010) 324.
[20] XH Pang, JY Song, YJ Zhu, ve diğerleri, Euphorbiaceae içindeki türleri tanımlamak için DNA barkodunun kullanılması, Planta Med. 76 (2010) 1784-1786.
[21] XH Pang, JY Song, YJ Zhu, et al., Rosaceae türlerinin tanımlanması için bitki DNA barkodlarının uygulanması, Cladistics 27 (2011) 165–170.
[22] PD Hebert, EH Penton, JM Burns, DH Janzen, W. Hallwachs, On tür bir arada: DNA barkodlama, neotropik kaptan kelebeği Astraptes fulguration, Proc. Natl. Acad. bilim ABD 101 (2004) 14812–14817.
[23] MW Chase, RS Cowan, et al., Tüm kara bitkilerini barkodlamak için standart bir protokol önerisi, Taxon 56 (2007) 295–299.
[24] WJ Kress, DL Erickson, Kara bitkileri için iki lokuslu global DNA barkodu: kodlayan rbcL geni, kodlamayan trnH-psbA ayırıcı bölgesini tamamlar, PloS One 2 (2007) e508.
[25] DL Erickson, J. Spouge, A. Resch, ve diğerleri, kara bitkilerinde DNA barkodlama: başarıyı en üst düzeye çıkarmak için standartlar geliştirmek, Taxon 57 (2008) 1304-1316.
[26] NC Kane, Q. Cronk, Sınırsız Botanik: odakta barkodlama, Mol. ekol. 17 (2008) 5175–5176.
[27] R. Lahaye, M. van der Bank, D. Bogarin ve diğerleri, biyoçeşitlilik noktalarının florasını barkodlayan DNA, Proc. Natl. Acad. bilim ABD 105 (2008) 2923–2928.
[28] N. Kane, S. Sveinsson, H. Dempewolf, ve diğerleri, Kakaoda (Theobroma spp.; Malvaceae) Ultra-barcoding, bütün kloroplast genomları ve nükleer ribozomal DNA, Am. J. Bot. 99 (2012) 320–329.
[29] JD Thompson, TJ Gibson, F. Plewniak, F. Jeanmougin, DG Higgins, The CLUSTAL_X windows interface: kalite analiz araçlarıyla desteklenen çoklu dizi hizalaması için esnek stratejiler, Nucleic Acids Res. 25 (1997) 4876-4882.
[30] TA Hall, BioEdit: Windows 95/98/NT, Nucl. Asitler Belirti. Sör. 41 (1999) 95-98.
[31] S. Kumar, M. Nei, J. Dudley, K. Tamura, MEGA: DNA ve protein dizilerinin evrimsel analizi için biyolog merkezli bir yazılım, Kısa. Biyobilgi. 9 (2008) 299–306.
[32] PF Tu, B. Wang, T. Deyama, ZG Zhang, ZC Lou, Herba cistanchis'in feniletanoid glikozitlerinin RP-HPLC tarafından analizi, Açta Pharm. Çini. 32 (1997) 294–300.