​Cistanche Tubulosa'nın Feniletanoid Glikozidinin Diyabetik Nefropati Etkisi Üzerindeki Etkisini Araştırmak İçin Ağ Farmakolojisi ve Hayvan Deneylerine Dayalı

Özet: Amaç Etkisini araştırmakCistanche (Sistankara)feniletanol glikozitler(CPhG'ler) açıkdiyabetik böbrek hastalığı(DKD) ağ farmakolojisi ve hayvan deneylerine dayanmaktadır. Yöntemler UHPLC-QE-MS yöntemi analiz etmek için kullanıldı.CPhG'lerin kimyasal bileşenleri. Temel bileşenleri taramak için TCMSP ve İsviçre Hedef Tahmin veritabanları kullanıldı. DKD ile ilgili hedeflerin elde edilmesi için OMIM ve GeneCards veritabanları kullanıldı. Ortak hedefler elde edildikten sonra protein etkileşim ağı oluşturmak için STRING web sitesi kullanıldı. GO, KEGG yol analizi için DAVID veritabanı kullanıldı ve "CPhG'lerin çekirdek bileşen-hedef-yol" ağını oluşturmak için Cytoscape yazılımı kullanıldı. On adet sıçan normal grup olarak rastgele seçildi ve geri kalan sıçanlara yüksek şekerli ve yüksek yağlı yemle beslendi ve bir DKD modeli oluşturmak için tek bir intraperitoneal STZ enjeksiyonu yapıldı. Model grubu, dapagliflozin (1 mg/kg) grubu ve CPhG'ler yüksek, Orta ve düşük doz (500, 25{{40}}, 125) olarak ayrıldılar mg/kg) gruplar, her grupta 10 hayvan, 6 hafta boyunca ilaç tedavisi, genel durumlar gözlemlendi, vücut ağırlığı belirlendi ve her hafta kan şekeri ölçüldü; Son dozdan sonra 24 saatlik idrar toplandı. 24-saatlik toplam idrar proteinini (24-UTP) tespit et; Abdominal aorttan kan alın ve onu feda edin, serumu ayırın ve üre nitrojeni (BUN), ürik asit (UA), toplam kolesterol (TC), trigliserit (TG) ve yüksek tansiyonu tespit edin. Böbrek dokusundaki patolojik değişiklikleri gözlemlemek için yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) ve düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) seviyeleri, HE boyaması ve Masson boyaması, serum IL-1, IL{{17}'yi tespit etmek için ELISA kullanıldı. } ve TNF- düzeyleri ve Western blot böbrek dokusunu saptamak için kullanıldı. JAK2, p-JAK2, STAT3, p STAT3, SOCS3 protein ekspresyonu. Sonuçlar UHPLC-QE-MS teknolojisi ile toplam 699 bileşen tespit edildi. Taramanın ardından CPhG'lerin 16 temel bileşeni ve 323 ilgili hedef elde edildi. CPhG'ler ve DKD 99 hedefi paylaştı. Ana hedefler STAT3, SRC, EGFR vb. idi. KEGG yol analizi 151 sinyal yolunu taradı ve IL-17 sinyal yolunun, PI3K/Akt sinyal yolunun, TNF sinyal yolunun vb. önemli bir rol oynayabileceğini gösterdi. DKD'nin CPhG'ler tarafından tedavisi. CPhG'ler DKD sıçanlarının vücut ağırlığını artırabilir (P<0.01), su tüketimini azaltabilir (P<0.01), glikoz ve lipit metabolizmasını düzenleyebilir, 24-UTP ve BUN seviyelerini azaltabilir (P<0.01) ve böbrek dokusunu iyileştirebilir . Patolojik hasar böbrek dokusunda p-JAK2/JAK2 ve p-STAT3/STAT3'ün protein ekspresyonunu azalttı (P<0.01) ve SOCS3'ün protein ekspresyonunu arttırdı (P<0.01). Sonuç CPhG'ler, muhtemelen JAK2/'yi inhibe ederek birden fazla bileşen, birden fazla hedef ve birden fazla yol yoluyla DKD'ye müdahale eder.

STAT3 sinyal yolu.

Anahtar Kelimeler: Cistanche feniletanol glikozit; diyabetik nefropati; UHPLC-QE-MS; ağ farmakolojisi; hayvan deneyi; JAK2 /STAT3 sinyal yolu

CISTANCHE'IN BÖBREK HASTALARINDA ÇALIŞMASI NE KADAR SÜRER?

Diyabetik böbrek hastalığı (DKD)Diyabetin en önemli mikrovasküler komplikasyonlarından biri olan diyabet sadece diyabete yol açan birincil faktör değildir.kronik böbrek hastalığıaynı zamanda dünya çapında son dönem böbrek hastalığının (ESRD) ana nedenidir. Sebep [1-2]. DKD'nin klinik tedavisi temel olarak öncelikle kan şekerinin, kan basıncının ve kan lipitlerinin kontrol altına alınmasını, ikinci olarak böbrek fonksiyonunun korunmasını, nefrotoksik ilaçların kullanımından kaçınılmasını ve yaşam tarzının iyileştirilmesini içerir [3-4]. Ancak DKD'nin karmaşık patogenezi ve spesifik müdahale hedeflerinin bulunmaması nedeniyle mevcut tedavi seçeneklerinin sınırlamaları vardır ve etkili değildir. Son dönem DKD insidansı halen artmaktadır. Bu nedenle etkili doğal ilaçların bulunması büyük önem taşıyor.

Cistanche Deserticola Y． C． Anne veyaCistanche C'dir.Kurutulmuş etli saplarıCistanche tubulosa (Schenk) Wightpullu yaprakları olan [5] ilk olarak "Shen Nong's Materia Medica"da kaydedildi ve üst sınıf olarak listelendi. Bunlara "çöl ginsengi" adı verilir [6]. Tatlı, tuzlu ve sıcaktırlar. , böbrek ve kalın bağırsak meridyenlerine geri döner ve böbrek yang'ını besleyici, özü ve kanı yenileyici, bağırsakları nemlendiren ve müshil etkisine sahiptir. Araştırmalar, feniletanoid glikozitlerin (CPhG'ler) ana aktif bileşenlerden biri olduğunu ve gelişiminden sorumlu olduğunu göstermektedir.

Farmakolojik etkilerin uygulanmasının maddi temeli; Cistanche ekstraktının anti-diyabetik [7-8], anti-karaciğer kanseri [9], böbrek koruyucu [10-11], nöroprotektif [12-13] ve diğer farmakolojik etkileri vardır, ancak şu anda CPhG'ler bulunmaktadır. DKD tedavisinde etkili değildir. Etkileri ve mekanizmaları belirsizdir.

Bu çalışmada ağ farmakolojisi ve moleküler yerleştirme yöntemleri [14] kullanılmış, CPhG'ler araştırma nesnesi olarak alınmış, ana aktif bileşenleri ve DKD tedavisi için potansiyel hedefler tahmin edilmiş ve analiz edilmiş ve daha sonra streptozosin (STZ) ile indüklenen yüksek Lipid beslemeyle beslenen DKD sıçan modeli, klinik genişleme ve ilgili tedavilerin uygulanmasına ve etki mekanizmasına ilişkin ileri araştırmalara referans sağlamak amacıyla in vivo araştırmanın konusu olarak kullanıldı.

1 malzeme

1.1 Hayvanlar

70-SPF düzeyine sahip, vücut ağırlığı (240±20) g olan haftalık erkek SD sıçanları, Sincan Tıp Üniversitesi Hayvan Deney Merkezi'nden satın alındı ​​[Deneysel Hayvan Kullanım Lisansı No. SYXK (yeni) {{4} }], at Hayvanlar 1 hafta boyunca (22 ±2) derece sıcaklıkta, %50 ila %70 bağıl nemde ve 12 saat/12 saat dönüşümlü aydınlık ve karanlık döngüsünde uyarlanabilir bir şekilde yetiştirildi. Deney, Sincan Tıp Üniversitesi Tıbbi Deney Hayvanları Merkezi Hayvan Etiği Komitesi tarafından onaylandı (etik numarası IACUC-20220127-19).

1.2 Reaktifler ve ilaçlar

CPhGs (batch number 201610, purity >%80'i Xinjiang Hotan Dichen Co., Ltd. tarafından sağlanmıştır. Dapagliflozin (parti numarası NB2248), AstraZeneca, İngiltere'den satın alınmıştır. Yüksek şekerli ve yüksek yağlı yem (Kat. No. Boaigang-B1135DM) ve STZ (Parti No. 2021110307), Beijing Boai Port Bioteknoloji Co., Ltd.'den satın alınmıştır; idrar mikroalbümini (Seri No. 20220611), üre nitrojen (Seri No. 20220626), ürik asit (Seri No. 20220613), Toplam kolesterol (parti numarası 20220615), trigliseritler (parti numarası 20220616), yüksek yoğunluklu lipoprotein (parti numarası 20220614) ) ve düşük yoğunluklu lipoprotein (parti numarası 20220615) Nanjing Jiancheng Biyomühendislik Enstitüsü'nden satın alındı; interlökin-6 (IL-6, Lot numarası JL20896), interlökin-1 (IL-1 , lot numarası JL20884) ve tümör nekroz faktörü- (TNF- , lot numarası 13202) ) Shanghai Jianglai Bioteknoloji Co., Ltd.'den satın alınmıştır; JAK2 tavşan poliklonal antikoru (lot numarası 22v9316), p-JAK2 tavşan poliklonal antikoru (lot numarası 78g9360), STAT3 tavşan poliklonal antikoru (lot numarası 15x8824), p-STAT3 tavşan poliklonal antikoru (lot numarası 74m1478), SOCS3 tavşan poliklonal antikoru (lot) sayı 31d4841) hepsi Jiangsu Qianke Biyoteknoloji Araştırma Merkezi Co., Ltd.'den satın alınmıştır; HRP etiketli keçi anti-tavşan IgG poliklonal antikoru (parti numarası 20000758), Wuhan Mitaka Bioteknoloji Co., Ltd.'den satın alındı; -aktin tavşan monoklonal antikoru (parti numarası AC230205001), RIPA liziz tamponu (parti numarası 20220416), BCA Protein konsantrasyonu belirleme kitleri (parti numarası 20230401) Beijing Solebao Technology Co., Ltd'den satın alınmıştır.

1. 3 Enstrüman

Vanquish ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi, Q Exactive Focus yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi, Heraeus Fresco17 santrifüj, FC otomatik mikroplaka okuyucu (Thermo Fisher Scientific, ABD); JXFSTPRP-24 öğütücü (Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd.); Mingche D24 UV saf su sayacı (Almanya Merck Millipore Şirketi); ACQUITY UPLC BEH C18 kolonu (1,7 μm, 2,1 mm×100 mm) (American Waters Company); Accu Chek Performa kan şekeri ölçüm cihazı (İsviçre Roche Şirketi); CM1850UV kriyostat, DM300 dik floresan mikroskobu (Leica Company, Almanya); GL-88B girdap ölçer (Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.); elektronik analitik terazi (Bio-Rad Company, ABD).

2 yöntem

2. 1 UHPLC-QE-MS analizi

2.1.1 Test çözeltisinin hazırlanması

100 mg CPhG tartın, 500 μL %80 metanol ekleyin, 30 saniye vorteksleyin, 1 saat buzlu su banyosunda ultrasonik uygulayın, 1 saat boyunca -40 derecede bekletin, 4 derecede santrifüjleyin , 12 000 dev/dk, 15 dakika boyunca, süpernatantı aspire edin, 0. 22μm mikro gözenekli membrandan süzün ve -80 derecelik bir buzdolabında saklayın.

2.1.2 Kromatografik koşullar

ACQUITY UPLC BEH C18 sütunu (1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm); mobil faz asetonitril (A) %-1 formik asit (B), gradyan elüsyonu (0 ~ 11 dakika, %15 ~ %75 A; 11 ila 12 dakika, %75 ila %98 A; 12 ila 14 dakika, %98 A; 14 ila 14,1 dakika, %98 ila %15 A; 14,1 ila 15 dakika, %15 A); Hacim akış hızı 0 . 5 mL/dak; sütun sıcaklığı 35 derece; enjeksiyon hacmi 5 μL.

2.1.3 Kütle spektrometresi koşulları

tam tarama ddMS2 tam tarama modu; kılıf gazı hacim akış hızı 45 arb; yardımcı gaz hacmi akış hızı 15 arb; kılcal sıcaklık 400 derece; NCE modunda çarpışma enerjisi %15 ~ %30 ~ %45 döngü; püskürtme voltajı ± 4,0 kV.

2.2 Ağ Farmakolojisi Araştırması

2. 2. 1 CPhG'ler

Bileşen hedefi taraması: UHPLC-QE-MS ile analiz edilen kimyasal bileşenleri göreceli içeriğe göre sıralayın ve kimyasal yapıları henüz belirlenmemiş olanları silin. Her bir bileşenin farmakokinetik parametrelerini elde etmek için, taranan bileşenlerin InChIKey seri numarasını TCMSP veritabanına girin. Oral biyoyararlanım (OB) > %30 ve ilaca benzerlik (DL) > 0,18 koşullarına göre, gereklilikleri karşılayan adaylar taranacaktır. Hedefi tahmin etmek için İsviçre Hedef Tahmin veritabanına her bileşenin SMILES numarasını girin ve CPhG'lerin kimyasal bileşen hedefini elde edin.

2. 2. 2 DKD

Hastalık hedefi taraması OMIM, GeneCards ve NCBI veritabanlarında hastalık hedeflerini aramak için arama terimi olarak "diyabetik nefropati"yi kullanın.

2. 2. 3 Bileşen-hedef-hastalık ağının oluşturulması

CPhG bileşenlerinin ve hastalıklarının çapraz hedefleri, R yazılımı haritalaması yoluyla elde edildi ve analiz eklentisinin temel hedefleri tespit ettiği bir bileşen-hedef ağ sistemi oluşturmak için Cytoscape 3.7.2 yazılımı kullanıldı.

2. 2. 4 Protein-protein etkileşim ağının (PPI) oluşturulması

Bileşenlerin ve hastalıkların kesişim hedef proteinlerini STRING veritabanına aktarın, bir protein-protein etkileşimi ağı (PPI) oluşturun, ağda bağlı düğümler olmayan proteinleri silin ve en düşük protein etkileşimi puanının güven düzeyini {{1} olarak ayarlayın }.700. Bir PPI ağı oluşturun, TSV formatındaki sonuçlarını indirin, bunları Cytoscape 3.7.2 yazılımına aktarın ve temel hedefleri daha ayrıntılı olarak taramak için analiz eklentisini kullanın.

2. 2. 5 GO, KEGG analizi

Bileşen hastalıkların kesişim hedefleri üzerinde zenginleştirme analizi gerçekleştirmek için DAVID veritabanındaki İşlevsel Ek Açıklama bölümünü kullanın. Öncelikle analiz parametrelerini ayarlayın, Gen Listesi kutusuna kesişim hedefini girin, hedef tanımlayıcı olarak resmi gen sembolünü seçin, veri türü olarak Gen Listesini seçin (Liste Türü) ve veri türü olarak "Homo Sapiens (Türler)"i seçin. hedef kaynak (Türler). Race)", analiz parametrelerini onayladıktan sonra analize başlayın, GO ve KEGG analiz sonuçlarını alın ve ardından KEGG ve GO analiz sonuçlarının kabarcık diyagramını çizmek için ImageGP çevrimiçi çizim platformunu kullanın. Cytoscape 3.7.2 yazılımı bileşeni oluşturur. -hedef yolu ağ resmi.

2. 2. 6 Moleküler kenetlenme

Öncelikle SDF formatındaki etken maddenin 3 boyutlu yapı diyagramını PubChem veritabanından indirin, ardından PDB formatındaki kesişim hedefinin 3 boyutlu yapı diyagramını ABD Küresel Protein Veritabanından (PDB) indirin ve son olarak CB-Dock'a yükleyin. moleküler yerleştirme için web sitesi. Baskın yerleştirme konformasyonlarını tarayın ve bunları Pymol ile görselleştirin.

2.3 Hayvan deneyleri

2.3.1 Modelleme, gruplama ve ilaç uygulaması

10 adet sıçan normal grup olarak rastgele seçilip normal yemle, geri kalan sıçanlar ise yüksek şekerli ve yüksek yağlı yemle beslendi. 6 hafta sonra tek seferlik 30 mg/kg STZ (pH 4,5 sodyum sitrat tamponunda çözünmüş 0,1 mmol/L STZ) intraperitoneal enjeksiyonu yapıldı ve 72 saat sonra kuyruk damarından kan alındı. Açlık kan şekerini (FBG) tespit etmek için. AKŞ 16,7 mmol/L'den büyük veya ona eşitse diyabet modeli başarılı bir şekilde oluşturulmuştur [15]; devam 2 hafta boyunca yüksek şekerli ve yüksek yağlı yemle beslendiler. DKD modellemenin, idrar glikozu pozitifliği ve 24-saatlik toplam idrar proteini (24-UTP) 20 mg'dan büyük veya eşit olması temel alınarak başarılı olduğu belirlendi. Bunlardan 3'ü modelleme sürecinde öldü ve 7'si başarısız oldu. toplam 50 tanesi başarılı oldu. Başarılı bir şekilde modellenen sıçanlar rastgele olarak model grubu, dapagliflozin grubu (1 mg/kg) ve CPhG'ler yüksek, orta ve düşük doz (500, 250, 125 mg/kg) gruplarına ayrıldı. Her uygulama grubuna intragastrik olarak uygulandı. Normal gruptaki ve model gruptaki sıçanlara karşılık gelen ilaçlar verildi ve normal gruptaki ve model gruptaki sıçanlara toplam 6 hafta boyunca günde bir kez gavaj yoluyla aynı miktarda normal salin verildi. Uygulama süresi boyunca normal grup dışındaki her gruptaki sıçanlara yüksek yağlı yem verilmeye devam edildi.

2.3.2 Biyokimyasal Gösterge Tespiti

6 haftalık CPhG müdahalesinden sonra, sıçanlardan 24-saatlik idrar toplandı ve 24-saatlik toplam idrar proteini (24-UTP) ölçüldü; FBG seviyelerini tespit etmek için açlık kuyruk damarından kan toplandı; Abdominal aorttan kan toplandı, 4 derece, 1500 dev/dk. Serumu ayırmak ve serum üre nitrojenini tespit etmek için 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

BUN), ürik asit (UA), toplam kolesterol (TC), trigliserit (TG), yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL), düşük yoğunluklu lipoprotein (düşük yoğunluklu lipoprotein LDL) düzeyleri.

2.3.3 Böbrek dokusunun patolojik morfolojisinin gözlemlenmesi

Sıçanlara sodyum pentobarbital ile anestezi uygulandı ve sakrifiye edildi. Böbrekler soyuldu, tartıldı, %4 paraformaldehid ile sabitlendi, kurutuldu, şeffaf, balmumuna batırıldı, gömüldü ve hematoksilen-eozin (HE) boyama için bölümlere ayrıldı.

Masson boyamasından sonra doku morfolojisi mikroskop altında gözlemlendi ve entegre optik yoğunluğu analiz etmek ve ilgili kollajen lif alanını ölçmek için Image-Pro Plus 6.0 yazılımı kullanıldı.

2. 3. 4 ELISA

Yöntem, sıçanlarda serum inflamatuar faktörlerin düzeylerini tespit etmek için kullanıldı. IL-6, IL-1 ve TNF- seviyeleri kitin talimatlarına göre tespit edildi.

2. 3. 5 İlgili protein ifadesini tespit etmek için Western blot yöntemi

Sıçan böbrek dokusu alındı, toplam proteinin ekstraksiyonu için RIPA lizatı eklendi ve konsantrasyon BCA yöntemiyle belirlendi.

Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezinden sonra PVDF membranına aktarılır ve bloke edildikten sonra JAK2 (1:2000), p-JAK2 (1:1000), STAT3 (1:2000), p -STAT3 (1:2000), SOCS3 (1:2000), -aktin (1:2000) antikorları, gece boyunca 4 derecede inkübe edin, HRP etiketli IgG sekonder antikoru (1:5000) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin, elektrolüminesans kitiyle geliştirildi, açığa çıkarıldı Image J yazılımını kullanarak protein jel görüntüleyici ile

Parçaların kantitatif analizi. Dahili referans olarak -aktin kullanıldığında, hedef bandın gri değerinin dahili referans bandına oranı göreceli protein ifadesidir.

2.4 İstatistiksel analiz

Veriler SPSS 25.0 yazılımı ile işlendi ve veriler (x±s) olarak ifade edildi. Gruplar arası karşılaştırmada tek yönlü varyans analizi kullanıldı. P<0.05 indicates that the difference is statistically significant.