Cistanche Deserticola'dan İzole Edilen Toplam Feniletanoid Glikozit Fraksiyonunun Yumurtalıkları Alınmış Sıçanlarda Kemik Mikroyapısı Üzerine Faydalı Etkileri

Lingling Yang, Shuqin Ding, Bo Zhang, Jingjing Liu, Yanhong Dong, Qiwen Tang, Pingping Yang ve Xueqin Ma

1 Farmasötik Analiz Bölümü, Eczacılık Fakültesi, Ningxia Tıp Üniversitesi, 1160 Shenli Caddesi, Yinchuan 750004, Çin

2 Klinik Tıp Okulu, Ningxia Tıp Üniversitesi, 692 Shenli Caddesi, Yinchuan 750004, Çin

3 Hui Etnik Tıp Modernizasyonunun Anahtar Laboratuvarı, Eğitim Bakanlığı, Ningxia Tıp Üniversitesi, 1160 Shenli Caddesi, Yinchuan 750004, Çin

Bu, Creative Commons Atıf Lisansı altında dağıtılan ve orijinal esere uygun şekilde atıfta bulunulması koşuluyla herhangi bir ortamda sınırsız kullanım, dağıtım ve çoğaltmaya izin veren açık erişimli bir makaledir.

İletişim:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Soyut

Bu çalışma, izole edilen toplam feniletanoid glikozit fraksiyonunun antiosteoporotik aktivitesini tahmin etmek için tasarlanmıştır.cistancheçöl çiçeği(CDP) ovariektomi (OVX) ve ilgili mekanizmalar ile indüklenen sıçanlarda. 3 aylık oral uygulamadan sonra, OVX sıçanlarında azalmış kemik mineral yoğunluğu, serum Ca ve P geri kazanıldı ve bozulan trabeküler kemik mikromimarisi, Cistanche Deserticola (60, 120 ve 240 mg/kg) müdahalesi ile kısmen iyileştirildi, aktiviteler kemik rezorpsiyon belirteçleri aşağı regüle edildi ve kemik oluşum indeksinin biyoaktifi yukarı regüle edildi; bu arada, MDA içeriği azaldı ve CDP tedavisi ile GSH arttı. Bileşimsel olarak, 8 feniletanoid glikozit bileşiği tanımlandı.cistancheçöl çiçeği(CDP), HPLC yöntemi kullanılarak yüzde 50,3 olarak nicelenen toplam içerikle. mekanik olarak,cistancheçöl çiçeği(CDP) TRAF6, RANKL ve RANK seviyelerini düşürdü, böylece RANKL/RANK/TRAF6-aşağı akış NF-κB ve PI3K/AKT sinyal yollarının aktivasyonunu baskıladı ve nihayetinde NFAT2 ve c'nin temel osteoklastojenik proteinlerinin aktivitelerini önledi -Fos. Yukarıdaki verilerin tümü, CDP'nin yumurtalıkları alınmış sıçanlarda kemik mikro yapısı üzerinde faydalı etkiler gösterdiğini ima etti ve bu etkiler, RANKL, RANK ve TRAF6'nın bağlanmasıyla tetiklenen NF-κB ve PI3K/AKT sinyal yollarıyla ilgili olabilir.

Cistanche tübülozabirçok etkisi vardır, daha fazla bilgi için buraya tıklayın

1. Giriş

50 yaşından büyük her 3 kadından 1'inin acı çekeceği postmenopozal osteoporoz, tüm dünyada 200 milyondan fazla kadını etkileyen ana sağlık tehlikesi haline geliyor [1]. Menopozda, östrojen seviyesindeki keskin düşüş, genellikle gelişmiş osteoklastojenezin neden olduğu aşırı kemik rezorbsiyonuna yol açar; daha sonra, osteoblastın neden olduğu kemik oluşumu ile osteoklastın neden olduğu kemik rezorpsiyonu arasındaki denge bozuldu ve hızlanan kemik rezorpsiyonu sonunda osteoporoza ve hatta kalça veya omurga kırığına neden oldu [2]. Nükleer faktör kappa B'nin (RANK) reseptör aktivatörü, RANK'ın ligandı olan RANKL'a bağlandığında osteoklast farklılaşmasının tetiklendiğine inanılıyordu. Bununla birlikte, protein tümör nekroz faktörü reseptörü ile ilişkili faktör 6 (TRAF6) [3] ve ardından PI3K/AKT ve NF-κB dahil olmak üzere aşağı akış sinyal yollarının uyarılması sürece RANK ile RANKL kombinasyonu aktive edilemez. Ve son olarak, aktive edilmiş T hücrelerinin c2 (NFAT2) ve c-Fos nükleer faktörünün ekspresyonları, osteoklastın farklılaşmasının yanı sıra kemik rezorpsiyonunu modüle etmek için düzenlendi [4]. Bu nedenle, osteoklastın aktivasyonu ve farklılaşması ile doğrudan veya dolaylı olarak ilgili olan faktörlerin ve düzenleyicilerin, kemik kaybını önlemek için çok önemli hedefler olduğuna inanılıyordu.

Gerçekten de menopoz sonrası osteoporoz tedavisinde etkili olan östradiol valerat gibi bazı klinik ve sentetik hormon replasman tedavisi ilaçları vardır. Ne yazık ki, bunlardan bazıları klinik uygulamalarını sınırlayan meme ve endometriyal kanserler gibi ciddi kanser riskini artırdı [5]. Bu nedenle hem etkinliği hem de yan etkileri minimal olan diğer alternatiflerin seçilmesi gerekmektedir. Geleneksel Çin ilaçlarının (TCM) yanı sıra izole edilmiş biyoaktif bileşikler ve fraksiyonların [6-9], menopoz sonrası osteoporoz dahil çeşitli rahatsızlıklar üzerinde etkili olduğu kanıtlanmıştır. Bu biyoaktif bileşenler ve fraksiyonlar arasında, potansiyel etkinliği olan feniletanoid glikozit (PhG) bileşiklerinin, osteoporoz tedavisi için umut verici maddeler olduğuna inanılıyordu [10-12]. PhG'lerin yapıları, bir glikozidik bağ yoluyla -glukopiranoz, apioz, galaktoz, ramnoz veya ksiloz ile birleştirilen bir hidroksil fenil etil grubu olan sinnamik asit aglikondan oluşur. Cinsin tıbbi türlerinde yaygın olarak bulunurlar.cistanche[13]. cistancheçöl çiçeğiYC Ma, Çin farmakopesinde kayıtlı resmi bir TCM'dir ve önemli bir TCM olmasının yanı sıra [14], C Deserticola, State Food tarafından onaylanmış tıbbi likör ve besin sıvısı olarak geliştirilmiş, birkaç yan etkisi olan yaşlanma karşıtı bir tonik bitkidir. ve İlaç İdaresi. Çin farmakopesi kayıtlarına göre, C. Deserticola, yerliler tarafından kas zayıflığı ve bel zayıflığı gibi böbrek özü eksikliği sorunlarının üstesinden gelmek için geleneksel olarak kullanılmıştır ve ekinakozit ve akteozit dahil olmak üzere feniletanoid glikozit bileşikleri, bu bitkideki ana biyoaktif bileşenlerdir. TCM'nin "böbrek-yönetimli kemik" teorisine göre, kemik sistemi böbrek özü tarafından yönetilir [15] ve osteoporoz gibi kemikle ilgili sorunlar, böbrek özünü besleme aktivitesine sahip otlar veya bileşiklerle giderilebilir. Bu nedenle, C. Deserticola'dan izole edilen toplam feniletanoid glikozit fraksiyonunun en azından kısmen osteoporoz tedavisinde faydalı olduğunu varsaydık. Bu nedenle mevcut deney, bir yumurtalıkları alınmış (OVX) sıçan modeli kullanarak hipotezimizi doğrulamak için tasarlandı; Tahmin edilmesi gereken kemik rezorpsiyonu ve oluşum belirteçlerinin yanı sıra, RANKL/RANK/TRAF6- ile indüklenen PI3K/AKT ve NF-κB sinyal yollarının yanı sıra antioksidasyon indeksi de antiosteoporotik biyoaktivitenin ana mekanizmalarını araştırmak için kullanıldı. .

2. Malzemeler ve Yöntem

2.1. Bitki Materyalleri ve Hazırlanması.

Toplam 30 kg sapcistancheçöl çiçeğiY.C. Ma, 2015 Eylül'de Yongning İlçesinden 106 koordinatlarıyla toplanmıştır.026597 ve 38.262816, Ningxia Eyaleti, Çin. Bitki, Dr. Lin Dong (Ningxia Tıp Üniversitesi, Farmakognozi Bölümü) ve buna karşılık gelen bir örnek (#201509{{40}}1) tarafından tanımlandı. Farmasötik Analiz Bölümü'nde muhafaza edilmiştir. İlk olarak, çözücü olarak yüzde 70 etanol ile geri akış yöntemi kullanılarak 30.0 kg toz C. Deserticola özütlendi; materyalin solvente oranı 1:10 olarak ayarlandı ve geri akış süresi 3 kez 2 saatti. Daha sonra, tüm filtratlar birleştirildi ve 60 derece C'de azaltılmış basınç altında yoğuşturuldu. İkinci olarak, ön ayırma için AB-8 makrogözenekli reçine kolonları ve su içinde farklı oranlarda etanol (yüzde 0, yüzde 20, Elüsyon için yüzde 30, yüzde 40, yüzde 50 ve yüzde 60, her biri 60 L) kullanıldı. Üçüncü olarak, yüzde 40 ve yüzde 50 elüentler birleştirildi ve suda yüzde 0, yüzde 20, yüzde 30, yüzde 40 ve yüzde 50 etanol ile tekrarlanan AB-8 makro gözenekli reçine kolonları kullanılarak daha da saflaştırıldı ve her eluent 12 L idi. Son olarak, yüzde 40'lık fraksiyon toplandı ve azaltılmış basınç altında yoğuşturularak 150 g uçuk sarı tortu feniletanoid glikozit C. çölicola fraksiyonu elde edildi (CDP, verim yüzde 0.5 idi). İn vivo deneyler için, CDP'yi çözmek için yüzde 0,5 CMC-Na çözücü kullanıldı; hayvanlara oral uygulama, 1 mL/100 g vücut ağırlığı olarak belirlendi; in vitro Western blot analizi için, CDP, DMSO ile çözündürüldü ve daha sonra 0.1 mg/mL, 0.01 mg/ml ve 0.001 mg/mL'lik nihai konsantrasyonları elde etmek için DMEM ile seyreltildi.

2.2. Kimyasallar ve Çözücüler.

Estradiol valerat (EV) Delpharm Lille SAS, Fransa'dandı; Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Şangay, Çin, 201605'ten alkalin fosfataz (ALP), kemik gla-proteini (BGP), tartarat dirençli asit fosfataz (TRAP) ve deoksipiridinolin (DPD) çapraz bağlama ELISA kitleri; Nanjing Jiancheng Biyoloji Mühendisliği Enstitüsü, Nanjing, Çin'den malondialdehit (MDA, 20181221), süper oksit dismutaz (SOD, 20121218) ve glutatyon (GSH, 20181221) reaktif kitleri; Intakt parathormon (l-PTH, NEWASHE7UZ), kalsitonin (2L9ISN7AIU) ve östrojenle ilişkili reseptör alfa (ERR, Y3AY8QEWB3), Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Wuhan, Çin'den ELISA kitlerini çapraz bağlar; katepsin K ELISA reaktif kiti, BioVision, Amerika, 1l300141; RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κB p65 (AH04138226), PI3 kinaz p85 alfa (AC09021266) birincil antikorları , AKT 1 (AF05173234), -aktin (17AV0411) ve ZSGB-BIO'dan yaban turpu peroksidazla konjuge keçi anti tavşan IgG'sinin ikincil antikorları, Çin, 136080; toplam BCA protein tahlil kiti ve oste oklast oluşumunun ve fetal sığır serumunun tespiti için ticari kit ve HyClone, Logan, UT, ABD'den Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM); Millipore Life Sciences, Billerica, MA, ABD'den poliviniliden flflorür (PVDF) membran; Gibco, Rockville, MD, ABD'den penisilin ve streptomisin. Kullanılan diğer tüm kimyasal maddeler AR sınıfındaydı.

2.3. Cistanche Deserticola P. HPLC Kantifikasyonu

CDP'nin bileşimini belirlemek ve ölçmek için bir Agilent 1220 HPLC cihazı kullanıldı. Kromatografi koşulları aşağıdaki gibidir: C18 kolonu (TSK-GEL, 4 6 I d × 250 mm, 5 um); gradyanlı elüsyon, çözücüler A (asetonitril) ve B (yüzde 0,5 asetik asit içeren su) (0-10 dak: yüzde 17-20 A; 10-30 dak: yüzde 20-25 A; ve 30-40 dak: 25-30 yüzde A); algılama dalga boyu 333 nm idi; ortam sıcaklığı; akış hız 1.0 mL/dak idi; numune enjeksiyon hacmi 5 μL idi. Sekiz PhG bileşiği, yani cistanozit F, ekinakozit, 6'-asetillakteozit, cistanozit C, cistanozit A, ateozit, 2'-asetillaktosid ve izoakteozit tanımlandı; karşılık gelen referans maddeleri ve harici bir standart yöntem kullanılarak, yukarıdaki 8 PhG'nin içeriği HPLC analizi ile ölçülmüştür (Şekil 1).

2.4. Hayvan Deneysel Protokolü.

Ningxia Medical University'nin hayvan testi merkezinden 3 aylık toplam 60 dişi yetişkin Sprague-Dawley sıçanı, ortalama başlangıç ​​vücut ağırlıkları yaklaşık 234 ± 25 g olarak amaçlandı. Sıçanlar, 1 hafta boyunca alışmaları için standart spesifik patojen içermeyen bir ortamda barındırıldı. Daha sonra, tüm sıçanlara sadece anestezi uygulandı (kloral hidrat, 100 mg/kg, ip) veya sahte yumurtalıkları alındı ​​(SHAM) ya da iki yumurtalık alındı ​​ve daha sonra rastgele 5 alt gruba ayrıldı: ağızdan araçla tedavi edildi (yüzde 0,5 CMC- Na) model grubu (OVX), estradiol valerat (1 mg/kg/gün) pozitif grup (EV) ve 60, 120 ve 240 mg/kg/gün CDP düşük (CDPL), sırasıyla orta (CDPM) ve yüksek (CDPH) dozaj grupları. Tüm sıçanlara günlük olarak oral yoldan verildi ve tüm vücut ağırlıklarının değişimine bağlı olarak her 2 haftada bir doz ayarlanarak 3 ay sürdü. Hayvan deneyinin son gününde metabolik kafesler kullanılarak 24-saatlik idrar alındı; anestezi uygulanmış sıçanların femoral arterinden serum toplandı; sağ uyluk kemiği, kaval kemiği ve tüm organlar diseke edildi ve ileri analiz için -80 derece C'de saklandı. Yaptığımız hayvan deneyleri, Ningxia Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylandı.

2.5. Kemik Mineral Yoğunluğu Tayini ve Mikro-CT Analizi.

İlk olarak, her sıçanın sağ femurunun toplam kemik mineral yoğunluğunu tahmin etmek için çift enerjili bir X-ışını absorpsiyometri makinesi (Lunar, ABD) kullanıldı; ikinci olarak, aynı femur, bir mikro-CT tarayıcı aparatı (GE, Amerika) kullanılarak trabeküler kemik mikro mimarisinin 3 boyutlu görüntüsünü tahmin etmek için kullanıldı. İdeal bir 3D görüntü elde etmek için izotropik çözünürlük 14 μm olarak ayarlandı; ilgilenilen bölge (ROI), her numunenin femurunun büyüme plakasında aynı koordinatlar ayarlanarak seçildi; ve trabeküler ayrılma (Tb. Sp), trabeküler sayı (Tb. N), trabeküler kalınlık (Tb. Th), kemik mineral içeriği (BMC), doku mineral yoğunluğu (TMD) ve doku mineral içeriği (TMC) dahil olmak üzere kemik morfometrik parametreler ) ROI analiz edilerek elde edildi.

2.6. Serum ve İdrar Biyokimyasal Testi.

Serum katepsin K, TRAP, SOD ve GSH'nin yanı sıra serum PTH, kalsitonin, ERR, MDA, BGP ve idrar DPD içeriği, üreticinin talimatına göre ilgili reaktif kitleri kullanılarak belirlendi ve alkalin fosfataz (ALP) seviyesi ve serum ve idrar kalsiyum (Ca) ve fosfor (P) içerikleri otomatik bir makine (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, ABD) kullanılarak tahmin edildi.

2.7. Western Blot Analizi.

Osteoklastlar, makrofaj koloni uyarıcı faktör (MCSF) ve RANKL ile eklenen RAW 264.7 hücreleri kullanılarak indüklendi. Kısaca, 1 x 107 RAW 264.7 hücresi, 30 ng/mL MCSF ve 25 ng/mL RANKL varlığında bir 6-kuyu plakasında kültürlendi. 6 günlük indüksiyondan sonra, olgunlaşmış osteoklast hücreleri, ilgili kit ile TRAP lekeli yöntem kullanılarak tanımlandı, ardından CDP (0.1, 0.01 ve 0.001 mg/mL) ile tedavi edildi. sırasıyla) 24 saat; daha sonra hücreler, 0.5 mmol fenilmetilsülfonil florür, proteaz ve fosfataz inhibitörleri içeren bir lizis tamponu ile parçalandı. Lizat daha sonra yüzde 10 SDS-PAGE kullanılarak ayrıldı ve AKT1, NF-KB-p65, RANKL, PI3K-p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos ve -aktin ile problanan bir PVDF membranına aktarıldı. (1:400) 2 saat boyunca yüzde 5 yağsız süt ile bloke edildikten sonra. Aynı membranlar sıyrıldı ve sırasıyla yukarıdaki 9 karşılık gelen antikorla tekrar problandı, ardından sonunda Image Lab yazılımı tarafından tespit edildi. Deneyler üç kez tekrarlandı.

2.8. İstatistiksel analiz.

Ortalama ± SD olarak tanımlanan in vivo ve in vitro deneylerden elde edilen tüm veriler, tek yönlü ANOVA ve ardından Dunnett testi (SPSS 22.0 yazılımı, SPSS, ABD) kullanılarak analiz edildi; p < 0="" 05="" istatistiksel="" olarak="">

Sonuçlar

3.1. Cistanche Deserticola P.'nin Kimyasal Bileşimi

HPLC yöntemi kullanılarak sekizfeniletanoid glikozitŞekil 1'de gösterildiği gibi bu fraksiyonda bileşikler bulundu. Standart referanslar ve harici bir standart yöntem kullanılarak, bileşikler ve içerikleri şu şekilde belirlendi ve miktarları belirlendi: (1) ateozit F (yüzde 3,6), (2) ekinakozit (yüzde 8,8), (3) sistanozit A (5.{ {9}} yüzde ), (4) ateozit (yüzde 13,3), (5) izoakteozit (yüzde 3,3), (6) ateozit C (yüzde 3,6), (7) 2'-asetillakteozit (yüzde 9,9) ve (8 ) 6′-asetillakteozid (yüzde 3,2). Bu sekiz bileşenin toplam içeriği yüzde 50,7 olarak ölçülmüştür.

3.2. Cistanche Deserticola P'nin Trabekül'ün Kemik Mineral Yoğunluğu ve Mikromimarisi Üzerine Etkileri.

Farklı alt gruplardaki sıçanların toplam kemik mineral yoğunluğu Şekil 2'de gösterilmektedir. OVX model grubundaki sıçanlarda kemik mineral yoğunluğu içeriğinde azalma eğilimi gözlendi ve sonrasında yaklaşık yüzde 12.0 azaldı. SHAM grubundaki sıçanlarla karşılaştırıldığında operasyonun 12 haftası (p < 0="" 001).="" cdp="" ile="" tedavi="" edilen="" sıçanların="" tümü,="" ovx="" modeli="" sıçanlarla="" karşılaştırıldığında,="" sırasıyla="" yüzde="" 11,2,="" yüzde="" 12.{9}}="" ve="" yüzde="" 10,7="" (p="">< 0="" 01)="" ile="" önemli="" ölçüde="" artmış="" kemik="" mineral="" yoğunluğu="" sergiledi.="" grup.="" ayrıca,="" toplam="" kemik="" mineral="" yoğunluğu="" verileriyle="" tutarlı="" olarak,="" mikro-ct="" rekonstrüksiyonu="" ve="" femurun="" histomorfometrik="" tespiti,="" ovx="" grubundaki="" sıçanların,="" trabeküllerin="" sayısında="" ve="" alanında="" da="" belirgin="" bir="" düşüşle="" kanıtlanan,="" trabeküler="" mimaride="" bariz="" bozulma="" gösterdiğini="" gösterdi.="" belirgin="" olarak="" artan="" tb.="" sp,="" sham="" grubunun="" sıçanlarıyla="" karşılaştırıldığında.="" cdp="" ile="" tedavi,="" trabeküler="" mimaride="" ovx'in="" neden="" olduğu="" bozulmayı="" önledi;="" şekil="" 3'te="" gösterildiği="" gibi,="" bmc,="" tmc="" ve="" tb.="" n="" değerleri="" önemli="" ölçüde="" arttı="" ve="" tb="" alanı.="" sp="" önemli="" ölçüde="" azalırken,="" tmd="" ve="" tb="" değerleri.="" ovx="" operasyonundan="" ve="" bizim="" cdp="" müdahalemizden="" önemli="" ölçüde="" etkilenmemiş="">

3.3. Cistanche Deserticola P'nin İdrar ve Serum Biyokimyasal Parametreleri Üzerine Etkileri.

Şekil 4'ün gösterdiği gibi, OVX model grubundaki sıçanlarda idrar P ve serum kalsitonin içeriğinde önemli azalma eğilimleri tespit edildi, bu, SHAM sıçanlarından yaklaşık yüzde 30 ve yüzde 60 daha azdı (p < 0="" 001="" ),="" sırasıyla,="" ovx="" ve="" sham="" grupları="" arasında="" idrar="" ca="" ve="" serum="" ca="" ve="" ayrıca="" serum="" p="" ve="" serum="" pth="" seviyelerinde="" belirgin="" bir="" artış="" veya="" azalma="" eğilimi="" gözlenmedi.="" cdp="" ile="" tedavi,="" ovx="" model="" grubundaki="" sıçanlara="" kıyasla="" serum="" p="" ve="" ca="" seviyelerinin="" belirgin="" şekilde="" yukarı="" regüle="" edilmesi="" (p="">< 0="" 05)="" ile="" kanıtlanan,="" ovx="" sıçanlarında="" serum="" p="" ve="" ca="" kaybını="" önemli="" ölçüde="" önledi.="" ek="" olarak,="" ovx="" model="" grubuna="" kıyasla="" cdp'nin="" hem="" düşük="" hem="" de="" yüksek="" doz="" gruplarında="" kalsitonin="" artışı="" ancak="" istatistiksel="" olarak="" anlamlı="" olmayan="" eğilimler="">

3.4. Cistanche Deserticola P'nin Kemik Oluşumu ve Kemik Rezorpsiyon Belirteçleri Üzerine Etkileri.

CDP'nin kemik oluşum indeksi üzerindeki yararlı etkilerinin yanı sıra kemik rezorbsiyon belirteçleri üzerindeki inhibisyon etkileri Şekil 5'te açıklanmıştır. Kemik oluşumu belirteçleriyle ilgili olarak, serum BGP seviyeleri yumurtalıkları alınmış cerrahiden hemen hemen etkilenmemiştir. tedavi edilen tüm gruplarda önemli değişiklikler gözlenirken, CDP müdahale gruplarının hem düşük (60 mg/kg) hem de orta (120 mg/kg) dozlarında serum ALP'de istatistiksel olarak anlamlı iyileşmeler elde edildi. SHAM grubunun sıçanları ile karşılaştırıldığında (p < 0="" 01).="" kemik="" erime="" indeksi="" ile="" ilgili="" olarak,="" serum="" katepsin="" k="" ve="" dpd="" seviyeleri="" ile="" ovx="" model="" grubundaki="" sıçanlarda="" trap="" seviyeleri,="" sham="" fareleri="" ile="" karşılaştırıldığında="" sırasıyla="" yaklaşık="" yüzde="" 75,0,="" yüzde="" 41.4="" ve="" yüzde="" 21.0="" oranında="" önemli="" ölçüde="" arttı.="" ve="" cdp="" ile,="" özellikle="" 60="" mg/kg'lık="" düşük="" dozla="" tedavi="" edildiğinde,="" katepsin="" k="" ve="" dpd'nin="" yanı="" sıra="" ovx="" model="" grubundaki="" trap="" özellikleri,="" sırasıyla="" yüzde="" 67.3,="" yüzde="" 41.4="" ve="" yüzde="" 25.9="" oranında="" belirgin="" bir="" şekilde="" inhibe="" edildi.="" ovx="" model="" grubundaki="" sıçanlarla="">

3.5. Cistanche Deserticola P'nin Vajina ve Rahim ile Tüm Vücut Ağırlıklarına Etkileri.

Altı grupta tedaviden önce sıçanların ilk tüm vücut ağırlıklarında anlamlı olmayan farklılıklar gözlendi (Şekil 6). Bununla birlikte, yumurtalıkları alınmış operasyon, OVX model grubundaki sıçanların nihai vücut ağırlığında yaklaşık yüzde 36,0 olan önemli bir artışa yol açarken, rahim ve vajina ıslak ağırlıkları yaklaşık 9{{4 oranında büyük ölçüde azaldı. }}.0 SHAM farelerine kıyasla sırasıyla yüzde ve yüzde 60.0 (p < 0="" 001).="" err="" içeriği="" ovx="" ve="" sham="" grupları="" arasında="" anlamlı="" bir="" fark="" göstermese="" de,="" cdp="" ve="" ev="" dahil="" tüm="" tedavi="" grupları="" err="" seviyesini="" önemli="" ölçüde="" artırdı.="" ayrıca,="" ev="" ile="" tedavi="" edildiğinde,="" yukarıda="" belirtilenler,="" ovx="" sıçanlarının="" vajina="" ve="" rahim="" ağırlıklarının="" kaybının="" yanı="" sıra="" tüm="" vücut="" ağırlıklarını="" kazandı,="" kısmen="" tersine="" döndü="" (p="">< 0="" 001),="" ancak="" cdp="" müdahalesinden="">

3.6. Cistanche DeserticolaP'ın Serum MDA, SOD ve GSH Düzeyleri Üzerindeki Etkileri.

SHAM ve OVX model grupları arasında serum SOD ve GSH özelliklerinde istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktu; Şekil 7'de açıklandığı gibi, yukarıdaki iki grup arasında GSH'de artan bir eğilim gözlemlenebilir. Ek olarak, SHAM sıçanları ile karşılaştırıldığında, OVX model grubundaki sıçanlarda serum MDA seviyesi yaklaşık yüzde 50 oranında keskin bir şekilde yukarı regüle edildi. SOD aktivitesi CDP tedavisinden etkilenmezken, GSH özelliği CDP müdahalesi ile önemli ölçüde iyileştirildi ve CDP, MDA seviyesini sırasıyla 60 ve 240 mg/kg dozlarında sırasıyla yüzde 33,9 ve yüzde 42,4 azalttı ( p < 0="">

3.7. Cistanche Deserticola P'nin Protein İfade Düzeyleri Üzerindeki Etkileri.

Şekil 8'de gösterilen verilerimiz, CDP tedavisinin, kontrole kıyasla TRAF6, RANK ve RANKL protein seviyelerini önemli ölçüde azalttığını ileri sürdü. NF-KB içeren aşağı akış sinyal yolları bastırıldı ve PI3K/AKT, NF-KB-p65 aşağı regülasyonunun ekspresyonu ile kanıtlanan CDP müdahalesi ile uyarıldı, oysa PI3K-p85 ve AKT1 yukarı doğru düzenlendi. Sonuç olarak, 0.001-0.1 mg/mL konsantrasyonda CDP ile tedaviden sonra NFAT2 ekspresyonu önemli ölçüde azaldı ve c-Fos arttı. CDP'nin RANKL ve RANK seviyelerini aşağı regüle ettiği, bu ligandın reseptörü ile bağlanma miktarlarının azalmasına yol açtığı ve RANKL'ın RANK ile bağlantısının TRAF6'nın aşağı regülasyonu ile daha da azaldığı Şekil 9'da önerilen bir mekanizma açıklanmaktadır. ardından NF-κB yolu dahil olmak üzere aşağı akış yollarının baskılanması, buna karşın PI3K/AKT sinyal yolu uyarıldı, bu da sonunda NFAT2 ekspresyonunun azalmasına ve c-Fos seviyesinin artmasına neden oldu.

4. Tartışma

Phenylethanoid glycosides are naturally occurring water-soluble components which widely exist in the medicinal plant kingdom [11]. Thus far, the compounds of phenylethanoid glycosides had attracted more and more researchers because of their evident role in handling various human ailments and abnormalities [13]. Numbers of antiosteoporotic bioactive fractions and compounds, including polyphenol and phenylethanoid glycosides, were identified and isolated from dozens of natural medicinal herbs [5, 10, 12, 16, 17]. C. deserticola is well known as "ginseng of the desert" which implied the safety profile of this edible TCM [18, 19]. As a general tonic herb and natural health food that has long been used in Asian countries, C. deserticola exhibited beneficial function for the enhancement of kidney strength. It was found that TCM, traditionally used to invigorate and keep kidney essence, were usually used to treat osteoporosis, both in vitro and in vivo published data had proved the antiosteoporotic activity of C. deserticola [20–23], and phenylethanoid glycoside constituents including echinacoside and acteoside are the main bioactive components that exist in this edible medicinal plant; all of which suggested that not only echinacoside and acteoside themselves but also other phenylethanoid glycoside components contained in C. deserticola were considered as responsible for the antiosteoporotic property of this herb. In our present study, a favorable safety macroporous resin was used to isolate and enrich the phenylethanoid glycoside fraction from C. deserticola, and by using the HPLC method, eight main phenylethanoid glycoside components, namely, acteoside F, echinacoside, cistanoside A, acteoside, isoacteoside, acteoside C, 2′-acetylacteoside, and 6′-acetylacteoside, were found in the isolated phenylethanoid glycoside fraction, and the contents were 3.6 percent , 8.8 percent , 5.0 percent , 13.3 percent , 3.3 percent , 3.6 percent , 9.9 percent , and 3.2 percent , respectively. Echinacoside, one of the main activity compounds recorded in C. deserticola [14], had been proved to possess antiosteoporotic activity; however, the dosage of 270 mg/kg was so high which limited its further clinical application [24]. In the current experiments, the total phenylethanoid glycoside fraction with a lower dosage of 60-240 mg/kg body weight/- day was used on OVX rats, and the contents of identified constituents were nearly 50 percent pure in this fraction by using the HPLC method.

OVX'in osteoporoza neden olabileceği iyi biliniyordu ve bir OVX sıçanının insan postmenopozal osteoporozunu simüle etmek için klasik ve uygun bir model olduğuna inanılıyordu. Aynı zamanda, ovariektomi ameliyatından sonra kemik mineral yoğunluğunda, trabeküler kemik mikro mimarisinde, uterus ve vajina ıslak ağırlıklarında ve östrojen seviyesinde önemli bir azalma ve ayrıca kemik rezorpsiyonu ve vücut ağırlığında belirgin bir artış gözlendi. östrojen kaybına bağlı olarak parçalanır [25]. Şimdiye kadarki verilerimiz, OVX'in gerçekten de postmenopozal osteoporozu indüklediğini ve her zaman kemik kalitesi, kemik mikromimarisindeki ve uterus ve vajina ıslak ağırlıklarındaki keskin düşüşün eşlik ettiğini açıkça göstermiştir. EV klinik uygulamada kullanılan genel bir hormon replasman ajanı olduğu için in vivo deneyimizde pozitif kontrol olarak kullanılmış ve vücut ağırlığının artması ve uterus ağırlıklarının atrofisi, ayrıca bozulmuş kemik mineral yoğunluğu ve trabeküler kemik mikromimarisi kullanılmıştır. , EV takviyesi ile beklenen şekilde tersine çevrildi. Pozitif kontrolden farklı olarak, OVX model grubundaki sıçanların azalan vajina ve uterus ağırlıklarının yanı sıra kazanılan tüm vücut ağırlığı, CDP tedavisinden etkilenmedi, bu da CDP'nin yan etkileri indüklemeden kemik oluşumunu artırabileceğini ima etti. vücut ve uterus organik dokuları üzerinde. ERR seviyeleri CDP tedavisi ile önemli ölçüde yukarı regüle edilmesine rağmen, uterus ve vajina organik dokuları üzerinde hiçbir yan etkinin gözlenmemesi tıpkı bir fitoöstrojen etkisi gibiydi. Ek olarak, CDP tedavisi, ovariektomi ameliyatı ile bozulan OVX sıçanlarında kemik kalitesini önemli ölçüde güçlendirdi.

Ek olarak, OVX sıçanlarının idrar ve serumlarındaki P ve Ca seviyeleri de antiosteoporotik etkiyi yansıtmak için kullanıldı ve Ca ve inorganik P konsantrasyonları genellikle kalsitonin ve PTH seviyelerine bağlıydı [26]. Bu çalışmada, OVX model grubundaki sıçanlarda Ca, serum P, serum Ca ve PTH'nin üriner atılım düzeyinde önemli bir düşüş veya artış eğilimi olmamasına rağmen, önemli idrar P ve kalsitonin seviyeleri (p < {="" {1}})="" gözlemlendi.="" ovariektomi="" ameliyatının="" neden="" olduğu="" östrojen="" eksikliğinin="" her="" zaman="" kanda="" kalsitonin="" seviyesinin="" düşmesine="" yol="" açtığına="" dair="" yayınlanmış="" verilerle="" uyumlu="" olarak,="" bu="" azalan="" serum="" kalsitonin,="" sonunda="" pth="" seviyesinin="" artmasına="" yol="" açtı;="" burada="" ca,="" pth="" sekresyonunun="" ana="" düzenleyicisi="" olarak="" kabul="" edildi.="" bu="" çalışmada="" pth="" konsantrasyonu="" ovx="" ve="" sham="" grupları="" arasında="" anlamlı="" bir="" farklılık="" göstermediğinden,="" hem="" serum="" hem="" de="" idrardaki="" ca="" seviyesi="" de="" yukarıdaki="" iki="" grup="" arasında="" belirgin="" bir="" değişiklik="" göstermedi.="" bununla="" birlikte,="" ovx="" ve="" sham="" grupları="" arasında="" kalsitonin="" seviyesinde="" önemli="" ölçüde="" düşüş="" eğilimi="" elde="" edildi="" ve="" sonuç="" olarak,="" ovx'in="" idrarındaki="" p="" içeriği="" güçlü="" bir="" şekilde="" azaldı.="" yukarıdaki="" verilerin,="" ovx="" sıçanlarında="" ca="" düzeyinin="" idrarla="" atılımının="" sham="" sıçanlarına="" kıyasla="" neden="" belirgin="" bir="" değişiklik="" göstermediğine="" dair="" çelişkili="" fenomeni="" açıklayabileceğine="" inandık="" ve="" bu="" fenomen="" ayrıca="" artmış="" kemik="" döngüsü="" oranıyla="" da="" ilişkili="" olabilir="" [27]="" .="" cdp="" ile="" tedaviden="" sonra,="" serumdaki="" p="" ve="" ca="" seviyeleri="" belirgin="" şekilde="" yukarı="" regüle="" edildi="" ve="" ovx="" sıçanlarında="" idrardaki="" p="" içeriği="" aşağı="" regüle="" edildi,="" bu="" da="" cdp'nin="" sadece="" kemik="" mineral="" element="" atılımını="" önleyemediğini,="" aynı="" zamanda="" bunların="" serum="" içeriğini="" de="" arttırdığını="" yansıtıyordu.="" elementler,="" böylece="" dolaylı="" olarak="" kemik="" kaybını="">

Ayrıca, CDP'nin altta yatan antiosteoporotik mekanizmalarını açıklamak için kemik oluşumu ve rezorbsiyon belirteçleri ile SOD ve GSH dahil olmak üzere antioksidan enzimler de kullanıldı. Yayınlanmış verilere benzer şekilde, OVX model grubundaki sıçanlardaki ALP seviyesi, postmenopozal osteoporozda hızlanmış bir kemik devir hızına işaret eden istatistiksel olarak anlamlı olmayan bir artış eğilimi sergiledi [10]. Bununla birlikte, CDP (60, 120 ve 240 mg/kg/gün) ile tedaviden sonra, ALP'nin özelliği önemli ölçüde arttı. OVX'in östrojen seviyelerinde keskin bir düşüşe neden olduğu iyi biliniyordu, bu genellikle aşırı kemik rezorpsiyonuna ve oksidatif strese yol açar [28], bu durum TRAP, katepsin K ve DPD seviyelerinin yanı sıra MDA'nın sıçanlarda belirgin şekilde yukarı regüle edilmesiyle kanıtlanmıştır [28]. OVX model grubu. Ancak, bu bozulmalar CDP müdahalesi ile kısmen iyileştirildi. Ek olarak, CDP (60 ve 240 mg/kg) ile OVX sıçan tedavisi, GSH aktivitesinde önemli bir artış gösterdi (p < 0="" 05).="" yukarıdaki="" sonuçlar,="" cdp'nin="" ovx'in="" neden="" olduğu="" osteoporoz="" üzerinde="" terapötik="" bir="" etki="" gösterdiğini="" ve="" bu="" etkilerin="" hem="" kemik="" oluşumunu="" artırarak="" hem="" de="" kemik="" emilimini="" baskılayarak="" ve="" ayrıca="" kemik="" antioksidan="" sistemini="" geliştirerek="" olduğunu="" ima="">

RANK'ın ligandı RANKL tarafından aktivasyonu, PI3K/AKT ve NF-κB sinyali yoluyla NFAT2 ve c-Fos ekspresyonlarını uyardı [29]. NF-KB'nin bozulması, osteoporotik bir fenotip ile bozulmuş bir osteoklast farklılaşmasına ve RANKL/RANK/TRAF kaynaklı osteoklastojenez sırasında NF-KB'nin yukarı regüle edilmiş c-Fos ve aşağı regüle edilmiş NFAT2 ifadelerine yol açabileceğinden, NF-B'nin osteoklastogenez için gerekli olduğu kanıtlanmıştır. CDP'nin NFAT2 ve c-Fos aracılı osteoklastogenez üzerindeki yararlı etkisini tahmin etmek için RANKL ve RANK'ın ekspresyon seviyeleri analiz edildi. Beklendiği gibi, CDP, RANKL ve RANK ifadelerini aşağı doğru düzenleyerek NFAT2'yi önemli ölçüde inhibe etti ve c-Fos seviyelerini uyardı. Bu arada, RANK'ın kendisi, aşağı akış sinyalini tetiklemek için TRAF6 tarafından birleştirilmediği sürece intrinsik kinaz özelliğinden yoksundu [3]. CDP ayrıca, RANKL ve RANK'ın bağlanma miktarlarının önemli ölçüde azalmasına yol açan TRAF6'nın ifadesini de azalttı. OVX sıçanlarında varsayımsal bir antiosteoporotik CDP mekanizması yukarıdaki sinyal yollarını kapsıyordu ve düzenleyiciler Şekil 9'da tarif edildi. Kısaca, CDP TRAF6, RANKL ve RANK seviyelerini düşürdü, böylece PI3K/AKT ve NF-κB dahil olmak üzere aşağı akış sinyal yollarını baskıladı. RANKL/RANK tarafından tetiklenir ve son olarak anahtar osteoklastojenik proteinler NFAT2 ve c-Fos'un ekspresyonlarını ve aktivitelerini azaltır. Bu nedenle, çok sayıda veri ipucu, esas olarak RANKL/RANK/TRAF6-aracılı PI3K/AKT ve NF-κB yolları aracılığıyla OVX sıçanlarının kemik metabolizması üzerinde CDP'nin yararlı etkisini ima etti.

5. Sonuç

Özetle, C. Deserticola'dan izole edilen toplam feniletanoid glikozitler, OVX sıçanlarının postmenopozal osteoporozu üzerinde önemli faydalı etkiler sergilemiştir ve kemik kaybını baskılamadaki terapötik potansiyel, esas olarak kemik oluşumunu uyarmak ve kemik emilimini inhibe etmek ve aynı zamanda kemik antioksidanını iyileştirmek yoluyla olmuştur. sistem; mekanizmalar, RANKL/RANK/TRAF6-indüklenen NF-κB aktivasyonu ve PI3K/AKT inaktivasyonunun yanı sıra c-Fos stimülasyonu ve NFAT2 supresyonu ile ilişkili olabilir ve son olarak, osteoklast farklılaşması inhibe edilmiştir.

Kısaltmalar

AKT: Protein kinaz B

ALP: Alkalin fosfataz

BGP: Kemik GLA proteini

BMC: Kemik mineral içeriği

CDP: C. Deserticola'nın feniletanoid glikozit fraksiyonu

CK: Katepsin K

BT: Kalsitonin

DPD: Deoksipiridinolin

ERR : Östrojenle ilgili reseptör alfa

EV: Estradiol valerat

GSH: Glutatyon l-PTH: bozulmamış parathormon

MCSF: Makrofaj koloni uyarıcı faktör

MDA: Malondialdehit

NFAT2: Aktive edilmiş T hücrelerinin nükleer faktörü c2

NF-κB: Nükleer faktör-kappa B

OPG: Osteoprotegerin

OVX: Yumurtalıkları alınmış

PhG'ler: Feniletanoid glikozitler

PI3K: Fosfoinositid 3-kinaz

RANK: Nükleer faktör-kappa B'nin reseptör aktivatörü

RANKL: Nükleer faktör-kappa'nın reseptör aktivatörü

B ligand ROI: İlgi alanı

SOD: Süperoksit dismutaz

Tb. N: Trabeküler sayı

Tb.Sp: Trabeküler ayrılma

Tb.Th: Trabeküler kalınlık

TCM: Geleneksel Çin tıbbı

TMC: Doku mineral içeriği

TMD: Doku mineral yoğunluğu

TNF: Tümör nekroz faktörü

TRAF6: Tümör nekroz faktörü reseptörü ile ilişkili faktör 6

TRAP: Tartrata dirençli asit fosfataz.

Veri kullanılabilirliği

Bu çalışmanın bulgularını desteklemek için kullanılan veriler, istek üzerine ilgili yazardan temin edilebilir.

Çıkar çatışmaları

Yazarların çıkar çatışması yoktu.

Yazar katkıları

XM deneyleri tasarladı ve denetledi; SD ve LY, deneylerin çoğunu gerçekleştirdi ve makalenin taslağını hazırladı; BZ ve JL, Western blot analizini gerçekleştirdi ve hayvan deneylerine katıldı; YD verileri analiz etti; QT ve PY taslağı revize etti. Tüm yazarlar makaleyi inceledi. Lingling Yang ve Shuqin Ding, el yazmasına eşit derecede katkıda bulundular.

Teşekkür

Bu çalışma, Ningxia Yüksek Öğrenim Bilim Teknoloji Vakfı (NGY2017090), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81560684), Ningxia Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2018BHF2001), Ningxia Anahtar Araştırma ve Doğu ve Batı Bilim ve Teknoloji İşbirliği Buluş Programı (Nos. 2017BY084 ve 2017BY079) ve Çin Bilimler Akademisi Batı Işık Vakfı-Batı Genç Bilim Adamları 2017.

Referanslar

[1] LJ Melton III, EA Chrischilles, C. Cooper, AW Lane ve BL Riggs, "Perspektif. Kaç kadında osteoporoz var?", Journal of Bone and Mineral Research, cilt. 7, hayır. 9, s. 1005-1010, 1992.

[2] S. Schnell, SM Friedman, DA Mendelson, KW Bingham ve SL Kates, "Yaşlılar için kalça kırığı programında tedavi edilen hastaların 1-yıl mortalitesi," Geriatrik Ortopedik Cerrahi ve Rehabilitasyon, cilt. 1, hayır. 1, s. 6-14, 2010.

[3] EM Tan, L. Li, IR Indran, N. Chew ve EL Yong, "TRAF6, osteoklastogenezin baskılanmasına ve yeni bir prenilflavonoid tarafından ovariektominin neden olduğu kemik kaybının önlenmesine aracılık eder", Journal of Bone and Mineral Research, cilt. 32, hayır. 4, s. 846–860, 2017.

[4] JH Kim ve N. Kim, "Osteoklast farklılaşmasında NFATc1'in düzenlenmesi", Journal of Bone Metabolism, cilt. 21, hayır. 4, s. 233-241, 2014.

[5] Q. Ye, XQ Ma, CL Hu ve diğerleri, "Antiosteoporotik aktivite ve Podocarpium podocarpus bileşenleri", Phytomedicine, cilt. 22, hayır. 1, s. 94–102, 2015.

[6] SA Jang, HS Song, JE Kwon, et al., "Protocatechuic asit, yumurtalıkları alınmış farelerde trabeküler kemik kaybını hafifletir", Oxidative Medicine and Cellular Longevity, cilt. 2018, Makale Kimliği 7280342, 11 sayfa, 2018.

[7] AB Abdel-Naim, AA Alghamdi, MM Algandaby, et al., "Chrozophora tinctoria'dan izole edilen rutin, kemik hücresi proliferasyonunu ve kemikleşme belirteçlerini artırır," Oxidative Medicine and Cellular Longevity, cilt. 2018, Makale Kimliği 5106469, 10 sayfa, 2018.

[8] J. Wattanathorn, C. Thipkaew, W. Thukham-mee, S. Muchimapura, P. Wannanon ve T. Tong-un, "Morindacitrifolia L. yaprak özütü, in vivo deneysel bir modelde serebral iskemi ve osteoporoza karşı korur of menopoz," Oksidatif Tıp ve Hücresel Uzun Ömür, cilt. 2018, Makale Kimliği 1039364, 13 sayfa, 2018.

[9] S. Sungkamanee, J. Wattanathorn, S. Muchimapura ve W. Thukham-mee, "Morus alba ve Polygonum odoratum'un birleşik ekstraktının antiosteoporotik etkisi," Oksidatif Tıp ve Hücresel Uzun Ömür, cilt. 2014, Madde ID 579305, 9 sayfa, 2014.

[10] J. Liu, Z. Zhang, Q. Guo, Y. Dong, Q. Zhao ve X. Ma, "Syringin, TRAF6 aracılı NF-KB inhibisyonu ve PI3K/AKT stimülasyonu yoluyla yumurtalıkları alınmış farelerde kemik kaybını önler ," Phytomedicine, cilt. 42, s. 43–50, 2018.

[11] CW Lu, SK Huang, TY Lin ve SJ Wang, "Herba Cistanche'nin aktif bir bileşeni olan Echinacoside, hipokampal CA3 piramidal nöronlarda epileptiform aktiviteyi bastırır," The Korean Journal of Physiology & Pharmacology, cilt. 22, hayır. 3, s. 249–255, 2018.

[12] X. Xu, Z. Zhang, W. Wang, H. Yao ve X. Ma, "Cistanosid A'nın yumurtalıkları alınmış farelerin kemik metabolizması üzerindeki terapötik etkisi," Molecules, cilt. 22, hayır. 2, s. 197, 2017.

[13] K. Alipieva, L. Korkina, IE Orhan ve MI Georgiev, "Verbascoside–a incelemesi, (biyo)sentezi ve farmakolojik önemi," Biotechnology Advances, cilt. 32, hayır. 6, s. 1065-1076, 2014.

[14] Çin Farmakopesi Editör Komitesi, Çin Halk Cumhuriyeti Farmakopesi, China Medical Science and Technology Press, Pekin, Çin, 10. baskı, 2015.

[15] H. Zhang, WW Xing, YS Li ve diğerleri, "Osteoblastlar ve osteoklastlar üzerinde geleneksel bir Çin bitkisel preparatının etkileri", Maturitas, cilt. 61, hayır. 4, s. 334–339, 2008.

[16] X. Ma, J. Liu, L. Yang, B. Zhang, Y. Dong ve Q. Zhao, "Cynomorium songaricum, PI3K/AKT'nin RANKL/RANK/TRAF6 aracılı baskılanması yoluyla yumurtalıkları alınmış farelerde kemik erimesini önler ve NF-κB yolları," Life Sciences, cilt. 209, s. 140–148, 2018.

[17] XQ Ma, T. Han, X. Zhang, ve diğerleri, "Kaempferitrin, yumurtalıkları alınmış sıçanlarda kemik kaybını önler", Phytomedicine, cilt. 22, hayır. 13, s. 1159-1162, 2015.

[18] PL Liao, CH Li, LS Tse, JJ Kang ve YW Cheng, "Cistanche tubulosa sağlıklı gıda ürünü Memoregain®'in güvenlik değerlendirmesi: genotoksisite ve 28-gün tekrarlanan doz toksisite testi, Gıda ve Kimyasal Toksikoloji , cilt. 118, s. 581–588, 2018.

[19] CC Wong, HB Li, KW Cheng ve F. Chen, "Ferrik indirgeyici antioksidan güç tahlilini kullanan 30 Çin şifalı bitkisinin antioksidan aktivitesinin sistematik bir araştırması," Food Chemistry, cilt. 97, hayır. 4, s. 705-711, 2006.

[20] D. Song, Z. Cao, Z. Liu, ve diğerleri, "Cistanche Deserticola polisakkarit, RANKL sinyalini ve reaktif oksijen türlerinin üretimini inhibe ederek osteoklastogenezi ve kemik emilimini azaltır," Journal of Cellular Physiology, cilt. 233, hayır. 12, s. 9674–9684, 2018.

[21] HD Liang, F. Yu, ZH Tong, HQ Zhang ve W. Liang, "Serum BGP ve TRAP ve kemik iliği Smad1 mRNA, Smad5 mRNA, TGF- 1 mRNA ve TIEG1'i etkileyen Cistanches Herba sulu özütü osteoporoz hastalığında mRNA ekspresyon seviyeleri," Molecular Biology Reports, cilt. 40, hayır. 2, s. 757-763, 2013.

[22] TM Li, HC Huang, CM Su ve diğerleri, "Cistanche Deserticola özü, osteoblastlarda kemik oluşumunu arttırır", Journal of Pharmacy and Pharmacology, cilt. 64, hayır. 6, s. 897–907, 2012.

[23] H. Liang, F. Yu, Z. Tong ve Z. Huang, "Cistanches Herba sulu ekstresinin yumurtalıkları alınmış sıçandaki kemik kaybı üzerindeki etkisi", International Journal of Molecular Sciences, cilt. 12, hayır. 8, s. 5060–5069, 2011.

[24] F. Li, X. Yang, Y. Yang, ve diğerleri, "Yumurtalıkları alınmış sıçanlarda ekinakozidin antiosteoporotik aktivitesi", Phytomedicine, cilt. 20, hayır. 6, s. 549-557, 2013.

[25] H. Nian, MH Ma, SS Nian ve LL Xu, "yumurtalıkları alınmış sıçanlarda icariinin antiosteoporotik aktivitesi", Phytomedicine, cilt. 16, hayır. 4, s. 320–326, 2009.

[26] SR Fahmy, AM Soliman, AA Sayed ve M. Marzouk, "Ovariektomi uygulanan sıçanlarda Cicer arietinum özütünün olası antiosteoporotik mekanizması," International Journal of Clinical and Experimental Pathology, cilt. 8, hayır. 4, s. 3477–3490, 2015.

[27] R. Swaminathan, "Kemik döngüsünün biyokimyasal belirteçleri", Clinica Chimica Açta, cilt. 313, hayır. 1-2, s. 95–105, 2001.

[28] S. Muthusamy, I. Ramachandran, B. Muthusamy, ve diğerleri, "Ovariektomi, yetişkin sıçanlarda oksidatif stresi indükler ve kemik antioksidan sistemini bozar," Clinica Chimica Açta, cilt. 360, hayır. 1-2, s. 81–86, 2005.

[29] WJ Boyle, WS Simonet ve DL Lacey, "Osteoklast farklılaşması ve aktivasyonu" Nature, cilt. 423, hayır. 6937, s. 337– 342, 2003.