Beta Vulgaris Rubra L. (Pancar) Kabuğu Metanol Özü Oksidatif Stresi Azaltır ve H2O2 İle İndüklenmiş Oksidatif Stres Altındaki İnsan Göbek Damarı Endotel Hücrelerinde VEGF İfadesini Arttırarak Hücre Proliferasyonunu Uyarır

Lütfen iletişime geçinoscar.xiao@wecistanche.comdaha fazlasını bilmek

Laila Naif Al-Harbi 1,*, Subash-Babu Pandurangan 1, Alhanouf Mohammed Al-Dossari 1, Ghalia Shamlan 1, Ahmad Mohammad Salamatullah 1, Ali A Alshatwi 1 ve Amna Abdullah Alotiby 2

Soyut:Polifenollerin antioksidan kapasitesi veflavonoidlerDiyet ajanlarında bulunan, reaktif oksijen türlerinin (ROS) gelişiminin durdurulmasına ve endotelyal düz kas hücrelerinin oksidatif stres/indüklenmiş nekrozdan korunmasına yardımcı olur. Pancar (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) yaygın olarak tüketilen bir sebzedir.antioksidanlar. Pancar kabuğunun biyoaktif bileşikleri ve bunların insan göbek damarı endotel hücrelerindeki (HUVEC'ler) rolü hala yeterince araştırılmamıştır. Bu çalışmada, pancar kabuğu metanol özütü (BPME) hazırlandı ve indüklenmiş HUVEC'lerde biyo-etkililik, nükleer bütünlük, mitokondriyal membran potansiyeli, vasküler hücre büyümesi ve immünoregülasyonla ilişkili gen ekspresyon seviyeleri üzerindeki etkisi.oksitleyicistres analizi yapıldı. Gaz kromatografisi-kütle spektroskopisi (GC-MS) sonuçları, BPME'nin 5-hidroksimetilfurfural (yüzde 32,6), metil piruvat (yüzde 15,13), furfural (yüzde 9,98) ve2,3-dihidro{{11} içerdiğini doğruladı. },5-dihidroksi-6-metil-4H-Pyran-4-bir (yüzde 12,4). BPM özütü, hücre çoğalmasını etkili bir şekilde arttırdı ve MTT tahlili ile doğrulandı; nükleer bütünlük, propidium iyodür (PI) boyama deneyi ile doğrulandı; mitokondriyal membran potansiyeli (∆ψm), JC-1boyama testi ile doğrulandı. Annexin V tahlili, BPME ile muamele edilmiş HUVEC'lerin yüzde 99 canlı hücre gösterdiğini doğruladı, ancak sadece H2O2 ile muamele edilmiş HUVEC'lerde sadece yüzde 39.8 canlılık gösterildi. Ek olarak, 48 saat boyunca HUVEC'lerin BPME tedavisi, lipid peroksidin (LPO) mRNA ekspresyonunu azalttı ve NOS-3, Nrf-2, GSK-3, GPX, endotelyal nitrik oksit sentazı (eNOS) arttırdı. ) ve vasküler hücre büyüme faktörü (VEGF)mRNA ekspresyon seviyeleri. BPME tedavisinin proinflamatuar (nükleer faktör-κ (F-κ ), doku nekroz faktörü- (TNF- ), ücretli benzeri reseptör-4 (TLR-4), interlökin{{37} azalttığını bulduk. } (IL-1 )) ve vasküleriltihap(hücre içi yapışma molekülü (ICAM), vasküler hücre yapışma molekülü(VCAM), EDN1, IL-1 ) ile ilgili mRNA ifadeleri. Sonuç olarak, pancar kabuğu tedavisi vasküler düz hücre büyüme faktörlerini ve mikrotübül gelişimini etkin bir şekilde artırırken, vasküler inflamatuar düzenleyicileri azalttı. BPM, vasküler düz hücre rejenerasyonu, doku onarımı ve yaşlanma karşıtı potansiyel için faydalı olabilir.

Anahtar Kelimeler:pancar kökü; oksidatif stres; mitokondri; damarlanma; iltihap

Daha fazlasını öğrenmek için lütfen buraya tıklayınız

1. Giriş

Anjiyogenez, vücudun mevcut damar sisteminden vaskülogenezin fizyolojik sürecidir [1]. Sadece embriyonik gelişim ve üreme için değil, hücre döngüsü ve doku onarımı için de gereklidir [2,3]. Bununla birlikte, tümör büyümesi, romatoid artrit ve çeşitli iskemik ve inflamatuar hastalıklar gibi çeşitli hastalıkların patogenezi ile ilişkilidir [3-5]. Vasküler endotel, kan damarı tonusunu ve immün ve inflamatuar reaksiyonları düzenleyerek vasküler hemostazın korunmasında önemli bir rol oynar [6,7]. Endotel hücreleri (EC'ler), kan damarlarının tüm iç yüzeylerini kaplayan ve lokal olarak veya uzak bölgelerde etki eden çeşitli moleküller üreten ince tek hücreli katmanlardır [7]. Endotel, vücut homeostazı için esastır ve endotel hücre yanıtındaki herhangi bir değişiklik, ateroskleroz ve hipertansiyon gibi inflamatuar ve vasküler hastalık süreçlerinin birincil olaylarına yol açar [6,8,9]. Bu hastalıklar, EC yapısını ve fonksiyon bütünlüğünü değiştiren ve endotel disfonksiyonuna yol açan oksidatif strese neden olur [9]. İnsan göbek damarı EC'leri (HUVEC'ler), insan vasküler endoteliyle ilgili çalışmalar için bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, endotel fonksiyonunda yer alan ana biyolojik yolakları incelemek için yararlı bir modeli temsil ederler [10]. Biyoaktif bileşikler ve fitokimyasallar, meyvelerde, sebzelerde, yeşil bitkilerde ve anti-inflamatuar, antioksidan, antikanserojenik ve anjiyojenik özellikler gibi sayısız sağlık yararı sergileyen birçok bitkide bol miktarda bulunur [11-13]. Bu bağlamda kırmızı pancar (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) Amaranthaceae familyasına aittir ve yüksek düzeyde antioksidanların en iyi kaynaklarından biri olarak sınıflandırılır [14,15]. Spesifik olarak, biyolojik olarak aktif olan çok sayıda fitokimyasal içerir.betalainler, flavonoidler,polifenoller, terapötik enzimler, askorbik asit, dehidroaskorbik asit (DHAA) ve inorganik nitrat (NO3) [16-18]. Ayrıca potasyum, kalsiyum, magnezyum, sodyum, demir, çinko, fosfor, bakır ve manganez gibi değerli temel besinleri sağlar [19]. Birkaç çalışma, kırmızı pancar ekstraktının (kök) hipoglisemik, lipid düşürücü, anti-inflamatuar, antihipertansif ve antiproliferatif özelliklerinden dolayı sayısız faydalı etkiye sahip olduğunu bildirmiştir [20-22]. Bu faydalı özelliklerin tümü, biyoaktif bileşiklerin serbest radikal temizleme yetenekleriyle bağlantılı olabilir. Bu nedenle, kırmızı pancar tüketimi, sayısız beslenme ve sağlık yararı ile ilişkilendirilmiştir. Besin değeri nedeniyle, tip 2 diyabet ve kardiyovasküler hastalık gibi kronik metabolik hastalıkları indükleyen oksidatif streslere karşı fonksiyonel bir besin kaynağı olarak kullanılabilir [23]. Literatür incelemesine dayanarak, Beta vulgaris güçlü antioksidan, immün düzenleyici ve anjiyojenik özelliklere sahiptir. Apigenin pancar yapraklarında bulunmuştur; karaciğer ve bağırsak hücrelerinde antiproliferatif etkileri vardır ve AMPK aktivasyonu yoluyla yüksek yağlı diyete bağlı obezite komorbiditesini iyileştirebilir [24,25]. De Silva ve diğerleri, (2020) [26], Beta vulgaris'in vasküler EC'leri, bu bitkide bulunan birkaç biyoaktif bileşiğin birleşik etkisinden kaynaklanabilecek harici olarak indüklenen oksidatif stresten koruduğunu belirlemiştir. Şimdiye kadar, Beta vulgaris kök kabuğunun EC proliferasyonu ve anjiyogenez etkisi için mekanik etkisi yeterince araştırılmamıştır. Bu nedenle, HUVEC'lerde hücresel morfoloji ve gen ekspresyon analizi kullanarak Beta vulgaris kök kabuğu ile ilgili vasküler hücre proliferasyonu, mikrotübül gelişimi, oksidatif stres ve anjiyogenez kapasitesini incelemek için bu çalışmayı yürütmeyi amaçladık. Kırmızı pancar kabuğu metanol ekstraktının nükleer bütünlük, mikrotübül gelişimi, mitokondriyal etkinlik ve insan vasküler EC'lerinde hücre döngüsü stimülasyonu ile ilişkili anjiyojenik etkileri araştırılmaktadır.

2. Malzemeler ve Yöntemler

2.1. Pancarın Hazırlanışı(Beta vulgaris rubra L.) Metanol ÖzüTaze pancar örnekleri (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr.) ilk olarak Riyad, Suudi Arabistan Krallığı (KSA) sebze mağazalarından elde edildi. Taze pancarlar, sapları ve kirleticileri ortadan kaldırmak için damıtılmış su ile yıkandı. Dış deri çıkarılmak ve küçük parçalar halinde kesilmek üzere soyuldu. Numuneler 40°C'de sıcak hava fırınında kurutuldu ve ardından elektronik bir karıştırıcı kullanılarak toz haline getirildi. Daha sonra, 5{{10}}0 g toz, 1 L metanol (Sigma, St. Louis, MO, ABD) içeren steril bir şişede oda sıcaklığında 24 saat boyunca ekstrakte edildi. bir çalkalayıcı ve üç kez tekrarlandı. Daha sonra, özü filtrelemek için bir Whatmanfifilter (Whatman, Clifton, NJ, ABD) kullanıldı. Son olarak, basınç düşürülerek çözücü özden ayrıldı ve öz, metanolün buharlaştırılmasından sonra katı bir kuru madde olarak toplandı. Ekstrakte edilen numune, bir sonraki kullanıma kadar buzdolabında 4 ◦C'de saklandı. 2.2. Gaz Kromatografisi ve Kütle Spektroskopisi Analizi Pancar kabuğu metanol özütü (BPME) bir silika kapiler kolona (30 m × {{60}}.25 mm ID × 0) enjekte edildi. .25 µm film kalınlığı) GC-MS cihazının (Agilent 6890N/5973I, California, CA, ABD) kimyasal bileşimleri tespit etmek için kütle seçici detektörlü. Cihazın sıcaklığı ilk 7{{90}} ◦C olarak, 2 dakika tutularak, 20 ◦C/dk'da 305 ◦C'ye ayarlandı, ardından 1 dakika tutuldu. Toplam GC çalışma süresi, taşıyıcı gaz olarak helyum gazı (yüzde 99.999) (sabit bir arkadaş hızı 1.2 mL/dk), enjektör sıcaklığı olarak 250 ◦C ve bir iyon kaynağı olarak 230 ◦C ile 45 dakikaya ayarlandı. sıcaklık. GC-MS spektrumuna dayalı olarak, karşılık gelen bileşenin nispi yüzdesi hesaplandı ve bilinmeyen bileşenin kütle spektrumları, Ulusal Standart ve Teknoloji Enstitüsü'nde mevcut olan bilinen 62,000 desenle karşılaştırılarak tanımlandı. bilgisayar kitaplığı (NIST08). 2.3. Hücre Kültürü Materyalleri ve Kimyasalları HUVEC'ler American Type Culture Collection'dan (ATCC, Manassas, VA, ABD) satın alınmıştır. Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), EDTA, tripsin ve diğerleri gibi hücre kültürü materyalleri Gibco'dan (Paisley, UK) elde edildi. Penisilin-streptomisin (PS) ve fetal sığır serumu (FBS), Hyclone Laboratories, ABD'den satın alındı. Moleküler biyoloji deneyinde kullanılan kimyasallar, özellikle MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- olmak üzere Sigma-Aldrich'ten elde edilmiştir. difeniltetrazolyum bromür], PI ve JC-1 boyası. SYBR Green PCR Master Mix ve cDNA sentez kiti Qiagen'den (Hilden, Almanya) elde edildi. 2.4. HUVEC'ler HUVEC'ler DMEM'de kültürlendi ve yüzde 1 PS ve yüzde 10 FBS kompleksi ile desteklendi. Hücreler, 37 ◦C'de, yüzde 5 CO2'de nemli bir atmosferde inkübe edildi ve yaklaşık olarak her 3 günde bir alt kültürlendi. 2.5. MTT Tahlili ile Hücre Canlılığı ve Hücre Proliferasyonu HUVEC'ler (1 x 104 hücre/oyuk) bir bakım ortamı ile kültürlendi ve bir 96-kuyu kültür plakasında gece boyunca yapışmaya bırakıldı. Daha sonra ortam, MTT tahlil plakası haritasına göre artan konsantrasyonlarda BPME (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6 ve 3.2 µg/mL) içeren yeni bir kültür ortamı ile değiştirildi ve 24 ve 48 için inkübe edildi. h; işlenmemiş hücreler kontrol olarak kullanıldı. Kuluçka süresinden sonra, deney hücreleri 20 uL/kuyucuk 5 mg/mL MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2, 5-dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözündürülen difeniltetrazolyum bromür ve ayrıca 4 saat 37°C'de inkübe edildi. Daha sonra ortam atıldı ve üretilen mor formazan 100 uL yüzde 100 DMSO içinde çözüldü. Çözeltinin absorbansı, 570 nm dalga boyunda bir mikroplaka okuyucu (Thermo Scientific, Waltham, MA, ABD) kullanılarak ölçüldü. Hücre proliferasyonunun yüzdesi (yüzdesi) aşağıdaki denklemle hesaplandı: (numunenin absorbansı/kontrolün ortalama absorbansı) x 100. 2.6. Deneysel Tasarım Mevcut hücre proliferasyon analizine göre, test edilen düşük BPME konsantrasyonu (0.1 ve 0.2 µg/mL), toksisite olmaksızın çoğalan HUVEC'ler ve mikrotübül morfolojisi gösterdi. 0.1 ve 0.2 µg/mL BPME dozu seçilmiş ve hücre proliferasyonu, anti-inflamatuar, anjiyojenik ve apoptotik potansiyelleri belirlemek için 48 saat boyunca normal HUVEC'ler ve 10 mM H2O2-indüklenen oksidatif stresli HUVEC'ler ile işlenmiştir. (Şekil 1). Her iki grupta da araç kontrolü 48 saat sürdürüldü. Quercetin (10 uM) her iki deney grubunda da referans kontrol olarak kullanıldı. İnkübasyondan sonra, işlenmemiş ve deneysel hücreler, bir BDTM MitoScreen (JC-1) Kiti kullanılarak hücre ve nükleer morfoloji ve mitokondriyal membran potansiyeli için analiz edildi; apoptoz, diğer sitometride Annexin V/apoptoz bazlı hücre sıralama yöntemiyle belirlendi. Oksidatif stres, proinflamatuar ve anjiyogenez ile ilişkili gen ekspresyon seviyeleri araştırıldı.

2.7. Nükleer Hasar için Propidium İyodür Boyama Testi HUVEC'lerde 0.1 ve 0.2 µg/mL BPME (H2O2 ile veya H2O2 olmadan) ile tedaviden sonra karakteristik nükleer hasar, piknoz veya apoptotik morfolojik değişiklikler için hücresel morfolojiler Leite ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi, ters floresan mikroskobu altında PI boyama analizi kullanılarak belirlendi. [27].

2.8. JC-1 Boya Boyama ile Mitokondriyal Membran Potansiyeli (∆ψm) Testi Mitokondriyal membran potansiyeli (∆ψm) araç kontrolünde mitokondriyal verimliliği değerlendirmek için JC-1 testi ile belirlendi ve {{4} }.1 ve 0.2 µg/mL BPME ile muamele edilmiş HUVEC'ler (H2O2 ile ve H2O2 olmadan). Kısaca, JC-1 boyama solüsyonu benzer hacimde kültür ortamı ile karıştırıldı ve daha sonra deneysel HUVEC'lere eklendi ve karanlıkta 20 dakika 37 ◦C'de inkübe edildi. Daha sonra bağlanmamış JC-1 boyası, 4 ◦C'de 200 µL JC-1 boyama yıkama tamponu kullanılarak iki kez nazikçe yıkandı. Daha sonra, bir flüoresans mikroskobu kullanılarak flüoresans mikroskobu altında JC-1 boyamasına karşı j-agregasyonun birikimi gözlendi ve görüntüler alındı. Ek olarak, mitokondriyal membranın potansiyeli, BDTM MitoScreen (JC-1) Kiti kullanılarak akış sitometrisinde ölçüldü.

2.9. Akış Sitometrisi Kullanılarak Annexin V/apoptoz Analizi Diğer sitometri tabanlı Annexin V/PI saptama kiti (Sigma Chemicals, ABD) yöntemi canlı, proapoptotik, erken apoptotik ve nekrotik hücreleri ölçmek için kullanıldı. Oksidatif stres kaynaklı HUVEC'ler (1 × 105/kuyu), 24-kuyucuklu plakalara kaplandı ve BPME (0.1 ve 0.2 µg/mL) veya araç kontrolü ile inkübe edildi. 48 saat İnkübasyondan sonra hücreler, 400 uL 5 uL Annexin V-floresein izotiyosiyanat (FITC) ve 5 uL PI içeren bağlama tamponu içinde inkübe edildi; Bunu takiben hücreler, karanlıkta oda sıcaklığında (RT) 15 dakika tutuldu. Hücreler, apoptotik (PI negatif ve Annexin V pozitif) ve geç apoptotik (PI-pozitif ve Annexin V pozitif) hücreleri tanımlamak için diğer sitometri (BD Biosciences, San Jose, CA, ABD) ile analiz edildi [28].

2.10. Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR Analizi Fastlane® Cell to cDNA kiti (Qiagen, Hilden, Almanya) toplam RNA'yı çıkarmak ve cDNA'yı araç kontrolünden, BPME ile muamele edilmiş HUVEC'lerden (H2O2 ile ve H2O2 olmadan) yarı otomatik bir kantitatif PCR (qPCR) kullanarak sentezlemek için kullanıldı. enstrüman (Applied Biosystems, Foster City, CA, ABD). (lipid peroksit, NOS-3), antioksidan (Nrf-2, GSK-3 ve GPx), proinflamatuar (nükleer faktör-κ (NF-κ), dahil olmak üzere oksidatif stresin ekspresyon seviyeleri, tümör nekroz faktörü- (TNF- ), interlökin-1 (IL-1 ), vasküler hücre büyüme faktörü (VEGF), ücretli benzeri reseptör-4 (TLR-4)) ve vasküler inflamasyon (hücre içi yapışma molekülü (ICAM), vasküler hücre yapışma molekülü (VCAM), EDN1 ve endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS)) ile ilgili genler ve referans gen, -aktin, HUVEC'lerde analiz edildi ve yöntemle nicelendirildi Yuan ve ark. [29]. Amplifikasyon değerleri (∆Ct), Ct (tedavi edilmiş) ve Ct (kontrol) arasındaki farkla hesaplandı. Gen ifadesi, 2−∆∆Ct değerinin ifadesi kullanılarak çizildi.

2.11. İstatistiksel Analiz Tüm deneyler üç kopyalandı ve elde edilen veriler ortalama değerler ± standart sapma (SD) olarak ifade edildi. Gruplar arasındaki farklılıkların istatistiksel analizi, SPSS yazılımı (Sürüm 28.5, SAS Institute Inc., Cary, NC, ABD) kullanılarak tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile yapıldı. Daha sonra, anlamlı farklılıklar bulunursa Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi yapılmıştır. Tüm sonuçlar, her grupta altı tekrar için ortalama ± SD olarak sunuldu. p değeri < 0.05="" anlamlı="" kabul="" edildi="">

Bağışıklığı iyileştirmek için Cistanche

3. Sonuçlar

3.1. BPME'deki Biyoaktif Moleküller BPME'nin kimyasal bileşenleri GC-MS (Turbomass, PerkinElmer) kullanılarak doğrulandı. Pancar kabuğu ekstresinin kimyasal bileşimi, Ulusal Standart ve Teknoloji Enstitüsü (NIST) Spektral veritabanı ile mevcut kütle spektrumları karşılaştırılarak belirlendi. GC-MS sonuçları, BPME'nin hidroksiaseton (yüzde 8,18), 5-hidroksimetilfurfural (yüzde 32,6), metil piruvat (yüzde 15,13), beta-d-allopiranoz (yüzde 1,48), furfural (yüzde 9,98), içerdiğini doğruladı. 2-hidroksi-gama-bütirolakton (yüzde 1,32) ve 2,3-dihidro-3,5-dihidroksi- 6-metil-4H-Pyran -4-bir (yüzde 12.4; Şekil 2a, Tablo 1). 3.2. Hücre Proliferasyonu BPME'nin HUVEC'lere karşı in vitro hücre proliferasyon potansiyeli Şekil 2b'de sunulmaktadır. Araç kontrolü ile karşılaştırıldığında deney gruplarında önemli bir hücre büyümesi inhibisyonu gözlenmedi. HUVEC'ler ile tedavi edilen BPME konsantrasyonunun arttırılmasının, 24 saatlik (yüzde 103) tedavi ile karşılaştırıldığında 48 saat sonra (yüzde 112) hücre proliferasyonu ve canlılığının artmasıyla sonuçlandığı bu çalışma ile doğrulanmıştır. Ek olarak, 48 saat sonra BPME ile muamele edilmiş HUVEC'lerin ışık mikroskobik görüntüleri, tek tip yapışık hücre morfolojisi şekline sahip normal hücreleri doğruladı, herhangi bir hasar olmadan artan çoğalan (replikasyon) hücre sayısı belirgindi (Şekil 2c). 3.3. HUVEC'lerde Hücre ve Nükleer Morfoloji, Mikrotübül Oluşumu ve JC-1 Boyama Analizi Şekil 3, FL floresan mikroskobik görüntülerinde mikrotübül gelişiminin morfolojisini gösterir. H2O2- ile indüklenen oksidatif stresli HUVEC'ler, kontrol HUVEC'leri ile karşılaştırıldığında, zayıf proliferasyon ve yapışık hücrelerin düzensiz morfolojisi gösterdi. 0.2 µg/mL BPME ile tedavi edilen normal HUVEC'ler, replikasyon veya mikrotübül morfolojisi ile neogenez yoluyla çoğalan hücreler gösterdi. Bu arada, 00,1 µg/mL BPME ile tedavi edilen hücreler dozu, mikrotübüllerin erken evrelerine sahip yüzde 100 yapışık hücre gösterdi. 0,2 µg/mL BPME ile tedavi edilen oksidatif stresli HUVEC'ler, mikrotübül morfolojisine sahip çoğalan yeni hücreleri tanımladı ve oksidatif hücresel hasarı azalttı. Ek olarak, 0.1 µg/mL BPME, çoğalan hücrelerle normal vasküler hücre morfolojisini de arttırdı.

Şekil 4a, kontrol ve BPME (0.1 veya 0.2 µg/mL) ile muamele edilmiş HUVEC'lerde küresel bir şekle sahip nükleer yapının normal morfolojisini göstermektedir. Şekil 4b, H2O2 tarafından indüklenen oksidatif stres ile normal ve HUVEC'lerin PI boyaması için görüntüleri gösterir. H2O{{10}} ile muamele edilmiş HUVEC'ler, 30 dakika sonra yoğuşma ve piknoz sergileyen düzensiz şekilli çekirdekler gösterir. Ancak, oksidatif stres altında HUVEC'ler için 0.2 µg/mL BPME tedavisi, normal morfolojiye sahip dairesel çekirdekler gösterdi. 0,2 µg/mL BPME özütü ile karşılaştırıldığında, 0,1 µg/mL BPME, HUVEC'lerde H2O2- kaynaklı oksidatif strese karşı daha az koruyucu etkiye sahipti.

Şekil 2. Artan konsantrasyonda pancar kabuğu metanol özütü (BPME) ile tedavi edilen HUVEC'lerde pancar kabuğu metanol özütünün (a), in vitro hücre çoğalmasının (b) ve hücre morfolojisi için ışık mikroskopi görüntülerinin (c) GC-MS kromatogramı için sonuçlar ) (kırmızı ok başı ile belirtilen yapışık ve çoğalan hücrelerin tek tip şekli). Tüm değerler ortalama ± SD'dir (n=6). * p Araç kontrolü ile karşılaştırıldığında 0.05'ten küçük veya buna eşittir.

Şekil 3. Araç kontrolünde floresan mikroskobuna dayalı mikrotüp oluşumunun analizi, 0.1 ve 0.2 µg/mL pancar kabuğu metanol özütü (BPME) dozu normal ve H2O{{6} ile muamele edilmiştir. } 48 saat sonra oksidatif stresli HUVEC'leri indükledi. 48 saat sonra, H2O2- ile indüklenen oksidatif stresli HUVEC'ler, araç kontrolü ile karşılaştırıldığında değiştirilmiş morfoloji gösterdi. 0.1 ve 0.2 µg/mL pancar kabuğu metanol özütü (BPME) ile muamele edilmiş HUVEC'lerin hacimleri, düz kas hücresi davranışının ortak morfolojisine benzeyen çoğalan hücrelere sahip vasküler mikrotübüllerle normal morfoloji gösterdi.

Şekil 4. Araç kontrolünde nükleer morfoloji için propidium iyodür (PI) boyama analizi, 0.1 ve 0.2 µg/mL pancar kabuğu metanol özütü (BPME) ile muamele edilmiş normal (3a) ve 48 saat sonra H2O2-indüklenen oksidatif stresli (3b) HUVEC'ler. PIstaining'de araç kontrolü, çekirdeğin küçülme, piknoz veya apoptotik çekirdek belirtisi olmaksızın normal göründüğünü gösterdi. Yalnızca H2O2'de, tedavi edilen hücreler 48 saat sonra polarize bir nükleer membran gösterdi. 0.2 µg/mL BPME ile tedavi, 0.1 µg/mL BPME veya 10 µM Quercetin ile karşılaştırıldığında H2O2-indüklenen nükleer membran polarizasyonunu normalleştirdi.

Şekil 5a, kontrol ve BPME ile muamele edilmiş hücreler dahil olmak üzere HUVEC'ler için JC-1 boyama sonuçlarını göstermektedir; Şekil, ekstramitokondriyal lipofilik katyonik JC-1 (yeşil renk) ve intramitokondriyal olarak kırmızı renkle dönüştürülen J-agregatlarının negatif yüklü mitokondri alımıyla teyit edildiği gibi, aktif mitokondriye sahip sağlıklı hücreleri göstermektedir. Şekil 5b, H2O2 tarafından indüklenen oksidatif stres ile HUVEC'lere uygulanan 0.2 µg/mL BPME için JC-1 boyama sonuçlarını göstermektedir; sonuçlar, negatif yüklü mitokondrinin neredeyse yüzde 94'ünün lipofilik katyonik JC'yi -1 (yeşil renk) 0.1 µg/mL BPME (yüzde 61,4) tedavisine kıyasla kırmızı renkli J-agregatlarına dönüştürdüğünü doğruladı veya H2O{{20}}HUVEC'lerde indüklenen oksidatif stres (yüzde 2). Mitokondriyal membran potansiyelinin (MMP), referans ilaç kersetin ile karşılaştırıldığında BPME ile tedavi edilen hücrelerde daha yüksek olduğu gözlendi. 3.4. FACS Destekli Mitokondriyal Membran Potansiyeli (∆ψm; BD MitoScan) ve HUVEC'lerde Annexin V/apoptoz Analizi Şekil 6, normal HUVEC'lerin 0.2 µg/mL BPME tedavisinden sonra BD MitoScan analizindeki mitokondriyal membran potansiyeli kapasitesini gösterir. ve H2O2 tarafından indüklenen oksidatif strese sahip HUVEC'ler. 0,2 µg/mL BPME tedavisinin, yalnızca H2O2 ile tedavi edilen HUVEC'lerle karşılaştırıldığında (yüzde 27,9 ± yüzde 7,2) MMP'yi (∆ψm) yüzde 92,7 ± yüzde 3,7'ye yükselttiğini bulduk. Buna karşılık, quercetin ile tedavi edilen hücreler, yalnızca BPME ve H2O2 veya H2O2 ile tedavi edilen HUVEC'lerle karşılaştırıldığında yüzde 41,4 ± yüzde 1,6 oranında artan MMP (∆ψm) gösterdi.

Şekil 5. Araç kontrolü için JC-1 boyaması kullanılarak mitokondriyal membran potansiyelinin analizi, 0.1 ve 0.2 µg/mL pancar kabuğu metanol özütü (BPME) normal işleme tabi tutuldu (bir ) ve H2O2-indüklenmiş oksidatif stresli (b) 48 saat sonra HUVEC'ler. J-agregatlara karşı monomerik formda JC-1'e karşılık gelen, boyanın kırmızı ve yeşil sinyallerinin birleştirilmiş görüntülerini gösteren JC{{10}}flfloresan görüntüleri. Daha az J-agrega H2O2 tek başına işlem görmüş HUVEC'ler bulduk. 0.2 µg/mL BPME ile muamele edilmiş HUVEC'lerde, 0.1 µg/mL BPME veya 10 µM Quercetin ile karşılaştırıldığında doğrudan (yüksek MMP, µm) yüksek mitokondriyal membran potansiyelini temsil eden yüksek j-agregatları gösterir.

4. Tartışma

Hücre dışı veya hücre içi stres üzerine, reaktif oksijen türlerinin (ROS) biyoyararlanımı antioksidan savunmayı aşar ve oksidatif stres redoks sinyalini ve kontrolünü bozar [31]. Oksidatif stresin gelişimi, nörodejeneratif hastalıklar, diyabet ve ateroskleroz gibi kronik bozuklukların patojenleri ile ilişkilidir. Oksidatif stres, endotelyal disfonksiyonu başlatır ve sistemik inflamasyonu ve makrofajların işe alınmasını teşvik eder [32]. Aktive edilmiş bağışıklık hücreleri, damar sistemine göç eder ve düz kas hücresi kan damarlarının vazokonstriksiyon ve yeniden şekillenmesi ve vasküler düz kas hücrelerini ve damar duvarını etkileyen inflamasyon ile ilişkili sitokinleri ve kemokinleri serbest bırakır [33]. Artan vasküler oksidatif stres, vasküler hasar, düz kas hücre sertliği ve yapısal elastin anormallikleri ile sona erer. Ek olarak, perivasküler yağ dokusunda artan NADPH oksidaz (NOX-2) aktivitesi nedeniyle viseral obezite veya ateroskleroz gibi diğer patolojik durumlarda vasküler oksidatif stres uyarılmıştır [34]. Vasküler oksidatif stres, yaşlanma sırasında meydana gelen temel epigenetik değişikliklere neden olur ve erken yaşlanma süreciyle son bulur [35]. Biyolojik sistemde ROS üretiminin ve oksidatif stresin gelişimi büyük ölçüde NOX-2, endotelyal ksantin oksidaz, bağlanmamış eNOS ve lipoksijenaz'a ek olarak mitokondriyal işlev bozukluğuna bağlıdır [36]. Diyet ajanlarının antioksidan özellikleri, artan antioksidan kapasite yoluyla ROS oluşumunu nötralize edebilir [26]. Ginkgo Biloba özü, OxiLDL'nin neden olduğu endotelyal disfonksiyonda ROS üretimini ve lipoksijenaz aktivitesini azaltarak ateroskleroz gelişimine karşı korur [37]. Ayrıca çeşitli fenolik bileşikler veflavonoidleryenilebilir bitkiler ve tahıllar, ROS ve lipid peroksidasyonunu temizleme özelliğine sahiptir [38]. Pancar kabuğu (Beta vulgaris) metanolik özütü, yüksek lif, antosiyaninler ve vitexin ve betanin gibi flavonoidlerin mevcudiyeti nedeniyle antioksidan potansiyele sahiptir [39]. Bu çalışmada, mitokondriyal membran potansiyeli, LPO söndürme ve vasküler inflamasyon ile ilişkili mRNA ekspresyon seviyelerinin inhibisyonu üzerindeki etkisini keşfetmek için mitokondriyal bağımlı mekanik yaklaşımı tanımlamak için BPME seçilmiştir. MTT tahlili, test edilen 0.1 µg/mL'ye kıyasla etkili 0.2 µg/mL BPME dozu ile PI boyamasında artan nükleer bütünlük ile teyit edildiği gibi, BPME'nin hücre proliferasyonunu önemli ölçüde arttırdığını doğruladı. BPME'nin. Düşük konsantrasyonlu ve en yüksek aktiviteli etkili dozun tanımlanması fizyolojik olarak güvenli kabul edilebilir. JC-1'nin FL floresan mikroskobik boyamasını bulduk ve mitokondriyal membran potansiyeli hem normal hem de H2O{{10}}harici olarak uyarılan oksidatif stresli HUVEC'lerde 0,2 µg/mL BPME'den sonra restore edildi tedavi. Mitokondriyal disfonksiyon, oksijen (O2·−) radikallerini glutatyon peroksidaz tarafından H2O2 ve H2O'ya dönüştürmede başarısız olan oksidatif fosforilasyonu değiştirir. Yetersiz ROS detoksifikasyonu veya kontrolsüz ROS üretimi nedeniyle, artan mitokondriyal oksidatif stres ateroskleroz ile bağlantılıdır [40]. Pancar kabuğu özleri, ROS detoksifikasyonunu ve H2O2 oluşumunu başarılı bir şekilde artıran mitokondriyal membran potansiyelini etkili bir şekilde restore etti. Annexin V/PI boyama analizi, BPME tedavisinin canlı hücre yüzdesini koruduğunu ve hem normal HUVEC'lerde hem de H2O2 tarafından indüklenen oksidatif strese sahip HUVEC'lerde hücre proliferasyon aşamasını geliştirdiğini doğruladı. Bu bağlamda Choo ve ark. [41] iskemik bölgede aşırı ROS veya eksojen H2O2 oluşumundan sonra, nakledilen mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) kendi kendine çoğalma ve çoklu soy kapasitesini bozabileceğini doğruladı. Rejeneratif tıpta vasküler düz kas hücreleri, arteriyel periferik direncin korunması, kan basıncı düzenleyicileri, kan arkadaşı ve arterlerin onarımı yoluyla kontraktil ton arterlerinin ana düzenleyicileridir [42]. Ek olarak, EC'lerin yaşa bağlı fenotip modülasyonu, azalmış hücresel kasılma ve artan hücre yaşlanması ile ilişkilidir. Sürekli stres üzerine veya azaltılmış mekanosensitivite nedeniyle, yaşlanmış düz kas hücrelerinde mikro-ortam sinyallerinin adaptasyonunda azalma tespit edilir [43]. Mevcut sonuçlar, anjiyogenez kapasitesinin kanıtladığı gibi, BPME tedavisinin canlı hücre popülasyonunu koruduğunu doğruladı. BPME'nin HUVEC'lerde tanımlanan çoğalma kapasitesi, LPO ekspresyonundaki azalma ve artan antioksidan gen ekspresyonları ile desteklenmiştir. ROS ve LPO başlangıçta hücre proliferasyonu veya farklılaşması sırasında mitokondriyal kompleks (I ve III) ve NOX-4'dan üretilir [44]. Aşırı ROS, özellikle hücresel çoğalma ve fonksiyonlar için kritik olan genomik DNA'nın bütünlüğünü değiştirerek biyomoleküllere tepki verir ve zarar verir [45]. Bununla birlikte, epigallokateşin ve tokoferol gibi antioksidan polifenollerin diyetle alınmasının hücreleri oksidatif stresten koruduğu ve çoğalma kapasitesini arttırdığı doğrulanmıştır [46]. Çalışmamızda H2O2'nin neden olduğu oksidatif stresli HUVEC'lerde LPO'nun mRNA ekspresyon düzeylerinin düştüğü ve NOS-3, Nrf-2 ve eNOS'un iki kat arttığı bulundu. eNOS, düz kas hücreleri ve vasküler dokulardaki NO ürünlerinin çoğundan sorumlu olan NOS'un baskın izoformudur. NO· her tür vasküler damarı genişletir ve EC'lerde trombosit agregasyonunu ve lökosit yapışmasını korur [47]. Şimdiye kadar, kardiyovasküler risk faktörleri hakkında birçok çelişkili rapor olmuştur ve endotel disfonksiyonu, azalmış veya artmış eNOS ekspresyonu ile ilişkilendirilmiştir [48]. Aşırı H2O2 üretiminin bir sonucu olması muhtemel olan vasküler hastalıkta gözlenen eNOS'un yüksek ekspresyonu. Bir dismutasyon ürünü olan O2·−, transkripsiyonel ve transkripsiyon sonrası mekanizmalar yoluyla eNOS ekspresyonunu artırabilir [49]. Vasküler hastalığın patogenezine, O2·− ile reaksiyondan sonra NO·'nun hızlanmış bir bozunması ve son olarak ONOO− formu eşlik eder, bu da eNOS ayrışmasına ve NOX enzim disfonksiyonuna yol açar [50]. Oksidatif stres, antioksidan enzimler tarafından baskılanmıştır ve BPME tedavisinden sonra GSK-3 ve GPX'in mRNA seviyeleri artmıştır. BPME, betalainler, flavonoidler, polifenoller, terapötik enzimler, askorbik asit, dehidroaskorbik asit (DHAA) ve inorganik nitrat (NO3) dahil biyolojik olarak aktif olan çok sayıda fitokimyasal içerir ve bunlar HUVEC'lerde antioksidan kapasitenin düzenlenmesinde rol oynayabilir. Bu bağlamda, Cha ve ark. (2014) [51] klorojenik asidin insan keratinositlerinde oksidatif stresin neden olduğu DNA hasarına karşı etkili bir şekilde koruduğunu bildirmiştir. Endotelden türetilen bir vazokonstriktör olan endotelin-1 (Edn-1), düz kas hücre göçü gerçekleştirir ve nitrik oksit kaynaklı strese sahip hücrelerde antiapoptotik bir faktör olarak görev yapar [52,53]. Vasküler yeniden şekillenme, göç, çoğalma ve hücre dışı matris birikimi süreçleri hem Edn-1 hem de NO [54,55] tarafından uyarılmıştır. Oksidatif stresli HUVEC'lerde BPME tedavisinden sonra Edn-1 ifadesinin arttığını gözlemledik. Oksidatif stres veya LPO birikimi üzerine, vasküler inflamasyonun erken evresi, lökositlerin endotelyal düz kas hücrelerine yapışmasıdır, kritik iskemi ve ateroskleroz olayları için belirgindir [56]. VCAM ve ICAM ifadeleri aracılık eder; NF-κB, IL-1 ve TNF-ifadeleri gibi birçok kemokin ve kemotaksis ajanı tarafından uyarılmıştır [57]. IL-1 aktivasyonunun inhibisyonu, ardından adezyon molekülü ekspresyonu, diyetteki fenolik bileşik ellagik asit tarafından başarılmıştır [58]. Oksidatif strese sahip harici olarak uyarılan HUVEC'lere BPME ile tedavi, VCAM, ICAM, NF-κB, IL-1 ve TNF ekspresyon seviyeleri gibi vasküler hücreye özgü proinflamatuar faktörleri önemli ölçüde azalttı. Bu bağlamda Crespo ve ark. [59], kaempferol ve kersetin'in sırasıyla VCAM, ICAM, NF-κB ve IL-1 ekspresyonları gibi proinflamatuar genleri inhibe ettiğini bildirdi. Genel olarak, BPME'nin oksidatif stres ve vasküler inflamasyonla ilişkili gen ekspresyon potansiyelinin inhibisyonu, vasküler hücre büyüme faktörlerinin ekspresyonunu destekledi ve potansiyel olarak vasküler hücre proliferasyonu ve büyümesine yardımcı oldu.

5. Sonuçlar

Mevcut bulgular, antioksidan genlerin artan ekspresyonunun, oksidatif stresin söndürülmesi ile ilişkili olduğunu ve HUVEC proliferasyonunun ve anjiyogenezin bozulmasının üstesinden gelmeye yardımcı olduğunu doğrulamaktadır. Hidroksimetilfurfural içeren siyah sarımsak, HUVEC'lere TNF ile indüklenen monosit hücre yapışmasının inflamatuar etkisini baskılar ve ayrıca ROS oluşumunu, VCAM-1 ekspresyonunu ve NF-κB aktivasyonunu baskılar [60]. Ayrıca He ve ark. [61] hidroksimetilfurfuralin EC'leri hipoksiden koruma potansiyeline sahip olduğunu doğruladı. Pancar kabuğunun ayrıca flavonoidler, furan ve 5-hidroksimetilfurfural, metil piruvat, furfural ve 2,3-dihidro-3,5- gibi antioksidan bileşenler içerdiği tespit edilmiştir. dihidroksi-6-metil-4H-Pyran-4-bir; bu bileşenler gelişmiş antioksidan kapasiteden ve proinflamatuar vasküler düz kas hücresi adezyon moleküllerinin baskılanmasından sorumludur. Pancar kabuğu, peroksidatif hücresel stresin dış uyaranı veya iç patolojik uyaranı söndürmek için antioksidan havuzları için bir uyarıcı olarak kullanılmıştır. Bulgularımız, pancar bileşenlerinin, vasküler hücre proliferasyonu ve anjiyogenez için faydalı olabilecek HUVEC'lerde metabolik stres ve inflamasyonu azaltmaya yardımcı olduğunu kanıtladı.

Yazar Katkıları:

Kavramsallaştırma, LNA-H. ve S.-BP; metodoloji, LNA-H. ve S.-BP; yazılım, GS; doğrulama, LNA-H. ve S.-BP; biçimsel analiz, S.-BP, AMA-D., AAA (Ali A Alshatwi) ve GS; inceleme, LNA-H., S.-BP ve AMA-D.; kaynaklar, LNA-H.; veri iyileştirme,S.-BP ve LNA-H.; yazma—orijinal taslak hazırlama, LNA-H. ve S.-BP; yazma—inceleme ve düzenleme, LNA-H., AMS, GS ve AAA (Amna Abdullah Alotiby); görselleştirme, S.-BP ve AAA (Ali A Alshatwi); süpervizyon, LNA-H. ve S.-BP; proje yönetimi, LNA-H.; fon alımı, LNA-H. Tüm yazarlar, makalenin yayınlanan versiyonunu okudu ve kabul etti. Finansman: Yazarlar, King Saud Üniversitesi Bilimsel Araştırma Dekanlığına bu çalışmayı RG-1442-432 nolu araştırma grubu aracılığıyla finanse ettiği için teşekkürlerini iletmektedir. : Bu çalışmada sunulan veriler, ilgili yazardan talep üzerine sağlanabilir. Çıkar Çatışmaları: Bu çalışma için herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Referanslar

1. Abdolmaleki, Z.; Arab, H.-A.; Amanpour, S.; Muhammednejad, S. Artemisia sieberi'nin etanolik ekstraktının aktif maddesi artemisinin ile karşılaştırıldığında anti-anjiyogenik etkileri. Rev. Sütyen. Farmacogn. 2016, 26, 326-333. [Çapraz Referans]
2. Yoo, SY; Kwon, SM Anjiyogenez ve terapötik fırsatları. Medyat. Enflamasyon. 2013, 2013, 127170. [CrossRef] [PubMed]
3. Folkman, J. Angiogenesis kanser, vasküler, romatoid ve diğer hastalıklarda. Nat. Med. 1995, 1, 27-31. [Çapraz Referans]
4. Hoeben, A.; Landuyt, B.; Highley, MS; Wildier, H.; Van Oosterom, AT; De Bruijn, EA Vasküler endotelyal büyüme faktörü ve anjiyogenez. farmakol. Rev. 2004, 56, 549-580. [Çapraz Referans]
5. Ferrara, N.; Alitalo, K. Anjiyojenik büyüme faktörlerinin ve inhibitörlerinin klinik uygulamaları. Nat. Med. 1999, 5, 1359-1364. [Çapraz Referans]
6. Kadırga, HF; Webster, NR Endotelin Fizyolojisi. Br. J. Anaest. 2004, 93, 105-113. [Çapraz Referans]
7. Onat, D.; Brillon, D.; Kolombo, bilgisayar; Schmidt, AM İnsan vasküler endotel hücreleri: Diyabet ve aterosklerozda vasküler inflamasyonu incelemek için bir model sistem. Kör. Diyabet Cum. 2011, 11, 193–202. [CrossRef] [PubMed]
8. Packard, RR; Libby, P. Aterosklerozda iltihaplanma: Vasküler biyolojiden biyobelirteç keşfine ve risk tahminine. Klinik. Kimya 2008, 54, 24-38. [Çapraz Referans]
9. Esper, RJ; Nordby, RA; Vilariño, JO; Paragano, A.; Cacharron, JL; Machado, RA Endotel disfonksiyonu: Kapsamlı bir değerlendirme. Kardiyovasküler diyabetol. 2006, 5, 4. [ÇaprazRef]
10. Baudin, B.; Brunel, A.; Bosselut, N.; Vaubourdolle, M. İnsan göbek damarı endotel hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için bir protokol. Nat. Protokol 2007, 2, 481–485. [CrossRef] [PubMed]
11. Cao, Y.; Cao, R. Anjiyogenez çay içerek inhibe edilir. Nature 1999, 398, 381. [CrossRef] [PubMed]
12. Yen, G.-C.; Duh, P.-D.; Tsai, H.-L. Askorbik asit ve gallik asidin antioksidan ve pro-oksidan özellikleri. Gıda Kimyası 2002, 79, 307-313. [Çapraz Referans]
13. Dhalaria, R.; Verma, R.; Kumar, D.; Puri, S.; Tapval, A.; Kumar, V.; Nepovimova, E.; Kuca, K. Yaşlanma önleyici özellikleri ile yenilebilir meyvelerin biyoaktif bileşikleri: İnsan ömrünü uzatmak için kapsamlı bir inceleme. Antioksidanlar 2020, 9, 1123. [CrossRef] [PubMed]
14. Baião, DdS; da Silva, D.; Del Aguila, EM; Paschoalin, VMF Farklı pancar formülasyonlarının besleyici, biyoaktif ve fizikokimyasal özellikleri. Gıda Bağımlısı. 2017, 6. [ÇaprazRef]
15. Lalonde, R.; Roitberg, B. Ağaçlarda çiftleşme davranışının evrimi üzerine: Avlanma mı yoksa hava durumu mu? Ben. Nat. 1992, 139, 6. [ÇaprazRef]
16. Silva, D.; Baiao, DDS; Ferreira, VF; Paschoalin, çok yollu oksidatif stres ve inflamasyon modülatörü olarak VMF Betanin: Kardiyovasküler hastalık patogenezinde koruyucu etkileri olan bir pancar pigmenti. Krit. Rev. Gıda Bilimi. Nutr. 2020, 1-16. [Çapraz Referans]
17. Baiao, DDS; Silva, D.; Paschoalin, VMF Dikkat çekici sebze: Nitrat ve fitokimyasal içerikleri, sağlığa fayda sağlamak ve kardiyovasküler hastalık tedavilerini desteklemek için yeni formülasyonlarda ayarlanabilir. Antioksidanlar 2020, 9, 960. [CrossRef] 18. Abd El-Ghaffar, EA; Hegazi, NM; Saad, HH; Süleyman, MM; El-Raey, MA; Shehata, SM; Barakat, A.; Yaşır, A.; Sobeh, M. HPLC-ESI- Pancar (Beta vulgaris) yapraklarının MS/MS analizi ve tip 1 diyabetik sıçanlarda faydalı özellikleri. Biyomedikal. Eczacı. 2019, 120, 109541. [CrossRef]
19. Singh, B.; Nathan, BS Pancarın kimyasal bileşimi, fonksiyonel özellikleri ve işlenmesi-bir inceleme. Int. J. Sci. Müh. Araş. 2014, 5, 679.
20. Ninfali, P.; Angelino, D. Beta vulgaris cicla ve rubra'nın beslenme ve fonksiyonel potansiyeli. Fitoterapia 2013, 89, 188-199. [Çapraz Referans]