Beta Vulgaris Rubra L. (Pancar) Kabuğu Metanol Özü Oksidatif Stresi Azaltır ve H2O2 İle İndüklenmiş Oksidatif Stres Altındaki İnsan Göbek Damarı Endotel Hücrelerinde VEGF İfadesini Arttırarak Hücre Proliferasyonunu Uyarır

Lütfen iletişime geçinoscar.xiao@wecistanche.comdaha fazla bilgi için

Soyut:Diyet maddelerinde bulunan polifenollerin ve flavonoidlerin antioksidan kapasitesi, reaktif oksijen türlerinin (ROS) gelişimini durdurmaya ve endotelyal düz kas hücrelerinin oksidatif stres/indüklenmiş nekrozdan korunmasına yardımcı olur. Pancar (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) zengin bir antioksidan kaynağı olan yaygın olarak tüketilen bir sebzedir. Pancar kabuğunun biyoaktif bileşikleri ve bunların insan göbek damarı endotel hücrelerindeki (HUVEC'ler) rolü hala yeterince araştırılmamıştır. Bu çalışmada, pancar kabuğu metanol özütü (BPME) hazırlandı ve indüklenmiş oksidatif strese sahip HUVEC'lerde biyo-etkililik, nükleer bütünlük, mitokondriyal membran potansiyeli, vasküler hücre büyümesi ve immünoregülasyonla ilişkili gen ekspresyon seviyeleri üzerindeki etkisi analiz edildi. . Gaz kromatografisi-kütle spektroskopisi (GC-MS) sonuçları, BPME'nin 5-hidroksimetilfurfural (yüzde 32,6), metil piruvat (yüzde 15,13), furfural (yüzde 9,98) ve 2,3-dihidro{{ içerdiğini doğruladı. 14}},5-dihidroksi-6-metil-4H-Pyran-4-bir(yüzde 12,4). BPM özütü, hücre çoğalmasını etkili bir şekilde arttırdı ve MTT tahlili ile doğrulandı; nükleer bütünlük, propidium iyodür （PI） boyama deneyi ile doğrulandı; mitokondriyal membran potansiyeli（Aψm）, JC-1 boyama testiyle doğrulandı. Annexin V tahlili, BPME ile muamele edilmiş HUVEC'lerin yüzde 99 canlı hücre gösterdiğini doğruladı, ancak sadece H2O2 ile muamele edilmiş HUVEC'lerde sadece yüzde 39.8 canlılık gösterildi. Ek olarak, 48 saat boyunca HUVEC'lerin BPME tedavisi, lipid peroksidin (LPO) mRNA ekspresyonunu azalttı ve NOS-3, Nrf-2, GSK-3, GPX, endotelyal nitrik oksit sentazı (eNOS) arttırdı. ) ve vasküler hücre büyüme faktörü (VEGF)mRNA ekspresyon seviyeleri. BPME tedavisinin proinflamatuar (nükleer faktör-k (Fk ), doku nekroz faktörü- (TNF- ), ücretli benzeri reseptör-4(TLR-4), interlökin-1 ( IL-1 )) ve vasküler inflamasyon (hücre içi yapışma molekülü (ICAM), vasküler hücre yapışma molekülü (VCAM), EDN, IL-1 ) ile ilgili mRNA ifadeleri. Sonuç olarak, pancar kabuğu tedavisi vasküler düz hücre büyüme faktörlerini ve mikrotübül gelişimini etkin bir şekilde artırırken, vasküler inflamatuar düzenleyicileri azalttı. BPM, vasküler düz hücre rejenerasyonu, doku onarımı ve yaşlanma karşıtı potansiyel için faydalı olabilir.

Anahtar Kelimeler:pancar kökü; oksidatif stres; mitokondri; damarlanma; iltihap

1. Giriş

Anjiyogenez, vücudun mevcut damar sisteminden vaskülogenezin fizyolojik sürecidir [1. Sadece embriyonik gelişim ve üreme için değil, hücre döngüsü ve doku onarımı için de gereklidir[2,3]. Bununla birlikte, tümör büyümesi, romatoid artrit ve çeşitli iskemik ve inflamatuar hastalıklar gibi çeşitli hastalıkların patogenezi ile ilişkilidir [3-5]. Vasküler endotel, kan damarı tonusunu ve immün ve inflamatuar reaksiyonları düzenleyerek vasküler hemostazın korunmasında önemli bir rol oynar [6,7].püriten c vitaminiEndotel hücreleri (EC'ler), kan damarlarının tüm iç yüzeylerini kaplayan ve lokal olarak veya uzak bölgelerde etki eden çeşitli moleküller üreten ince tek hücreli katmanlardır [7]. Endotel, vücut homeostazı için esastır ve endotel hücre yanıtındaki herhangi bir değişiklik, ateroskleroz ve hipertansiyon gibi inflamatuar ve vasküler hastalık süreçlerinin birincil olaylarına yol açar [6,8,9]. Bu hastalıklar, EC yapısını ve fonksiyon bütünlüğünü değiştiren ve endotel disfonksiyonuna yol açan oksidatif strese neden olur [9]. İnsan göbek damarı EC'leri (HUVEC'ler), insan vasküler endoteliyle ilgili çalışmalar için bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, endotel fonksiyonunda yer alan ana biyolojik yolakları incelemek için yararlı bir modeli temsil ederler [10].

Daha fazla bilgi için lütfen buraya tıklayın

Biyoaktif bileşikler ve fitokimyasallar meyvelerde, sebzelerde, yeşil bitkilerde ve birçok bitkide bol miktarda bulunur ve bunlar anti-inflamatuar, antioksidan, antikanserojenik ve anjiyojenik özellikler [11-13] gibi sayısız sağlık yararları sergiler. Bu bağlamda kırmızı pancar (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) Amaranthaceae familyasına aittir ve yüksek düzeyde antioksidanların en iyi kaynaklarından biri olarak sınıflandırılır [14,15. Spesifik olarak, betalainler, flavonoidler, polifenoller, terapötik enzimler, askorbik asit, dehidroaskorbik asit (DHAA) ve inorganik nitrat (NO3)[16-18] dahil olmak üzere biyolojik olarak aktif olan çok sayıda fitokimyasal içerir. Ayrıca potasyum, kalsiyum, magnezyum, sodyum, demir, çinko, fosfor, bakır ve manganez gibi değerli temel besinleri sağlar [19]. Birkaç çalışma, kırmızı pancar özütünün (kök) hipoglisemik, lipid düşürücü, anti-inflamatuar, antihipertansif ve antiproliferatif özelliklerinden dolayı sayısız faydalı etkiye sahip olduğunu bildirmiştir [20-22].sistancheBu faydalı özelliklerin tümü, biyoaktif bileşiklerin serbest radikal temizleme yetenekleriyle bağlantılı olabilir. Bu nedenle, kırmızı pancar tüketimi, sayısız beslenme ve sağlık yararı ile ilişkilendirilmiştir. Besin değeri nedeniyle, tip 2 diyabet ve kardiyovasküler hastalık gibi kronik metabolik hastalıkları indükleyen oksidatif streslere karşı fonksiyonel bir besin kaynağı olarak kullanılabilir [23].

Literatür incelemesine dayanarak, Beta vulgaris güçlü antioksidan, immün düzenleyici ve anjiyojenik özelliklere sahiptir. Apigenin pancar yapraklarında bulunmuştur; karaciğer ve bağırsak hücrelerinde antiproliferatif etkileri vardır ve AMPK aktivasyonu yoluyla yüksek yağlı diyete bağlı obezite komorbiditesini iyileştirebilir [24,25]. De Silva ve diğerleri, (2020) [26], Beta vulgaris'in vasküler EC'leri, bu bitkide bulunan birkaç biyoaktif bileşiğin birleşik etkisinden kaynaklanabilecek harici olarak indüklenen oksidatif stresten koruduğunu belirlemiştir. Şimdiye kadar, Beta vulgaris kök kabuğunun EC proliferasyonu ve anjiyogenez etkisi için mekanik etkisi yeterince araştırılmamıştır. Bu nedenle, HUVEC'lerde hücresel morfoloji ve gen ekspresyon analizi kullanarak Beta vulgaris kök kabuğu ile ilgili vasküler hücre proliferasyonu, mikrotübül gelişimi, oksidatif stres ve anjiyogenez kapasitesini incelemek için bu çalışmayı yürütmeyi amaçladık. Kırmızı pancar kabuğu metanol ekstraktının nükleer bütünlük, mikrotübül gelişimi, mitokondriyal etkinlik ve insan vasküler EC'lerinde hücre döngüsü stimülasyonu ile ilişkili anjiyojenik etkileri araştırılmaktadır.

2. Malzemeler ve Yöntemler

2.1.Pancar (Beta vulgaris rubra L.) Metanol Ekstraktının Hazırlanışı

Taze pancar örnekleri (Beta Vulgaris var. Rubra L.; BVr.) ilk olarak Riyad, Suudi Arabistan Krallığı'ndaki (KSA) sebze mağazalarından elde edildi. Taze pancarlar, sapları ve kirleticileri ortadan kaldırmak için damıtılmış su ile yıkandı. Dış kabuk soyularak çıkarılıp küçük parçalar halinde kesilir. Numuneler 40 derecede sıcak hava fırınında kurutuldu ve daha sonra elektronik bir blender kullanılarak toz haline getirildi. Daha sonra, 1 L metanol (Sigma, St. Louis, MO, ABD) içeren steril bir şişede 500 g toz, bir çalkalayıcıda oda sıcaklığında 24 saat boyunca özümlendi ve üç kez tekrarlandı. Daha sonra, özü filtrelemek için bir Whatman filtresi (Whatman, Clifton, NJ, ABD) kullanıldı. Son olarak, basınç düşürülerek çözücü özden ayrıldı ve öz, metanolün buharlaştırılmasından sonra katı bir kuru madde olarak toplandı. Ekstrakte edilen numune, bir sonraki kullanıma kadar 4°C'de bir buzdolabında saklandı.

2.2. Gaz Kromatografisi ve Kütle Spektroskopisi Analizi

Pancar kabuğu metanol özütü (BPME), GC-MS cihazının (Agilent 6890N/5973I) bir silika kılcal kolonuna (30 m×0.25 mm ID×0.25 um film kalınlığı) enjekte edildi. , California, CA, USA) kimyasal bileşimleri tespit etmek için kütle seçici dedektörlü. Aletin sıcaklığı ilk 70 derece olarak ayarlandı, 2 dakika, 305 dereceye kadar 20 derece/dk'da tutuldu ve ardından 1 dakika tutuldu. Toplam GC çalışma süresi, taşıyıcı gaz olarak helyum gazı (yüzde 99.999) (1.2 mL/dk sabit akış hızı), enjektör sıcaklığı 250 derece ve iyon kaynağı sıcaklığı olarak 230 derece ile 45 dakikaya ayarlandı. GC-MS spektrumuna dayalı olarak, karşılık gelen bileşenin nispi yüzdesi hesaplandı ve bilinmeyen bileşenin kütle spektrumları, Ulusal Standart ve Teknoloji Enstitüsü'nde mevcut olan bilinen 62,000 desenle karşılaştırılarak tanımlandı. bilgisayar kitaplığı (NIST08).

Cistanche yaşlanmayı geciktirebilir

2.3. Hücre Kültürü Materyalleri ve Kimyasalları

HUVEC'ler, American Type Culture Collection'dan (ATCC, Manassas, VA, ABD) satın alındı. Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), EDTA, tripsin ve diğerleri gibi hücre kültürü materyalleri Gibco'dan (Paisley, UK) elde edildi. Penisilin-streptomisin (PS) ve fetal sığır serumu (FBS), Hyclone Laboratories, ABD'den satın alındı.cistanche nedirMoleküler biyoloji deneyinde kullanılan kimyasallar, özellikle MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- olmak üzere Sigma-Aldrich'ten elde edilmiştir. difeniltetrazolyum bromür], PI ve JC-1 boyası. SYBR Green PCR Master Mix ve cDNA sentez kiti Qiagen'den (Hilden, Almanya) elde edildi.

2.4.HUVEC'ler

HUVEC'ler DMEM'de kültürlendi ve yüzde 1 PS ve yüzde 10 FBS kompleksi ile desteklendi. Hücreler, 37°C'de, yüzde 5 CO2'de nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edildi ve yaklaşık olarak her 3 günde bir alt kültürlendi.

2.5. MTT Testiyle Hücre Canlılığı ve Hücre Proliferasyonu

HUVEC'ler(1x104 hücre/kuyu) bir bakım ortamı ile kültürlendi ve gece boyunca bir 96-kuyu kültür plakasında yapışmasına izin verildi. Ardından ortam, artan konsantrasyonlarda BPME(0,0 içeren yeni bir kültür ortamı ile değiştirildi.05,{{10}}.1,0.2 0.4,0.8,1.6 ve 3.2ug/mL) MTT tahlil plakası haritasına göre ve 24 ve 48 saat süreyle inkübe edildi; işlenmemiş hücreler kontrol olarak kullanıldı. Kuluçka döneminden sonra, deney hücreleri 20 μL/kuyucuk 5 mg/mL MTT （3-【4,5-dimetiltiazol-2-yl】-2 ile muamele edildi, 5-dimetil sülfoksit (DMSO)) içinde çözündürülen difeniltetrazolyum bromür ve ayrıca 4 saat 37 derecede inkübe edildi. Daha sonra ortam atıldı ve üretilen mor formazan 100μL yüzde 100 DMSO içinde çözüldü. Çözeltinin absorbansı, 570 nm dalga boyunda bir mikroplaka okuyucu (Thermo Scientific, Waltham, MA, ABD) kullanılarak ölçüldü. Hücre proliferasyonunun yüzdesi (yüzdesi) aşağıdaki denklemle hesaplandı: (numunenin absorbansı/kontrolün ortalama absorbansı) x 100.

2.6. Deneysel tasarım

Mevcut hücre proliferasyon tahlili, daha düşük bir BPME konsantrasyonunu ({{0}}.1 ve 0.2 ug/mL) test etti ve toksisite olmaksızın çoğalan HUVEC'ler ve mikrotübül morfolojisi gösterdi. 0.1 hacimleri ve 0.2 ug/mL BPME dozu seçilmiş ve normal HUVEC'ler ve 10 mM H, O ile indüklenen oksidatif stresli HUVEC'ler ile 48 saat boyunca işlenerek hücre proliferasyonu, anti-inflamatuar belirlenmiştir. , anjiyojenik ve apoptotik potansiyeller (Şekil 1). Her iki grupta da araç kontrolü 48 saat sürdürüldü. Quercetin （10 μM）, her iki deney grubunda da referans kontrol olarak kullanıldı.Yaşlanma karşıtı cistancheİnkübasyondan sonra, işlenmemiş ve deneysel hücreler, bir BDM MitoScreen (C-1) Kiti kullanılarak hücre ve nükleer morfoloji ve mitokondriyal membran potansiyeli için analiz edildi; apoptoz, akış sitometrisinde Annexin V/apoptoz bazlı hücre sıralama yöntemi ile belirlendi. Oksidatif stres, proinflamatuar ve anjiyogenez ile ilişkili gen ekspresyon seviyeleri araştırıldı.

2.7.Nükleer Hasar için Propidium iyodür Boyama Deneyi

HUVEC'lerde {{0}}.1 ve 0,2 ug/mL BPME (H, O2'li veya H2'siz) ile tedaviden sonra karakteristik nükleer hasar, piknoz veya apoptotik morfolojik değişiklikler için hücresel morfolojiler PI boyama analizi kullanılarak belirlendi. Leite ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi, ters floresan mikroskobu altında. [27].

2.8.JC-1 Boya Boyama ile Mitokondriyal Membran Potansiyeli （△中m） Tayini

Mitokondriyal zarın potansiyeli (△!m), araç kontrolünde mitokondriyal verimliliği ve 0.1 ve 0.2 ug/mL BPME ile muamele edilmiş HUVEC'leri değerlendirmek için JC{{0}} tahlili ile belirlendi. (H2O2 ile ve H2O2 olmadan). Kısaca, JC-1 boyama solüsyonu benzer hacimde kültür ortamı ile karıştırıldı ve daha sonra deneysel HUVEC'lere eklendi ve karanlıkta 20 dakika 37 derecede inkübe edildi. Daha sonra bağlanmamış JC-1 boyası, 4 derecede 200 μL JC-1 boyama yıkama tamponu kullanılarak iki kez nazikçe yıkandı. Daha sonra, bir flüoresans mikroskobu kullanılarak flüoresans mikroskobu altında JC-1 boyamasına karşı j-agregasyonun birikimi gözlendi ve görüntüler alındı. Ek olarak, mitokondriyal membranın potansiyeli, BDIM MitoScreen (JC-1) Kiti kullanılarak akış sitometrisinde ölçüldü.

2.9. Akış Sitometrisi Kullanılarak Anneksin Vlapoptoz Analizi

Canlı, proapoptotik, erken apoptotik ve nekrotik hücreleri ölçmek için akış sitometrisi tabanlı Annexin V/PI saptama kiti (Sigma Chemicals, ABD) yöntemi kullanıldı. Oksidatif strese bağlı HUVEC'ler(1×10 derece/kuyu), 24-kuyu plakalarına kaplandı ve BPME（0.1 ve 0.2 ug/mL） veya araç kontrolü ile inkübe edildi. 48 saat İnkübasyondan sonra hücreler, 400 µL 5 µL Annexin V-fluorescein izotiyosiyanat （FITC） ve 5 µL PI içeren bağlama tamponu içinde inkübe edildi; Bunu takiben hücreler, karanlıkta oda sıcaklığında (RT) 15 dakika tutuldu. Hücreler, apoptotik (PInegatif ve Annexin V pozitif) ve geç apoptotik (PI-pozitif ve Annexin V pozitif) hücreleri belirlemek için akış sitometrisi (BD Biosciences, San Jose, CA, ABD) ile analiz edildi [28].

2.10. Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR Analizi

Fastlane® Cell to cDNA kiti (Qiagen, Hilden, Almanya) toplam RNA'yı çıkarmak ve araç kontrolünden cDNA'yı sentezlemek için kullanıldı, kantitatif bir PCR (qPCR) yarı otomatik enstrüman (Applied Biosystems) kullanılarak BPME ile muamele edilmiş HUVEC'ler (H-O2'li ve H-O2'siz) , Foster City, CA, ABD). Oksidatif stresin ifade seviyeleri şunları içerir: (lipid peroksit, NOS-3), antioksidan (Nrf-2, GSK-3 ve GPx), proinflamatuar (nükleer faktör-k (NF-k), tümör nekroz faktörü- (TNF- ), interlökin-1 (IL-1 ), vasküler hücre büyüme faktörü (VEGF), ücretli benzeri reseptör-4(TLR-4), ve vasküler inflamasyon (hücre içi yapışma molekülü (ICAM), vasküler hücre yapışma molekülü (VCAM), EDN1 ve endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS)) ile ilgili genler ve referans gen, -aktin, HUVEC'lerde analiz edildi ve Yuan ve diğerleri [29] Amplifikasyon değerleri (ACt), Ct (tedavi edilen) ve Ct (kontrol) arasındaki farkla hesaplandı.Gen ifadesi, 2-AACt değerinin ifadesi kullanılarak çizildi.

2.11.İstatistiksel Analiz

Tüm deneyler tekrarlandı ve elde edilen veriler ortalama değerler ± standart sapma (SD) olarak ifade edildi. Gruplar arasındaki farklılıkların istatistiksel analizi, SPSS yazılımı (Sürüm 28.5, SAS Institute Inc., Cary, NC, ABD) kullanılarak tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile yapıldı.cistanche faydalarıDaha sonra, anlamlı farklılıklar bulunursa Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi yapılmıştır. Tüm sonuçlar, her grupta altı tekrar için ortalama ± SD olarak sunuldu. < 0.05="" p="" değeri="" anlamlı="" kabul="" edildi="">

3. Sonuçlar

3.1.BPME'de Biyoaktif Moleküller

BPME'nin kimyasal bileşenleri, GC-MS (Turbomass, PerkinElmer) kullanılarak doğrulandı. Pancar kabuğu ekstresinin kimyasal bileşimi, Ulusal Standart ve Teknoloji Enstitüsü (NIST) Spektral veritabanı ile mevcut kütle spektrumları karşılaştırılarak belirlendi. GC-MS sonuçları, BPME'nin hidroksiaseton (8,18), 5-hidroksimetilfurfural (yüzde 32,6), metil piruvat (yüzde 15,13), beta-d-allopiranoz (yüzde 1,48), furfural (yüzde 9,98),{ {15}}hidroksi-gama-bütirolakton (yüzde 1,32) ve 2,3-dihidro-3.5-dihidroksi-6-metil-4H-Pyran{ {27}}bir(yüzde 12,4;Şekil 2a,Tablo 1).

3.2.Hücre Çoğalması

BPME'nin HUVEC'lere karşı in vitro hücre proliferasyon potansiyeli, Şekil 2b'de sunulmaktadır. Araç kontrolü ile karşılaştırıldığında deney gruplarında önemli bir hücre büyümesi inhibisyonu gözlenmedi. HUVEC'ler ile tedavi edilen BPME konsantrasyonunun arttırılmasının, 24 saatlik (yüzde 103) tedavi ile karşılaştırıldığında 48 saat (yüzde 112) sonrasında hücre proliferasyonu ve canlılığının artmasıyla sonuçlandığı bu çalışma ile doğrulanmıştır. Ek olarak, 48 saat sonra BPME ile muamele edilmiş HUVEC'lerin ışık mikroskobik görüntüleri, tek tip yapışık hücre morfolojisi şekline sahip normal hücreleri doğruladı, herhangi bir hasar olmadan artan çoğalan (replikasyon) hücre sayısı belirgindi (Şekil 2c).

3.3.Hücre ve Nükleer Morfoloji, Mikrotübül Oluşumu ve JC-1 HUVECS'te Kalma Analizi

Şekil 3, floresan mikroskobik görüntülerde mikrotübül gelişiminin morfolojisini gösterir. H2O2- ile indüklenen oksidatif stresli HUVEC'ler, kontrol HUVEC'leri ile karşılaştırıldığında, zayıf proliferasyon ve yapışık hücrelerin düzensiz morfolojisi gösterdi. 0.2 ug/mL BPME ile tedavi edilen normal HUVEC'ler, replikasyon veya mikrotübül morfolojisi ile neogenez yoluyla çoğalan hücreler gösterdi. Bu arada, 0.1 ug/mL BPME ile tedavi edilen hücreler dozu, mikrotübüllerin erken evrelerine sahip yüzde 1{{10}}0 yapışık hücre gösterdi. 0,2 ug/mL BPME ile tedavi edilen oksidatif stresli HUVEC'ler, mikrotübül morfolojisine sahip çoğalan yeni hücreleri tanımladı ve oksidatif hücresel hasarı azalttı. Ek olarak, 0.1 ug/mL BPME, çoğalan hücrelerle normal vasküler hücre morfolojisini de arttırdı.

Şekil 4a, kontrolde ve BPME（0.1 veya 0.2 ug/mL） ile muamele edilmiş HUVEC'lerde küresel bir şekle sahip nükleer yapının normal morfolojisini göstermektedir. Şekil 4b, H, O tarafından indüklenen oksidatif strese sahip normal ve HUVEC'lerin PI boyaması için görüntüleri göstermektedir. H2O2- ile muamele edilmiş HUVEC'ler, 3{{10} sonrasında yoğuşma ve piknoz sergileyen düzensiz şekilli çekirdekler göstermektedir. } dk. Ancak, oksidatif stres altında HUVEC'ler için 0.2 ug/mL BPME tedavisi, normal morfolojiye sahip dairesel çekirdekler gösterdi. 0,2 ug/mL BPME özütü ile karşılaştırıldığında, 0,1 ug/ml BPME, HUVEC'lerde H2O2-'nın neden olduğu oksidatif strese karşı daha az koruyucu etkiye sahipti.

Şekil 5a, kontrol ve BPME ile muamele edilmiş hücreler dahil olmak üzere HUVEC'ler için JC-1 boyama sonuçlarını göstermektedir; Şekil, ekstramitokondriyal lipofilik katyonik JC-1(yeşil renk) ve gerçekten mitokon içinde kırmızı renkle dönüştürülen J-agregatlarının negatif yüklü mitokondri alımıyla teyit edildiği gibi, aktif mitokondriye sahip sağlıklı hücreleri göstermektedir. Şekil 5b, H2O2 tarafından indüklenen oksidatif stres ile HUVEC'lere uygulanan 0.2 ug/mL BPME için JC-1 boyama sonuçlarını göstermektedir; sonuçlar, negatif yüklü mitokondrinin neredeyse yüzde 94'ünün lipofilik katyonik JC'yi-1(yeşil renk) 0.1 ug/mL BPME (yüzde 61,4) tedavisine kıyasla kırmızı renkli J-agregatlarına dönüştürdüğünü doğruladı veya

HUVEC'lerde H2O2 kaynaklı oksidatif stres (yüzde 2). Mitokondriyal membran potansiyelinin (MMP), referans ilaç kersetin ile karşılaştırıldığında BPME ile tedavi edilen hücrelerde daha yüksek olduğu gözlendi.

3.4. FACS Destekli Mitokondriyal Membran Potansiyeli (△pm; BD MitoScan) ve HUVEC'lerde Annexin V/apoptoz Analizi

Figure 6 shows the mitochondrial membrane potential capacity in BD MitoScan analysis after 0.2 ug/mL of BPME treatment of normal HUVECs and HUVECs with oxidative stress induced by H>O, 0,2 ug/mL BPME tedavisinin, yalnızca HO2 ile tedavi edilen HUVEC'lerle karşılaştırıldığında (yüzde 27,9 ± 7,2) MMP(Aum) değerini yüzde 92,7 ± yüzde 3,7'ye yükselttiğini bulduk. Buna karşılık, quercetin ile tedavi edilen hücreler, yalnızca BPME ve H2O2 veya H2O2 ile tedavi edilen HUVEC'lerle karşılaştırıldığında yüzde 41,4 ± yüzde 1,6 oranında artan MMP (Aum) gösterdi.

3.5. HUVEC'lerde Gen İfade Düzeylerinin Kantifikasyonu

Oksidatif stres(LPO3), antioksidan (NOS-3, Nrf-2, GSK-3 ve GPX), proinflamatuar (IL-1 , TNF- , NF-band TLR{ {7}}) ve vasküler inflamasyon (VCAM, ICAM, EDN, eNOS) ile ilişkili ve VEGF mRNA ekspresyon seviyeleri, araç kontrolünde 0.1 ve 0.2 ug/mL olarak ölçülmüştür. BPME ve kersetin （10 μM） ile muamele edilmiş HUVEC'ler 48 saat sonra （Şekil 8）. önemli ölçüde bulduk (p<0.001) increased="" levels="" of="" lpo,="" nos-3,="" and="" nf-kb.il-1.tnf-α,="" vcam,="" icam,="" edn,="" and="" enos="" expression="" and="" decreased="" nrf-2,="" gsk-3β,="" and="" gpx="" levels="" in="" ho,-induced="" huvecs.="" treatment="" with="" 0.2="" ug/ml="" of="" bpme="" significantly="" decreased="" oxidative="" stress="" and="" vascular="" inflammation="" and="" increased="" antioxidant="" factor-related="" mrna="" expression="" when="" compared="" with="" oxidative-stressed="" huvecs.="" vegf="" expression="" levels="" showed="" a="" significant="" two-fold="" increase="" in="" 0.2="" ug/ml="" of="" bpme-treated="" cells="" only="" when="" compared="" to0.1="" ug/ml="" of="" bpme.="" vegf="" expression="" was="" not="" detected="" in="" huvecs="" with="" oxidative="" stress="" induced="" by="" h2o2.="" the="" observed="" effect="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" 0.1="" ug/ml="" bpme="" or="" quercetin="" (10="">

4. Tartışma

Hücre dışı veya hücre içi stres üzerine, reaktif oksijen türlerinin (ROS) biyoyararlanımı antioksidan savunmayı aşar ve oksidatif stres redoks sinyalini ve kontrolünü bozar [31]. Oksidatif stresin gelişimi, nörodejeneratif hastalıklar, diyabet ve ateroskleroz gibi kronik bozuklukların patojenleri ile ilişkilidir. Oksidatif stres, endotelyal disfonksiyonu başlatır ve sistemik inflamasyonu ve makrofajların işe alınmasını teşvik eder [32]. Aktive edilmiş bağışıklık hücreleri, damar sistemine göç eder ve düz kas hücresi kan damarlarının vazokonstriksiyon ve yeniden şekillenmesi ve vasküler düz kas hücrelerini ve damar duvarını etkileyen inflamasyon ile ilişkili sitokinleri ve kemokinleri serbest bırakır [33]. Artan vasküler oksidatif stres, vasküler hasar, düz kas hücre sertliği ve yapısal elastin anormallikleri ile sona erer. Ek olarak, perivasküler yağ dokusunda artan NADPH oksidaz (NOX-2) aktivitesi nedeniyle viseral obezite veya ateroskleroz gibi diğer patolojik durumlarda vasküler oksidatif stres uyarılmıştır [34]. Vasküler oksidatif stres, yaşlanma sırasında meydana gelen temel epigenetik değişikliklere neden olur ve erken yaşlanma süreciyle son bulur [35].

Biyolojik sistemdeki ROS üretiminin ve oksidatif stresin gelişimi büyük ölçüde NOX-2, endotelyal ksantin oksidaz, bağlanmamış eNOS ve lipoksijenaz'a ek olarak mitokondriyal işlev bozukluğuna bağlıdır [36]. Diyet ajanlarının antioksidan özellikleri, artan antioksidan kapasite yoluyla ROS oluşumunu nötralize edebilir [26]. Ginkgo Biloba özü, OxiLDL'nin neden olduğu endotelyal disfonksiyonda ROS üretimini ve lipoksijenaz aktivitesini azaltarak ateroskleroz gelişimine karşı korur [37]. Ek olarak, yenilebilir bitkilerden ve tahıllardan elde edilen çeşitli fenolik bileşikler ve flavanoidler, ROS ve lipid peroksidasyonunu temizleme özelliğine sahiptir [38]. Pancar kabuğu (Beta vulgaris)metanol özütü, yüksek lif, antosiyaninler ve vitexin ve betanin gibi flavonoidlerin mevcudiyeti nedeniyle antioksidan potansiyele sahiptir [39]. Bu çalışmada, mitokondriyal membran potansiyeli, LPO söndürme ve vasküler inflamasyon ile ilişkili mRNA ekspresyon seviyelerinin inhibisyonu üzerindeki etkisini keşfetmek için mitokondriyal bağımlı mekanik yaklaşımı tanımlamak için BPME seçilmiştir.

MTT testi, test edilene kıyasla 0 etkili {{0}}.2 ug/mL BPME dozuyla PI boyamasında artan nükleer bütünlükle onaylandığı gibi, BPME'nin hücre proliferasyonunu önemli ölçüde arttırdığını doğruladı. 1 ug/mL BPME. Düşük konsantrasyonlu ve en yüksek aktiviteye sahip etkili bir dozun belirlenmesi fizyolojik olarak güvenli kabul edilebilir. JC-1'nin floresan mikroskobik boyamasını bulduk ve mitokondriyal membran potansiyeli, 0,2 ug/mL BPME tedavisinden sonra hem normal hem de H2O ile indüklenen harici olarak uyarılan oksidatif stresli HUVEC'lerde restore edildi. Mitokondriyal disfonksiyon, oksijen (O,.-) radikallerini H, O ve H, Oby glutatyon peroksidaza dönüştüremeyen oksidatif fosforilasyonu değiştirir. Yetersiz ROS detoksifikasyonu veya kontrolsüz ROS üretimi nedeniyle, artan mitokondriyal oksidatif stres ateroskleroz ile bağlantılıdır [40]. Pancar kabuğu özleri, ROS detoksifikasyonunu ve H2O2 oluşumunu başarılı bir şekilde artıran mitokondriyal membran potansiyelini etkili bir şekilde restore etti. Annexin V/PI boyama analizi, BPME tedavisinin canlı hücre yüzdesini koruduğunu ve hem normal HUVEC'lerde hem de H202'nin neden olduğu oksidatif stresli HUVEC'lerde hücre proliferasyon aşamasını geliştirdiğini doğruladı. Bu bağlamda Choo ve ark. [41], iskemik bölgede aşırı ROS veya eksojen H2O oluşumundan sonra, nakledilen mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) kendi kendine çoğalma ve çoklu soy kapasitesini bozabileceğini doğruladı. Rejeneratif tıpta, vasküler düz kas hücreleri, arteriyel periferik direnci, kan basıncı düzenleyicilerini, kan akışını ve arterlerin onarımını koruyarak kasılma tonu arterlerinin ana düzenleyicileridir [42]. Ayrıca, EC'lerin yaşa bağlı fenotip modülasyonu, azalmış hücresel kontraktilite ve artan hücre yaşlanması ile ilişkilidir. Sürekli stres üzerine veya azaltılmış mekanosensitivite nedeniyle, yaşlanmış düz kas hücrelerinde mikro-ortam sinyallerinin azalmış adaptasyonu tanımlanır [43]. Mevcut sonuçlar, anjiyogenez kapasitesinin kanıtladığı gibi, BPME tedavisinin canlı hücre popülasyonunu koruduğunu doğruladı.

BPME'nin HUVEC'lerde tanımlanan çoğalma kapasitesi, LPO ekspresyonundaki azalma ve artan antioksidan gen ekspresyonları ile desteklenmiştir. ROS ve LPO başlangıçta hücre proliferasyonu veya farklılaşması sırasında mitokondriyal kompleks(I ve I) ve NOX-4'dan üretilir [44]. Aşırı ROS, özellikle hücresel çoğalma ve fonksiyonlar için kritik olan genomik DNA'nın bütünlüğünü değiştirerek biyomoleküllere tepki verir ve zarar verir [45]. Bununla birlikte, epigallokateşin ve tokoferol gibi antioksidan polifenollerin diyetle alınmasının hücreleri oksidatif stresten koruduğu ve çoğalma kapasitesini arttırdığı doğrulanmıştır [46]. Çalışmamızda Hoo'nun neden olduğu oksidatif stresli HUVEC'lerde LPO'nun mRNA ekspresyon düzeylerinin düştüğü ve NOS-3, Nrf-2 ve eNOS'un iki kat arttığı bulundu. eNOS, düz kas hücreleri ve vasküler dokulardaki NO ürünlerinin çoğundan sorumlu olan NOS'un baskın izoformudur. NUMARA. her tür vasküler damarı genişletir ve EC'lerde trombosit agregasyonunu ve lökosit yapışmasını korur[47]. Şimdiye kadar, kardiyovasküler risk faktörleri hakkında birçok çelişkili rapor olmuştur ve endotel disfonksiyonu, azalmış veya artmış eNOS ekspresyonu ile ilişkilendirilmiştir [48]. H-Oz'un aşırı üretiminin bir sonucu olması muhtemel olan vasküler hastalıkta eNOS'un yüksek ekspresyonu gözlendi. Bir dismutasyon ürünü olan O2-7, transkripsiyonel ve transkripsiyon sonrası mekanizmalar yoluyla eNOS ekspresyonunu artırabilir [49]. Vasküler hastalığın patogenezine NO'nun hızlandırılmış bir yıkımı eşlik eder. O2-7 ile reaksiyondan sonra ve son olarak ONOO- formu, eNOS ayrışmasına ve NOX enzim disfonksiyonuna yol açar [50]. Oksidatif stres, antioksidan enzimler tarafından baskılanmıştır ve BPME tedavisinden sonra GSK-3 ve GPX'in mRNA seviyeleri artmıştır. BPME, betalainler, flavonoidler, polifenoller, terapötik enzimler, askorbik asit, dehidroaskorbik asit (DHAA) ve inorganik nitrat (NOg) dahil biyolojik olarak aktif olan çok sayıda fitokimyasal içerir ve bunlar HUVEC'lerde antioksidan kapasitenin düzenlenmesinde rol oynayabilir. Bu bağlamda, Cha ve ark. (2014) [51] klorojenik asidin insan keratinositlerinde oksidatif stres kaynaklı DNA hasarına karşı etkili bir şekilde koruduğunu bildirmiştir.

Endotelden türetilen bir vazokonstriktör olan endotelin-1 (Edn-1), düz kas hücre göçü gerçekleştirir ve nitrik oksit kaynaklı strese sahip hücrelerde antiapoptotik bir faktör olarak görev yapar[52,53]. Vasküler yeniden şekillenme, göç, çoğalma ve hücre dışı matris birikimi süreçleri hem Edn-1 hem de NO [54,5] tarafından uyarılmıştır. Oksidatif stresli HUVEC'lerde BPME tedavisinden sonra Edn-1 ifadesinin arttığını gözlemledik. Oksidatif stres veya LPO birikimi üzerine, vasküler inflamasyonun erken evresi, lökositlerin endotelyal düz kas hücrelerine yapışmasıdır, kritik iskemi ve ateroskleroz olayları için belirgindir [56]. VCAM ve ICAM ifadeleri aracılık eder; NF-kB, IL-1 ve TNF-ifadeleri gibi birçok kemokin ve kemotaksis ajanı tarafından uyarılmıştır[57]. IL-1 aktivasyonunun inhibisyonu, ardından adezyon molekülü ekspresyonu, diyetteki fenolik bileşik ellagik asit tarafından sağlanmıştır [58]. Oksidatif strese sahip harici olarak uyarılan HUVEC'lere BPME ile tedavi, VCAM, ICAM, NF-KB, IL-1 ve TNF-x ekspresyon seviyeleri gibi vasküler hücreye özgü proinflamatuar faktörleri önemli ölçüde azalttı. Bu bağlamda Crespo ve ark. [59]kaempferol ve kersetin'in sırasıyla VCAM, ICAM, NF-kB ve IL-1 ifadeleri gibi proinflamatuar genleri inhibe ettiğini bildirdi. Genel olarak, BPME'nin oksidatif stres ve vasküler inflamasyonla ilişkili gen ekspresyon potansiyelinin inhibisyonu, vasküler hücre büyüme faktörlerinin ekspresyonunu destekledi ve potansiyel olarak vasküler hücre proliferasyonu ve büyümesine yardımcı oldu.

5. Sonuçlar

Mevcut bulgular, antioksidan genlerin artan ekspresyonunun, oksidatif stresin söndürülmesi ile ilişkili olduğunu ve HUVEC proliferasyonunun ve anjiyogenezin bozulmasının üstesinden gelmeye yardımcı olduğunu doğrulamaktadır. Hidroksimetilfurfural içeren siyah sarımsak, HUVEC'lere TNF ile indüklenen monosit hücre yapışmasının enflamatuar etkisini baskılar ve ayrıca ROS oluşumunu, VCAM-1 ekspresyonunu ve NF-kB aktivasyonunu baskılar [60]. Ayrıca He ve ark. [61], hidroksimetilfurfural'in hipoksiden koruma potansiyeline sahip olduğunu doğruladı. Pancar kabuğunun ayrıca flavonoidler, furan ve 5-hidroksimetilfurfural, metil piruvat, furfural ve 2,3-dihidro-3,5- gibi antioksidan bileşenler içerdiği tespit edilmiştir. dihidroksi-6-metil-4H-Pyran-4-bir; bu bileşenler gelişmiş antioksidan kapasiteden ve proinflamatuar vasküler düz kas hücresi adezyon moleküllerinin baskılanmasından sorumludur. Pancar kabuğu, peroksidatif hücresel stresin dış uyaranı veya iç patolojik uyaranı söndürmek için antioksidan havuzları için bir uyarıcı olarak kullanılmıştır. Bulgularımız, pancar bileşenlerinin, vasküler hücre proliferasyonu ve anjiyogenez için faydalı olabilecek HUVEC'lerde metabolik stres ve inflamasyonu azaltmaya yardımcı olduğunu kanıtladı.

Bu makale Genes 2021, 12, 1380'den alınmıştır. https://doi.org/10.3390/genes12091380 https://www.mdpi.com/journal/genes