Kordon Kanı Tedavisinin Yaşlanma Karşıtı Etkisinin İzlenmesi İçin Biyoassay

İletişim:jerry.he@wecistanche.com

Sang-Hun Bae1*, Ala Jo1,2*, Jae Hyun Park1, Chul-Woo Lim1, Yuri Choi1, Juhyun Oh2, Ji-Min Park1, TaeHo Kong1, Ralph Weissleder2,3, Hakho Lee2, Jisook Moon1

1. Biyoteknoloji Bölümü, Yaşam Bilimleri Fakültesi, CHA Üniversitesi, Gyeonggi-do 13488, Kore Cumhuriyeti

2. Sistem Biyolojisi Merkezi, Massachusetts Genel Hastanesi, Harvard Tıp Okulu, Boston, MA 02114, ABD

3. Department of Systems Biology, Harvard Medical School, Boston, MA 02115, USA *Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur.

Sorumlu yazar: Hakho Lee, PhD. Sistem Biyolojisi Merkezi, Massachusetts General Hospital, 185 Cambridge St, CPZN 5206, Boston, MA 02114, ABD. 617-726-8226 hlee@mgh.harvard.edu Jisook Moon, Doktora. Biyoteknoloji Bölümü, Yaşam Bilimleri Fakültesi, CHA Üniversitesi, Pangyo-ro 335, Bundang-gu, Seongnam-si, Gyeonggi-do 13488, Kore Cumhuriyeti. 82-31-881-7210 jmoon@cha.ac.kr

© Ivyspring Uluslararası Yayıncı. Bu, Creative Commons Attribution (CC BY-NC) lisansı (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/) koşulları altında dağıtılan bir açık erişim makalesidir. Tüm hüküm ve koşullar için http://ivyspring.com/terms adresine bakın.

Alınan: 2018.10.04; Kabul Tarihi: 2018. 11. 18; Yayınlanma tarihi: 2019.01.01

Cistanche yaşlanma karşıtı etkiye sahiptir.

Soyut

Arka fon: Yaşlı hayvanları erken gelişim evresindeki plazmayla (örn. göbek kordonu plazması) tedavi etmek, nöronal ve bilişsel işlevlerin yaşa bağlı bozulmasını yavaşlatmak için etkileyici bir potansiyel gösterdi. Bununla birlikte, bu tür bulguları klinik gerçeklere çevirmek, tedavi etkinliğini değerlendirmek için etkili yollar gerektirir; ideal yöntemler minimal invaziv, seri testler için uygun, uygun maliyetli ve nicel olmalıdır.

yöntemler: İzlemek için yeni bir biyosensör yaklaşımı geliştirdikyaşlanma karşıtıterapi. İki temel sensör bileşeni geliştirdik: i) kan yoluyla taşınan bir metabolit, bir vekil yaşlanma belirteci olarak tanımlandı; ve ii) yerinde uygulamalar için kompakt ve uygun maliyetli bir tahlil sistemi geliştirildi. Yaşlı fareleri ya insan göbek kordonu plazması ya da tuzlu su ile tedavi ettik; fare plazmasında tarafsız metabolit profili, araşidonik asidin (AA)yaşlanma karşıtıEfekt. Daha sonra, doğrudan plazmadan AA tespiti için optimize edilmiş rekabetçi bir manyeto-elektrokimyasal sensör (cMES) uyguladık. Geliştirilen platform, AA'yı 1,5 saat içinde küçük hacimli plazmadan (0.5 µL) doğrudan tespit edebildi.

Sonuçlar: cMES testleri, AA seviyeleri veyaşlanma karşıtı etki: AA seviyeleri, yaşlanma ile azalırken, plazma ile tedavi edilen yaşlı farelerde arttı ve bu da gelişmiş öğrenme ve hafıza performansı gösterdi.

Sonuçlar: cMES platformu hem klinik öncesi hem de klinikyaşlanma karşıtıminimal invaziv, boylamsal tedavi gözetimi sağlayarak araştırma; bu kapasitelerin gelişimini hızlandıracakyaşlanma karşıtıterapiler, bireysel yaşam kalitesinin iyileştirilmesi.

Anahtar Kelimeler: Yaşlanma karşıtı, Araşidonik asit, Metabolit profili oluşturma, Manyeto-elektrokimyasal sensör, Biyosensör

giriiş

Yaşlanma, bilişsel dejenerasyon (örneğin, nörodejenerasyon, demans) ve diğer kronik hastalıklar (örneğin, kanser, kardiyovasküler hastalık, kas dejenerasyonu) için giderek artan bir şekilde klinik bir risk faktörü olarak kabul edilmektedir [1]. Genişleyen insan ömrü ve artan yaşlı nüfusla birlikte, yaşlanma mekanizmalarını aydınlatmak [1-3] ve yaşlanma süreçlerini yavaşlatmak ve hatta tersine çevirmek için terapötik stratejiler bulmak için önemli çabalar devam etmektedir [4]. Gerçekten de, hayvan çalışmalarından umut verici sonuçlar bildirilmiştir; genç farelerden plazma transfüzyonu alan yetişkin fareler, bilişsel işlevi, sinaptik plastisiteyi ve nöronal aktiviteyi yeniden kazandı [5]. Hızlı gelişmeyaşlanma karşıtıtedaviler ve bunların insan deneylerine çevrilmesi beklenmektedir [6]. Bununla birlikte, yöntemlerin insanlarla uygulanması (örneğin, invaziv beyin görüntüleme, kontrollü davranış gözlemi) ve subjektif (örneğin, hasta deneyimlerine ilişkin anketler) zor olduğundan, tedavi etkilerini izlemeye yönelik mevcut ölçümlerin pratikliği sınırlıdır. İlerlemek için bir anahtar şartyaşlanma karşıtıterapiler bu nedenle tedavi izleme için nicel, minimal invaziv analizlerin geliştirilmesinde yatmaktadır.

Metabolitlerin güçlü bir kaynak olacağını düşündük.yaşlanma karşıtıbiyobelirteçler. Metabolitler, bir organizmada temel bir fenotiptir ve diğer hastalıklar için tanısal biyobelirteçler olarak incelenmektedir [7]. Özellikle, yaşlanma tipik olarak organizmalardaki genel metabolit profillerini etkileyen metabolik değişiklikler veya işlev bozukluğu ile ilişkilidir. Bu nedenle, metabolitlerin bileşiminin ve/veya seviyelerinin izlenmesinin,yaşlanma karşıtıtedavi. Ayrıca, özellikle kan testleri şeklindeki metabolit tahlilleri, nicel ve minimal invaziv olabilir; bu değerler, farklı tedavi rejimlerini veya hasta gruplarını değerlendirmeyi ve seri örnekleme yoluyla (anti-)yaşlanma dinamiklerini izlemeyi kolaylaştıracaktır.

Burada izleme için yeni bir biyosensör stratejisini açıklıyoruz.yaşlanma karşıtıtedavi. İki temel unsur geliştirildi: i) kan yoluyla taşınan bir metabolit, bir vekil yaşlanma belirteci olarak tanımlandı; ve ii) rutin klinik ortamlardaki uygulamalar için hızlı, uygun maliyetli bir tahlil sistemi geliştirildi. Spesifik olarak, yaşlı farelerden oluşan bir kohortu (yaklaşık 2 yaşında) insan kordon kanından plazma ile tedavi ettik. Fare kanı üzerinde yapılan kapsamlı metabolomik analizler, yaşlandıkça seviyesi önemli ölçüde azalan araşidonik asidin (AA) tedavi edilen grupta tersine arttığını ortaya koydu. Bu gözlem, küçük moleküler hedefler için bir manyeto-elektrokimyasal sensör tasarlamamıza yol açtı: AA'nın manyetik boncuklar üzerinde yakalandığı ve daha yüksek hassasiyet için konsantre edildiği rekabetçi bir elektrokimyasal reaksiyonu optimize ettik. Geliştirilen platform, AA'yı 1,5 saat içinde küçük hacimli plazmadan (0,5 µL) doğrudan tespit edebildi. Bu platformu kullanarak, kandaki AA seviyeleri ile hayvanların motor görevdeki daha iyi performansı arasında pozitif bir ilişki kurabiliriz.

Sonuçlar

Yetişkin farelerin kordon kanı plazması ile tedavi edilmesi Şekil 1a, genel deney şemasını göstermektedir.

Bir ajan olarak, insan göbek kordonu kan örneklerinden elde edilen plazmayı kullandık. Önceki çalışmalar, genç fare plazması enjekte edilen yaşlı farelerin uzamsal hafıza fonksiyonunu geri kazandığını ve insan kordon kanı plazmasının sistemik uygulamasının yaşlı farelerde hipokampal bağımlı bilişi iyileştirdiğini gösterdi [5, 8]. Hücresel bileşenlerden yoksun olan plazmanın enjekte edilmesi, tür uyumsuzluğundan kaynaklanan bağışıklık reddi riskini en aza indirdi. Yaşlı fareler (başlangıç ​​yaşı, 18 aylık) randomize edildi ve kuyruk boşuna enjeksiyon (130 uL; ayrıntılar için bkz. Şekil S1) yoluyla plazma (bir tedavi grubu) veya salin tamponu (sahte bir grup) aldı. Pozitif kontrol olarak genç fareler (3 aylık) kullanıldı. Göbek kordonu kanından elde edilen plazma havuzlanmadı ve her fareye aynı donörden alınan plazma tekrar tekrar aşılandı (Şekil S1). 4-haftalık bir tedaviyi takiben, fareler bir davranış testine (yani rotarod) tabi tutuldu ve analizler için kan alındı.

Şekil 1. Deneysel tasarım. Genç (3-aylık), yaşlı (20- ve 23-aylık) ve plazma ile tedavi edilen yaşlı gruplara (20- insan kordon kanı plazması uygulandı. ve 23-aylık). Üç grup, motor koordinasyonu ve öğrenmeyi ölçmek için 2-deneme Rotarod testlerine tabi tutuldu. Hedeflenmemiş metabolit profili, üç gruptan alınan kan üzerinde gerçekleştirildi ve en çokyaşlanma karşıtı- ilgili yol biyoinformatik bir yaklaşımla belirlendi. Biyosensör, yolun en önemli metabolitini tespit etmek için geliştirildi.

Şekil 2. İnsan kordon kanı plazma tedavisi ile ilişkili metabolit biyobelirteçlerinin belirlenmesi. (A) Metabolit pertürbasyonunun global profili. Satırlar, LC/MS ve sütunlardan numunelere kadar özelliklere (m/z değeri ve alıkonma süresinin benzersiz bir kombinasyonu) karşılık gelir. Satırlar hiyerarşik olarak kümelenmiştir. (B) Boyutsal indirgeme için PCA'nın puan grafiği. Örnekler, ana bileşen (PC) 1 ve 2'ye karşı çizildi. Eksen açıklamalarının parantez içindeki değerleri, bu bileşenler tarafından açıklanan varyans oranlarıdır. Plazma ile tedavi edilen grubun genç gruba sahte gruptan çok daha yakın olduğu göz önüne alındığında, PC1 büyük olasılıkla yaşlanma karşıtı etkileri açıklar. (C) Yol zenginleştirme analizi. Metabolitler, ölçülen m/z değerlerinin moleküler kütle bilgileriyle eşleştirilmesiyle tanımlandı. Her daire bulunan belirli bir yolu temsil eder. Belirli bir yol için, dairenin x konumu veya boyutu, metabolitlerin göreceli-arasındaki merkeziliğine (yol etkisinin bir ölçüsü) ve y konumu veya rengine (kırmızı için daha düşük p değerleri ve mavi için daha yüksek) karşılık gelir. hangi metabolitlerin aşırı temsil edildiği. Baskın yollar daha yüksek x ve y değerlerine sahiptir. Buna göre, araşidonik asit (AA) metabolizması, durumu açıklamak için en olası yol olarak tanımlandı.yaşlanma karşıtı etkilerkordon kanı plazmasından.

Fare kan örneklerinde metabolik analizler

İlk önce fare plazmasında tarafsız bir küçük moleküllü metabolit profili gerçekleştirdik. Her üç fare grubundan alınan kan numuneleri sıvı kromatografisi ve kütle spektrometrisi (LC/MS) analizlerine tabi tutulmuştur. MAIT (metabolit otomatik tanımlama araç seti) ile m/z verilerini işledik ve ANOVA (8572 benzersiz m/z kombinasyonu ve alıkoyma süresi) aracılığıyla istatistiksel olarak önemli özellikleri belirledik (Şekil 2a). Metabolitlerin hiyerarşik kümeleme analizi (HCA) iki temel model ortaya çıkardı: i) metabolit profilleri yaşlı (tedavi edilmeyen) ve genç fareler arasında belirgin şekilde farklıydı; ve ii) plazma ile tedavi edilen yaşlı farelerin profili, genç farelerinkine daha yakındı.

Temel bileşen analizi (PCA), metabolomik verilerin doğal yapılarını ortaya çıkardı (Şekil 2b). Toplam varyasyonların yaklaşık yüzde 50'si birinci (PC1) ve ikinci ana bileşenler (PC2) tarafından açıklanabilirdi. Üç kohortun tümü (yani, genç, plazma ile muamele edilmiş ve sahte gruplar), farklılaşan grup sınıfları için biyolojik olarak ilgili özelliklerin tanımlandığını gösteren ayrı pozisyonlara yerleşti. İlginç bir şekilde, plazma ile tedavi edilen yaşlı grup, sahte gruptan genç gruba doğru hareket etti. Grup ayrımını ölçmek için iki temel bileşen üzerinde hiyerarşik kümelemeyi hesapladık. Dendrogramda, genç ve plazma ile muamele edilmiş gruplar, muamele edilmemiş gruba (3162.5) göre daha düşük bir farklılık seviyesinde (veya daha yüksek bir benzerlik seviyesinde, 1120.9) kümelenmiştir (Şekil S2). Bu sonuçlar, seçilen özelliklerin (Şekil 2a'daki değişkenler veya satırlar) yaşlanma ile ilgili metabolit biyobelirteçlerini çıkarmak için kullanılabileceğini veyaşlanma karşıtı. Kamusal alanda bir veritabanı kullanarak özellikleri bilinen metabolitlerle açıkladık [9].

KEGG (Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi) [10] haritalaması uygulayarak tanımlanan metabolitlerin fonksiyonlarını ve bağlantılarını daha da değerlendirdik. Belirli bir yol için, i) bir aday metabolitin aşırı temsilini ve ii) diğer metabolit çiftleri arasında anahtar bir ara düğüm olarak önemini (yani, arasındalık merkeziliği) [11] ölçtük (ayrıntılar için Yöntemlere bakınız). Araşidonik asit (AA) metabolizmasının en fazla temsil edilen yol olduğunu (Şekil 2c'deki en yüksek y değeri) ve bu yoldaki metabolitlerin iletişim yollarında (Şekil 2c'de daha yüksek x değerleri) bulunma eğiliminde olduğunu bulduk. bilgi akışını yönetir. AA metabolizmasındaki birçok metabolit arasından, biyobelirteç olarak AA'nın kendisini seçtik; yola bir başlangıç ​​girişi olarak, tek başına AA, diğer bozulmuş metabolitlerin bir temsilcisi olabilir.

Plazmada AA tespiti için rekabetçi manyeto-elektrokimyasal sensör (cMES)

Daha sonra, AA tespiti için hızlı, yerinde bir tahlil sistemi geliştirmek için yola çıktık. Manyeto-elektrokimyasal algılama teknolojisini kullanmayı seçtik [12-17]. Hedef zenginleştirme ve algılamayı tek bir platformda birleştirir: moleküler hedefleri yakalamak ve etiketlemek için manyetik boncuklar (MB'ler) kullanılır ve boncuk bağlı hedefler elektrokimyasal algılama yoluyla tespit edilir. Bu yaklaşımın birçok pratik avantajı vardır: i) doğal numuneler (plazma veya kan), numune saflaştırmasına gerek kalmadan doğrudan kullanılabilir; ii) tahlil, manyetik zenginleştirme ve enzimatik sinyal amplifikasyonu yoluyla yüksek algılama hassasiyetine ulaşır; iii) elektriksel algılama şemasına dayalı olarak, sensörler taşınabilir bir cihaz olarak kolayca küçültülebilir (Şekil 3a).

Bununla birlikte, manyeto-elektrokimyasal algılama yoluyla AA'nın saptanması teknik bir zorluk teşkil ediyordu; AA küçük bir molekül (~304.5 Da) olduğundan, bir çift AA-antikoru kullanan immünoanalizlerin uygulanması zordu. Bu nedenle, yalnızca tek bir AA antikoru gerektiren rekabetçi bir tahlil formatını (cMES; rekabetçi manyeto-elektrokimyasal sensör) araştırdık (Şekil 3b). Hedef yakalama için MB'leri AA antikorları (MBAb) ile kapladık. Ayrıca AA'yı oksitleyici bir enzim (yaban turpu peroksidaz, HRP) ile birleştirerek rakip bir ajan (AA-HRP) hazırladık. Spesifik olarak, bir hapten formu kullandık; AA, sığır serum albümini (BSA) üzerinde konjuge edildi ve ayrıca HRP'yi BSA taşıyıcısına konjuge etti (Şekil S3). cMES tahlili için kan örnekleri MBAb ve AA-HRP ile karıştırıldı. AA-HRP miktarı, MBAb'de (Yöntemler) AA-bağlama bölgelerini doyurmak için yeterliydi. Bu, numunelerdeki endojen AA miktarlarına bağlı olarak MB'lerde farklı HRP yüklemesine yol açacaktır. Sırayla bir kromojenik elektron aracısının (3,3',5,5'-tetrametilbenzidin, TMB) eklenmesi, düzlemsel bir elektrot tarafından okunan bir elektrik akımı üretti. AA yakalama ve TMB inkübasyonu için reaksiyon süresi, sinyal seviyesini en üst düzeye çıkarmak için optimize edildi (Şekil S4).

Şekil 3. AA testi için rekabetçi manyeto-elektrokimyasal sensör (cMES). (A) Cihaz şeması. cMES cihazının küçük bir ayak izi vardır ve

yerinde işlemler. (B) AA tespiti için rekabetçi bir elektrokimyasal deney tasarladık. Manyetik boncuklar (MBAb), AA'ya karşı antikorlarla konjuge edildi.

Kontrol numuneleri yalnızca AA-HRP içermiştir ve manyetik boncuklarla karıştırılmıştır. Test numuneleri manyetik boncuklar ve AA-HRP ile karıştırılmıştır. (C) Elektrik akımları

taşınabilir cMES okuyucu ile ölçülür. cMES testinde, artan AA konsantrasyonu [AA] ile mevcut büyüklük azalır. Kontrolden gelen sinyal

örnek, [AA]=0 ng/mL için taban çizgisini belirledi. Kontrol ve hedeflenen plazma numuneleri arasındaki akım farkı (∆I), analitik bir metrik olarak kullanıldı. (D)

Bilinen miktarlarda AA seruma eklendi ve cMES ile ölçüldü. Tespit sınırı ~ 126 ng/mL idi. (E) cMES ve ELISA için karşılaştırıldı

uyum. Her iki modaliteden elde edilen sonuçlar iyi bir uyum gösterdi (R2=0.959). Veriler, üçlü ölçümlerden elde edilen ortalama ± SEM olarak görüntülenir.

Şekil 4. Plazma örneklerinde AA ölçümleri. (A) Plazma enjeksiyonundan sonra fare AA seviyesinin zaman süreci analizi. Farelere (n=6) 13{{10}} μL plazma (AA konsantrasyonu=7,2 µg/mL) enjekte ettik ve 3, 7 ve 14'ten sonra fare kanı topladık günler. Daha sonra fare kanının AA seviyeleri izlendi. AA seviyeleri 3. günde önemli ölçüde arttı ve 7 gün sonra normal seviyeye döndü. *p < 0.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0.001.="" (b)="" fare="" plazma="" örnekleri="" test="" edildi.="" kontrol="" grubunda="" (n="5)," genç="" fareler="" (yaşlar,="" 5="" ve="" 8="" ay),="" sahte="" tedavi="" görmüş="" yaşlı="" farelerden="" (yaşlar,="" 20="" ve="" 23="" ay;="" n="8)" daha="" yüksek="" aa="" seviyelerine="" sahipti.="" plazma="" ile="" tedavi="" edilen="" grup="" (n="5)" için="" aa'da="" sürekli="" artış="" gözlendi.="" *p="">< 0.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0,001.="" (c)="" (b)'deki="" ile="" aynı="" kohortlardan="" alınan="" plazma="" numuneleri="" kütle="" spektrometrisi="" ile="" analiz="" edildi.="" aa="" seviyeleri,="" cmes="" ile="" ölçüldüğü="" gibi="" benzer="" bir="" eğilim="" gösterdi.="" *p="">< 0.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0,001.="" veriler="" ortalama="" ±="" sem="" olarak="">

Rekabetçi tahlilin bir sonucu olarak, daha yüksek plazma AA konsantrasyonları ([AA]) ile elektrik akımının büyüklüğü azaldı. Bu nedenle MBAb'yi yalnızca AA-HRP ile inkübe ederek bir kontrol örneği hazırladık. Kontrol örneği, sinyal farklılıklarını hesaplamak için üst taban çizgisini (yani, [AA]=0 ng/mL) ayarlamak için kullanıldı; kontrol ve plazma örneğinden gelen elektrik akımları ölçüldü ve net fark |∆I |=|Icontrol - Iplasma|elde edildi (Şekil 3c). Çok

diferansiyel ölçümler de ortak arka plan sinyali için telafi edildi.

Değişken miktarlarda AA eklenmiş numunelerin kullanıldığı titrasyon deneyi (Şekil 3d), saptama sınırını (LOD) ~125.9 ng/mL olarak ortaya çıkardı. Testin LOD'si, genç fare plazmasındaki (5 ay, n=2) tipik AA konsantrasyonundan (38 ug/ml) ~300-kat daha düşüktü. Bu sonuçlara dayanarak, bir tampon solüsyonu ekleyerek ilk plazma numunelerini (100-kat) seyrelttik (Yöntemlere bakınız). Spesifik olmayan bağlanmadan gelen sinyal, potansiyel olarak yüksek seyreltme faktöründen yararlanan, içsel bir arka plan seviyesine (~43 nA) yakındı. Test sonuçlarının geleneksel ELISA'dan alınan sonuçlarla eşleştiğini de doğruladık (R2=0.961, Şekil 3e). Ancak cMES tahlili, çoğunlukla hızlı bağlanma kinetiği nedeniyle ELISA'dan (4 saat) daha hızlıydı (1 saat); cMES'de, MB'ler tüm numune hacminde AA'yı yakalar (3-boyutlu difüzyon), oysa AA yakalaması, plaka tabanlı ELISA'da 1-boyutlu difüzyona dayanır.

Plazma ile tedavi edilen farelerde AA izleme

Tek bir plazma tedavisinden sonra farelerde AA seviyelerini analiz etmek için cMES uyguladık. AA, insan kordon kanında doğal olarak bulunduğundan, plazma enjeksiyonu fare AA düzeylerini ek olarak artıracaktır. Altı farklı insan kordon kanı plazmasından elde edilen ortalama AA konsantrasyonu, 7,2 ± 0,5 µg/mL (ortalama ± SEM) idi. Farelere (n=6) 130 µL insan kordon kanı plazması enjekte ettik ve AA seviyelerini izledik (Şekil 4a). Plazma enjeksiyonu kan AA düzeylerini hemen artırdı (3. gün; p < 0.01,="" diğer="" tüm="" zaman="" noktalarına="" kıyasla),="" ancak="" etki="" geçiciydi;="" aa="" seviyeleri="" tedaviden="" 7="" gün="" sonra="" normale="" döndü="" (p="0.34," plazma="" enjeksiyonundan="" önceki="" zaman="" noktasına="">

Daha sonra tam tedavi programından sonra plazma AA seviyelerini izleriz (Şekil S1). Üç farklı fare grubu kullanıldı: plazma ile tedavi edilen (n=8) ve sahte (n=8) yaşlı gruplar (20-23 aylık) ve genç kontrol grubu (<8 months="" old,="" n="5)." we="" used="" 0.5="" µl="" of="" mouse="" plasma="" for="" each="" measurement.="" the="" sham="" group="" showed="" lower="" aa="" level="" compared="" to="" the="" young="" group="" (p="0.003," fig.="" 4b).="" the="" plasma="" treated="" group,="" however,="" showed="" increased="" aa="" levels="" even="" after="" 1="" month="" after="" the="" treatment.="" the="" effect="" was="" sustained="" up="" to="" 4="" months="" post="" treatment;="" the="" plasma-treated="" group="" had="" higher="" aa="" level="" than="" the="" sham="" group="" (p="0.0003)." we="" also="" analyzed="" aliquots="" of="" samples="" via="" lc/ms="" (fig.="" 4c).="" the="" results="" from="" both="" assays="" were="" concordant,="" corroborating="" aa's="" value="" as="" a="">

Yaşlı farelerde bilişsel ve davranışsal iyileşmeye yol açan plazma tedavisi

Hayvan kohortlarının davranışsal fenotiplerini, özellikle motor öğrenme ve hafıza fonksiyonlarını değerlendirerek ayrıca değerlendirdik. Plazma veya sham tedavisinden 1 ve 4 ay sonra {{0}}deneme rotarod testleri yaptık (Şekil 5a); Bir farenin dönen bir çubuğa düşmeden önceki gecikme süresi (çalışma süresi), hayvanın motor performansını değerlendirmek için kullanıldı. Tedaviden 1 ay sonra (20-aylık), hem sahte hem de plazma ile tedavi edilen grupların gecikmesi, gençlerinkinden (5-aylık) önemli ölçüde daha düşüktü (p < 0.0001).="" )="" grubu="" (şekil="" 5b).="" bununla="" birlikte,="" plazma="" ile="" tedavi="" edilen="" grup,="" motor="" öğrenme="" ve="" hafızada="" kademeli="" bir="" gelişme="" gösterirken,="" sahte="" grupta="" aynı="" fakülte="" azaldı.="" aa="" seviyelerindeki="" değişiklikler,="" davranış="" değişikliklerini="" takip="" etti="" ve="" bu="" da="" erken="" bir="" gösterge="" olarak="" hizmet="">yaşlanma karşıtıtedavi etkisi (Şekil 5c).

Beyin dokusu analizleri (Şekil 5d, 5e), yaşlı farelerin (sahte grup) genç farelere göre subventriküler bölgede daha küçük DCX-pozitif hücre alanına sahip olduğunu gösterdi. Tersine, DCX-pozitif hücrelerin alanı plazma ile tedavi edilen hayvanda arttı ve değişmeden kaldı (p=0.04), bu da enjekte edilen kordon kanı plazmasının yaşlı beynin nörojenezini uyardığını gösterir. Sonuçlar, plazma tedavisinin, tedavi edilen grupta motor fonksiyonunda iyileşme ile sonuçlanan sürekli nörogenez üzerindeki potansiyel faydasını ortaya koymaktadır.

Tartışma

Gençleştirme terapilerindeki gelişmeler, aynı zamanda, tedavi etkinliğinin okunması için nesnel ve niceliksel bir ölçüme olan ihtiyacı da artırmaktadır. Bu nedenle, çalışmamızı yaşlanmanın fenotipik özelliklerini en iyi şekilde açıklayabilen moleküler biyobelirteçleri belirlemek için tasarladık veyaşlanma karşıtıtedavi. Hayvan deneylerimiz aşağıdaki gözlemlere yol açmıştır: i) genç ve yetişkin fare kohortlarının metabolit profilleri açıkça farklıdır; ve ii) yaşlı farelere insan kordon plazması enjekte etmek, metabolit modellerini genç farelerinkine daha yakın bir şekilde değiştirir. İlginç bir şekilde, araşidonik asidi (AA) en etkili vekil biyobelirteç olarak bulduk.yaşlanma karşıtıtedavi; AA metabolizması hem genç hem de plazma ile tedavi edilen farelerde oldukça düzensizdi ve linoleik asit metabolizması gibi diğer metabolik yolaklarla etkileşimde anahtar roller oynadığı bulundu [10, 18].

Rutin araştırma ve klinik ortamlarda AA tespitini kolaylaştırmak için hızlı, taşınabilir bir sensör sistemi (cMES) geliştirdik. Doğrudan plazma örneklerinden küçük moleküler hedefleri (yani metabolitleri) tespit etmek için immünomanyetik zenginleştirme ile rekabetçi bir tahlil şemasını özel olarak entegre ettik. Bu kombinasyon aşağıdaki avantajları sağlar. (i) Manyetik boncuklar tüm numune hacminde (3-boyutsal difüzyon) AA'yı yakaladığından, tahlil hızlı bağlanma kinetiğinden yararlanır. (ii) Tahlil işlemleri (örneğin yıkama adımları), boncuk toplama için kullanılan harici mıknatıslarla basitleştirilmiştir. (iii) AA'ya bağlı boncukları algılama elektrotunun yakınında manyetik olarak konsantre ederek, genel analitik sinyal geliştirilebilir (~ yüzde 72) [12]. Gerçekten de, cMES testinin kullandığını gösterdik.<1 µl="" of="" plasma="" with="" the="" total="" assay="" time="" within="" 1.5="" hour.="" both="" cmes="" and="" mass="" spectrometry="" consistently="" showed="" that="" plasma="" aa="" levels="" decrease="" with="" aging,="" but="" that="" they="" reversely="" increase="" with="" cord-plasma="" treatment.="" importantly,="" increases="" in="" aa="" levels="" could="" be="" an="" early="" indicator="" of="" improved="" cognitive="" functions="" in="" treated="" animals.="" these="" results="" highlight="" the="" utility="" of="" aa-cmes;="" with="" minimally="" invasive="" blood="" draw,="" individual="" patients="" can="" be="" monitored="" in="" a="" serial="" fashion="" to="" better="" assess="" treatment="">

Şekil 5. Davranışsal ve moleküler testler. (A) 2-deneme Rotarod testleri, plazma enjeksiyonundan 1 ve 4 ay sonra yapılmıştır. (B) Plazma ile tedavi edilen grup

motor koordinasyonda ilerleyici gelişme gösterdi; performans sonunda genç grubun performansına yakındı (3 ayda ikinci deneme). Sham grubunun koşma süresi yaşlanma ile azaldı. *p < 0.05;="" **p="">< 0.01.="" (c)="" plazma="" ile="" tedavi="" edilen="" grup="" için,="" aa="" seviyelerindeki="" artış,="" motor="" fonksiyon="" iyileşmesinden="" önce="" geldi.="" *p="">< 0.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0,001.="" (d)="" subventriküler="" bölgedeki="" beyin="" hücreleri,="" bir="" nörogenez="" belirteci="" olan="" doublecortin="" (dcx)="" için="">

Ölçek çubuğu 50 µm'dir. Sham grubunun, subventriküler bölgede genç farelere göre önemli ölçüde daha küçük DCX-pozitif hücre alanına sahip olduğuna, buna karşın plazma ile tedavi edilen hayvanda alanın arttığına ve değişmeden kaldığına dikkat edin. (E) Görüntüdeki (D) DCX-pozitif hücrelerin alanı ölçüldü. *p < 0.05;="" ***p=""><>

AA'nın kas büyümesini ve beyin gelişimini desteklediği gösterilmiştir [19, 20]. Diğer raporlar da AA'nın potansiyel faydalarını vurguladı.yaşlanma karşıtı[21, 22]. Mevcut çalışma bu bulgularla uyumludur, ancak kapsamı AA seviyeleri ile ilişkisel bir ilişki kurmakla sınırlıdır.yaşlanma karşıtıfenotipler. Bununla birlikte, seri AA izlemesi, plazma ile tedavi edilen farelerde AA artışlarının, transfüze edilmiş plazmadan değil, endojen kaynaklardan muhtemel olduğunu göstermiştir. Ayrıca, sürdürülebiliryaşlanma karşıtıEtkiler, plazma tedavisinin bitiminden 4 ay sonra bile alıcı farelerde gözlenmiştir. Motor öğrenme ve hafıza fonksiyonları gelişti; ve beyindeki nöronal öncü hücrelerin sayısı arttı. Bu gözlemler, plazma ile tedavi edilen farelerde fizyolojik değişiklikleri kuvvetle önerir; kesin mekanizma henüz aydınlatılamamıştır.

Bu çalışmanın diğer bazı sınırlamaları gelecekteki araştırmalarda ele alınmalıdır. İlk olarak, daha yüksek doğruluk için cMES testinin rafine edilmesi gerekir. Özellikle, gerçek negatif numunelerin olmaması nedeniyle (yani, herhangi bir endojen AA içermeyen kan numuneleri), spesifik olmayan bağlanmadan gelen sinyalleri hesaba katmak zordu. Örnekleri 100-kat oranında seyrelttiğimiz için kan matrislerinin etkisi göz ardı edilebilir. Ancak böyle bir varsayım, AA eksikliği olan bir fare modelinden [23] veya AA'nın immüno-tüketimi yoluyla hazırlanabilen AA silinmiş plazma örnekleri kullanılarak doğrulanmalıdır. İkinci olarak, basitlik için AA metabolizmasında tek bir metaboliti tespit etmeye odaklandık, ancak bu yaklaşım, belirli bir yoldaki metabolitler arasındaki etkileşimler gibi biyolojik bağlamı görmezden gelebilir. Bir metabolit panelinin dahil edilmesi, metabolik bozulmaları daha iyi yakalayacak ve ayrıca teşhis doğruluğunu artıracaktır. cMES, küçük numune miktarları tüketirken çeşitli belirteçleri tespit etmek için kolayca ölçeklenebilir. Üçüncüsü, mevcut bulguları insanlara enterpolasyon yapmak zor olacaktır. Fareler ve insanlar benzer metabolik yolları paylaşsalar da, fareler insanlardan 7-kat daha yüksek metabolik hıza sahiptir [24]. İnfüzyon için optimal plazma dozlarını belirlemek ve biyobelirteçler için temel çizgileri belirlemek için insan denemeleri gereklidir; hayvan çalışmaları ile bilgilendirilmiş, bu tür insan çalışmaları planlıyoruz. Bu çabalar kalkınmayı hızlandıracak.yaşlanma karşıtıterapiler, bireysel yaşam kalitesini iyileştirmenin yanı sıra toplumsal yükleri azaltma.

yöntemler

Deneysel tasarım

Plazma, doğumda toplanan insan göbek kordonu kanından ayrıldı. Kordon kanı plazması yaşlı farelere (18-aylık) ve sahte kontrole (18-aylık) ve genç farelere (3-aylık pozitif olarak) intravenöz infüzyonla uygulandı. kontrol) salin enjekte edildi. Transplantasyondan 1 ve 4 ay sonra, motor koordinasyonu ve uzun süreli belleği değerlendirmek için 2-deneme rotarod testleri yapıldı (Şekil S1). Hedeflenmemiş metabolit profili, üç gruptan alınan kan üzerinde gerçekleştirildi ve biyoinformatik analiz,yaşlanma karşıtıilgili yol (Araşidonik asit metabolizması). Biyosensör, kanda dolaşan araşidonik asidi kolay ve verimli bir şekilde tespit etmek için geliştirilmiştir.

Kordon kanı örneği hazırlama

İnsan kordon kanı, CHA Genel Hastanesinin (Seul, Kore, IRB No. CHAMC-2015- 08-130-009) Kurumsal İnceleme Kurulu altında toplanmıştır. 4 donörden insan kordon kanı bağışlandı ve adeninli (CPDA-1) antikoagülanlı sitrat-fasfat-dekstroz ile tedavi edildi. İnsan kordon kanı plazması, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 2,000 g'de santrifüj edilerek izole edildi. İzole plazma örnekleri -80 derecede saklandı ve oda sıcaklığında tek bir donma-çözülme döngüsü ile kullanıldı.

Hayvan deneyleri

Hayvan protokolleri, CHA Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Metabolik bozulmaları ve yaşlanma ile ilişkili davranışsal fenotipleri değerlendirmek için 18-aylık dişi C57BL/6 farelerini kullandık veyaşlanma karşıtı. Pozitif kontroller, 3-aylık dişi C57BL/6 fareleriydi. Tüm fareler, standart 12 saatlik aydınlık-karanlık döngüsünde oda sıcaklığında yetiştirildi. Yetişkin fareler için kordon kanı plazması veya salin (130 uL), 4 hafta boyunca 12 kez intravenöz olarak enjekte edildi. İzole edilmiş insan kordon kanı plazması havuzlanmadı ve belirli bir hayvan, aynı donörden kordon kanı plazması aldı. Her deneyde kullanılan hayvan sayısı, ilgili yöntem bölümlerinde açıklanmıştır. Plazma, santrifüjleme yoluyla toplandı (3,000 g, oda sıcaklığında 15 dakika).

Metabolit toplama ve veri analizi

Kan yoluyla taşınan metabolitlerin profilini çıkarmak için, farelerden belirlenen zaman noktalarında kardiyak ponksiyon yoluyla kan alındı: genç grup (3-aylık, n=10), sahte grup ({{ 4}}aylık, n=10; 23-aylık, n=12), plazma ile tedavi edilen grup (20-aylık, n {{13 }}; 23-aylık, n=5). Kan numuneleri, bir sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi (LC-MS) sistemi (Agilent) kullanılarak analiz edildi. LC/MS dosyalarını standart bir mzXML formatına (ProteoWizard) [25] dönüştürdük ve daha sonra bunları özellik tespiti, istatistiksel analiz ve metabolit tanımlaması için MAIT (metabolit otomatik tanımlama araç seti) [26] kullanarak işledik. İstatistiksel olarak önemli özellikler (yani iyonize ve/veya parçalanmış metabolitler), varyans analizi (ANOVA) yoluyla tanımlandı. Bu özellikler, kütle spektral iyonunun kütle/yük oranına (m/z toleransı 0.005) dayalı olarak metabolom veri tabanındaki [9] olası tüm olası metabolitlerle eşleştirildi. Hiyerarşik kümeleme analizi yoluyla küresel metabolit değişikliklerini ve temel bileşen analizi (PCA) yoluyla metabolomik verilerin doğal yapılarını karakterize ettik. PCA ve hiyerarşik kümeleme gibi denetimsiz öğrenmeye fare başına iki veya üç teknik kopya (teknik varyasyonun biyolojik varyasyondan çok daha küçük olmasını sağlayarak) dahil edildi. Temel bileşenler (HCPC) üzerinde hiyerarşik kümeleme, bir R paketi olan FactoMineR tarafından gerçekleştirilmiştir [27]. Fonksiyonel bir analiz için, yaşlanma ve plazma tedavisi ile bozulma olasılığı en yüksek metabolik yollar KEGG yol analizi (MetaboAnalyst 3.0) [28] ile belirlendi. Belirli KEGG yollarında eşleşen metabolitlerin aşırı temsilini ölçmek için hipergeometrik dağılım kullanıldı.

İmmünomanyetik boncukların hazırlanması

Epoksi gruplarıyla (Dynabeads M-270 Epoxy, Invitrogen) kaplanmış manyetik boncuklar (5 mg), 100 uL 0.1 M sodyum fosfat çözeltisi içinde süspanse edildi. Araşidonik aside karşı 100 mikrogram antikor (Biomatik) eklendi ve iyice karıştırıldı. Yüz mikrolitre 3 M amonyum sülfat çözeltisi ilave edildi ve karışım, oda sıcaklığında 2 saat inkübe edildi ve daha sonra yavaş tilt rotasyonu ile gece boyunca 4 derecede inkübe edildi. Konjugasyon reaksiyonu pH=7.4'te gerçekleştirildi. Bu işlemler, epoksi (boncuk) ve amin (antikor) grupları arasında, daha önce antikor-boncuk konjugatlarını pH zorluklarına maruz bırakarak doğruladığımız kovalent bağ oluşumunu indükler [29]. Boncuk başına ortalama 2.4x104 antikor immobilize edildi. Antikorla konjuge manyetik boncuklar kalıcı bir mıknatısla ayrıldı, iki kez PBS solüsyonu ile yıkandı ve yüzde 1 BSA içeren 200 uL PBS içinde yeniden süspanse edildi. Boncuklar bir aya kadar 4 derecede saklanmıştır.

Araşidonik aside HRP konjugasyonu

HRP daha sonra indirgeyici aminasyon kimyası yoluyla BSA'ya konjuge edildi. Spesifik olarak, 100 µg BSA-konjuge AA (RPU51089, Biomatik), 0,5 mL 0,2 M karbonat-biyokarbonat tamponu (pH 9,4) içinde çözülmüş ve bir miligram liyofilize EZ-link'e eklenmiştir. Plus Aktive Peroksidaz (Thermo Scientific) ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildi. Daha sonra üzerine 10 µL sodyum siyanoborohidrit (Thermo Scientific) eklendi ve karışım oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edildi. Son olarak, 20 µL Quenching buffer (Thermo Scientific) ilave edildikten sonra oda sıcaklığında 15 dakika inkübasyon yapıldı. Jel elektroforezi ve protein bant analizi, BSA-AA'ya HPR konjugasyonunu doğruladı (Şekil S3a). HRP ile konjuge AA toplandı ve Amicon Ultra 100K santrifüj filtresi (Millipore) ile konsantre edildi. Kalan peroksidaz ve BSA-AA, dört kez PBS ile yıkandı.

Plazma örneklerinde AA'nın elektrokimyasal tespiti

AA'nın elektrokimyasal tespiti için, genç (n {{0}}), sahte (n=8) ve plazma ile tedavi edilen gruplardan (n=5 1 ay süreyle) kan alındı. ve 3 ay için n=5). Fare plazma örnekleri (0,5 uL), PBS içinde yüzde 1 BSA'nın 50 uL'si içinde seyreltildi (x100-kat seyreltme) ve immünomanyetik boncuk çözeltisi (50 uL) ve HRP-konjuge AA çözeltisi ile karıştırıldı (50 uL). AA-HRP miktarı, manyetik boncuklardaki bağlanma bölgelerini doyurmaya yetecek kadar büyüktü. Test başına yaklaşık 8.4 × 107 boncuk kullandık, bu da 2.0 × 1012 AA bağlama bölgeleri sağladı. AA-HRP miktarı ~1.7x1013 idi; AA-HRP ve bağlanma bölgeleri arasındaki oran ~8:1 idi. Karışım, yavaş tilt rotasyonu ile 1 saat oda sıcaklığında inkübe edildi. Kontrol boncuğu, PBS (50 uL) içinde yüzde 1 BSA'nın immünomanyetik boncuk çözeltisi (50 uL) ve HRP-konjuge AA çözeltisi (50 uL) ile karıştırılmasıyla hazırlandı. Reaksiyona giren tüm boncuklar kalıcı bir mıknatısla ayrıldı ve iki kez 80 uL PBS (yüzde 1 BSA) ile yıkandı. Son olarak, boncuklar 7 uL PBS içinde yeniden süspanse edildi. Hazırlanan boncuk solüsyonu ve 20 µL TMB solüsyonu (Biomatik) elektrotun üzerine yüklendi. 6 dakika sonra kronoamperometri ölçümüne başlandı. Minyatür bir elektrokimyasal sensör kullandık (AcurreHealth Inc. tarafından geliştirilen bir prototip sistem). 40-45 s aralığındaki mevcut seviyelerin ortalaması alındı. Plazmadaki tahmini orijinal AA konsantrasyonlarını raporlamak için dönüşüm faktörünü (x100) kullandık.

Enzim bağlantılı immünosorbent tahlili (ELISA)

ELISA deneyleri, üretim yönergelerine göre fare araşidonik asit (AA) ELISA kiti (Biomatik) kullanılarak yapıldı. Her kuyucuğa seri olarak seyreltilmiş AA ilave edildi ve HRP-konjuge AA ile 37 derecede 40 dakika inkübe edildi. Dört kez yıkama tamponu ile yıkandıktan sonra TMB solüsyonu eklendi ve 20 dakika inkübe edildi. Durdurma solüsyonu eklenerek renk gelişimi durduruldu. Absorbans, mikroplaka okuyucu (Tecan) kullanılarak 450 nm'de okundu.

Rotarod testi

Kong ve arkadaşlarının Rotarod testini değiştirdik. [30] lokomotor koordinasyonu değerlendirmek için. 3-cm çapında çubuklu rotarod 4 rpm'de başladı ve 5 dakika boyunca 30 saniyede 4 rpm hızlandı. Fareler çubuğa yerleştirildi ve farelerin çubuktan düşmeleri için geçen süre ölçüldü. Her fareye günde 3 deneme verildi ve her günün koşu süreleri, eğitim sürelerinin ortalaması olarak hesaplandı. İlk rotarod testi plazma tedavisinden 1-ay sonra yapıldı: genç grup (n=29), sahte grup (n=17), plazma ile tedavi edilen grup (n {{ 11}}). Plazma tedavisinden 4- ay sonra bir yeniden eğitim seansı başlatıldı. Aşırı eğitimden kaçınmak için 2 gün boyunca yeniden eğitim yapıldı. Diğer prosedür ilk seansla aynıydı.

Beyin dokusu görüntüleme

İnsan kordon kanı plazması veya salin enjeksiyonundan 1 ay (n=4) ve 4 ay (n=3) sonra, hayvanlara ötenazi uygulandı ve ardından yüzde 4 paraformaldehit (PFA) ve PBS ile perfüze edildi. sol ventrikül. Genç (n=5) ve sahte gruplar (n=4) kontrol olarak kullanıldı. Onların beyinleri

ekstrakte edilmiş ve kriyo-korumalı. Her beyin, 30 um kalınlığında bir kriyotom üzerinde kesildi. İle

immünohistokimyayı gerçekleştirin, spesifik olmayan bağlanma, 40 dakika boyunca 0%0,3 Triton X-100 içinde yüzde 5 normal keçi serumu ile bloke edildi. Doublecortin'e karşı birincil antikor (DCX; 1:400, Cell Signaling, #4604S) gece boyunca 4 derecede uygulandı ve ardından yıkama için PBS kullanıldı [31]. DCX'in saptanması için ikincil antikor Alexa Fluor 488 (1:2000, Invitrogen, #A11008) kullanıldı. Görüntüler bir floresan mikroskobu (Nikon Eclipse 80i) kullanılarak alındı ​​ve Image J [32] kullanılarak analiz edildi.

istatistiksel analiz

İstatistiksel analiz, R temel işlevleri ve lme4, her iki Lineer için bir R paketi kullanılarak yapıldı.

Karma Etki Modelleri veya Genelleştirilmiş Doğrusal Model

(GLM) ve ardından bir LSD post-hoc testi [33]. Veriler ortalama ± standart hata olarak sunulmuştur ve < 0.05="" p="" değeri="" anlamlı="" kabul="">

Ek materyal

Ek rakamlar.

http://www.thno.org/v09p0001s1.pdf

Teşekkür

Minyatürleştirilmiş elektrokimyasal sensörü sağladığı için AccureHealth Inc.'e teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Kore Hükümeti (MSIT) (2017M3A9B4025699) tarafından finanse edilen Bilgi ve İletişim Teknolojilerini Geliştirme Enstitüsü (IITP) hibesi tarafından desteklenmiştir.

Rekabet İlgi Alanları

Yazarlar, rekabet eden bir çıkar olmadığını beyan etmişlerdir.