CaWRKY30, Savunmayla İlgili Genleri Modüle Etmek Yoluyla Ralstonia Solanacearum Aşılamasına Karşı CaWRKY40'ı Hedefleyerek Biber Bağışıklığını Pozitif Düzenler Bölüm 1

Soyut:

WRKY transkripsiyon faktörleri (TF'ler) ağı, bitkilerin bağışıklık düzenlemesinde kritik bir rol oynayan WRKY TF'lerin alt kümesinden oluşur. Bununla birlikte, özellikle biber (Capsicum annum L.) gibi model olmayan bitkilerde WRKY TF ağının işlevleri belirsizliğini koruyor. Bu çalışma, biberin Ralstonia solanacearum enfeksiyonuna karşı bağışıklığı için grup III Pepper WRKY proteininin bir üyesi olan CaWRKY30'u fonksiyonel olarak karakterize etti. CaWRKY30 çekirdekte tespit edildi ve transkripsiyonel ekspresyon seviyeleri, R. solanacearum aşılama (RSI), yapraktan uygulama etilen (ET), absisik asit (ABA) ve salisilik asit (SA) ile önemli ölçüde yukarı doğru düzenlendi. CaWRKY30'un virüs kaynaklı gen susturması (VIGS), biberin RSI'ye karşı savunmasızlığını artırdı.

Ek olarak, CaWRKY30'un VIGS tarafından susturulması, RSI tarafından tetiklenen HR benzeri hücre ölümünü ve CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1, CaHIR1 ve CaWRKY40 gibi aşağı regüle edilmiş savunma ile ilişkili işaret genlerini riske attı. Tersine, CaWRKY30'un biberde geçici aşırı ekspresyonu, HR benzeri hücre ölümünü ve yukarı regüle edilmiş savunma ile ilgili marker genlerini tetikledi. Ayrıca, CaWRKY30'un geçici aşırı ekspresyonu, CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 ve CaWRKY40'ın transkripsiyon seviyelerini yukarı regüle etti.

Öte yandan, CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 ve CaWRKY40'ın geçici aşırı ekspresyonu, CaWRKY30'un transkripsiyonel ekspresyon seviyelerini yukarı regüle etti. Sonuçlar, yeni karakterize edilen CaWRKY30'un, biberin ET, ABA ve SA gibi fitohormonlar tarafından sinerjik olarak aracılık edilen sinyalleme tarafından yönetilen ve CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 ve CaWRKY40'tan oluşan WRKY TF ağlarına transkripsiyonel olarak asimile olan Ralstonia saldırısına karşı bağışıklığını pozitif olarak düzenlediğini önermektedir. . Toplu olarak, verilerimiz, biberin bağışıklığı ile RSI'ye tepki arasındaki karışmanın altında yatan mekanizmanın açıklanmasını kolaylaştıracaktır.

Transkripsiyon faktörleri, gen ekspresyonunun düzenlenmesini ve spesifik hücre tiplerinin oluşumunu kontrol ederek bağışıklık sisteminde önemli bir rol oynar. Transkripsiyon faktörleri ve bağışıklık arasındaki ilişki aşağıdadır:

1. Transkripsiyon faktörü - NF-κB: NF-κB, T hücrelerinin ve B hücrelerinin adaptif immün yanıtlarının düzenlenmesinde yer alan anahtar bir transkripsiyon faktörüdür. NF-κB aktivasyonu, enflamatuar yanıtı, bağışıklık tepkisini ve hücre apoptozunu destekleyebilir.

2. Transkripsiyon faktörleri—STAT'lar: STAT'lar, taşıyıcı sinyalleşmeye ve hücresel tepkilere aracılık eden transkripsiyon faktörleridir. STAT'lar aktive edilebilir, aktive edilmiş T hücreleri ve B hücrelerinde kilit bir rol oynayabilir ve immün hücre proliferasyonu, farklılaşması ve aktivasyonu gibi süreçlere katılabilir.

3. Transkripsiyon faktörü - AP-1: AP-1, çeşitli hücresel fonksiyonların ve bağışıklık tepkilerinin düzenlenmesinde yer alan bir transkripsiyon faktörleri ailesidir. AP-1 aktivasyonu, hücre proliferasyonu, farklılaşması ve transformasyonu gibi süreçleri teşvik etmenin yanı sıra antiviral ve immün yanıtları sürdürebilir.

4. Transkripsiyon faktörleri—CEBP'ler: CEBP'ler, çeşitli doku hücrelerinde CEBP , , , vb. dahil olmak üzere geniş bir transkripsiyon faktörleri ailesidir. Bağışıklık sisteminde CEBP, makrofajların aktivasyonu ve sitokinlerin salınmasının yanı sıra B hücrelerinin ve T hücrelerinin farklılaşması ve aktivasyonunda yer alır.

Birlikte ele alındığında, transkripsiyon faktörleri, farklı hücre tipleri ve fonksiyonlarında bağışıklık sistemi aktivitesinin düzenlenmesine ve sürdürülmesine katılarak bağışıklıkta önemli bir rol oynar. Bu nedenle günlük hayatımızda bağışıklığın geliştirilmesine de dikkat etmemiz gerekiyor. Cistanche bağışıklığı artırabilir ve etteki polisakkaritler, insan bağışıklık sisteminin bağışıklık yanıtını düzenleyebilir, bağışıklık hücrelerinin stres yeteneğini geliştirebilir ve bağışıklık hücrelerinin sterilizasyon etkisini artırabilir.

Cistanche'nin sağlığa faydalarına tıklayın

anahtar kelimeler:

acı biber (Capsicum annuum); Ralstonia solanacearum; CaWRKY30; WRKY TF'ler.

1. Giriş

Bitkiler, hareketsiz yapıları nedeniyle yaşamları boyunca sıklıkla çeşitli biyotik ve abiyotik streslere maruz kalırlar [1,2]. Bitkiler, büyük ekolojik ve çevresel kısıtlamalardan kaynaklanan tekrarlanan seçim baskısına yanıt olarak çeşitli savunma mekanizmaları geliştirmiştir. Farklı transkripsiyonel faktörler (TF'ler), bu klasik savunma mekanizmalarını transkripsiyon düzeyinde düzenlemek için karmaşık transkripsiyonel ağlar geliştirmek üzere birbirine bağlanır [3,4]. Çeşitli streslere karşı savunma reaksiyonları, bitkiler için enerji harcaması ve gelişimi açısından kritik olduğundan, uygun şekilde senkronize edilir ve kontrol edilir [5]. Savunma mekanizmaları, alışmalarını etkileyen çeşitli çevresel koşullar nedeniyle farklı bitki türlerinde değişiklik gösterebilir [6-8].

Dolayısıyla model fabrikalarda kullanılan savunma sistemi, model olmayan tesislerde tam anlamıyla uygulanamaz. Bu nedenle, bitkilerin savunma sistemleri son yıllarda birincil odak noktası olmuştur; ancak, bu çalışmalar daha çok model bitkiler, yani Arabidopsis thaliana ve pirinç (Oryza sativa L.) üzerinde yoğunlaşmıştır. Bununla birlikte, bitkilerin çeşitli streslere tepkisini düzenlemek için bu transkripsiyonel komplekslerin fonksiyonel senkronizasyonu, özellikle model olmayan bitkilerde yeterince araştırılmamıştır.

WRKY proteinleri, bitkilerdeki en büyük TF ailesini içerir. WRKY TF'leri, bir veya iki WRKY alanı ve N-terminalinde yaygın olarak WRKYGQK dizisini ve ardından C2HC veya C2H2 çinko parmak motifini içerir [4,9,10]. WRKY proteinleri, birkaç WRKY alanı ve çinko-parmak motifinin yapısına dayalı olarak filogenetik olarak üç ana gruba (yani, gruplar I-III) ayrılır.

WRKY TF'lerin II. Grubu yine beş alt gruba (IIa, IIb, IIc, IId ve IIe) bölünmüştür [11–13]. WRKY üyeleri, ikinci b ipliğindeki WRKY GQK motifi ile DNA'nın ana oluğuna [14] dikey olarak özel bir kama sokarak çeşitli hedef genlerin promotör bölgelerinde bulunan W-kutularına [TTGAC(C/T)] bağlanır; hedef genlerin ekspresyonunun transkripsiyonel modülasyonu [14-16]. WRKY'ler, tohum dinlenmesi, tohum çimlenmesi, yaşlanma ve tohum gelişimi dahil olmak üzere bitkilerde çeşitli biyolojik sistemlerde yer almıştır. Benzer şekilde, bunlar ayrıca biyotik ve abiyotik streslere yanıtta ve hedef genlerinin anahtarlama transkripsiyonunda yer alırlar [17-20].

Sadece bir stres tarafından transkripsiyonel olarak indüklenen bir WRKY TF grubunun veya bir WRKY TF'nin birkaç stresi modüle ettiği bildirilmektedir. W-kutuları promotör bölgeleri içinde zenginleştirilmiştir [21–24]. Bu çalışmalar, belirli bir strese veya iki veya daha fazlasının bir kombinasyonuna yanıt olarak ortaya çıkan WRKY ağlarının varlığını göstermektedir. WRKY proteinlerinin ve altta yatan mekanizmaların biyotik ve abiyotik streslere yanıttaki rolü son on yılda sıklıkla araştırılmıştır; bununla birlikte, bu çalışmaların vurgusu, temel olarak model bitkilerde, örneğin A. thaliana ve O. sativa'daki bir strese yanıt olarak bir gen üzerindeydi. Son zamanlarda, çeşitli bitki türlerinden WRKY TF'lerin yakın homologları arasında önemli bir fonksiyonel farklılık öne sürülmüştür [24,25]. Capsicum annuum L. gibi model olmayan bitkilerde WRKY'lerin ve WRKY ağının tekli veya kombine baskılara tepki olarak işlevleri şimdiye kadar yeterince araştırılmadı.

Biber dünya çapında ekonomik önemi ile bilinir. Ilıman mevsimlerde yaylalarda ekilir [26,27]. Biber, sırasıyla Phytophthora capsicum ve Ralstonia solanacearum gibi bakteriyel patojenlerin neden olduğu biber yanıklığı ve bakteriyel solgunluk gibi çeşitli toprak kaynaklı hastalıklara maruz kalmaktadır [28,29]. Bu patojenlerin çakışması, yüksek sıcaklıklar ve yüksek nem (HTHH) altında biber üretimi üzerinde yıkıcı etkiler yaratır. HTHH, biberin R proteininin aracılık ettiği bağışıklığını bozar ve patojen büyümesini ve gelişimini hızlandırır. Ayrıca, patojen saldırısı ve HTHH aynı anda biber üzerinde geçmişte biberin evrimini etkileyen doğal seçilim baskısı uygular [30-32]. Tersine, patojen enfeksiyonu ve HTHH'nin aynı anda meydana gelmesi, A. thaliana ve O. sativa gibi model bitkilerin evrimini etkilemeyebilir. Bu nedenle biber, biyotik veya abiyotik streslere, yani RSI veya HTHH'ye karşı bağışıklık ile ilgili araştırmalar için daha uygun görünmektedir.

Ralstonia solanacearum biber, domates, patates vb. gibi çok sayıda üründe bakteriyel solgunluğa neden olur. Toprak kaynaklı bir gram-negatif proteobakteridir [33]. Ksilem dokularında hızlı koloniler oluşturur, bu da istila edilmiş bitkilerde bakteriyel solgunluk hastalığına yol açar [34].

Bitki türlerinin biyotik ve abiyotik strese tepkilerinin fitohormonlar tarafından düzenlendiği bilinmektedir [35]. Fitohormonlar, bitki büyümesinin düzenlenmesi, bitki üremesi ve hayatta kalmasıyla ilgili küçük moleküllerdir. Salisilik asit (SA) ve jasmonik asit (JA), bitki türlerinin bağışıklık tepkileri için kritik öneme sahiptir. Bu ikisi, bitkilerin patojenlere karşı bağışıklık tepkilerinin kritik temelleri olarak kabul edilir. SA'nın biyosentezi ve sinyali, biyotrofik patojenlere karşı savunma için hayati önem taşırken, JA nekrotrofik patojenlere karşı savunma sağlar [36,37]. Etilen (ET), çeşitli bitki-patojen etkileşimlerine karşı savunma tepkilerinde yardımcı olur [37].

Subtropikal bölgelerdeki çeşitli yerli biber çeşitleri, HTHH altında bile hızlandırılmış hastalık direnci göstermektedir [38]. Isı ile ilişkili cis-element HSE genellikle SA, JA, ET, ABA dahil fitohormonlarla veya bitki bağışıklığında yer alan çoğu MAPK ve CDPK'nin promotör bölgelerinde patojenle ilgili cis-elemanları ile bir arada bulunur [39-41]. Bağışıklık ve HTHH arasında karışma varlığını önerir. Biber genomu, A. thaliana ve O. sativa'ya kıyasla sırasıyla 27 ve 7,5 kat daha büyüktür. Bununla birlikte, sadece 73 WRKY genine sahipken, A. thaliana ve O. sativa'nın daha küçük genomları sırasıyla 72 ve 122 WRKY genine sahiptir [9,42,43]. Daha önce CaWRKY6 [44], CaWRKY22 [9], CaWRKY40 [45] ve CaWRKY58'in [46] biberin RSI'ye verdiği yanıtta yer aldığını tespit etmiştik.

Bunlardan CaWRKY6, -22, -27 ve -40, bitki bağışıklığının pozitif düzenleyicileri olarak işlev görürken CaWRKY58, negatif düzenleyicidir. Bu genler, promotör bölgelerinde HSE elemanlarının ve W-kutularının bir alt kümesine ve diğer WRKY TF'lerin promotörlerine sahiptir; Ek olarak, CaWRKY40 doğrudan CaWRKY6 [44] ve CabZIP63 [16] tarafından düzenlenirken, CaWRKY40 dolaylı olarak CaCDPK15 [47] tarafından düzenlenmiştir. Tersine, biberin WRKY TF'lerinin çoğu henüz patojen saldırılarına tepkileri açısından karakterize edilmemiştir.

Mevcut çalışmada, biberin WRKY TF ailesi için tam uzunlukta bir cDNA izole edildi ve CaWRKY30 olarak adlandırıldı. Bunu ifadesel ve işlevsel olarak karakterize ettik ve CaWRKY30'un SA, JA, ET ve ABA'nın RSI ve yaprağa uygulanmasıyla indüklendiğini bulduk. CaWRKY30'un biber yapraklarında geçici aşırı ekspresyonu, HR benzeri hücre ölümünü ve H2O2 üretimini tetikledi. Biberde CaWRKY30'un susturulması, biberin RSI'ye bağışıklığını tehlikeye attı. Bu sonuçlar, CaWRKY30'un biberin RSI'ye karşı bağışıklığını pozitif olarak düzenlediğini göstermektedir.

2. Sonuçlar

2.1. CaWRKY30'un Klonlanması ve Sekans Analizi

Genom çapında analizle yeni bir WRKY geni CaWRKY30 (CA01g34480) tanımlandı. CaWRKY30 geni, promotör bölgesinde TGA (TGACG motif-bağlama faktörü), TGACG-motifi, TATC-box, TATAbox ve W-box gibi bağışıklıkla ilgili cis-elementlerin mevcudiyeti, bunun mümkün olduğunu gösterdiği için, fonksiyonel karakterizasyon için seçilmiştir. biberin bağışıklığındaki rolü (Şekil S1). 924 bp açık okuma çerçevesinin (ORF) CaWRKY30'un (CA01g34480) bir cDNA fragmanı, gene özgü primerler (Tablo S1) kullanılarak klonlandı. CaWRKY30'un çıkarsanan amino asit dizisinin uzunluğu, korunmuş WRKY alanına sahip 307 amino asit kalıntısıydı ve grup III'e kategorize edildi (Şekil 1). Öngörülen protein, sırasıyla 34.55 kDa ve 7.32'lik bir boyuta ve teorik pI'ye sahiptir. CaWRKY30, sırasıyla NsWRKY53, CcWRKY53, NaWRKY53 ve StWRKY53 ile yüzde 88, 60, 68 ve 57 amino asit özdeşliğini paylaşır (Şekil S2).

2.2. CaWRKY30'un RSI Altında Transkripsiyonel İfadesi ve Çeşitli Fitohormonlarla Tedavisi

CaWRKY30'ün promotör bölgesinde bağışıklıkla ilişkili cis elementlerinin varlığı, biberin bağışıklığı RSI'daki potansiyel rolünü gösterdi. Kavramı kontrol etmek için, RSI üzerine CaWRY30'un transkripsiyonel seviyelerini değerlendirmek için qRT-PCR analizi yapıldı. CaWRKY30'un transkripsiyonel seviyeleri, Ralstonia ile işlenmiş yapraklarda, sahte olarak işlenmiş yapraklara kıyasla artmıştır (Şekil 2A). Geliştirilmiş CaWRKY30 transkripsiyonel ekspresyon seviyeleri, tedaviden 0 saat ila 48 saat sonra (HPT) arasında tutarlıydı. En yüksek transkripsiyonel ifade seviyeleri 48 hpt'de kaydedildi (Şekil 2A).

ET, ABA, SA ve JA aracılı sinyal yolları dahil olmak üzere fitohormonlar, biyotik ve abiyotik streslere karşı bitki reaksiyonlarının temel düzenleyicileridir. CaWRKY30'ün fitohormon aracılı sinyal yolları tarafından düzenlenmesi, qRT-PCR analizi kullanılarak ET, ABA, SA ve JA'nın yapraktan uygulanmasıyla incelenmiştir. Sonuçlar, CaWRKY30'un göreli transkripsiyonel ekspresyon seviyelerinin, sahte ile karşılaştırıldığında 100 uM ET ile 0 saatten 48 hpt'ye yükseldiğini gösterdi. Bu transkripsiyon seviyeleri, ET ile 48 hpt'de en yüksekti (Şekil 2B). 100 uM ABA'nın yaprağa uygulanması, sahteye kıyasla CaWRKY30'un transkripsiyonel seviyelerini önemli ölçüde artırdı. Transkripsiyon seviyeleri ABA ile 12 hpt'de en yüksek seviyeye ulaştı (Şekil 2C). Sonuçlar, CaWRKY30'un transkripsiyonel birikiminin, sahte ile karşılaştırıldığında 1 mM SA uygulamasından sonra önemli ölçüde arttığını gösterdi. Bu gelişmiş transkripsiyonel ifade seviyeleri 24 hpt'de en yüksekti (Şekil 2B).

Şekil 2. Ralstonia solanacearum aşılamasına (RSI) ve çeşitli fitohormonların yaprağa uygulanmasına tabi tutulan biber yapraklarındaki CaWRKY30 göreli transkripsiyonel ekspresyon seviyelerinin qRT-PCR testi. RSI (A), 100 µm ET (B) uygulaması, 100 µm ABA (C) uygulaması ve 1 mM uygulaması dahil olmak üzere çeşitli işlemlere tabi tutulan biber yapraklarında CaWRKY30'un transkripsiyonel seviyelerini kontrol etmek için qRT-PCR analizi kullanıldı. SA (D) farklı zaman aralıklarında. RSI ile işlenmiş yapraklardaki transkripsiyon bolluğu, göreli ifade seviyesi "1" olarak ayarlanmış MgCl2 -işlenmiş kontrol yaprakları (sahte) ile karşılaştırıldı. (B – D) Fito-hormonla işlenmiş yapraklardaki transkripsiyonel ifade seviyeleri, ifade düzeyi "1" olarak ayarlanmış ddH2O ile işlenmiş yapraklarla (sahte) karşılaştırıldı. Çubuğun yüksekliği ortalamayı, hata çubukları ise ortalamanın standart hatasını gösterir. Çubukların üzerindeki farklı harfler, Fisher'in korumalı LSD testine dayalı ortalamalar arasında önemli bir fark gösterir.

2.3. CaWRKY30'un Çekirdekte Lokalize Olduğu Bulundu

WoLFPSORT kullanılarak yapılan dizi analizi, tahmin edilen CaWRKY30 protein dizisinin, çekirdekteki potansiyel hedeflemesini gösteren varsayılan bir nükleer lokalizasyon sinyaline (Şekil 1) sahip olduğunu gösterdi. Bu algıyı doğrulamak için, CaMV35S'nin kurucu bir promotörü tarafından yönlendirilen bir aCaWRKY30 GFP füzyon yapısı üretildi. Daha sonra bu oluşturulan vektör Agrobacterium strainGV3101'e aktarıldı. CaWRKY30 GFP yapısını Nicofiamabenthamiana'nın yapraklarında A. tumefacient enjeksiyonu ile geçici olarak aşırı ifade ettik ve GFP sinyalleri konfokal flores.bilim mikroskobu ile incelendi. Sonuçlar, CaWRKY30-GFP'nin GFP sinyallerinin çekirdeklerde bulunduğunu, buna karşın kontrolün GFP'sinin, sitoplazma ve çekirdekler gibi çeşitli hücre altı kısımlarında tespit edildiğini gösterdi (Şekil 3).

Şekil 3. CaWRKY30'un hücre altı lokalizasyonu. CaWRKY30, nicotiana benthaminna yapraklarının çekirdeğinde tamamen yerleşmiştir. Yeşil renk, GFP'yi gösterir. Mavi renk, çekirdeğin DAPI boyamasını gösterir. Cam göbeği rengi, yeşil CFP ve mavi DAPI lekeli çekirdeklerin füzyonunu gösterir. CPP signaGreen) kontrol için, hücrenin her yerinde N. benthamiana yaprakları tespit edildi. görüntüler, aşılamadan 48 saat sonra konfokal mikroskopi ile yakalandı. Çubuklar=25 um.

2.4. CaWRKY30'un VIGS Tarafından Susturulması Pepper'ın RSI ve Aşağı Düzenlenmiş Bağışıklık İlişkili Marker Genlerine Bağışıklığını Kısıtladı.

CaWRKY30, biber bağışıklığındaki rolünü incelemek için virüs kaynaklı gen susturma (VIGS) ile susturuldu. Toplam 50 CaWRKY30-susturulmamış (TRV:00) ve 50 CaWRKY30- susturulmuş (TRV: CaWRKY30) bitki satın alındı. Altı CaWRKY30 susturulmuş bitki, uyumlu öldürücü R. solanacearum suşunun hücreleriyle kök aşılama yoluyla gen susturmadaki verimliliklerini kontrol etmek için rastgele seçildi. Bulgularımız, CaWRKY30'un transkripsiyon seviyelerinin Ralstonia ile işlenmiş CaWRKY30 susturulmuş bitkilerde susturulmamış bitkilere kıyasla ~ yüzde 30 oranında azaldığını gösterdi ve CaWRKY30'un susturulmasını doğruladı (Şekil 4A).

CaWRKY30 susturulmuş bitkiler, susturulmamış bitkilere kıyasla önemli ölçüde daha yüksek RSI duyarlılığı gösterdi. Biberin patojene duyarlılığı, aşılamadan 3 gün ve 5 gün sonra (dpi) CaWRKY30 susturulmuş biber bitkilerinde susturulmamış bitkilere kıyasla daha yüksek cfu değerleri ile işaretlenen Ralstonia popülasyon artışında bir artış göstererek arttı (Şekil 4B). Ralstonia aşılanmış CaWRKY30 susturulmuş (TRV: CaWRKY30) ve susturulmamış (TRV:{9}}) biber yapraklarında H2O2 üretimini ve hücre nekrozunu saptamak için histokimyasal boyama testi yapıldı. Susturulmamış biber yapraklarında 48 hpi'de (aşılamadan saatler sonra) koyu bir DAB boyaması (H2O2 üretiminin bir işareti) ve koyu tripan mavisi boyamasıyla gösterilen HR benzeri hücre ölümü fark edildi. Tersine, CaWRKY30 susturulmuş biber yapraklarında tripan mavisi ve DAB boyama konsantrasyonları önemli ölçüde azalmıştır (Şekil 4C). İyon sızıntısının bir göstergesi olan elektriksel iletkenlik, RSI'den sonra plazma zarı hasarını ve hücre ölümünü incelemek için hesaplandı.

Sonuçlar, RSI ile işlenmiş susturulmamış bitkilerin, 24 ve 48 dpi'de Ralstonia ile işlenmiş CaWRKY30 susturulmuş bitkilerden daha yüksek iyon sızıntısı sergilediğini gösterdi (Şekil 4D). Bağıl hastalık indeksi, RSI'den sonra CaWRKY30-susturulmuş ve susturulmamış bitkilerde hastalık seviyesini anlamak için 10 dpi'ye kadar tahmin edilmiştir (Ek Tablo S2). CaWRKY30 susturulmuş bitkilerde 10 dpi'de belirgin hastalık semptomları fark edilirken susturulmamış bitkiler çok az hastalık semptomu gösterdi (Şekil 4E). Altı CaWRKY30-susturulmuş ve susturulmamış bitki rastgele seçildi ve fenotip analizi için köklere R. solanacearum sızdı. CaWRKY30 susturulmuş biberde 10 dpi'da bariz solma hastalığı semptomları fark edilirken susturulmamış bitkiler çok zayıf solma semptomları gösterdi (Şekil 4F). Bağışıklık ile ilgili işaretleyici genlerin transkripsiyonel birikimini incelemek için qRT-PCR analizi yapıldı ve sonuçlar, CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 ve CaHIR1 gibi bağışıklıkla ilişkili işaretleyici genlerin transkripsiyonel ifade düzeylerinin CaWRKY'de azaldığını ifade etti{{ 25}}48 dpi'da susturulmamış bitkilerle sessizleştirilmiş bitkiler karşılaştırması (Şekil 4G).

Şekil 4. CaWRKY30'un VIGS tarafından susturulması, biberin RSI'ye ve yukarı regüle edilmiş bağışıklıkla ilişkili belirteç genlerine karşı direncini azalttı. R. solanacearum ile aşılanmış, yapay (MgCl2 çözeltisi ile aşılanmış) CaWRKY30-susturulmuş biber bitkilerinde (TRV: CaWRKY30) ve kontrol bitkilerinde (TRV:00) CaWRKY30 ifade düzeylerinin qRT-PCR testi (A). 3 ve 5 dpi'de (B) R. solanacearum ile aşılanmış CaWRKY30-susturulmuş ve susturulmamış (kontrol) biber bitkileri arasındaki R. solanacearum'un büyümesindeki fark. R. solanacearum ile aşılanmış CaWRKY30-susturulmuş (TRV: CaWRKY30) ve susturulmamış (TRV:00) biber yapraklarında 48 dpi'da histokimyasal boyama (DAB ve trypan blue boyama). Ölçek çubuğu=50 µm (C). 24 ve 48 hpi'de CaWRKY30-susturulmuş (TRV: CaWRKY22) ve susturulmamış (TRV:{25}}) biber bitkilerinin yaprak disklerindeki hücre ölümü tepkilerini değerlendirmek için iyon iletkenliği olarak elektrolit sızıntısı ölçümü R. solanacearum (D) içeren ve içermeyen. CaWRKY30-VIGS ile susturma, biber bitkilerinin R. solanacearum enfeksiyonuna duyarlılığını artırdı.

Hastalık indeksi zamanla önemli ölçüde arttı. CaWRKY30-susturulmuş (TRV: CaWRKY30) bitkiler, susturulmamış (TRV:00) bitkilere kıyasla zamanla R.solanacearum enfeksiyonuna karşı yüksek duyarlılık gösterdi. Ortalamalar, replikasyon başına beş bitki (E) ile dört biyolojik tekrara dayanmaktadır. R.solanacearum uygulamasının CaWRKY30-susturulmuş (TRV: CaWRKY30) ve susturulmamış (TRV:00) biber bitkileri üzerindeki fenotipik etkisi 10 dpi'de (F). R ile aşılamadan 48 saat sonra CaWRKY30-susturulmuş (TRV: CaWRKY30) ve susturulmamış (TRV:00) biber bitkilerinde savunmayla ilişkili işaret genlerinin transkripsiyonel seviyelerinin qRT-PCR testi. solanacearum (G). Sahte işlem görmüş susturulmamış bitkilerin göreli transkripsiyonel ekspresyon seviyesi "1" olarak ayarlandı. Çubuğun yüksekliği ortalamayı, hata çubukları ise ortalamanın standart hatasını gösterir. Veriler, dört biyolojik kopyadan ortalama ± SE'yi temsil eder. Çubukların üzerindeki farklı harfler, ortalamalar arasında önemli farklılıklar gösterir.

For more information:1950477648nn@gmail.com