Nörodejeneratif Hastalıklarda Şaperon Aracılı Otofaji ve Merkezi Sinir Sistemindeki Akut Nörolojik Hasarlar Bölüm 2

4. CMA Etkinliğini Test Etmek İçin Deneysel Araştırma Araçları

Bu bölümde CMA aktivitesini in vitro ve in vivo olarak test etmek için mevcut deneysel araştırma araçlarını açıklıyoruz. Bilgi elde etmek için yaygın olarak kullanılan yöntemler, CMA aktivitesi ve ayrıca CMA fonksiyonel analizleriyle ilişkilidir.

CMA (Sertifikalı Yönetim Muhasebecisi), yönetim muhasebesi alanında yeterli operasyonel beceriye ve mesleki bilgiye sahip kişileri belgelendirmeyi amaçlayan bir profesyonel yönetim muhasebeci sertifikasıdır. İnsan beyninin bir yeteneği olan hafıza, bilgiyi, bilgiyi veya deneyimi hatırlama yeteneğini ifade eder.

CMA ile hafıza arasında belli bir ilişki vardır. Her şeyden önce, CMA sınavı adayların çok sayıda bilgi noktasını ve kavramı hatırlamasını ve aynı zamanda adayların bu bilgi noktalarını uygulayacak becerilere hakim olmasını gerektirir. Bu nedenle mükemmel hafıza, CMA sınavında iyi sonuçlara ulaşmada çok önemli bir rol oynayacaktır.

İkinci olarak, öğrenme ve pratik yoluyla hafıza geliştirilebilir, bu da CMA sınavına çalışmaya yardımcı olur. Örneğin, bilgi noktalarını tekrar tekrar gözden geçirerek, bilgileri farklı şekillerde öğrenip ezberleyerek ve hafıza tekniklerini kullanarak hafızayı geliştirebilir ve adayların CMA sınavı için gereken bilgi noktalarında ve becerilerde daha iyi uzmanlaşmasına yardımcı olabilirsiniz.

Son olarak, CMA eğitimi sadece bir sınav değil, aynı zamanda profesyonel kalitede bir gelişmedir. Kariyer gelişiminde, profesyonel yeteneğinizi daha iyi ortaya koymak istiyorsanız, iş görevlerinizi daha iyi tamamlamanıza yardımcı olacak belirli bir hafıza yeteneğine doğal olarak ihtiyacınız vardır.

Kısaca CMA ile hafıza arasında yakın bir ilişki vardır. Belleğinizi geliştirmeye çalışmak yalnızca iyi notlar almanıza yardımcı olmakla kalmayacak, aynı zamanda iş görevlerinizi daha iyi tamamlamanıza ve kariyeriniz geliştikçe kişisel değerlerinizi ve kariyer başarılarınızı fark etmenize de yardımcı olacaktır. Belleğimizi geliştirmemiz gerektiği görülebilir ve Cistanche Deserticola, antioksidan, antiinflamatuar ve yaşlanma karşıtı etkilere sahip olduğundan hafızayı önemli ölçüde geliştirebilir, bu da beyindeki oksidasyonu ve inflamasyonu azaltmaya yardımcı olabilir, böylece sağlığı korur. sinir sistemi. Ek olarak, Cistanche Deserticola sinir hücrelerinin büyümesini ve onarımını da destekleyerek sinir ağının bağlantısını ve işlevini geliştirebilir. Bu etkiler hafızayı, öğrenme yeteneğini ve düşünme hızını geliştirmeye yardımcı olabilir ve ayrıca bilişsel işlev bozukluklarının ve nörodejeneratif hastalıkların ortaya çıkmasını önleyebilir.

Bellek gücünü artırmak için Bil'e tıklayın

4.1. CMA Etkinliğinin Takibi İçin Faydalı Analizler

CMA'nın ana moleküler bileşenlerinin miktarlarındaki değişikliklerin değerlendirilmesi, CMA aktivitesini değerlendirmenin dolaylı bir yolu olarak kullanılabilir [46]. Ek olarak, CMA aktif lizozomların sayısı ve dağılımı, CMA aktivitesindeki değişiklikleri anlamak için analiz edilebilir [46].

Ancak bu analizler yalnızca CMA durumuyla ilişkili verileri sağlar. Bu nedenle, bu analizler fonksiyonel analizlerle tamamlanmalıdır [47]. Ana CMA bileşenlerindeki değişiklikleri değerlendirmek için immünoblotlama ve görüntüleme, CMA aktivitesini değerlendirmek için en yaygın kullanılan yöntemlerdir.

LAMP2A'nın lizozomal seviyeleri CMA için sınırlı olduğundan [48], lizozomlardaki LAMP2A proteininin bolluğundaki değişiklikler genellikle CMA aktivitesi ile ilişkilidir. Bu nedenle görüntüleme değerlendirmelerinde lizozomal membranda LAMP2A'nın varlığı analiz edilmelidir [47].

Lizozomla zenginleştirilmiş fraksiyonlar veya en azından membranöz hücre fraksiyonu kullanılarak LAMP2A için immünoblotlama, toplam tam hücre lizatlarının kullanılmasından daha bilgilendiricidir [46]. Lizozomal-hsc70 seviyeleri aynı zamanda CMA aktivitesiyle de ilişkilidir [49].

Ancak hsc70 en bol bulunan hücresel şaperonlardan biridir ve lizozomlarda bulunan fraksiyonu az miktardadır. Bu nedenle, toplam hücresel lizatlarda hsc70 için immünoblotlama, CMA için bilgilendirici değildir [46]. Hsc70'in lizozomal belirteçler (örneğin, LAMP1) ile birlikte lokalizasyonu, CMA-aktif lizozomları tespit etmek için kullanılabilir [49].

CMA aktive edildiğinde tüm lizozomal havuzla orantılı olarak hsc70 ile aynı yerde bulunan bu lizozomların sayısı artar [12]. Ek olarak, hsc70 için immün altın boyamayı kullanan elektron mikroskobik analizi de CMA-aktif lizozom havuzu hakkında bilgi sağlayabilir [49].

Hücrelerden veya dokulardan izole edilmiş lizozomların kullanıldığı analizlerde, iyi bilinen CMA substratlarının (örn. GAPDH) artan seviyeleri, CMA aktivitesinin azaldığını gösterebilir [46].

Genel olarak CMA substratları translokasyondan sonra hızla bozunur [6]. Bu nedenle, lizozomal proteaz inhibitörleri (yani leupeptin) ile tedavi edilen veya tedavi edilmeyen modeller arasındaki hücrelerde veya hayvanlarda CMA substratlarının lizozomal seviyelerinin karşılaştırılması, CMA değerlerindeki akışın ölçülmesine olanak tanır [24].

4.2. Fonksiyonel Analizler

Çeşitli fonksiyonel analizler, hücrelerde, dokularda ve izole edilmiş organellerde zaman içinde CMA aktivitesinin izlenmesine olanak sağlar.

4.2.1. Hücre İçi Protein Bozunması Değerlendirmesi

Toplam sitozolik proteinlerin yaklaşık %30'u CMA tarafından parçalanabilir [9]. Bununla birlikte, CMA tarafından parçalanan sitozolik proteinin gerçek fraksiyonu, hücre tipine ve hücresel koşullara bağlı olarak değişir [6].

Bu nedenle, CMA yoluyla bozunmaya uğrayan hücresel protein havuzunun ölçümü, CMA yolunun genel aktivitesini belirlemek için yaygın bir yöntemdir [46].

Radyo-etiketli bir aminoasit ve lizozomal proteazların veya diğer otofajik yolların inhibitörlerinin kullanıldığı darbe ve takip deneyleri, CMA bozunmasına uğrayan proteinleri diğer yollar tarafından yönetilenlerden ayırmak için kullanılabilir [50].

4.2.2. Foto-dönüştürülebilir CMA Muhabirleri

Ek olarak, yapay floresan CMA habercilerinin lizozomal ilişkisini izlemeye yönelik bir yöntem, substrat dağıtımını ve CMA yoluyla bozunmayı izlemek için de yararlı olabilir [51].

Foto-dönüştürülebilir floresan habercileri [51] kullanarak, foto-dönüştürülmüş proteinin farklı bir floresans kanalındaki lizozomlarla ilişkisini izlemek mümkündür. Hücre başına floresan nokta sayısındaki artış, CMA aktivasyonunun iyi bir göstergesi olabilir [46].

4.2.3. İzole Lizozomlar Kullanılarak CMA'nın İn Vitro Analizleri

Farklı otofajik yollar arasındaki çapraz konuşma, sağlam hücrelerde CMA aktivitesinin doğru şekilde değerlendirilmesini zorlaştırmaktadır [41]. Bu nedenle, CMA yollarının dinamik bozunma sürecinde yer alan tüm fonksiyonel adımları ayrı ayrı analiz etmeliyiz [46,49].

CMA aktivitesini analiz etmek için en güvenilir yaklaşım, CMA'nın izole edilmiş lizozomlarla in vitro yeniden oluşturulmasıyla elde edilir [52]. CMA'da aktif olan lizozomların spesifik fraksiyonunun izolasyonu, CMA bölmelerindeki endojen CMA substratlarının içeriğinin analizine izin verir [47].

İzole edilmiş lizozomlar aynı zamanda CMA prosesi-substrat bağlanması, lizozomal alım ve lizozomal bozunmada yer alan adımları takip etmek üzere CMA'nın in vitro yeniden oluşturulmasına da izin verir [50].

Lizozomal proteaz inhibitörleriyle tedavi ve ardından CMA substratı ile inkübasyon, substrata bağlanan ve lizozomlara transloke edilen (bağlanma ve alım) substratın ölçümüne izin verecektir [39].

Proteoliz önlenmemiş olan lizozomine bağlanan substrat miktarının azaltılmasıyla, alımı hesaplamak mümkün olacaktır [39,53].

İzole edilmiş lizozomal fraksiyonlar ayrıca içerikteki değişikliklerin, translasyon sonrası modifikasyonun ve lizozomal membrandaki CMA bileşenlerinin organizasyonunun doğrudan karşılaştırılmasına olanak tanır. İzole lizozomlarda lizozomal LAMP2A veya liz-hsc70 seviyelerindeki azalmalar, CMA aktivitesinin azaldığının göstergesidir [54,55], LAMP2A seviyelerindeki artışlar ise CMA aktivitesinin yukarı regüle edildiğini gösterir [56].

Ek olarak, belirli bir zamanda multimerik bir kompleks halinde bir araya getirilen lizozomal LAMP2A'nın oranı, izole edilmiş lizozomların mavi doğal elektroforezi ve LAMP-2A için immünoblot kullanılarak belirlenebilir [57].

5. Nörodejeneratif Hastalıklar ve CMA

Nöronlar post-mitotik hücrelerdir ve stres koşulları altında hücresel homeostazı sürdürmek için etkili protein parçalama mekanizmalarına ihtiyaç duyarlar [58,59]. CNS'deki protein parçalanma sürecinin bozulması, birçok nörodejeneratif hastalığın belirgin bir özelliği olan anormal veya hasarlı proteinlerin birikmesine neden olur.

CMA fonksiyon bozukluğunun, CNS'yi etkileyen çeşitli nörodejeneratif hastalıklardaki farklı patolojilerle ilişkili olduğuna dair önemli kanıtlar toplanmıştır [1,14].

Bu hastalıklarda, PD'de -sinüklein [60], AD'de Tauprotein [61], HD'de Huntingtin (Htt) [62,63] ve TDP{{5} gibi çeşitli patojenik proteinler CMA'nın substratları olarak tanımlanmıştır. } ALS ve FTLD'de [64,65].

5.1. Parkinson Hastalığı

PH en sık görülen nörodejeneratif hastalıklardan biridir. PH'nin ana patolojik özellikleri, substantia nigra içindeki dopaminerjik nöronların kademeli kaybı ve Lewy cisimciklerinde protein -sinükleinin birikmesidir.

Çok sayıda çalışma CMA'daki bozulmanın PD'nin ana patogeneziyle ilişkili olduğunu göstermiştir [4,66]. PH'li hastalarda beyinde LAMP2A proteini seviyesinin azalması, CMA aktivitesinin zayıfladığını gösterir [67,68].

Önceki birçok çalışma, CMA bozunma yolunun inhibisyonunun, dopaminerjik nöronların kademeli kaybıyla ilişkili olan -sinüklein birikimine neden olduğunu ileri sürmüştür [8].

Önemli olarak, ailesel Parkinson hastalığında tanımlanan -sinüklein'in A53T ve A30P mutant formları CMA tarafından bozunamaz. Ayrıca bu mutant formlar, lizozomal membranda LAMP2A'ya sıkı bir şekilde bağlanır ve sonuç olarak diğer CMA substratlarının in vitro normal bozunmasını engeller [60,69]. Lösin açısından zengin tekrar kinaz 2 proteinindeki (LRRK2) G2019S mutasyonu, ailesel Parkinson hastalığının patolojik bir nedeni olabilir. [70].

G2019S mutantı, lizozomal membranda CMAtranslokasyon kompleksinin dinamik birleşmesini inhibe ederek, PD'nin fare modelinde ve mutant LRRK2 PD hastalarının beyinlerinde CMA'nın işlev bozukluğuna neden olur [25]. Ek olarak, LRRK2'nin patojenik mutant formları sitozolik Hsc70'e bağlanır ve CMA bileşenleriyle anormal şekilde etkileşime girerek diğer CMA substratlarının bozunmasını ve in vitro nöronal protein homeostazisini bloke eder [25,71].

Ubiquitin C-terminal hidrolaz L1 (UCH-L1), LAMP-2A, Hsc70 ve Hsp90 ile fiziksel olarak etkileşime girer ve CMA yolunun düzenleyici mekanizmasında yer alır [72]. Önceki bir çalışmada, I93M mutant formu UCH-L1 tek bir PD ailesinde tanımlandı [73].

Ayrıca UCH-L1'deki I93M mutasyonunun, LAMP2A'nın sitozolik bölgesi ile etkileşimi anormal şekilde arttırdığı ve in vitro CMA yolunu inhibe ettiği de rapor edilmiştir [74]. Ayrıca, memeli hücrelerinde UCH-L1'in I93M mutant formunun ekspresyonu, sinüklein miktarında CMA inhibisyonuna bağlı artışı indüklemiştir [74].

Bu bulgular, UCH-L1'in I93M mutant formunun CMA mekanizması ile anormal etkileşiminin, -sinüklein agregasyonu ile ilişkili PD patogenezinin altında olabileceğini düşündürmektedir. DJ-1 olarak da bilinen Parkinson hastalığı proteini 7 (PARK7), bir oksidasyon direnci de dahil olmak üzere çeşitli hücresel aktivitelerde yer alan çok işlevli protein [75].

PARK7/DJ-1mitokondriyal homeostazın korunmasında önemli bir role sahiptir [75]. DJ-1 genindeki bir mutasyonun, otozomal resesif ve PD'nin erken formlarına aracılık ettiği rapor edilmiştir [76]. DJ-1 eksikliği, lizozomlarda LAMP2A'nın bozunmasını hızlandırarak -sinüklein birikmesine yol açmıştır [77 ]

Buna karşılık, DJ-1, CMA'yı düzenleyerek -sinüklein birikimini engellemeyi başarmıştır [78]. Genel olarak, CMA işlev bozukluğuna neden olan çeşitli moleküler mekanizmaların, PD patogenezinin altında yattığı düşünülmektedir.

Ancak CMA ile ilişkili patolojik mekanizmalar büyük ölçüde belirsizliğini koruyor. CMA süreci ile PH'nin gerçek patolojileri arasındaki ilişkiyi açıklığa kavuşturmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyulacaktır.

5.2. Alzheimer Hastalığı

AD yaşlılarda en sık görülen nörodejeneratif hastalıktır. AD'nin ana patogenezi, protein homeostazisinin bozulmasından kaynaklanan amiloid plak oluşumu ve Tau agregasyonudur. AD ile ilgili çeşitli proteinler, CMA substratları olarak tanımlanmıştır. Bu protein substratlarının CMA bozunmasının, AD'li hastalarda bozulduğu gösterilmiştir [45,61,79].

Amiloid-oligomerlerin ilerleyici birikimi AD'de merkezi toksik bir olaydır [80,81]. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, amiloid oligomerlerinin çoklu KFERQ motifleriyle etiketlenmesinin, bunların endozomlara ve lizozomlara girişini teşvik ederek, insan birincil kültürlü kortikal nöronlarını nörotoksisiteden koruduğunu gösterdi [82]. Amiloid öncü proteini (APP), AD'de önemli bir patojenik moleküldür çünkü üretmek üzere işlenebilmektedir. amiloid- [83].

APP, Cterminus'unda KFERQ benzeri bir motif içerir. Bu motif, APP-C-terminal fragmanlarının birikmesini önlemek amacıyla APP'nin normal işlenmesi ve bozulması için önemlidir [84]. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, APP'nin Hsc70'e bağlanan bir CMA substratı olduğunu ortaya çıkardı [85].

APP'nin CMA degradasyonunun inhibisyonu, sitotoksisitesini arttırır. Ayrıca, CMA'nın Hsc70 aşırı ekspresyonu veya Metformin tarafından aktivasyonu, AD'li bir fare modelinde birikmiş beyin amiloid plak seviyelerini azalttı ve moleküler ve davranışsal AD fenotiplerini tersine çevirdi [85]. Tau normalde nöronal hücrelerdeki mikrotübülleri stabilize eden sitozolik bir proteindir.

Tauprotein, CMA hedefleme motiflerine sahiptir ve CMA yolu tarafından parçalanabilir [79]. Tau hiperfosforilasyonu ve nörofibriler yumakların oluşumuyla sonuçlanan mutant Tau proteinlerinin toplanması, AD'nin ve ilgili tauopatilerin ayırt edici özelliğidir [86,87].

Ek olarak, mutant Tau proteinleri LAMP2A ile anormal şekilde etkileşime girebilir ve lizozom lümenine translokasyonu engelleyerek CMA aktivitesini bozabilir [79]. Kalsinörin 1'in düzenleyicisi (RCAN1), CMA'nın bir substratıdır [45] ve AD'li hastalarda yükselmektedir [88].

RCAN1, Tau proteinlerinin kalsinörine bağımlı defosforilasyonunun bir inhibitörüdür. Daha da önemlisi, CMA aktivitesi, RCAN1 seviyesinin arttırılmasıyla inhibe edilebilir, böylece CMA'nın diğer substratlarının bozunması bozulur [45].

5.3. Huntington Hastalığı

HD, kontrolsüz hareket, demans ve duygusal rahatsızlık ile karakterize, geç başlangıçlı nörodejeneratif bir hastalıktır. HD, mutant Htt proteininin striatal ve kortikal nöronlarda birikmesi ve toplanmasından kaynaklanan baskın olarak kalıtsal bir hastalıktır.

Htt, anormal derecede genişlemiş bir N-terminal poliglutamin (polyQ) yolu içerir [62,63,89]. Htt bozunmasının fonksiyon bozukluğu, HD'nin ana patogenezi olarak öne sürülmektedir.

Önceki çalışmalar, CMA'nın, HD'nin hücresel ve fare modellerinde mutant Htt'nin bozulmasında rol oynadığını göstermiştir [62]. Htt, varsayılan bir KFERQ motifini barındırır ve CMA, Hsc70 ve LAMP2A'nın temel bileşenleriyle etkileşime girer. Ek olarak, poliQ kanalında genişleme olan mutant Htt, in vitro CMA tarafından bozulmuş bir alım sergiler [89].

Htt'nin bozulmasında sadece CMA değil aynı zamanda makrootofaji de rol oynar [90]. Htt, bozunma sürecinde hem LAMP2A'ya hem de makrootofaji ile ilişkili protein Atg7'ye bağlanabilir [89,91,92].

Hastalığın başlangıç ​​aşamasında HD'nin hücresel ve hayvan modellerinde CMA aktivitesinin yukarı doğru düzenlendiği bildirilmektedir. Ancak hastalığın geç evresinde CMA'nın aktivitesi azalır [91]. Bu bulgular, CMA aktivitesindeki erken artışın, makrootofajinin verimsizliğine yanıt olarak telafi edici bir düzenleme olabileceğini düşündürmektedir. Lizozomal LAMP2A seviyesindeki düşüş, HD'nin geç fazında CMA fonksiyonunda bir kayıp olduğunu gösterir [91].

5.4. Amyotrofik Lateral Skleroz ve Frontotemporal Lobar Dejenerasyonu

ALS ve FTLD, birçok benzer klinik ve patolojik özelliğe sahip nörodejeneratif hastalıklardır [93]. İşlem tepkisi DNA bağlayıcı protein 43 kDa (TDP-43), RNA metabolizmasının birçok yönünü düzenleyen bir ribonükleer proteindir.

ALS ve FTLD'li hastalarda nöronal hücrelerde TDP-43 C-terminal fragmanlarının birikmesi sıklıkla tespit edilir [65]. Bu nedenle, TDP-43 birikiminin yaygın olarak bu hastalıkların ayırt edici özelliği olduğu düşünülmektedir.

TDP-43 proteini, Hsc70'e bağlanan KFERQ benzeri bir motif içerir ve CMA süreci tarafından parçalanabilir [94,95]. Hsc70 ekspresyonunun sporadik ALS hastalarının lenfomonositlerinde azaldığı ve TDP-43 birikimine katkıda bulunduğu rapor edilmiştir [64].

TDP-43'deki KFERQ benzeri motifteki bir mutasyon, CMA yoluyla bozulmasını bozabilir, kültürlenmiş hücrelerde TDP-43 birikimini ve CMA'nın inhibisyonunu indükleyebilir [94]. CMA, TDP-43'nin fizyolojik ve patolojik formlarının dönüşümünün kontrol edilmesine yardımcı olabilir [94].

For more information:1950477648nn@gmail.com