Bölüm2:OSBPL7'yi Hedefleyen Bileşikler ABCA1- İki Böbrek Hastalığı Modelinde Böbrek Fonksiyonunu Koruyan Bağımlı Kolesterol Akışı

Daha fazla bilgi için. İletişimtina.xiang@wecistanche.com

Tartışma

Bu çalışma, ABCA1-bağımlı kolesterol akışını yukarı doğru düzenleyen fenotipik ilaç keşfi (PDD) ile bir bileşik sınıfının tanımlanmasını açıklamaktadır. Hedef dekonvolüsyon, OSBPL7'nin moleküler hedef olduğunu ortaya çıkardı. Hayvan böbrek hastalığı modellerinde, bu bileşikler renal lipid birikimini azalttı, podosit kaybını önledi, proteinüriyi normalleştirdi ve renal fonksiyon düşüşünü azalttı.

Kronik için güncel tedavilerböbrek hastalığıACEi, ARB'ler ve daha yakın zamanda sodyum-glukoz ortak taşıyıcı tip 2 inhibitörleri (SLGT2i) ile sınırlıdır. Bu ajanların, özellikle proteinürik böbrek hastalığı olan hastalarda, kronik böbrek hastalığının ilerlemesini geciktirmedeki etkinliğine rağmen, KBH'de karşılanmayan tıbbi ihtiyaç çok büyük olmaya devam etmektedir3,3940. 4300 hastadan oluşan randomize bir çalışmada, SGLT2i'nin, her şeye rağmen beklenmedik bir şekilde etkili olduğu bulunmuştur. diyabetin varlığı4, glukoz düşürücüden başka renoproteksiyon mekanizmalarının rol oynadığını düşündürür. Aslında, yakın tarihli bir çalışma, SGLT2i'nin plazma HDL'sini artırabildiğini ve kardiyak yağ birikimini azaltabileceğini göstermiştir42. SGLT2i'nin bu yeni ortaya çıkışı, daha etkili tedaviler geliştirmek için çoklu CKD sürüş mekanizmalarını hedeflemenin yararının altını çiziyor.

Biz ve diğerleri, glomerüler kolesterol birikimini tanımladık.böbrek hastalıklarıHem metabolik hem de metabolik olmayan kökenlerden kaynaklanır. ABCAl aracılı kolesterol akışında azalma ile bağlantılı olarak glomerüler lipid birikimi, DKD7-11, FSGS12-14 ve AS13'te meydana gelir. Bu veriler, ABCAl fonksiyonunun eski haline getirilmesinin, bu tip böbrek hastalıklarının tedavisinde etkili olabileceğini düşündürmektedir. Yakın zamanda, siklodekstrin ile renal kolesterol tükenmesinin veya genetik ABCAl aşırı ekspresyonunun, aşağıdakilerden koruduğunu gösterdik.Böbrek yetmezliğiDKD9, FSGS13,14 ve ASl3 modellerinde. Ayrıca podosit spesifik ABCAl eksikliğinin DKD7'de renal fenotipi kötüleştirdiğini gösterdik. T1317 gibi LXR agonistleri ile yapılan çalışmalar, bu ajanların sınırlandırılmasına rağmen çekici bir terapötik hedef olarak kalan ABC Al'nin kilit rolü için güçlü destek sağlamıştır.

Fenotipik ilaç keşfi ve aday küçük molekül eczanesinin optimizasyonu ile ajanlar aradık. Birkaç temsilcisi ABCAl protein seviyelerini ve kolesterol yüklü hücrelerden kolesterol akışını artıran bir dizi 5-arilnikotinamid belirledik. Tangier hastalığı olan bir hastadan alınan fibroblastlarda akış aktivitesinin olmaması ve ABCAl mRNA'sında bir artışın olmaması, yeni bir etki mekanizması ortaya çıkardı.

Hedef ayrıştırma çabaları, OSBPL7'yi yüksek ilgi gören bir hedef olarak tanımladı. Moleküler prob（³H-Cpd K）, OSBPL7'yi canlı hücrelerde verimli bir şekilde bağladı ve etiketlenmemiş bileşiklerle etkili bir şekilde rekabet edebildi. Daha da önemlisi, ABCAl kolesterol akışını artırma yetenekleri ile sondanın OSBPL7'ye bağlanması için rekabet etme yetenekleri arasında daha geniş bir bileşik grubu için bağıntılı bir "aktivite-aktivite" ilişkisi gösterdik. Moleküler modelleme ve yerleştirme çalışmaları ile birleştirilen mutasyon analizi, bileşiklerin tahmin edilen OSBPL7 sterol bağlama cebi ile doğrudan etkileşimini gösterir. Son olarak, siRNA çalışmaları, OSBPL7'nin ABC Al işlevine dahil olduğunu doğruladı.

Cistanche nereden alınır ve cistanche ne için kullanılır öğrenmek için tıklayın  

Ayrıca CBIR'i potansiyel bir hedef olarak belirledik. Birkaç rapor, hücresel kolesterol regülasyonunda endokannabinoid sinyallemenin bir rolü olduğunu öne sürüyor. Rimonabant'ın çöpçü reseptör B1 (SR-B1) ve ABCGl'yi mütevazi bir şekilde yukarı regüle ettiği, ancak bizim verilerimizle tutarlı olarak ABC Al'i göstermediği gösterildi45. Sentetik kanabinoid WIN55,212-2'in, oxLDL yüklü RAW264.7 makrofajlarda46 çöpçü reseptör CD36'yı arttırırken ABC Al ifadesini azalttığı gösterildi. Birlikte bu veriler, ABCA1'in düzenlenmesinde CBIR için güçlü bir rolü desteklemez. Çalışmalarımızda, AM251, WIN55-212-2 ve araşidonik koloroetilamin (ACEA) dahil olmak üzere rimonabant ve diğer CBIR agonistleri/antagonistleri, ABCA1'i indüklemek için etkin değildi. kolesterol akışı (Şekil 3a, 4a).

Memeli oksisterol bağlayıcı proteinler (OSBP'ler) başlangıçta kolesterol ve sfingomiyelinin biyosentezinde yer almaktaydı47-49. Birkaç çalışma, spesifik OSBP'leri ABC Al protein stabilitesinin düzenlenmesi ve ABCAl aracılı kolesterol akışının düzenlenmesi ile ilişkilendirmiştir50,51. Bu rapordan önceki hiçbir veri, OSBPL7'yi ABCA1'in düzenleyicisi olarak göstermemiştir. Verilerimiz OSBPL7'nin ABC Al'i etkileyen bir şaperon veya substrat transfer fonksiyonu sağlayabileceğini göstermektedir. Transfekte edilmiş hücrelerdeki ön ortak immünopresipitasyon deneyleri, iki protein arasında doğrudan bir etkileşim tanımlamadı. Bununla birlikte, genom çapında ilişkilendirme çalışmalarının (GWAS) bir meta-analizi, insanlarda plazma kolesterol seviyelerini etkileyen 60 genetik lokus arasında OSBPL7'yi tanımladı.

ABC Al'nin böbrek hastalığındaki rolüne uzun vadeli ilgimiz, 5-arilnikotinimidleri böbrek hastalığının in vitro ve in vivo modellerini değerlendirmemize yol açtı. OSBPL7'nin glomerüller ve podositler dahil olmak üzere böbreklerde eksprese edildiğini ve Cpd A ve Cpd G'nin kolesterol yüklü podositlerden apo Al-aracılı kolesterol akışını yukarı regüle ettiğini bulduk. Cpd A ve Cpd G, mRNA ekspresyonunu etkilemeden plazma membranında ABCAl artışını destekler. Bu mekanizma, hem plazma hem de hücre içi membranlarda ABC Al'de bir artışa yol açan ABCAl mRNA'yı yukarı doğru düzenleyen LXR agonistleriyle çelişir. Cpd A ve Cpd G'nin terapötik etkinliğini in vivo olarak bir FSGS fare modelinde (ADR ile indüklenen nefropati) değerlendirdik. Her iki ajanın da azalmış proteinüri, kilo kaybı ve renal patolojik değişikliklerle ilişkili olarak renal kolesterol içeriğini azalttığı bulundu. Cpd G, ADR'nin neden olduğu podosit kaybını ve glomerüler yapısal değişiklikleri önlemede oldukça etkiliydi. ABCAl'ın böbreklerde önemli ölçüde azalması, buna eşlik eden bir artışiltihaplıproteinler, ABCA1 için önemli bir rolü destekleyen Cpd G tarafından önlendi. Cpd G, AS farelerinde albüminüri, BUN ve serum kreatinin düzeylerini etkili bir şekilde azalttı. Daha da önemlisi, Cpd G, ileri böbrek yetmezliği olan yaşlı Col4a3 hayvanlarında yaşam süresini uzatmıştır.

Bu veriler, ABCAl'yi hedefleyen bileşiklerin terapötik potansiyelini destekler ve bu yeni etki biçiminin, RAAS, SGLT2, NRF2 ve kolesterol sentezini veya emilimini hedefleyen ilaçlara ek veya tamamlayıcı etkinlik sunacağını kuvvetle önerir. Özellikle, Cpd G'nin etkisinin aksine, RAAS blokajı, bu modelde erken müdahale için en etkili tedavi olmasına rağmen, eski Col4a3 farelerinde yaşam süresini uzatmaz53,54. Cpd G'nin antiproteinürik aktivitesi, daha önce AS38'in bir singeneik modelinde bildirdiğimiz ramiprilin etkilerinden üstündü. Bu nedenle Cpd G, GFR'yi arttırdığı gösterilen ancak proteinüri üzerinde hiçbir etkisi olmayan bir NRF-2 agonisti olan bardoksolona kıyasla AS ve proteinüri hasta popülasyonunu daha iyi hedefleyebilir 10- genel popülasyonda yıllık SDBY riski55,56. Statinlerin deneysel AS57'de koruyucu olduğu bulundu ve kardiyovasküler riski azaltmak için tüm KBH hastalarında önerilir, ancak böbrek hastalığının ilerlemesini yavaşlatmada etkisiz oldukları kanıtlanmıştır. Son olarak, yakın zamanda ezetimibin AS'de yağ asidi ve trigliserit emilimi. Ancak ezetimib böbrek kolesterol içeriğini etkilemedi ve GFR'yi iyileştirme ve proteinüriyi azaltmadaki etkinliği burada Cpd G için bildirdiğimiz etkilerden daha düşüktü.

Özetle, mevcut rapor, ABCAl aracılı kolesterol akışını indükleyen, sınıfının birincisi ilaca benzer küçük moleküllerin fenotipik ilaç keşfi ile tanımlanmasını açıklar. Kimyasal biyoloji, OSBPL7'yi moleküler hedef olarak tanımladı ve moleküllerin, öngörülen oksisterol bağlanma alanı içinde yakından etkileşime girdiğini gösterdi. Bildiğimiz kadarıyla bu, başlangıçta fenotipik yaklaşımlarla keşfedilen ve daha sonra hedefi başarıyla belirlenen ilaç benzeri bileşiklerin sadece birkaç örneğinden biridir44. Bileşikler G ve A, ilerleyici böbrek hastalığının iki farklı etiyolojisini yansıtan fare modellerinde böbrek fonksiyonunu iyileştirmede oldukça etkiliydi. ADR'ye meydan okuyan farelerde AST seviyelerini düşürme ve daha da ikna edici bir şekilde Col4A3 KO farelerinin ömrünü uzatma yetenekleriyle yansıtıldığı gibi, güvenli ve iyi tolere edilmiş görünüyorlar. Bu bileşikler, yeni bir etki modu aracılığıyla hücresel kolesterol metabolizmasını hedefleyerek böbrek hastalığı için potansiyel yeni bir tedavi sunabilir. Bu ajanlar, kan basıncını veya glikoz kontrolünü hedefleyen mevcut ilaçlarla birlikte, KBH'deki önemli karşılanmamış ihtiyacı ele alabilir.

yöntemler

Bileşikler. Bu çalışmada kullanılan bileşikler Ek Tablo 5'te özetlenmiştir ve aksi belirtilmedikçe F.Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, İsviçre'de sentezlenmiştir. İn vitro deneyler için, liyofilize bileşikler DMSO (Sigma) içinde yeniden oluşturuldu ve alikuotlar -20 derecede saklandı. İn vivo deneyler için, liyofilize bileşikler, yüzde 1.25 hidroksipropil metilselüloz, yüzde 0.10 dokusat sodyum tuzu,0 yüzde 0.18 propilparaben sodyum ve yüzde 0.02 sitrik asit içeren araçlarda yeniden süspanse edildi. monohidrat, pH 6'da. Buz üzerinde gerçekleştirilen üç kısa darbe sonikasyonu ile ince bir partikül süspansiyonu üretildi.

Sentetik kimya prosedürleri ve analitik veriler. Lütfen Ek Veri 1 dosyasına bakın.

Kimyasal biyoloji/aday hedef taraması Kısaca, bir FLAG etiketi ile kaynaşmış ilgili aday hedefi ifade eden bir plazmit, HEK293 hücrelerine transfekte edildi. 24 saat sonra, ABCA1-aracılı kolesterol akışını（1 indükleyebilecek bir konsantrasyonda tritiye K bileşiği.0 μM） 3 saat boyunca ilave edildi, ardından canlı hücreler UV ışığına (K{{{ 7}} nm) yerinde potansiyel bileşik/hedef çapraz bağlamayı sorgulamak için. Hücre lizatları hazırlandı, eksprese edilen protein daha sonra sefaroz boncuklarına birleştirilmiş bir anti-FLAG antikoru kullanılarak seçici olarak immüno-çökeltildi, bağlı proteinler SDS-PAGE ile ayrıldı ve iki özdeş leke hazırlandı ve protein ekspresyonunu saptamak için western blot ve otoradyografi ile problandı ve sırasıyla bileşik çapraz bağlamanın varlığı veya yokluğu. Bu ekranın akış şeması, Şekil 2'de gösterilmektedir. Şekil 2d, Cpd A ve Cpd G'nin, aşırı eksprese edilmiş ve immüno-çökeltilmiş OSBPL7'den trityumlu Cpd K'nin yerini alma yeteneğini gösterir. Şekil 3b, OSBPL7'nin tahmin edilen oksisterol bağlama cebinde nokta mutasyonlarını içeren aşırı eksprese edilmiş ve immüno-çökeltilmiş OSBPL7 varyantlarına trityumlu Cpd K'nin bağlanmasını saptamak için bu tahlilin kullanımını gösterir. Bu yöntemin avantajları şunlardır: i. plazmit transfeksiyonunun kullanılması, düşük endojen seviyelerde ifade edilebilenler için otantik bir hedefi kaçırma olasılığını azaltan her adayın yüksek ifadesine yol açar, iii. kimyasal probun hedefi ile etkileşimi, farmakolojik olarak aktif bir konsantrasyonda ilgili bir biyolojik bağlamda (canlı hücreler) meydana gelir ve iii. immünopresipitasyon, ilgili eksprese edilen proteinin, sinyal/gürültü oranını önemli ölçüde geliştirerek arka plan proteinlerinden saflaştırılmasına izin verir.

Hücre kültürü. Hücre dizileri ATCC'den satın alındı ​​ve orijinal olarak Dr. Jochen Reiser'den olan insan podositleri hariç, en fazla geçiş 15 için alt kültürlendi. Koşullu olarak ölümsüzleştirilmiş insan podositleri, yüzde 10 FBS (GIBCO), yüzde 1 penisilin/streptomisin,0 içeren RPMI ortamında(Corning) 33 derecede izin verilen koşullar altında kültürlendi.01 mg/ml rekombinant insan insülini, 0,0055 mg/ml insan transferini (büyük ölçüde demir içermez) ve 0,005 ug/ml sodyum selenit (ITS, Corning). Farklılaşmayı indüklemek için podositler, yüzde 10 FBS (GIBCO) ve yüzde 1 penisilin/streptomisin içeren bir RPMI ortamında 37 derecede 14 gün boyunca kültürlendi. Farklılaştırılmış podositler, 18 saat süreyle RPMI-0.2 yüzde FBS'de aç bırakıldı ve daha sonra, belirtildiği gibi 37 derecede 18 saat boyunca DMSO içinde taze hazırlanmış 1 uM, 5 uM ve 10 uM bileşiklerle işlendi.

Makrofajlarda ve fibroblastlarda kolesterol çıkışı. Bileşiklerin ABCAl aracılı kolesterol akışını indükleme yeteneği, kuyu mikroplakalarında THP1 hücrelerinin veya fibroblastların kopya kültürlerinde belirlendi. Hücreler 150 000 hücre/kuyu yoğunluğunda kaplanmıştır. THP1 monositleri, yüzde 10 fetal bovin serumu ve 3 pl 2-merkaptoetanol içeren bir RPMI ortamında 72 saat boyunca PMA (100 nM) ilave edilerek makrofajlara farklılaştırıldı. Hücreler bir kez RPMI-1640 ile yıkandı ve ardından 50 ug/ml asetillenmiş LDL ve 10μCi/ml 【'H】-kolesterol ile yüzde 2 FCS içeren RPMI-1640 ortamında 48 saat 37 derecede yüklendi. . Yüklemeden sonra hücreler bir kez RPMI-1640 ile yıkandı ve 1 mg/ml yağ asidi serbest sığır serum albümini (BSA) içeren RPMI-1640 ortamında 24 saat daha test bileşikleri ile inkübe edildi. Hücreler daha sonra bir kez yıkandı ve kolesterol akışı, 10 ug/ml insan apoAI veya 30 ug/ml HDL2, HDL3 veya LDL'nin 1 mg/ml BSA içeren RPMI-1640 ilavesiyle indüklendi. 6 saat Kültür süpernatanlarındaki radyoaktivite, sintilasyon sayımı ile belirlendi. Kolesterol akışı, kolesterol alıcılarının yokluğunda inkübe edilen kontrollere karşı nispi bir değer olarak ifade edildi. Doz-yanıt eğrileri, XLfit3 (ID Business Solutions Ltd. UK) kullanılarak hesaplandı.

Podositlerde kolesterol çıkışı. 13 gün boyunca farklılaştırılan insan podositleri, yüzde 2 FBS ve [PH]-kolesterol (1 uCi/ml, American Radiolabeled Chemicals) içeren RPMI ortamında 37 derecede 24 saat etiketlendi. Hücreler daha sonra 3 kez PBS ile yıkandı ve 0%2 yağsız-BSA (Sigma) ile desteklenmiş RPMI ile bileşiklerle veya bileşiksiz 18-saat 37 derecede inkübe edildi. Bileşikler, aşağıdaki konsantrasyonlarda kullanılmıştır: Cpd C（1 μM）, Cpd A （1 μM, 5 uM） ve Cpd G（l uM, 5 uM,10 μM）. 18-h inkübasyonun ardından ortama insan apoAI（Calbiochem） eklendi (20 ug/mL nihai konsantrasyon) ve hücreler 18 saat daha 37 derecede inkübe edildi. ApoAI ilavesinden önce(T =0h) ve sonra(T=18h) toplanan ortam alikotları 12,{25}}×g'de 5 dakika santrifüjlendi ve süpernatandaki radyoaktivite sıvı sintilasyon ile sayıldı. Hücreler daha sonra PBS ile yıkandı, yüzde 0.1 SDS, 0.1 M NaOH ile lize edildi ve lizatlardaki radyoaktivite sıvı parıldama ile ölçüldü. Yüzde olarak ifade edilen apo Al-aracılı kolesterol akışı, apo Al eklendikten sonra ortama salınan etiket miktarının (ApoA1 eklenmesinden önceki ve sonraki ortamdaki radyoaktivite farkı) her bir oyuktaki toplam etiket miktarına bölünmesiyle hesaplandı. (ortama salınan radyoaktivite artı parçalanmış hücrelerde radyoaktivite).

siRNA çalışmaları. İnsan OSBPL7, insan CBIR ve hedef olmayan siRNA negatif kontrolüne özgü siRNA havuzları, Ek Tablo 6'da özetlenmiştir. THPI monositleri, {{4} içinde 80,000 hücre/kuyu yoğunluğunda tohumlanmıştır. }kuyu plakaları ve yukarıda açıklandığı gibi PMA ile ayırt edilir. 72 saat sonra ortam, kuyu başına 50 ul taze ortam ile değiştirildi. Hücreler daha sonra üreticinin talimatları izlenerek Viromer Blue reaktifi (Origene) kullanılarak transfekte edildi. Kısaca, 10 ul siRNA （5 uM） 90 ul Viromer Blue ile karıştırıldı（sağlanan tamponda） yüzde 1 v/v seyreltildi. 15 dakikalık inkübasyondan sonra, siRNA-transfeksiyon reaktif madde kompleksleri, taze ortamda 1:6.5'te seyreltildi ve oyuk başına 50 ul'lik bir hacme ilave edildi. 24 saat sonra hücreler, RPMI ortamında, yüzde 1 FBS,100 nM PMA,2 uCi H-kolesterol içinde asetillenmiş LDL (25 ug/ml) ile 24 saat süreyle inkübasyon yoluyla kolesterol ile yüklendi. RT-PCR ile transfeksiyon etkinliğini doğrulamak için transfekte edilmiş hücreleri içeren bir dizi kuyu ayrıldı. Kolesterol yüklü makrofajlar daha sonra Cpd G5 uM veya araç (yüzde 0.1 DMSO) mevcudiyetinde RPMI ortamında Phenol Red, yüzde 0.2 BSA) ilave 24 saat süreyle inkübe edildi. Kolesterol akışı daha sonra yukarıda tarif edildiği gibi ölçülmüştür.

RT-PCR. RNA, RNEasy Plus Mini kiti (Qiagen) kullanılarak izole edildi. Üreticinin talimatlarına göre qScript cDNA SuperMix(Quantabio) kullanılarak ters transkripsiyon yapıldı. Kantitatif gerçek zamanlı PCR, TaqMan Fast Universal PCR Master Mix ve Taqman gen ekspresyon deneyleri kullanılarak yapıldı (Ek Tablo 7).

Batı lekesi. Lizatlar veya hücre fraksiyonları, indirgeme koşulları altında 10 dakika boyunca 55 derecede Laemmli tamponunda inkübe edildi. Hücre lizatlarından elde edilen toplam 30 ug protein veya hücre fraksiyonu preparasyonlarında toplanan hacmin üçte biri, yüzde 4-20 gradyan jellerinde (Biorad) SDS-PAGE ile ayrıldı ve proteinler daha sonra PVDF membranlarına aktarıldı. Yüzde 5 TBS-süt ile bloke edildikten sonra, membranlar gece boyunca 4 derecede primer antikorlarla problanmıştır. Aşağıdaki birincil antikorlar kullanıldı: fare anti-ABCA1(Abcam; 1:1000), tavşan anti-GAPDH antikoru (Milli-pore;1:10,000),fare anti-aktin( CP01,Millipore 10,000),anti-MEK, anti-ERp72, anti-V5 ve anti-Na plus /K plus ATPase(Hücre Sinyali; tümü 1:100) ve tavşan anti-OSBPL7(Sigma) ; 1:1000). Yıkandıktan sonra membranlar, anti-tavşan veya anti-fare IgG-HRP antikorları (Promega,1:10,00) ile inkübe edildi. Westernbright ECL HRP substratı (Advansta) ile inkübasyondan sonra sinyaller tespit edildi ve lüminesans sinyalleri Azure C600 Gel Imaging iş istasyonu (Azure Biosystems Inc, ABD) veya X-ray filmleri ile yakalandı.

Hücre fraksiyonasyonu. Farklılaştırılmış podositler, 18 saat boyunca Cpd C （l μM）, Cpd A（5 μM） veya Cpd G（10 μM） bileşikleri ile işlendi, yıkandı ve daha sonra buz gibi soğuk PBS'de toplandı. Hücreler 5 dakika boyunca 1000xg'de santrifüjlendi, süpernatan dikkatlice çıkarıldı ve pelet, bir proteaz ile desteklenmiş hipotonik tamponda (15 mM KCl,1.5 mM MgClz,10mM HEPES ve 1 mM DTT) yeniden süspanse edildi. inhibitör kokteyli (Roche). Hücreler bir cam douncer ile parçalandı ve 227 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için sükroz ilave edildi. Hücre lizatları 1000×g'de 30 dakika 4 derecede santrifüjlendi. Süpernatant daha sonra yeni bir tüpe aktarıldı ve 10,000xg'de 15 dakika 4 derecede santrifüjlendi. Mikrozomal fraksiyonu içeren pelet toplandı ve süpernatant yeni bir tüpe aktarıldı ve 1 saat 4 derecede 100.000 x g'de santrifüjlendi. Peletlenmiş plazma membran fraksiyonu toplandı ve organel içermeyen sitozolik fraksiyonu içeren süpernatan, Vivaspin 500 filtre kolonlarında konsantre edildi. Western blot, ABCAl için antikorlar ve yukarıda tarif edildiği gibi her bir membran fraksiyonu için spesifik markörler kullanılarak yapıldı. Plazma membran fraksiyonunu tanımlamak için Nat/K artı ATPase, mikrozomal zenginleştirilmiş fraksiyon için bir işaret olarak ERp72 ve membranöz olmayan sitozolik fraksiyon için kontrol olarak MEK kullanıldı.

ABC AT ko-immünopresipitasyon. ABCA{{0}}Bayrak yapısı Harvard Üniversitesi'nden Dr.Michael Fitzgerald tarafından sağlanmıştır. OSBPL7-V5 yapısı (pcDNA3.1-V5-ORP7) Addgene'den satın alındı. Origene'den memeli ifade vektörleri PCMV6-AN-GFP ve pCMV6-AC-3DDK, negatif kontroller olarak kullanıldı. HEK293 hücreleri, aşağıdaki plazmit kombinasyonlarından biriyle geçici olarak birlikte transfekte edildi:(1)ABCA1-Bayrak artı OSBPL7-V5;(2)ABCA1-Bayrak artı PCMV{{19 }}AN-GFP; veya(3) OSBPL7-V5＋pCMV6-AC-3DDK, üreticinin talimatlarına göre Fugene 6 transfeksiyon reaktifi (Promega) kullanılarak. Transfeksiyondan 48 saat sonra hücreler, bir proteaz inhibitör kokteyli (Roche) ile desteklenen 1 ml immünopresipitasyon tamponu (yüzde 1 Triton X-100,50 mM Tris-Cl pH 7.0,150mM NaCl) ile parçalandı. Lizatlar santrifüjleme ile temizlendi ve her süpernatandan eşit miktarlarda toplam protein, gece boyunca 4 derecede 30 ul anti-Flag M2 Afinite jeli "Sigma Aldrich" ile inkübe edildi. Boncuklar, santrifüjleme ile topak haline getirildi ve 5 kez 1 ml immünopresipitasyon tamponu ile yıkandı. İmmün çökeltilmiş proteinler, boncukların 50 ul 2x numune tamponu ile 15 dakika boyunca 56 derecede inkübe edilmesiyle ayrıştırıldı. Lizatlar ve eluatlarda ABC A1 ve OSBPL7-V5'in varlığı, yukarıda açıklandığı gibi western blot ile doğrulandı.

Hayvan çalışmaları. Hayvanlar 12 saat/12 saat aydınlık/karanlık döngülerinde ve kontrollü sıcaklık (18-23 derece) ve nem (yüzde40-60) altında, Üniversitedeki Veteriner Kaynakları Bölümü'nün patojen içermeyen bir hayvan tesisinde barındırıldı. Miami, Miller Tıp Fakültesi'nden. Farelere standart yüzde 18 protein kemirgen yemi diyeti ve ad libitum su sağlandı. Çalışma protokolü, Uluslararası Laboratuvar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından akredite olan Miami Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Tüm prosedürler, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı (USDA) tarafından denetlenen Hayvan Refahı Yasası (AWA) düzenlemeleri ve Laboratuar Hayvanlarının İnsani Bakım ve Kullanımına İlişkin Halk Sağlığı Hizmeti Politikası (PHS) dahil olmak üzere tüm federal ve eyalet etik yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirildi. Politika) Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH), Laboratuar Hayvanları Refahı Ofisi (OLAW) tarafından yönetilir. Dişi Balb/c fareleri, Adriamisin kaynaklı nefropati çalışmaları için Jackson Laboratories'den satın alındı. 8 haftalıkken, farelere kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla tek doz Adriamisin (Sigma-Aldrich, 12mg/Kg) veya araç (0yüzde 9 NaCl) verildi. Fareler rastgele altı deney grubuna ayrıldı ve ADR enjeksiyonundan 24 saat sonra başlayarak, 28 gün boyunca oral gavaj yoluyla günlük olarak araç veya farklı dozlarda bileşiklerle tedavi edildi. Aşağıdaki dozlar kullanıldı: Cpd C (LXR agonisti) 10mg/Kg; Cpd A 30mg/Kg; Cpd G 100mg/Kg. Tüm hayvanlar, ADR enjeksiyonundan 28 gün sonra kurban edildi. Col4a3 KO fareleri (Col4a3tmiDec suşu 129X1/SvJ), Jackson Labs'den satın alındı. Fareler rastgele 2 gruba ayrıldı. 4 haftalıktan başlayarak, farelere günde bir kez ya araç ya da Cpd G(100 mg/Kg) ile oral gavaj yoluyla 4 hafta boyunca doz verildi, ardından 8 haftalıkken kurban edildi. Col4a3 KO farelerinde, 6 haftalıkken başlatılan tedavi ile ikinci bir çalışma yapıldı. Bu çalışma, yerleşik böbrek yetmezliği olan farelerin Cpd G tedavisinin son dönem böbrek hastalığını geciktirip geciktiremeyeceğini ve dolayısıyla sağkalımı uzatıp uzatamayacağını değerlendirmek için yapılmıştır. Ramipril tedavisi için Col4a3 KO fareleri, 4 haftalıkken ramipril almaya başladı. Ramipril içme suyuna 10 mg/Kg/gün dozuna yol açacak konsantrasyonda eklendi.

Farelerin fenotipik analizi. Haftalık spot idrar örnekleri alındı. İdrar albümini ELISA (Bethy! laboratuvarları) ile ve kreatinin bir kolorimetrik tahlil (Stanbio) ile ölçüldü. Albüminüri, albümin/kreatinin oranı olarak ifade edildi. Farelere Ketamin (90 mg/Kg)/Xylazine(10mg/Kg) ile anestezi uygulandı, kan heparinize tüplerde toplandı ve daha sonra hayvanlara sol ventrikül yoluyla yüzde 0.9 NaCl çözeltisi ile perfüze edildi. Böbrek korteksleri dikkatli bir şekilde çıkarıldı ve sonraki değerlendirmeler için anında dondurulan, OCT'ye gömülen veya yüzde 10 formalin içinde sabitlenen örneklere ayrıldı.

Böbrek korteks bölümlerinde lipid birikiminin belirlenmesi. OCT gömülü böbrek korteks örnekleri 4 μm kalınlığında kriyoseksiyona tabi tutuldu ve Oil ile boyandı. Kırmızı O-izopropanol solüsyonu (Electron Microscopy Science, PA) suda 6:4 seyreltildi ve ardından Hematoxylin Harris Hg Free (VWR, PA) ile zıt boyama yapıldı. Kesitler daha sonra bir ışık mikroskobu (Olympus BX 41, Tokyo, Japonya) kullanılarak değerlendirildi.

Kolesterol ve trigliserit içeriğinin belirlenmesi. Hızlı dondurulan böbrek korteks örnekleri, buz üzerinde bir cam douncer kullanılarak 2 mM potasyum fosfat tamponu, pH 7,(1{{10}} pul tampon/mg doku） içinde homojenleştirildi. 100 ul homojenat hacmi doku homojenatı başına 1 ml heksan:izopropanol (3:2;vv) ile iyice karıştırıldı Sulu (pellet) ve organik (süpernet) fazlar 12,000x santrifüjleme ile ayrıldı. 5 dakika boyunca g Peletler (sulu faz) kurutuldu ve 8 M üre, yüzde 0.1 SDS, 0.1 M NaOH içinde yeniden oluşturuldu ve toplam proteinler BCA yöntemiyle (Thermofisher) ölçüldü Organik faz, nitrojene maruz bırakılarak kurutuldu. Lipidler daha sonra 100 ul izopropanol∶NP-40 (9:1;vv) içinde yeniden oluşturuldu.Trigliserit içeriği, üreticinin talimatlarına göre (Cayman Chemical USA) bir kolorimetrik kit kullanılarak test edildi.Toplam kolesterol ve CE içeriği, kullanılarak test edildi. bir enzimatik florometrik yöntem59. Toplam kolesterol ölçümü için, özütler tahlil tamponunda (100 mM potasyum fosfat) 1:100 oranında seyreltildi. e,50mM NAC,5mM kolik asit,yüzde 0.1 Triton X-10,pH 7.4)kolesterol oksidaz(1 U/ml), kolesterol esteraz(1 U/ml), yaban turpu peroksidaz（1 U/ml） içerir, ve Amplex Red（75 μM）. Reaksiyonlar, siyah opak 96-kuyucuklu bir plakada (Greiner) 30 dakika boyunca 37 derecede inkübe edildi ve floresan, bir mikroplaka okuyucuda (Spectramax i3X, Molecular Devices) 530 nm uyarma ve 580 emisyonda ölçüldü.

CE belirlemesi için, sığır karaciğer katalaz (45 U/ml) ve kolesterol oksidaz (1 U/ml) ile desteklenmiş yukarıda açıklanan test tamponundan 150 ul, 25 ul numuneye ilave edildi ve tükenmeden tükenmesi için gece boyunca 37 derecede inkübe edildi. kolesterol sadece kolesterol esterleri bırakır. Daha sonra 75 ul kolesterol ester saptama reaktifi (1 U/ml kolesterol oksidaz, 4 U/ml kolesterol esteraz, 24 U/ml yaban turpu peroksidaz, 300 uM Amplex Red） ilave edildi. Reaksiyon 37 derecede 30 dakika inkübe edildi ve flüoresans sinyali yukarıda tarif edildiği gibi ölçülmüştür Dahili standartlar, serbest kolesterolün enzimatik ayrışmasının tamlığını ve ayrıca tahlil duyarlılığını ve özgüllüğünü doğrulamak için 1 mM kolesterol ve 5 uM kolesterol oleat içeren numuneleri içermiştir.

Histolojik değerlendirme. 4 um kalınlığında formalinle sabitlenmiş parafine gömülmüş böbrek korteks bölümleri, Periyodik asit-Schiff(PAS) ile boyandı. Slaytlar bir renal patolog tarafından çift kör tasarımda analiz edildi. Glomerüler skleroz, (küresel ve segmental), podosit hipertrofisi ve podosit hiperplazisi, bu anormalliklerle bulunan glomerül yüzdesi olarak ifade edildi. Tübüler mikrokistler ve interstisyel inflamasyon, bir 0-4 ölçeğinde puanlandı, burada yüzde 0=0, yüzde05=1-10, yüzde1=11-25,2:26-50 yüzde,3:{{ yüzde 12}} ve 4=yüzde 75'ten fazla hasar. Mezanjiyal genişleme, yarı kantitatif analize (ölçek 0-5) veya mezanjiyal genişleme sergileyen glomerül yüzdesine (yüzde) göre puanlandı.

immünofloresan mikroskopisi. ABC Al ifadesinin saptanması için 4 um parafin böbrek korteks bölümleri parafinden arındırıldı ve yeniden hidratlandı. Antijenler, sitrat tamponu pH 6'da 30 dakika kaynatılarak alındı.0(Target Retrieval Solution, Citrate pH 6, Sigma, ABD). Kesitler, TBS içinde yüzde 0.1 Triton X-100 ile 30 dakika süreyle geçirgenleştirildi. Doku kesitleri TBS-T içinde yüzde 10 keçi serumu (kat #G9023, Millipore Sigma) ve yüzde 1 BSA (kat# SP-5050-500, Vector, ABD) ile oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edilerek spesifik olmayan herhangi bir bağlayıcı. Numuneler daha sonra gece boyunca 4 derecede Sıçan anti-ABCAl(Novus,1:200) ve Tavşan anti-WI1 (Abcam,1:200) antikorları ile nemlendirilmiş bir odada inkübe edildi. Kapsamlı bir şekilde yıkandıktan sonra, numuneler daha sonra florokrom konjuge ikincil antikorlar (Invitrogen, 1:500) ile oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edildi. Kesitlere analiz edilmeden önce DAPI (Vectashield Plus) içeren antifade montaj malzemesi eklendi.

Görüntüler, 0.18 um'lik bir adım boyutuna sahip bir Z-serisi modeli kullanılarak farklı düzlemlerde bir x63 yağlı objektif lensli bir FluoView FV1000 Konfokal Mikroskop (Olympus) kullanılarak elde edildi. Analiz sırasında, grip görüntüleme yazılımı sürüm 4.3b(Olympus) kullanılarak maksimum yansıtılan görüntü elde etmek için tek tek düzlemler ayrıştırıldı ve istiflendi. Örnek başına 5 farklı alandan en az 5 görüntü alındı. ABCAl glomerüler ortalama floresans yoğunluğunun (MFI) ölçümü Fiji—ImageJ yazılımı kullanılarak yapıldı.

OSBPL'nin saptanması için, OCT'ye gömülü donmuş böbrek korteks bölümleri, oda sıcaklığında 20dk boyunca PBS içinde PFA-sükroz (yüzde 2, yüzde 4) ile sabitlendi ve yüzde 0,3 Triton-PBS ile geçirgenleştirildi. 15 dakika ve 1 saat boyunca bloklama tamponu (PBS içinde yüzde 5 FBS) ile bloke edildi. Doku kesitleri daha sonra tavşan anti-OSBPL7 (Sigma, 1:50) ve Keçi anti-Synaptopodin(Santa Cruz, 1:800) antikorları ile nemlendirilmiş bir odada 4 derecede gece boyunca inkübe edildi. Kapsamlı bir şekilde yıkandıktan sonra, numuneler daha sonra florokrom konjuge ikincil antikorlarla inkübe edildi ve yukarıda tarif edildiği gibi montaj ortamı ile kaplandı. Görüntüler bir Leica DMI 6000B floresan mikroskobu kullanılarak alındı.

istatistiksel analiz. Tüm istatistiksel analizleri gerçekleştirmek için GraphPad Prism ver 6 veya 7 kullanıldı. Gruplar, iki kuyruklu t testi veya Tek yönlü ANOVA ve ardından Dunnett veya Tukey testi kullanılarak karşılaştırıldı. Gruplar arasındaki anlamlı varyansları belirlemek için F, Brown-Forsythe veya Bartlett testi kullanıldı, eğer P<0.05, then="" groups="" were="" compared="" using="" two-tailed="" mann-whitney,="" or="" kruskal-wallis="" followed="" by="" dunn's="" tests.="" the="" correlation="" between="" albuminuria="" and="" accumulation="" of="" cholesterol="" ester="" in="" kidney="" cortexes="" was="" assessed="" using="" the="" spearman="" coefficient="" test.="" p=""><0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" only="" data="" from="" independent="" experiments="" were="">

Tüm hayvanlar rastgele tedavi gruplarına ayrıldı.