Bölüm2: Krϋppel-benzeri Faktör 15, P53 SUMO1 Konjugasyonunu Güçlendirerek Renal Glomerüler Mezanjiyal Hücre Proliferasyonunu Bastırır

Daha fazla bilgi için. İletişimtina.xiang@wecistanche.com

3. SONUÇLAR

3.1|Birincil renal glomerüler MC'lerde ChIP-Seq yoluyla KLF15-bağlayıcı genlerin taranması

KLF15'in doğrudan bağlanan partner genlerini belirlemek için ChlP-Seq analizi yaptık ve sonuçta 2478 geni taradık. Bu genlerin www.uniprot.org web sitesindeki araç aracılığıyla GO analizi (Şekil 1A, B) 1941 genleriyle ilişkili moleküler işlev terimlerini, 1662 genle ilgili hücresel bileşen terimlerini ve 1766 genle ilgili biyolojik süreç terimlerini ortaya çıkardı. Amacımız KLF15'in MC'leri nasıl etkilediğini bulmak olduğundan, hücre süreci ile ilgili genlere odaklandık. 1315 hücre süreci ile ilgili gen arasında, 74 genin hücre döngüsü süreçlerine katıldığı bulundu; spesifik olarak, bu genler mitotik hücre döngüsüne, hücre döngüsü faz geçişine ve diğer işlemlere katıldı(Şekil 1C,D). Ayrıca, büyümeye dahil olan genleri analiz ettik ve bunların gelişimsel büyüme, hücre büyümesi ve diğer büyüme türleri ile ilişkili olduğunu bulduk(Şekil 1E).

3.2|SILAC ve LC/MS kullanılarak renal glomerüler MC'leri aşırı eksprese eden KLF15-'de diferansiyel olarak düzenlenmiş genlerin taranması

Ana hücrelere kıyasla KLF15'i aşırı eksprese eden HRMC'lerin SILAC ve LC/MS analizi, 1357 proteinin tanımlanmasına yol açtı. SILAC tarafından tanımlanan nicelenmiş proteinlerin GO alanlarını ve zenginleştirilmiş yollarını elde etmek için DAVID ve IPA'yı kullandık. İlginç bir şekilde, birçok proteinin biyolojik fonksiyonla ilgili terimleri, hücresel amino asit metabolik sürecinin düzenlenmesi, proteazom kompleksi, protein bağlanması ve transkripsiyon ve translasyon terimleri de dahil olmak üzere, önemli ölçüde zenginleştirilmiş ilk 30 GO terimi arasındaydı; ubiquitination(Şekil 2A). Şekil 2B, önemli ölçüde zenginleştirilmiş ilk 30 yol terimini göstermektedir. Proteazom ve nörodejeneratif hastalık terimleri de dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreç terimleri de ubiquitination ile ilgilidir.

hakkında bilgi almak için tıklayıncistanchedetayları ile satılık

3.3|Potansiyel olarak renal glomerüler MC proliferasyonu ile ilişkili olan KLF15-bağlayıcı genlerin biyoinformatik analizi

Potansiyel olarak ilişkili olan KLF15-bağlayıcı genleri keşfetmek içinböbrek glomerülerMC çoğalması, ChIP-Seq verilerinin ve SILAC-LC/MS verilerinin biyoinformatik analizini gerçekleştirdik. Elli iki gen tarandı (Tablo 2 ve Şekil 2C) ve SUMO1, makrofaj göçü önleyici faktör (MIF), ökaryotik başlatma faktörü (EIF), insülin benzeri büyüme faktörü (IGF) ve retikülokalbin (RCN) dahil olmak üzere bu genlerin beşi ), yakından ilişkiliydi.hücre çoğalması. Diferansiyel olarak eksprese edilen proteinlerin GO ve yol analizleri, taranan genlerin esas olarak ubiquitination süreci ile ilgili olduğunu öne sürdüğünden, ubikuitin benzeri (UBL) protein ailesinin bir üyesi olan SUMO1'in, benzer şekilde translasyon sonrası modifikasyona katıldığı sonucuna vardık. KLF15'in hedef geni olarak ubiquitination.

Artan miktarda kanıt, HG'nin diyabetik nefropati gelişimini indükleyen ana faktörlerden biri olduğunu ve in vitro MC proliferasyonunu ve artan matris sentezini desteklediğini göstermiştir.25 Önceki bir çalışma, PDGF-BB'nin gelişimden önce MC proliferasyonu için gerekli olduğunu göstermiştir. deneysel glomerülonefritte glomerülosklerozun değerlendirilmesi.26 MC'lerin in vitro olarak HG veya PDGF-BB tarafından uyarıldığını doğruladıktan sonra, hem RNA hem de proteinde KLF15 ve SUMO1 ekspresyonunda değişiklikler tespit ettik.

seviyeleri ve bu moleküllerin benzer eğilimlere sahip olduğunu buldu (Şekil 2D-l). Son olarak, SUMO1'in KLF15'in hedef geni olduğunu belirledik.

3.4|KLF15, 16 bp'lik bir CACCCA-SUMO-1 promotör bölgesine ve bir C artı A açısından zengin motife bağlanarak SUMO-1 gen ekspresyonunu yukarı doğru düzenler

KLF15 ChlP-Seq verilerinden taranan 52 genin KLF15-bağlama motiflerini karakterize etmek için MEME paketini(http://meme-suite.org/tools/meme) kullandık ve KLF-bağlama motifini belirledik (Şekil 3A).Ayrıca, SUMO1 promotörünün yukarısındaki binden fazla bazı analiz ettik ve KLF15'in 16 bp'lik bir diziyi (nükleotidler -205~-199) tanıyabildiğini ve buna bağlanabildiğini bulduk - CACCCA-(Şekil 3B).ChIP-PCR, KLF15'in SUMO1 promotörüne bağlı olduğunu doğruladı ve sonuçlar, anti-KLF15 antikor grubunda arka plan kontrol grubuna göre önemli ölçüde daha yüksek SUMO1 ekspresyonu gösterdi (Şekil 3C).

Ayrıca, SUMO1 ve KLF15 arasındaki hedefleme ilişkisini doğrulamak için bir çift lusiferaz raportör testi gerçekleştirdik. Yabani tip SUMO1 promotör grubu, HRMC'lerde pGL3 vektörü ve mutant gruplarından daha yüksek lusiferaz aktivitesi gösterdi ve aktivite, KLF15'in aşırı ekspresyonu ile önemli ölçüde arttı. Lusiferaz aktivitesindeki geliştirmeler, mutant promotör bölgesini eksprese eden bir plazmit ile transfeksiyon yoluyla tersine çevrildi(Şekil 3D). Birlikte ele alındığında, bu veriler SUMO1'in KLF15'in doğrudan bir transkripsiyonel hedefi olduğunu göstermektedir.

3.5 |SUMO1'in SUMOylation substratı olarak P53'ün taranması

SUMO modifikasyonları, ökaryotlarda yaygın olarak ifade edilen translasyon sonrası modifikasyonlardır. Bu modifikasyonların substrat proteinlerine geri dönüşümlü konjugasyonu, hedef proteinlerin işlevlerinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynayan ve ayrıca nükleositoplazmik taşıma, transkripsiyonel düzenleme, apoptoz, protein stabilizasyonu, stres tepkileri gibi çeşitli biyolojik işlemlere katılan SUMOilasyon olarak da bilinir. hücre döngüsü ilerlemesi.27 Doğrudan SUMO1 tarafından konjuge edilen aşağı akış sinyal moleküllerini keşfetmek için, IPA veritabanını kullanarak SUMO1'in bir ağ analizini gerçekleştirdik ve veriler, SUMO1'in diğerlerinin yanı sıra P53, APP, JUN ve AKT'ye doğrudan konjuge olabildiğini gösterdi. proteinler(Şekil 4A-C). Başlangıçta P53'ü SUMO1'in aşağı akış molekülü olarak seçtik çünkü hücre proliferasyonu ile yakından ilişkili iyi bilinen bir proteindir.28.29 Ayrıca, P53invarious türlerinin olası SUMOylation dizilerini tahmin etmek için SUMOsp yazılımını kullandık ve P53'ün SUMOylation dizisine sahip olduğunu bulduk（ Şekil 4D）. P53'ün gerçekten SUMOylation tarafından değiştirilip değiştirilmediğini belirlemek için, HRMC'leri bir SUMO1 aşırı ekspresyon plazmidi veya SUMO1 siRNA ile geçici olarak transfekte ettik. Hem IP hem de Western blot sonuçları, SUMO1-P53 ve P53'ün ifade değişikliklerinde değişikliklerle tutarlı olan eğilimleri ortaya çıkardı. SUMO1'de (Şekil 4E-J). Bu veriler, P53'ün SUMO1'in bir SUMOylation substratı olduğunu gösterir.

3.6 |KLF15, SUMO1 ekspresyonunu ve P53 SUMOylation'ı teşvik ederek MC proliferasyonunu inhibe eder

P53 SUMOylation ve MC proliferasyonunun KLF15 ve SUMO1 tarafından düzenlenmesini sağlamak için HRMC'lerde KLF15 veya SUMO1 ekspresyonu ile müdahale ettik ve HRMC'leri PDGF-BB ile tedavi ettik. PDGF-BB ile tedavi edilen HRMC'ler arasında, KLF15 aşırı ekspresyon plazmidi ile transfekte edilmiş hücreler, KLF15 kontrol plazmidi ile transfekte edilmiş hücrelerden daha yüksek SUMO1-P53, P53, KLF15 ve SUMO1 ekspresyonu sergilemiştir. SUMO1-P53, P53 ve SUMO1'deki aynı değişiklikler, SUMO1 aşırı ekspresyonu plazmid ile transfekte edilmiş hücrelerde bulunurken, bu hücrelerde KLF15 ekspresyonu değişmemiştir (Şekil 5A-F). PDGF-BB, şimdiye kadar açıklanan MC'lerin en etkili büyüme faktörlerinden biridir ve HRMC'lerin PDGF-BB'ye proliferatif yanıtı gözlenmiştir. Şekil 5G, H'de gösterildiği gibi, EdU-pozitif hücrelerin yüzdesi, rekombinant PDGF-BB'nin uygulanmasıyla önemli ölçüde arttı. EdU boyama sonuçları, hem KLF15 hem de SUMO1 aşırı ekspresyonunun PDGF-BB ile indüklenen hücre proliferasyonunu inhibe ettiğini gösterdi (Şekil 5G, H).

KLF15 ve SUMO1'in çoğalan HRMC'lerdeki rolleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için hücreleri yalnızca SUMO1 siRNA ile transfekte ettik veya bunları SUMO1 siRNA ve bir KLF15 aşırı ekspresyon plazmidi ile birlikte transfekte ettik. SUMO1'in aşağı regülasyonu, KLF15'in ifadesini etkilemedi, ancak SUMO1-P53 ve P53'ün ifade seviyeleri, SUMO1 siRNA transfeksiyonundan sonra açıkça azaldı(Şekil6A-C). Ek olarak, SUMO1 ekspresyonu inhibe edildiğinde, KLF15'i aşırı eksprese eden hücrelerde bile SUMO1-P53 ve P53 ekspresyon seviyeleri de baskılanmıştır (Şekil 6D-F). Daha sonra, bir EdU boyama deneyi kullanılarak MC proliferasyonu değerlendirildi. SUMO1 RNAi, PDGF-BBon HRMC'lerin çoğalma etkisini arttırdı ve KLF15 aşırı ekspresyon plazmidi ve SUMO1 siRNA ile birlikte transfekte edilen grup, aşırı ekspresyon plazmidi ve hibrit dizi kontrol siRNA ile birlikte transfekte edilen gruptan daha fazla EdU-pozitif hücreye sahipti (Şekil 6G, H) . Bu nedenle, KLF15'in P53 SUMOylation'ı artırarak MC proliferasyonunu baskıladığı sonucuna varıyoruz.

3.7|Glomerüler MC'lerde küresel SUMO1 ve P53 ekspresyonu, sıçan Thy-1 nefritinde MC proliferasyonu ile negatif ilişkilidir

Anti-Thy1 nefrit, proliferatif faz ve iyileşme fazı ile kendini sınırlayan mezangial proliferatif glomerülonefritin klasik bir modelidir. Bu modeli oluşturmak için Wistar sıçanlarına bir Thy1 antikoru enjekte ettik. Hem serum üre nitrojeni hem de kreatinin, kontrol sıçanları ve model sıçanlar arasında önemli bir değişiklik göstermemiştir (Şekil S1). Model sıçanlarda proliferatif faz (5. ve 7. günler) sırasında belirgin mezangial proliferasyon ve ECM birikimi gözlendi ve 10. günde iyileşme fazı sırasında MC'lerin sayısı azaldı (Şekil 7A). Ayrıca IHC tarafından hücre proliferasyon belirteci PCNA'daki ekspresyon değişikliklerini de saptadık (Şekil 7A, B). PCNA seviyeleri 5. günde arttı, 7. günde zirve yaptı ve 10. günde azaldı (Şekil 7F). Western blot analizi, izole glomerüllerde P53, SUMO1 ve KLF15'in protein ekspresyonunun, immünohistokimyasal sonuçlarla (Şekil 7E, F) tutarlı olarak model gruplarında kontrol grubuna göre (Şekil 7C, D) daha düşük olduğunu gösterdi. Bu sonuçlar, anti-Thy1 model sıçanlarda MC'lerin anormal çoğalmasının, KLF15 ve SUMO1'in düşük seviyeli ifadesi ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Bu moleküllerin ekspresyonuna müdahale etmenin sıçanlarda patolojik fenotipi hafifletmesi beklenir.

4. TARTIŞMA

buglomerülfiltrasyon üniteleridir.böbrek. Glomerüler fonksiyon bozukluğu, primer glomerüler patolojiden kaynaklanabilir veya sistemik hastalıklara sekonder olabilir. MC'lerin hiperproliferasyonunun ardından aşırı ECM üretimi (mezangial genişleme) ve inflamatuar hücreler için kemoatraktan üretimi dahil olmak üzere glomerüler hasarı takiben mezangial değişiklikler görüldü. Bu nedenle, özellikle anormal proliferasyon olmak üzere MC yanıtlarının modülasyonu yeni bir terapötik yaklaşımdır. KLF15, spesifik DNA dizilerine bağlanarak transkripsiyon faktörü olarak düzenleyici rol oynayan bir proteindir. Birçok çalışma, KLF15'in hücre proliferasyonunun düzenlenmesinde rol oynadığını bildirmiştir. Örneğin, KLF15'in MC proliferasyonu ile ilgili sinyal yollarının inhibisyonuna katıldığı bulunmuştur,15,30 ancak doğrudan hedef geni literatürde bildirilmemiştir. Bu nedenle, bu çalışma esas olarak KLF15'in doğrudan hedef genini tanımlamak için transkripsiyon ve translasyon seviyelerinin ortak taramasını içeriyordu.

KLF15, farklı türlerdeki ve farklı doku ve organlardaki farklı genleri düzenler. MC'lerin çoğalmasını düzenleme sürecinde, KLF15 birden fazla genin ifadesini etkiler ve birden çok yola katılır.131,32 KLF15'in doğrudan hedef genlerini araştırmak için ChIP-Seg.Klein RH ve meslektaşları ChlP-seq kullandık. kornea epitel hücrelerinin farklılaşması üzerinde KLF7 düzenlemesini incelemek için kullanılan teknoloji.33 Ying M ve diğerleri, bu tekniği KLF9'un glioblastomun pluripotensi üzerindeki inhibitör etkisini incelemek için kullandı.34ChlP-chip ile karşılaştırıldığında, ChIP-Seq gerçek tam genom analizini mümkün kılar daha yüksek çözünürlük, daha yüksek algılama hassasiyeti ve daha düşük numune boyutu talebi ile.35 KLF15 ile doğrudan bağlı DNA parçalarını elde etmek için ChP kullandık ve GenBank ile karşılaştırma ve analizden sonra 2478 olası hedef geni taradık. GO ve yol analizleri yoluyla hücre döngüsü ve çoğalma süreçlerinde yer alan birçok hedef gen belirledik.

ChlP-Seq deneyleri, algılama sinyalinin amplifikasyonu için PCR gerektirir ve amplifikasyon işlemi sırasında bir dereceye kadar yanlılık kaçınılmazdır. Ayrıca ChIP-Seq, yalnızca KLF15'in bağlanabileceği genleri elde eder ve KLF15'in ifadesi değiştiğinde bu genlerin ifadesinde meydana gelen değişiklikleri göstermez. Bu eksiklikleri telafi etmek için SILAC-LC/MS proteomik analizini kullandık. Bu teknik, doğrudan KLF15 tarafından düzenlenen proteinler ve dolaylı olarak düzenlenen veya translasyon sonrası modifiye edilen proteinler dahil, ifadesi KLF15 tarafından düzenlendiğinde değişen tüm proteinler hakkında bilgi sağlar. HRMC'ler, SILAC kullanılarak kültürlendi ve KLF15, hücrelerde plazmit transfeksiyonu yoluyla aşırı eksprese edildi. Proteinler, LC/MS tespiti için toplandı ve 1357 farklı şekilde eksprese edilen protein elde edildi. GO ve yol analizleri, diferansiyel olarak eksprese edilen proteinlerin bazılarının ubiquitination ile ilgili olduğunu ortaya çıkardı. Gen ve protein verileri kesişti. Araştırma amacı ile ilgili olmayan ve doğrudan KLF15 tarafından düzenlenmeyen genler çıkarıldı; sonuçta 52 gen tarandı. Bunlar arasından en belirgin ekspresyon farklılıklarına sahip olan ve proliferasyonla en yakından ilişkili olan beş gen seçildi. Yol analizi, çoğalan HRMC'lerde SUMO1 ve KLF15 ekspresyon analizi, ChlP-PCR ve çift lusiferaz raportör analizlerinin birleşik sonuçları göz önüne alındığında, SUMO1 proteini, KLF15'in hedef geni olarak seçildi.

Ubikuitine ek olarak, artan sayıda UBL proteini, SUMO38 dahil olmak üzere 3637 nöral öncü hücre ekspresyonu, gelişimsel olarak aşağı regüle edilmiş 8(NEDD8)3940 ve interferon ile uyarılan gen 15(ISG15),41 tanımlanmaktadır. Bu değiştirici proteinler, çeşitli biyolojik süreçleri güçlü bir şekilde düzenler. SUMO'nun substratlara kovalent eklenmesi, SUMOylation olarak adlandırılır, nükleer-sitosolik taşıma, transkripsiyonel düzenleme, apoptoz, protein stabilite kontrolü, stres tepkileri ve hücre döngüsü ilerlemesi dahil olmak üzere bir dizi hücresel süreçte yer alan translasyon sonrası bir modifikasyondur.27SUMO tipik olarak bir konsensüs dizisini barındıran protein substratlarının alıcı lizin kalıntılarına bağlanır ve protein-protein etkileşimlerinin düzenlenmesine ve ayrıca hücre altı bölümlendirmeye ve protein stabilitesine katkıda bulunur.2 SUMOS ailesinin bir üyesi olarak sUMO1, substratı değiştirerek hücre proliferasyonunu etkileyebilir ve hücre döngüsü düzenleyici proteinleri stabilize eder.43 Bu nedenle, literatür raporu ve kapsamlı tarama ve analiz sonuçları ile bir araya geldiğinde, KLF15'in SUMO1'in mesanjiyal hücre proliferasyonu üzerindeki etkisini nasıl düzenlediğine odaklandık.

SUMO1'in alt katmanlarını belirlemek için IPA veritabanı ve SUMOsp yazılımını kullanarak SUMO1'in ağ analizini gerçekleştirdik. P53 üzerine yayınlanmış araştırma ile birleştiğinde, ilk tarama verilerimiz P53'ü SUMO1'in SUMOylation dizisi YKxD/E ile bir aşağı akış molekülü olarak önerdi. Önceki çalışmalar, P53'ün bir SUMOylation substratı olduğunu göstermiştir45 ve geliştirilmiş P53 SUMO1 konjügasyonu, P53'ün stabilitesini ve aktivitesini ve indüklenmiş sensensi teşvik etmiştir.46 Çalışmamızda, HRMC'lerde SUMO1 ekspresyonuna müdahale, SUMO1-P53 ve P53, P53'ün SUMO1'in bir SUMOylation substratı olduğunu gösterir.

Ortaya çıkan kanıtlar, SUMOylation ve de-SUMOylation'ın renal disgenezi, renal karsinom, glomerüler hastalık, podosit apoptoz ve renal medulla hipertonisitesi, akut böbrek hasarı ve nefrolitiazis gibi çok sayıda nefropatik hastalıkta rol oynadığını göstermiştir.7-51 KLF15, SUMO1, P53 SUMOylation ve MC proliferasyonu arasındaki ilişki için, PDGF-BB ile indüklenen proliferasyona maruz kalmış hücreler üzerinde bir dizi transfeksiyon tedavisi gerçekleştirdik. KLF15'in aşırı ekspresyonu, SUMO1'in ekspresyonunu yukarı doğru düzenlerken, SUMO1'in aşırı ekspresyonu, KLF15'in ekspresyonunu etkilemedi. KLF15 veya SUMO1 aşırı ekspresyonu, P53'ün SUMOilasyonunu arttırdı ve PDGF-BB tarafından indüklenen hücre proliferasyonunu antagonize etti. SUMO1 ekspresyonu inhibe edildiğinde, P53'ün SUMOylation'ı da inhibe edildi ve KLF15, hücre proliferasyonu üzerindeki antagonistik etkisini kaybetti. Canlılarda. MC'lerin proliferasyonu, mesanjiyal proliferatif nefritin alevlenmesiyle kademeli olarak artarken, KLF15, SUMO1 ve P53 ekspresyonu önemli ölçüde azaldı. Hücreler ve dokulardaki entegre gözlemler göz önüne alındığında, KLF15'in P53'ün SUMOilasyonunu SUMO1 aracılığıyla düzenlediği ve böylece MC proliferasyonunu inhibe ettiği sonucuna varıyoruz.

5. SONUÇLAR

Bazı çalışmalar, KLF15'in MC'lerin çoğalmasını düzenlemede önemli bir rol oynadığını göstermiştir. Bu çalışmada, bu transkripsiyon faktörünün aracılık ettiği MC proliferasyonunu baskılama mekanizmalarını araştırdık. SUMO1'i ChIP-Seq ve SILAC-LC/MS'yi içeren biyoinformatik analizler yoluyla MC'lerde KLF15'in birincil hedefi olarak belirledik. Ayrıca, IPA veritabanı ve SUMOsp yazılımının yardımıyla, P53'ün SUMO1'in doğrudan bir substratı olduğunu belirledik. İn vitro ve in vivo deneyler, KLF15'in SUMO1 ekspresyonunu ve P53'ün SUMOilasyonunu teşvik edebildiğini ve ardından MC'lerin proliferasyonunu engellediğini doğruladı (Şekil S2). Bu sonuçlar, KLF15'in MC proliferasyonundaki düzenleyici rolünün anlaşılmasına katkıda bulunur ve MC proliferasyonu ile ilişkili böbrek hastalıkları için yeni tedaviler bulmak için teorik bir temel sağlar.