Bitki Ekstraktlarındaki Doğal ve Alkali Oksitlenmiş Proantosiyanidinlerin Ultra Yüksek Çözünürlüklü UHPLC-MS/MS ile Karakterizasyonu

Daha fazla bilgi için. İletişimtina.xiang@wecistanche.com

Soyut: Bu çalışmada, alkali öncesi ve sonrası 55 bitki ekstraktının proantosiyanidin (PA) bileşimini analiz ettik.oksidasyonultra yüksek çözünürlüklü UHPLC-MS/MS ile. Doğal PA yapılarını ayrıntılı olarak karakterize ettik ve modifiye edilmiş PA yapılarındaki karmaşık değişiklikleri ve oksidasyon nedeniyle farklı PA sınıflarındaki tipik reaksiyon modellerini ve modellerini inceledik. Doğal PA'lar A ve B tipi PC'ler, PD'ler ve PC/PD karışımlarıdır. Ek olarak, galloillenmiş PA'lar tespit ettik. Farklı bitki özlerindeki B-tipi PC'ler oldukça stabildi vealkali oksidasyon. Bazı örnekler için, A tipi eter bağlantıları üreten PC'lerin molekül içi reaksiyonlarını tespit ettik. A-tipi PC'ler de hiç veya çok az değişiklikle oldukça kararlıydı, ancak bazı tesislerde ek eter oluşumubağlantılarbelirlendi. PD birimleri içeren PA'lar daha reaktifti. Alkali oksidasyondan sonra, bu PA'lar veya bunların oksidasyon ürünleri, 280 nm'de UV tarafından farklı tipte ve/veya gecikmeli bir PA tümseğinin hala tespit edilmesine rağmen artık MS tarafından tespit edilmedi. Galloillenmiş PA'lar, PC bazlı olduklarında alkali oksidasyon altında oldukça stabildi, ancak B tipinden A tipine intramoleküler dönüşümü tespit ettik. Galloillenmiş PD'ler daha reaktifti ve galoillenmemiş PD'lere benzer şekilde reaksiyona girdi.

anahtar kelimeler: yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi; yörünge; oksidasyon; tanenler; UHPLC-DAD-MS/MS

Daha fazla ürün öğrenmek için buraya tıklayın

1. Giriş

proantosiyanidinler(PA'lar, syn. yoğunlaştırılmış tanenler), flavan-3-ol monomerik birimlerden oluşan oligomerler ve polimerlerdir(Şekil 1). PA yapılarının çeşitliliği, esas olarak hidroksilasyon modellerinden, flavan-3-ol birimlerinin ardışık düzeninden ve polimerizasyon derecesinden (DP), ayrıca C2 ve C3'teki stereokimyadaki farklılıklardan ve konumdaki varyasyondan kaynaklanır. ve inter'in stereokimyasıflavanoidbağlar [1]. En yaygın PA'lar (epi)kateşin birimlerinden oluşan prosiyanidinler (PC'ler) ve (epi)gallokateşin birimlerinden oluşan prodelfinidinlerdir (PD'ler)(Şekil 1). Şekilde gösterilen PA yapıları C4→C8 bağlantılarına sahiptir. Ancak, PA'lar C4→C6 bağları ile de bağlanabilir ve bu iki bağlantıyı kütle spektrometrisi ile birbirinden ayıramayız.

PAs are the most commonly available subgroup of plant tannins, responsible for nearly 90% of the world's overall market for industrial tannins (>(yılda birden fazla 100-kilo ton) ve biyo-polimer [2-5] olarak kimyasal ve ekonomik olarak daha çekicidir. Şu anda, sumak, mimoza, quebracho, meşe, kestane, mangrov, sumak, myrobalans ve tara gibi ağaç kabukları veya odunları gibi sadece birkaç kaynak, bunların üretimi için ve esas olarak deri tabaklama, şarap, mineral talepleri için kullanılmaktadır. hayvan beslemeye ek olarak yapıştırıcıların hazırlanması için yüzdürme ve petrol sondaj endüstrileri [4,6,7]. Bununla birlikte, yukarıda sıralanan endüstriyel uygulamalardan kaynaklanan meyve, sebze ve orman kaynaklarının işlenmesi ve işlenmesinden kaynaklanan atık veya yan ürünler bile doğal KA'lar için potansiyel bir kaynak olabilir [8-11]. PA'lar ayrıca kullanılabilirliklerini ve biyoaktivitelerini geliştirmek için daha fazla modifiye edilebilir [12,13].

PA'ların kimyasal özellikleri, türevlendirme reaksiyonları yoluyla değiştirilebilir [12]. Bu reaksiyonlar, örneğin, asit klorürler veya anhidritler ile reaksiyon yoluyla O-açilasyonu veya alkil halojenürler ile alkilasyonu içerir. Türevlendirme, ticari uygulamaları ve saflaştırma teknolojileri için PA'ların fizikokimyasal özelliklerini değiştirir. Bununla birlikte, gerçekleşen reaksiyonları gerçekten anlamak için kullanılan reaktifler ve çözücüler, sıcaklık, pH ve reaksiyon süresi gibi çeşitli parametrelerin düzenlenmesi gerekir [12]. Bitki PA'larının kullanılabilirliğini iyileştirmenin basit ve hızlı bir yolu, değiştirilmiş moleküler yapılara sahip yeni PA'lar oluşturmak için onları oksitlemektir. Oksidasyonun reaksiyon koşulları iyi bilinmesine ve farklı reaksiyon mekanizmaları önerilmesine rağmen, karşılık gelen yapısal değişiklikler esas olarak bireysel küçük PA'lar için bilinmektedir [14-18]. Örneğin, farklı monomerik ve dimerik flavan-3-ollerin oksidasyon ve yeniden düzenleme reaksiyonları, 30 yıl önce zarif bir şekilde tartışıldı ve bu PA'ların alkali pH'taki kimyasının A-ve/veya oluşumu tarafından düzenlendiğini gösterdi. B-tipi kinon-metitler, yeniden düzenleme reaksiyonlarına ve B-tipinin A-tipi PA'lara oksidatif dönüşümüne neden olan oldukça reaktif ara maddeler olarak [15]. Bunun yerine, bitki özlerindeki PA karışımlarının davranışı bilinmemektedir ve bu büyük olasılıkla, oksidasyondan sonra daha da zorlanan yapısal olarak farklı başlangıç ​​PA'larını analiz etmedeki zorluklardan kaynaklanmaktadır. Önceki çalışmamızda, farklı tipteki doğal PA'ların yeni tip PA'lar üretmek için kimyasal olarak değiştirilip değiştirilemeyeceğini test ettik ve kabuk atıkları için sıklıkla kullanılan alkalin ekstraksiyon sürecini taklit eden spesifik olmayan alkali oksidasyonun [19-23]üzerindeki etkilerini inceledik. 102 PA içeren bitki özleri [13]. Sonuçlar, PC'ler ve PD'ler için farklı reaktiviteler gösterdi. Sonuç, bitki PA'larının yüksek pH'da değiştirilebileceğini ve PD gruplarının varlığının, modifikasyon reaksiyonlarının olasılığını önemli ölçüde arttırdığını gösterdi. Ana reaksiyon yolunun molekül içi olduğu sonucuna varıldı, ancak PD açısından zengin ve gallovle PA'lar için hem molekül içi hem de moleküller arası reaksiyonlar belirtildi [13]. Ek olarak, diğer çalışmalar, PA'ların oksidasyonunun hem molekül içi hem de moleküller arası reaksiyonları içerdiğini göstermiştir [14,15,24,25].

Doğal ve oksitlenmiş PA'ların ayrıntılı karakterizasyonu ve anlaşılması zordur, ancak yüksek çözünürlüklü kütle analizörleri ile ultra yüksek performanslı sıvı kromatografik tandem kütle spektrometrik (UHPLC-MS/MS) enstrümantasyonundaki son gelişmeler birçok farklı bitki PA'sının karakterizasyonunu mümkün kılmıştır. [18,26-28]. PA'ların karakterizasyonu için popüler kütle analizörleri orbitrap [27,28] ve dört kutuplu olmuştur.

bitki özlerinde çalışılan PA'ların tam kütlelerinin ve karşılık gelen moleküler formüllerinin belirlenmesine izin veren yüksek çözünürlüklü özelliklerinden dolayı uçuş süresi(OTOF)[29,30]. Doğada bulunan PA'lar genellikle, elektrosprey iyonizasyonunda çok yüklü iyonlar veren ve kullanılan kütle aralığını genişleten farklı oligo ve polimerik yapıların bir karışımını içerir [30-32]. Ek olarak, PA'lar, tanımlamaları için kullanılabilecek iyi bilinen karakteristik parçalanma modellerine sahiptir: bunlar arasında kinon-metid (QM) bölünmesi, heterosiklik halka fisyon (HRF) ve retro-Diels-Alder (RDA) parçalanması bulunur [27, 31-33]. Aynı parçalanma modelleri genellikle hem A tipi hem de B tipi PA'lar için mevcuttur ve bir eter bağlantısına sahip A tipi PA'lar için gözlemlenen m/z değerleri, karşılık gelen B tipi PA'lardan 2 Da farklıdır [26,{{ 19}}].

Bu çalışmada, (a) 55 PA bakımından zengin bitki örneğindeki doğal PA yapılarını ayrıntılı olarak incelemek, (b) sonrasında modifiye PA yapılarındaki karmaşık değişiklikleri görmek için ultra yüksek çözünürlüklü tandem kütle spektrometrisi ile birleştirilmiş UHPLC kullandık. alkali koşullarda hava oksidasyonu ve (c) oksidasyona bağlı olarak farklı PA sınıflarındaki tipik reaksiyon modellerini ve modellerini tanımak.

2. Sonuçlar ve Tartışma

Önceki çalışmamıza dayanarak ilginç fakat karmaşık doğal PA karışımları içeren 55 PA açısından zengin bitki örneği seçtik [13]. Bu bitki örnekleri benzer şekilde [13]'te olduğu gibi alkali koşullar altında hava oksidasyonuyla oksitlendi ve oksidasyondan sonra PA'lar daha da karmaşıktı. Bu doğal ve modifiye edilmiş PA'lar, PA yapılarındaki karmaşık değişiklikleri tespit etmek için ultra yüksek çözünürlüklü Q-orbitrap MS/MS'ye bağlı UHPLC-DAD tarafından burada incelenmiştir. PA'lar, karşılık gelen tam kütleleri ve moleküler formülleri ile tek ve/veya çok yüklü iyonlarına göre tanımlandı. Analizler, ters fazlı LC ile gerçekleştirilmiştir ve bu nedenle, oligomerik ve polimerik PA'lar, 280 nm'de UV kromatogramlarında esas olarak çözülmemiş tümsekler olarak mevcuttu, bir örnek için Şekil 2A'da Ruprechtia salicifolia'nın yaprak özüne bakınız. Toplam iyon kromatogramında, diğer fenolik bileşiklerin iyonizasyonu PA'lardan daha yoğundu ve bu nedenle PA tümseği o kadar belirgin değildi (Şekil 2B). Bununla birlikte, çoklu yüklü iyonların izotop modelleri açıkça tanımlandığından ve olası piklerin örtüşmesi tespit edilebildiğinden, orbitrap doğruluğu MS sonuçlarının yorumlanmasını kolaylaştırır, böylece farklı oligo- ve polimerik PA'lar. Örneğin, m/z 441'de galloillenmiş (epi)kateşin, m/z 1017'de galloillenmiş dimerik PCat m/z729 ve galloillenmiş trimerik PC, Şekil 2C-E'de ekstrakte edilmiş iyon kromatogramlarında (EIC'ler) iyi ayrılmış tepe noktaları sergiler ve bunlar tam kütleler ve ilgili moleküler formül dahil olmak üzere UV ve kütle spektrumlarına dayalı olarak kolayca tespit edilebilir. Burada elde edilen sonuçlar, Ruprechtia salicifolia yapraklarının 24 mg/g PA içerdiğini, bunların sadece yüzde 3'ünün PD içeren PA'lar olduğunu, bazılarının galloillenmiş olduğunu ve mDP'nin bulunduğunu gösteren MS/MS tarafından elde edilen önceki sonuçlarla tutarlıydı. 7 [13] olmak.

2.1.B-Tipi PC'ler İlk Oksitlenmemiş Bitki Ekstraktlarında

Bitki ekstraktlarındaki B tipi PC'ler, karakteristik parçalanma modellerine ek olarak tek ve çok yüklü moleküler iyonlarına göre tespit edildi. Örneğin, Begonia bower'daki PC'ler, "Nigra" özütü, 288 Da ile m/z289'dan m/z 1729'a ayrılmış farklı bir dizi [MH] iyonu sergilemiştir, monomerden heksamere B-tipi PC'lere ve [M{{ 6}}H]' iyonları m/z 1008'den m/z 1296'ya kadar 144 Da ile ayrılır ve heptamerlerden nonamerlere B-tipi PC'lere karşılık gelir (Tablo S1). Monomerik PC'lerin kütle spektrumları, yani flavan-3-ols kateşin ve epikateşin, daha önce bildirildiği gibi m/z 245'te karakteristik bir fragman iyonu sergiledi [3132,36].

Genel olarak, B-tipi PC dimerlerinin MS/MS'si, m/z 287 ve 289'da (QM bölünmesi), m/z 425 ve 407'de (RDA parçalanması ve sıralı su eliminasyonu) ve m'de iyonlar veren karakteristik parçalanma modellerini gösterdi. /z 451(HRF; Şekil 3). RDA parçalanması, B-tipi PC dimerlerinin karakterizasyonu için en önemli parçalanma modeli olarak kabul edilir ve genişleme birimi üzerindeki parçalanmanın, daha büyük bir π-π-hiperkonjuge sistemli parça iyonları ürettiği için enerjisel olarak daha uygun olduğu düşünülmüştür. [31-33] terminal biriminde RDA parçalanması.

2.2.A-Tipi PC'ler İlk Oksitlenmemiş Bitki Ekstraktlarında

İlk bitki özütlerinde A tipi PA'ların varlığı, B tipi PA'lara benzer karakteristik parçalanma modelleri ile doğrulandı. Örnek olarak, bir A tipi bağlantıya sahip A tipi PC dimer ve trimerin karakteristik parçalanma yolları ve MS/MS verileri ayrıntılı olarak gösterilmiş ve tartışılmıştır (Şekil 4 ve 5). A-tipi PC dimerinin parçalanması, dört parça iyon üretti (Şekil 4). Terminal biriminin RDA parçalanması, m/z 423'te bir iyon üretti ve bu, A tipi bir bağlantının varlığını doğruladı [26,34,35]. Ek olarak, uzatma ünitesinin RDA parçalanmasının ve sıralı su kaybının m/z 407'de iyon üretebileceğini öneriyoruz. m/z 449'daki iyon, HRF üretimidir, yani kaybın sonucudur. floroglusinol birimi [26]. m/z 285 ve 289'daki iyonlar, QM bölünmesine karşılık geldi. Benzer şekilde, A-tipi PC trimer, m/z'de 863 bir moleküler iyon ve m/z'de MS/MS'de karakteristik fragman iyonları sergilemiştir. )[26]. A-tipi PC trimerinin RDA fragmantasyonu, m/z 711'de bir iyon üretti, bu da önceki çalışmaya göre A-tipi bağlantının varlığını doğrular [26] ve A-tipi bağlantının iki uzantı arasında olabileceğini ima eder. birimler. m/z 693'teki iyonun sıralı su kaybına karşılık geldiğini ve Şekil 5'te gösterildiği gibi A tipi bağlantının konumunu desteklediğini öneriyoruz. terminal flavan-3-ol birimi, iyonu m/z559'da sergiler. Bu iyon bizim çalışmalarımızda küçüktü. m/z573 ve 289'daki iyonlar, alt flavanoidler arası bağın QM bölünmesine karşılık geldi [26]. Ayrıca m/z 575 ve 287'de iyonlar tespit ettik. m/z 451 ve 411'deki iyonların, orta flavan-3-ol biriminin konumunu destekleyen heterosiklik C halkasının HRF'sine karşılık gelebileceğini öneriyoruz. Şekil 5'e göre genişletme birimleri arasında A tipi bağlantı.

2.3.B-Tipi PC'lerin Alkali Oksidasyon Nedeniyle Bitki Ekstraktlarındaki Modifikasyonları

Oksidasyondan sonra, farklı bitki ekstraktlarındaki B tipi PC'ler farklı şekilde modifiye edildi. Numunelerin bazıları hiçbir değişiklik göstermedi veya küçük değişiklikler gösterdi; bakınız Şekil 6A, B, örneğin, Begonia bower'ın yaprak ekstraktındaki daha kısa B-tipi PC oligomerleri için oksidasyon öncesi ve sonrası "Nigra"dır. Bu tür bitki özleri oksitlendiğinde, ilk ve oksitlenmiş bitki özlerinin toplam kütle spektrumları benzerdi. Bununla birlikte, ayrıntılı kütle spektrometrik verilerinde küçük farklılıklar tespit edildi. Örneğin, m/z 577'deki PC dimerine sırasıyla m/z575 ve m/z865'deki PC trimerine m/z 863 eşlik etti. Oksidasyondan önce PC'lerin miktarları düşük olduğunda, oksidasyondan sonra sinyalleri kütle spektrumlarından neredeyse kayboldu, bu da oksidasyon nedeniyle tanımlanamaz hale geldiklerini veya bozulduklarını ima etti. Bu fenomen, örneğin, düşük miktarlarda birkaç kısa PC oligomeri içeren Combretum Indicum ve Euphorbia characias yaprak özleri için gözlendi ve PA içeriğinin 4 mg/mL'den 1 mg'a düştüğünü gösteren önceki MS/MS verileriyle desteklendi. oksidasyon nedeniyle sırasıyla /mL ve 7 mg/mL ila 1 mg/mL [13]. Bu fenomen, kullanılan deneysel koşullarla ilgili olabilir; bu, başlangıçtaki PA içeriği düşük olduğunda daha şiddetli oldukları anlamına gelir. Bazı örneklerde, B-tipi PC'lerin bir kısmı daha fazla modifiye edilmiştir, örneğin Cyperus owoaii'nin yaprakçık ekstraktında oksidasyon öncesi ve sonrasında daha kısa B-tipi PColigomerler için Şekil 6C, D'ye bakınız. Bu tür bitki özleri oksitlendiğinde, ilk PC'lere kıyasla 2 Da'lık kütle farkını gösteren toplam kütle spektrumunda görünür farklılıklar tespit edildi (Şekil 6C, D, Tablo S2).

O-dihidroksi polifenollerin, yani PC'lerin katekol B-halkasının oksidasyonunun tipik olarak 2 Da'lık bir kütle farkı olan o-kinonlar verdiği iyi bilinmektedir. Aslında, bu tür oksidasyonun kütle spektrometrik analizlerinde de olabileceğini fark ettik. İyonizasyon sırasında PC'lerin kinon formlarının olası oksidasyonuna veya oluşumuna karşılık gelen PC'lerin m/z değerlerinden 2 Da daha küçük m/z değerlerine sahip kütle spektrumlarında küçük sinyaller olabilir (veriler yayınlanmamıştır). Burada alkali oksidasyonda o-dihidroksi polifenollerin ilk o-kinonları oluşturması mümkündür. Bununla birlikte, oluşan 0-kinon formları kararsızdır ve büyük olasılıkla daha hızlı tepki verir. Olası bir sonuç, literatürde daha önce bildirildiği gibi B-tipi PC'lerin A-tipi PC'lere oksidatif dönüşümü olabilir [15]. B-tipi PC'lerin A-tipi PC'lere dönüşümü, ilk adım olarak C-halkasının C2'sindeki hidrit iyonunun oksidatif olarak uzaklaştırılmasını içerir: hakim olan temel koşullar, B-halkasının o-dihidroksi işlevselliğinin oksidasyonunu indükler. daha sonra bir o-kinonaoksidanB-tipi prosiyanidin dimerinin A-tipi bire dönüştürülmesi için [15](Şekil 7). Bu kinon metid mekanizması ayrıca farklı sıcaklıklarda, pH'da ve katalitik koşullarda [37], nötr koşullar altında 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil radikalleri kullanılarak radikal oksidasyon [38] ve lakkaz ile kanıtlanmıştır ( EC1.10.3.2) [39].

MS/MS ile elde edilen oksitlenmiş ekstraktlarda ve bunların üretimlerinde 2 Da kütle farkı ile modifiye edilmiş PC'leri incelediğimizde, bunların A tipi PC'lere ve bunların fragman iyonlarına benzer olduğu sonucuna varıldı (yukarıda Bölüm 2.2'de tartışıldığı gibi), m/z 285 ve 289'da (QM bölünmesi), m/z 423(RDA parçalanması) ve m/z449'da (HRF) iyonlar veren karakteristik parçalanma modellerini gösterir. Örnek olarak, Şekil 8'de Microgramma Moritanya'nın yaprakçık ekstresinin B-tipi PC dimerlerinin A-tipi PC dimerlerine dönüşümünü gösteriyoruz.oksitlenmemişözü, m/z değerleri 577 olan (Şekil 8A) dört B-tipi PC dimeri saptadık, ancak m/z değerleri 575 olan A-tipi PC dimerleri (Şekil 8B) tespit etmedik. EIC'deki m/z575'teki küçük tepe noktaları, muhtemelen iyon kaynağındaki B tipi PC'lerin oksidasyonuna karşılık geldi, çünkü tutma süreleri B tipi PC'lerle tamamen aynı. Oksitlenmiş ekstraktta, m/z 577'de yalnızca ilk B tipi PC'lerin izlerini tespit ettik (Şekil 8C), ancak bunun yerine, m/z 575'te A tipi PC'lere karşılık gelen daha sonraki alıkonma sürelerinde yoğun tepe noktaları tespit ettik (Şekil 8C). 8D). m/z577'de EIC'de aynı alıkonma sürelerine sahip olan küçük tepe noktaları, m/z 575'in izotopik sinyallerine karşılık geldi. olarak karşılaştırılır. Ayrıca, B-tipi PC'nin A-tipi PC'ye dönüştürülmesinin her zaman bu örnekteki kadar eksiksiz olmadığına ve tüm B-tipi PC'lerin A-tipi PC'lere dönüştürülmediğine dikkat edilmelidir; kabaca tahmin edilen A tipi ve B tipi PC oligomerlerinin iyonlarının bolluğu eşitti. Öte yandan, bazı örneklerde 2 Da'dan daha fazla farklılık tespit ettik; örneğin, m/z 2017'deki PC heptameri, sırasıyla bir ve iki A tipi bağlantının oluşumuna işaret ederek m/z2015 ve 2013'te iyonlarla birlikte olabilir.

B tipi PC'lerin A tipine dönüştürülmesi ana reaksiyon mekanizması gibi görünse de, diğer modifikasyon reaksiyonlarını tamamen dışlayamayız. PA'lar, başlangıçtaki oksitlenmemiş özütlerde karmaşık karışımlar olarak mevcuttu ve bu karışımlar, muazzam miktarda MS verisi üreten alkali oksidasyondan sonra daha da karmaşıktı. Örneğin, PA'ların baz katalizli oksidasyonu ve yeniden düzenleme reaksiyonları üzerine önceki çalışmalar, PC dimerlerinin, florotaninler olarak da bilinen tetrahidroksipiranokromler dahil olmak üzere farklı C halkası izomerizasyon ürünlerine dönüşebildiğini göstermiştir [15]. Bu ürünler, 577'de çok benzer m/z değerleri, ancak LC'de farklı alıkonma süreleri ve MS'de farklı parçalanma modelleri sergileyecektir. m/z 577'deki EIC'lere dayanarak, kullanılan reaksiyon koşullarında bu tür yeniden düzenlemeler tespit etmedik. Heterosiklik C-halkasının yeniden düzenlenmesi ve açılması, bölgesel izomerizasyon, epimerizasyon veya 13-aril göçü yoluyla başka ürünler de üretebilir [15]. Epimerizasyon esas olarak üretim süreçleriyle ilgilidir ve örneğin, kakaonun kavrulmasıyla ilgili yüksek sıcaklıklar flavan-3-ol kayıplarına, aynı zamanda flavan-3-ol monomerlerinin, dimerlerinin epimerizasyonuna yol açar. , ve trimerler [40]. Ayrıca muz meyve etindeki polifenol oksidazın (-)-epigallocatechin'in (-)-gallocatechin'e epimerizasyonuna neden olduğu bildirilmiştir[41]. m/z289'da EIC'leri kullanarak flavan-3-ollerin olası epimerizasyonuna baktık ve genel olarak, kullanılan alkali oksidasyonun neden olduğu önemli epimerizasyon tespit etmedik. Bununla birlikte, Pavonia karnabahar çiçeklerinin oksitlenmiş özünde (-)-epikateçine göre daha yüksek miktarlarda ( artı )-kateşin tespit ettiğimiz için epimerizasyonu tamamen dışlayamayız (Şekil S1). Ayrıca, oksitlenmiş özlerin, redoks reaksiyonlarına neden olmuş olabilecek UHPLC-MS/MS'den önce nötralize edildiğine dikkat edilmelidir. Oksitlenmiş formlarda kinonlar, mevcut nükleofilik su ile reaksiyona girebilen elektrofillerdir ve bu, B-tipi PC'ler veren indirgeme reaksiyonu ile sonuçlanabilir, bu da bazı B-tipi PC'lerin neden etkilenmemiş göründüğünü açıklayabilir.

2.4.Alkali Oksidasyon Nedeniyle Bitki Ekstraktlarındaki A-Tipi PC'lerin Modifikasyonları

Farklı bitki özlerindeki A-tipi PC'ler, alkali oksidasyon nedeniyle farklı tepki verdi. Numunelerin bazıları hiçbir değişiklik göstermedi veya küçük değişiklikler gösterdi. Bu tür bitki ekstraktları alkali oksidasyona tabi tutulduğunda, toplam kütle spektrumunda önemli bir farklılık tespit edilmedi (örneğin, oksidasyondan önce ve sonra Aglaonema commutatum var. maculatum'un yaprak ekstraktında gözlenen ana iyonlar için Tablo S3'e bakın). Bununla birlikte, 2 Da'lık kütle farkına sahip olan ve ilave A-tipi eter bağlantılarının oluşturulabileceğini ima eden ayrıntılı kütle spektrometrik verilerinde küçük farklılıklar saptanabildi. Bu fenomen, A tipi PC'lere sahip bazı örnekler için daha belirgindi; bu A-tipi PC'lerin, alkali oksidasyona bağlı olarak ilave A-tipi eter bağlantıları oluşturduğu fark edildi (Şekil 9). Bu tür bitki özleri oksitlendiğinde, ilk A-tipi PC'lere kıyasla 2 Da'lık kütle farkını gösteren toplam kütle spektrumlarında belirgin farklılıklar tespit edildi. m/z 863 değerindeki [MH] iyonu, bir A tipi eter bağına sahip bir PC trimerine ve iki eter bağlantısına sahip bir PC trimerine m/z 861 değerindeki iyona karşılık gelir (Şekil 9A). ). Benzer şekilde, bir, iki ve üç eter bağlantısına sahip tetramerik PC'ler, sırasıyla m/z 1151, 1149 ve 1147'de [M-H]-iyonları tarafından tespit edildi (Şekil 9B). Orantılı olarak, bir taneye sahip pentamerik ve heksamerik PC'ler , iki ve üç eter bağı [M -H]- iyonları tarafından sırasıyla m/z 1439, 1437 ve 1435'te ve m/z 1727,1725 ve 1723'te saptandı (Şekil 9C, D; ancak, Bir PC heksamerinin m/z'sinde 861 [M -2H]2-iyon, m/z 1723'te [MH]-iyonundan açıkça daha fazlaydı ve bu nedenle, figür).

Ek A-tipi bağlantıların oluşumu da bu oligomerlerin alıkonma sürelerini etkilemiştir. PC'lerin polimerizasyon dereceleri arttıkça ek eter bağlantılarının sayısı bir dereceye kadar artıyor gibi görünüyordu, bu da ek bağlar için daha fazla pozisyon olduğu için bekleniyor. Bununla birlikte, yukarıda tartışıldığı gibi, iyonizasyon sırasında PC'lerin kinon formlarının olası oksidasyonuna veya oluşumuna karşılık gelen 2 Da'lık kütle farkıyla küçük sinyaller olabileceği de dikkate alınmalıdır. Bu pikler, A tipi PC'lere karşılık gelen ana piklerden önce Şekil 9'daki kütle spektrumlarında da görülebilir. İyonların bolluğu, izotop modellerinin şekilleri ve MS/MS ile elde edilen karakteristik fragman iyonları, ilave A-tipi eter bağlantılarının gözlemini doğruladı. Gözlenen bu molekül içi reaksiyonların, oksitlenmemiş ekstraktlara kıyasla oksitlenmiş ekstraktlarda daha yüksek PA oligomerleri veya polimerleri tespit edilmediğinden, ortalama polimerizasyon derecesini etkilemiyor gibi göründüğünü not etmek de önemlidir. Gözlem Mouls ve Fulcrand (2012) tarafından desteklenmektedir [14].

2.5. Hem PC hem de PD Alt Birimlerine Sahip PA'lara Sahip Bitki Ekstraktları ve Akalin Oksidasyonuna Bağlı Değişiklikleri

Numunelerin çoğu, hem (epi)kateşin hem de (epi)gallokateşin birimlerine sahip PA'ları içeriyordu, yani PA'lar PC/PD karışımlarıydı. Bu PC/PD karışımlarının, alkali oksidasyon yoluyla modifikasyona bağlı olarak akıbeti, PC'lere kıyasla farklıydı. PC/PD karışımları, hem UV hem de MS ile oksidasyondan önce bitki ekstraktlarında açıkça tespit edildi; örneğin, Podocarpus macrophyllus'un ilk yaprak özündeki küçük PA oligomerlerine bakın (Şekil 10A ve Tablo S4). Oksidasyondan sonra, modifiye edilmiş PA'lar, UVat 280 nm ile farklı bir tip ve/veya gecikmeli tümsek (Şekil S2) olarak hala tespit edildi, ancak MS tarafından artık tespit edilmediler, bakınız örneğin, oksitlenmiş yapraktaki eksik PA oligomerleri Podocarpus microphallus özütü(Şekil 10B ve Tablo S4). Ne değiştirilmiş PC/PD karışımlarına ne de olası bozunma ürünlerine karşılık gelebilecek başka bir sinyal tespit etmedik. Örneğin, m/z 577'deki PC dimer için, oksitlenmiş ekstraktta m/z 575'te karşılık gelen A-tipi PC dimerini tespit edebildik, ancak PC/PD dimerleri veya trimerleri için benzer farklı gözlemler yapılamadı (Şekil 10B). ESI-MS'de saptanabilir PC/PD oligomerlerinin kaybının nedeni, örneğin PA'lar [13-15,24,25] arasındaki moleküller arası reaksiyonlar olabilir. Moleküller arası reaksiyonların, iki farklı oligomerik zincirin bağlanmasıyla modifiye PA'ların oluşumuyla sonuçlandığı bilinmektedir ve tipik olarak, ortalama polimerizasyon derecesinde bir artışa yol açarlar [14]. Örneğin, Vernhet ve ark. (2014), küçük açılı X-ışını saçılım deneyleriyle, PA'lar konsantre çözeltilerde oksitlenirse, modifiye edilmiş PA'ların uzun doğrusal veya dallı zincirli yüksek polimerler olduğunu fark etmişlerdir [25]. Daha fazla oksidasyon, farklı PA'ların A ve B halkaları arasında siklizasyona da yol açabilir [24]. Ek olarak, bu yeni bağların ve yapıların asit katalizli bölünmeye karşı dirençli olduğu ve bu nedenle ortalama polimerizasyon derecesindeki artışın sadece depolimerize olmayan yöntemlerle tahmin edilebileceği kaydedilmiştir [14,24]. Ancak, sonuçlarımız, bu modifiye edilmiş PA'ların, PA'lar için kullanılan standart ESI-MS koşulları altında da tespit edilmediğini göstermiştir(Şekil 10). Önceki çalışmamızda, oksitlenmemiş ve oksitlenmiş numunelerdeki PA'ları saptamak için üçlü dört kutuplu seçilen reaksiyon izlemesine dayalı bir yöntem kullandık ve alkalin oksidasyon nedeniyle alt birim bileşiminin değiştiğini ve bu nedenle yöntemin artık algılama yeteneğine sahip olmadığını fark ettik. değiştirilmiş PA'lar [13]. Mevcut yüksek çözünürlüklü MS sonuçları, oksitlenmiş özütlerdeki modifiye PA'ların, oksitlenmemiş özütlerdeki ilk PA'lardan çok daha karmaşık olduğuna ve benzer UPLC-MS/MS koşulları altında tespit edilmediğine dair üçlü dört kutuplu önceki gözlemlerimizi desteklemektedir. [13].

Literatürde PA'ların oksidasyonu için kullanılan yöntemler bizim yöntemimizden oldukça farklıdır ve bu nedenle sonuçlar doğrudan karşılaştırılabilir olmayabilir [14,24,25]. Daha önceki çalışmalarda, şarap pH'ını taklit etmek için pH 3.5'te trifloroasetik asit ile asitleştirilmiş suda oksidasyon gerçekleştirilmiş ve gerçek oksidasyon, numunenin birkaç gün hava varlığında karıştırılmasıyla elde edilmiştir [14,24, 25]. pH 10'da karbonat tamponu ile alkali oksidasyonunu sadece bir saat kullandık.

Bitki özlerinin çoğu, hem PC hem de PD alt birimlerine sahip PA'ları içeriyordu ve sadece iki örnekte, PA'lar neredeyse PD saf olarak kabul edilebilirdi. Bu iki örnek, Callisiagenti varelegans ve Pellaea ooata'nın özleridir. B tipi PD'ler, Callisia nazik var. Oksidasyondan önce elegans özü; örneğin Tablo S5'teki küçük PD oligomerlerine bakın, ancak oksidasyondan sonra bu PD'ler artık MS tarafından tespit edilmedi. Ne değiştirilmiş PD'lere ne de onların olası bozunma ürünlerine karşılık gelebilecek başka bir sinyal tespit etmedik. Bununla birlikte, modifiye edilmiş PA'ların bazıları hala 280 nm'de UV ile daha düşük ve gecikmeli bir kambur olarak tespit edildi (Şekil S3). İlginç bir şekilde, oksidasyondan önce, Pellaea veri özünde A tipi trimerik PD'ler tespit edildi ve oksidasyondan sonra bu sinyaller hala mevcuttu, ancak yoğunlukları önemli ölçüde daha düşüktü.

MS ile ve ayrıca, PD trimerlerinde ek A tipi bağlantıların oluşumuna karşılık gelen m/z değerleri, A tipi PC'lere benzer şekilde tespit edildi (Tablo S6). Bu, B tipi homo ve heterojen PD'ler için gözlemlenen moleküller arası reaksiyonlara ek olarak, A tipi PD'lerin, A tipi PC'ler için tespit edilen benzer molekül içi reaksiyonlara sahip olabileceğini gösterebilir.

2.6. Bitki Ekstraktlarında Galloed PA'lar ve Alkali Oksidasyon Nedeniyle Değişiklikleri

Bazı bitkiler galloillenmiş PA'lar içeriyordu. Bitki özlerinde tahsis edilen PC'lerin, PD'lerin ve PC/PD'lerin varlığı, karakteristik parçalanma modelleriyle doğrulandı. Genel olarak, MS analizinde gallovle edilmiş PA'ların parçalanması, yukarıda tartışıldığı gibi RDA., HRF ve QM mekanizmaları yoluyla benzer şekilde meydana geldi [31-33]. Örnek olarak, Ruprechtia salicifolia'nın yaprak ekstraktındaki galloillenmiş bir PC dimerinin karakteristik parçalanma yolu ve MS/MS verileri ayrıntılı olarak gösterilmiş ve tartışılmıştır(Şekil 11). Galloil grubunun konumu yalnızca gösterge niteliğindedir ve terminal birimindeki herhangi bir başka serbest hidroksil grubuna eklenebilir. m/z603'teki iyon HRF üretimidir. m/z 287 ve 441'deki iyonlar, QM bölünmesine karşılık geldi. Ek olarak, m/z577'de PC dimerine karşılık gelen iyonla sonuçlanan galloil grubunun bölünmesini ve ardından m/z425'te bir iyonla RDA parçalanmasını ve m/z 407'de bir iyonla suyun daha fazla bölünmesini saptadık. m/z 577'nin HRF'si, m/z 451'de fragman iyonu üretti. Ek olarak, aromatik halkalara karşılık gelen m/z 109,123 ve 125'te küçük fragman iyonları tespit ettik. Galloillenmiş PA'lar yapılarında birkaç galloil grubu içerebilir (Tablo S7).

Farklı galloillenmiş PA'lar, alkali koşullar altında hava oksidasyonu sırasında farklı davrandı. Galloillenmiş PC'ler oldukça stabildi ve galoillenmemiş PC'lere benzer şekilde reaksiyona girdi. Örneğin, Nepenthes maxima'nın oksitlenmiş yaprak ekstraktında yapılarında bir galloil grubuna sahip galloillenmiş PC'ler için kayda değer bir değişiklik tespit edilmedi (Tablo S7). Bununla birlikte, iki veya daha fazla galloil grubuna sahip galloillenmiş PC'ler için iyonların yoğunluğunun, Nepenthes maxima'nın oksitlenmiş ekstraktında daha düşük olduğuna ve örneğin, birkaç galloil grubuna sahip galloillenmiş PC pentamerlerinin artık tespit edilemediğine dikkat edilmelidir(Tablo). S7). Bazı galloillenmiş PC'ler için tamsayı m/z değerleri, PC/PD'ler için m/z değerlerine benzerdir ve bu nedenle, ultra yüksek çözünürlüklü MS gereklidir. Örneğin, m/z 881, iki PC ve bir PD biriminden oluşan trimerik bir PA'ya (C4sH3; O19, mhesaplanmış 882.20074) ve iki galloil grubuna (C44H34O20, mhesaplanmış,882.16435) sahip galloillenmiş bir PC dimerine karşılık gelir. Coccoloba uvifera'nın oksitlenmiş yaprak özünde olduğu gibi, ilk özütteki galloillenmiş PA'lar Nepenthes maxima'dakilere benzer görünse de, galloillenmiş PC'ler oksidasyon nedeniyle A-tipi galloillenmiş PC'lere dönüştürüldü. Örneğin, bir galloil grubuna sahip olan ve bir iyon m/z 729 sergileyen tahsis edilen PC dimeri (Tablo S7), Nepenthes maxima'nın yaprak ekstraktındaki alkali oksidasyon sırasında stabildi, ancak her ikisi de m'de iyonlar sergileyen Coccoloba uifera'nın yaprak ekstraktında kısmen modifiye edildi. /z 727 ve 729. İlk iyon, galloillenmiş bir A-tipi PCdimere (m/z727.13148, C37H2O16) karşılık geldi ve A-tipi bağlantıyı destekleyen karakteristik MS/MS fragmanları gösterdi:m/z601(m/z'nin HRF ürünü 727),575(A-tipi PCdimer), 557 (m/z575'ten suyun bölünmesi),449 (m/z575'in HRF'si, bakınız Şekil 4),423(m/z 575'in RDA'sı, bakınız Şekil 4),285 (m/z575'in QM'si, bkz. Şekil 4), 169 (gallik asit),125 (bkz. Şekil 11) ve 109(bkz. Şekil 11). Bitki ekstraktları arasındaki benzer PA'lardaki bu farklılıkların bir nedeni, ekstraktlarda bulunan ve PA'ların reaksiyonlarını etkileyen diğer bileşikler olabilir.

Galloillenmiş PC/PD karışımları ve PD'ler reaktifti ve galoillenmemiş PC/PD karışımları ve PD'lere benzer şekilde modifiye edildi. Oksidasyondan sonra bu PA'lar, 280 nm'de UV'de hala görünür olmalarına rağmen MS tarafından tespit edilmedi. Bu değiştirilmiş PA'lara veya olası bozunma ürünlerine karşılık gelebilecek başka herhangi bir sinyal tespit etmedik. Bir örnekte, yani Acacia karroo yapraklarında, modifiye galloillenmiş ve nongalloillenmiş PD'ler de 280 nm'de UV ile tespit edilmedi.

Oksitlenmemiş ve oksitlenmiş özütlerdeki PA'ların seçilen reaksiyon izleme yöntemleriyle analiz edildiği önceki çalışmamızda [13], oksitlenmiş numunelerde galloyle özgü MS/MS yöntemiyle berrak bir galloil tümseğinin tespit edildiğini fark ettik, ancak şekil tümseğin boyutu, UV kromatogramında gözlenen tümseklere göre değişmiş ve kaymıştır. Orijinal gallovle edilmiş PA'lar, galloil grubunun seçilen reaksiyon izleme yöntemiyle hala tespit edilebileceği şekilde modifiye edilmişti [13]. (-)-epigallocatechin gallate ve (-)-epigallocatechin ile ilgili önceki çalışmalar, trihidroksifenil B-halkasının oksidasyon için temel etki alanı olduğunu ve galloil parçasının oksidasyonundan kaynaklanan saptanabilir hiçbir ürün olmadığını göstermiştir [42]. Ancak oksidasyon azo başlatıcı 2,2'-azobis(2,4-dimetilvaleronitril)'in termolizi ile üretilen peroksil radikalleri ile gerçekleştirildiği için kullanılan reaksiyon koşulları ve elde edilen oksidasyon ürünleri çalışmamıza göre oldukça farklıydı. [42].

Galloillenmiş PA'lara ek olarak, Cephalotaxus harringtomia subsp. drupalı ​​yaprakçıklar ve Laurus nobilis yaprakları, bir PC yapısına bağlı bir şeker ünitesine sahip glikosile edilmiş PC'ler içeriyor gibiydi. Bu glikosile edilmiş B-tipi PC'lerin bazılarının, şeker biriminin bölünmesi olmaksızın alkalin oksidasyon sırasında glikosile edilmiş A-tipi PC'lere dönüştüğü fark edildi. Ek olarak, A tipi PC'lere ek eter bağlantılarının oluşumu tespit edildi.

3. Malzemeler ve Yöntemler

pH 1{{10}}'de oksidasyona ek olarak bitki materyallerinin toplanması, işlenmesi ve ekstraksiyonu daha önce bildirildiği gibi gerçekleştirilmiştir [13]. İlk çalışma 102 örnek içeriyordu ve bunlardan toplam 55 örneği daha analiz ettik (Tablo S8). Havadan oksidasyon için, her bir ekstraktın 20μL'si, oda sıcaklığında 1 saat süreyle 18{{40}}uL pH 1{{60}}tampon ile oksitlendi. Oksidasyon, 100 uL yüzde 0.6 sulu HCOOH eklenerek durduruldu. Ek olarak, hem oksitlenmemiş hem de oksitlenmiş numuneler için 300 uL'lik son hacmi elde etmek için analizden önce ilk oksitlenmemiş 20 μL'ye 280 μL su ilave edildi. Ultra yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrik analizi, bir UPLC-DAD-ESI-QOrbitrap-MS/MS ile gerçekleştirilmiştir. Cihaz, bir dört kutuplu-Orbitrap kütle spektrometresi (QExactiveTM, Thermo Fisher Scientific GmbH, Bremen, Almanya) ile birleştirilmiş bir Acquity UPLC sisteminden (Waters Corp., Milford, MA, ABD) oluşuyordu. Kullanılan kolon bir Acquity UPLC BEH Fenil kolonuydu (2.1 x 100 mm, 1.7 um, Waters Corp., Wexford, İrlanda). Eluentler, A= asetonitril ve B=0%0,1 HCOOH idi. 0,5 mLdk-1 akış hızı kullanıldı ve elüsyon profili şu şekildeydi:0-0. 5 dak, yüzde 0,1 B'de (izokratik); 0.5-5 dak,0.1-30 yüzde A'da B(doğrusal gradyan);5-6yüzde,30 yüzde {{44} } B'de yüzde A(doğrusal gradyan);6-6.1 dak, 35-90 B'de yüzde A(doğrusal gradyan); 6.1-9.5 dakika, kolon yıkama ve yeniden dengeleme. Enjeksiyon hacmi 5μL idi. UV （λ=190-500nm） ve MS verileri analiz boyunca kaydedildi. Negatif iyonizasyon, püskürtme gerilimi -3.0 kV, kılıf gazı (N2) akış hızı 60, yardımcı gaz (N2) akış hızı 20, süpürme gazı akış hızı 0, olan ısıtılmış bir ESI kaynağında kullanılmıştır. artı 380 derecelik kılcal sıcaklık ve 30 eV'lik kaynak içi çarpışma kaynaklı ayrışma (CID). Tam tarama MS için, yörüngenin kütle aralığı m/z150-2250, çözünürlük 35,000 ve otomatik kazanç kontrolü3×10* idi. MS/MS analizleri için, yani dd-MS2(TopN), parametreler aşağıdaki gibidir: TopN 3; kademeli normalize çarpışma enerjileri 20, 50 ve 80 eV, çözünürlük 17,500 ve otomatik kazanç kontrolü 1×105. Kalibrasyon Pierce ESI Negative Ion Calibration Solution (Thermo Fisher Scentific Inc., Waltham, MA, ABD) ile yapıldı. Veriler Thermo Xcalibur Oral Browser yazılımı (Version3.0.63, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ABD) ile işlendi. Oksitlenmiş numuneler sodyum karbonat tamponu (pH 10) kullanılarak elde edildiğinden, UHPLC-MS/MS analizi sırasında sodyum formik asit ile küme iyonları oluşturdu. Bu nedenle, oksitlenmiş numunelerin her toplam iyon kromatogramının başlangıcında, güçlü bir sodyum format kümeleri zirvesi tespit edildi(Tablo S9). Model kolayca tespit edildi ve PA'ların analizini etkilemedi. Küçük PA oligomerlerinin MS/MS fragman iyonları Tablo S10'da sunulmaktadır.

4. Sonuçlar

Bu çalışmada, ultra yüksek çözünürlüklü UHPLC-MS/MS ile alkali oksidasyondan önce ve sonra 55 bitki özütünün PA bileşimini analiz ettik (Tablo S8). Doğal PA yapıları, tahsis edilenlere ek olarak A ve B tipi PC'ler, PD'ler ve PC/PD karışımları içeriyordu. PA bileşimleri karmaşıktı ve çeşitli PA'ların tam kütlelerini ve karşılık gelen moleküler formüllerini ölçmek için ultra yüksek çözünürlüklü MS'ye ihtiyaç vardı. Farklı bitki özlerindeki B-tipi PC'ler oldukça stabildi ve alkali oksidasyona bağlı olarak hiç veya çok az değişiklik gösterdi. Bazı örnekler için, A tipi eter bağlantıları üreten PC'lerin molekül içi reaksiyonlarını tespit ettik. A-tipi PC'ler de hiç veya çok az değişiklikle oldukça stabildi, ancak bazı tesislerde ek eter bağlantılarının oluşumu tespit edildi. PA'larda (saf PD'ler veya PC/PD karışımları) PD birimleri içeren bitki özleri daha reaktifti. Alkali oksidasyondan sonra, bu PA'lar veya bunların oksidasyon ürünleri, 280 nm'de UV tarafından farklı tipte ve/veya gecikmeli bir PA tümseğinin hala tespit edilmesine rağmen artık MS tarafından tespit edilmedi. PA'lar arasındaki moleküller arası reaksiyonlar muhtemelen bu PA'ları değiştirdi, böylece standart ESI-MS koşulları altında tespit edilmediler. Önceki çalışmalar, bu modifiye edilmiş PA'ların bozunma yöntemleriyle de çalışılamayacağını göstermiştir. Bu nedenle, bunların tanımlanması ve karakterizasyonu için yeni bir analitik yönteme ihtiyaç duyulacaktır. Galloillenmiş PA'lar, PC bazlı olmaları durumunda alkalin oksidasyon altında nispeten stabildi, ancak galloillenmiş B-tipi PA'ların galloillenmiş A-tipi PA'lara dönüşümünü destekleyen ek eter bağlantıları oluşturuldu. İki veya daha fazla galloil grubu içeren PA'lar, sadece bir grup içerenlerden daha reaktifti. Gallovillenmiş PC/PD karışımları ve PD'ler daha reaktifti ve galloillenmemiş olanlara benzer şekilde reaksiyona girdi. Ancak, molekül içi ve moleküller arası reaksiyonların dışlayıcı olmadığı ve bu reaksiyonların aynı anda meydana gelebileceği unutulmamalıdır. Ek olarak, bitki matrisi ve mevcut diğer bileşikler bu etkileşimleri etkilemiştir.