Cistanche Deserticola Polisakkarit Osteoklastogenezi ve Kemik Rezorpsiyonunu Azaltabilir

iletişim: emily.li@wecistanche.com

Dezhi Song, ve diğerleri

Osteoporoz, osteopeni ve kemik mikroyapısında bozulma ile karakterize metabolik bir hastalıktır. Osteoklastlar, kemik matrisini bozan birincil efektör hücrelerdir ve anormal işlevleri osteoporoz gelişimine yol açar. Hücresel metabolizma sırasında reaktif oksijen türlerinin (ROS) birikmesi, osteoklast proliferasyonunu ve farklılaşmasını teşvik eder, bu nedenle osteoporozda önemli bir rol oynar.cistanche çöl çiçeğipolisakkarit (CDP) sahipantitümör, anti‐iltihaplı, veantioksidan aktivite. Bununla birlikte, CDPon osteoklastlarının etkisi belirsizdir. Bu çalışmada, CDP'nin osteoklastogenezi ve hidroksiapatit emilimini inhibe ettiğini göstermek için tartarat dirençli asit fosfataz boyama, immünofloresan, ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu ve western blot analizi kullanıldı. Ek olarak, CDP ayrıca Ctsk, Mmp9 ve Acp5 dahil osteoklast işaretleyici genlerin ekspresyonunu da inhibe etti ve nükleer faktör κB (RANK) ekspresyonunun reseptör aktivatörü üzerinde hiçbir etkisi olmadı. Mekanistik analizler, CDP'nin osteoklastlarda RANKL aracılı ROS üretimini azaltmak için antioksidan enzimlerin ekspresyonunu arttırdığını ve aktive edilmiş T hücrelerinin nükleer faktörünü ve mitojenle aktive olan protein kinaz aktivasyonunu inhibe ettiğini ortaya koydu. Bu sonuçlar, CDP'nin aşırı osteoklast aktivitesinin neden olduğu osteoporoz tedavisi için aday bir ilacı temsil edebileceğini göstermektedir.

ANAHTAR KELİMELER:kemik emilim, cistancheçöl çiçeğipolisakkarit, MAPK, osteoklast, reaktif oksijen türleri

Cistanche hakkında daha fazla bilgi almak için buraya tıklayın

1. GİRİŞ

Osteoblastların aracılık ettiği kemik oluşumu ve osteoklastların aracılık ettiği kemik rezorpsiyonu arasındaki denge, kemik metabolik homeostazının korunmasında hayati bir rol oynar (Manolagas, 2000; Zhu ve diğerleri, 2018). Kemik rezorpsiyonu kemik oluşumunu aştığında, azalmış kemik kütlesi ve kemik mikroyapısal hasarı ile karakterize olan osteoporoz oluşur (Ikeda, 2008). Osteoporoz, yaşlı bireylerde ve menopoz sonrası kadınlarda sık görülen bir hastalıktır ve patogenezi tam olarak aydınlatılamamıştır (Cooper ve Melton, 1992). Östrojen eksikliği, osteoporozun birincil nedenidir (Manolagas, O'Brien ve Almeida, 2013). Ek olarak, reaktif oksijen türleri (ROS), nükleer faktörκB ligandının (RANKL) reseptör aktivatörü tarafından indüklenebilir ve osteoklast oluşumu ile ilişkilidir (Yip ve diğerleri, 2005) ve bu nedenle osteoporoz gelişimine katkıda bulunabilir (Manolagas, 2010). ). Bazı araştırmalar, Nrf2-antioksidan eksikliğinin ROS seviyelerini arttırdığını ve rütbe kaynaklı osteoklast farklılaşmasını desteklediğini bulmuştur (Hyeon, Lee, Yang ve Jeong, 2013). Bu nedenle, osteoklast farklılaşması sırasında ROS üretiminin azaltılması, osteoporoz tedavisi için terapötik bir strateji olarak değerlendirilmelidir.

Osteoklastlar, monosit veya makrofaj hematopoietik soydan türetilir ve performans gösteren tek çok çekirdekli hücrelerdir.kemik emilim(Teitelbaum, 2000). Bu nedenle, osteoklast oluşumunu içeren araştırmalar, etkili tedavilerin geliştirilmesinde büyük önem taşımaktadır.kemikmetabolizmahastalıklar(Lorenzo,2017). Osteoblastlar ve aktive T hücreleri tarafından üretilen makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve RANKL, osteoklastogenezi düzenleyen önemli sitokinlerdir (Kim ve Kim, 2016; Teitelbaum ve Ross, 2003). RANKL, osteoklast oluşumu sırasında aktif olan kritik bir transkripsiyon faktörü olan aktive edilmiş T hücrelerinin nükleer faktörünün (NFATc1) ekspresyonunu indükler (Ishida ve ark., 2002). Aktive edilmiş NFATc1, osteoklastogenez ve osteoklast fonksiyonunu düzenleyen tartarat dirençli asit fosfataz (TRAcP) ve katepsin K (CTSK) gibi osteoklast işaretleyici genlerin ekspresyonunu destekler (Balkan ve diğerleri, 2009; Crotti ve diğerleri, 2008). Bu sonuçlar, CDP'nin aşırı osteoklastik kemik rezorbsiyonunun neden olduğu osteoporozu tedavi etmek için kullanılabileceğini düşündürmektedir.

2|MALZEMELER VE YÖNTEMLER

2.1|Malzemeler

CDP (saflık > yüzde 98) Solarbio'dan (Pekin, Çin) satın alındı ​​ve fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1 mM'lik bir stok konsantrasyonunda hazırlandı. c-Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38 için spesifik antikorlar, fosforile edilmiş (p)-ERK,p-p38, p-JNK ve -aktin Santa'dan elde edildi. Cruz Biyoteknoloji (San Jose, CA). V-ATPase d2'ye karşı antikorlar, daha önce tarif edildiği gibi üretildi (H. Feng ve diğerleri, 2009). 3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sülfofenil)-2H-tetrazolyum (MTS) ve lusiferaz tahlil sistemi Promega'dan (Sidney, Avustralya) elde edildi. . Rekombinant M-CSF, R&D Systems'den (Minneapolis, MN) satın alındı. Rekombinant GST-rRANKL proteini, daha önce tarif edildiği gibi eksprese edildi ve saflaştırıldı (Xu ve diğerleri, 2000).

2.2|Hücre kültürü

RAW264.7 hücreleri (fare makrofaj hücreleri), American Type Culture Collection'dan (ATCC, Manassas, VA) elde edildi ve yüzde 10 fetal sığır serumu, 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penisilin ve 100 ug/ml streptomisin (tam ortam). Kemik iliği kaynaklı monositler (BMM'ler), Batı Avustralya Üniversitesi Hayvan etik kurulu (RA/3/100/1244) tarafından onaylanan prosedürlere göre ötenazi uygulanan 6 haftalık C57BL/6J farelerinden izole edildi. Uzun kemikler yumuşak dokulardan arındırılmış ve kemik iliği femur ve tibiadan temizlenmiş, daha sonra M-CSF (50 ng/ml) varlığında tam bir ortamda kültürlenmiştir.

2.3|osteoklastogenez tahlili

BMMs were plated into 96‐well culture plates at a density of 6 × 103cells per well and treated with a complete medium containing M‐CSF(50 ng/ml) and GST‐rRANKL (100 ng/ml), in the presence or absence of varying concentrations of CDP. The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4%paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells(>üç çekirdek) osteoklastlar olarak tanımlandı.

2.4|sitotoksisite deneyleri

BMM'ler, oyuk başına 6 x 103 hücrede 96 oyuklu plakalara ekildi ve gece boyunca yapışması için bırakıldı. Ertesi gün hücreler, değişen konsantrasyonlarda CDP ile inkübe edildi. 48 saat daha sonra, MTS solüsyonu (20 ul/oyuk) ilave edildi ve 2 saat boyunca hücrelerle inkübe edildi. 490 nm'de absorbans, bir mikroplaka okuyucu (MultiscanSpectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA) ile belirlendi.

2.5|immünofloresan boyama

BMM'ler, gece boyunca M-CSF (50 ng/ml) varlığında oyuk başına 6 x 103 hücre yoğunluğunda ekildi. Hücreler daha sonra olgun osteoklastlar oluşana kadar M-CSF ve GST-rRANKL (100 ng/ml) ile uyarıldı. Osteoklastlar daha sonra yüzde 4 paraformaldehit ile sabitlenmeden, yüzde 0.1 Triton X-100-PBS ile geçirgenleştirilmeden ve PBS içinde yüzde 3 bovin serum albümini ile bloke edilmeden önce 48 saat boyunca değişen konsantrasyonlarda CDP ile muamele edildi. Hazırlanan hücreler, F-aktin için boyamak için karanlıkta 45 dakika boyunca rodamin konjuge phalloidin ile inkübe edildi. Hücreler daha sonra PBS ile yıkandı, çekirdekler 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile zıt boyandı ve konfokal mikroskopi için lamellerle monte edildi.

2.6|Hidroksiapatit emilim tahlili

Osteoklast aktivitesini ölçmek için altı oyuklu kollajen kaplı plakalar (BD Biocoat; ThermoFisher Scientific) üzerinde kültürlenen BMM'ler (kuyu başına 1 x 105 hücre) GST-rRANKL (100 ng/ml) ve M-CSF (50 ng/ml) ile uyarıldı. ) olgun osteoklastlar oluşturulana kadar (Zhou ve diğerleri, 2016). Hücreler daha sonra hücre ayrışma solüsyonu (Sigma-Aldrich) kullanılarak plakadan nazikçe ayrıldı ve eşit sayıda olgun osteoklast, ayrı ayrı hidroksiapatit kaplı 96 oyuklu plakalara (Corning Osteoassay, Corning, NY) ekildi. Olgun osteoklastlar, belirtilen konsantrasyonlarda CDP'li veya CDP'siz-rRANKL ve M-CSF içeren bir ortamda inkübe edildi. 48 saat sonra, oyukların yarısı, oyuk başına çok çekirdekli hücre sayısını değerlendirmek için yukarıda tarif edildiği gibi TRAcP aktivitesi için immünohistokimyasal olarak boyandı. Kalan kuyucuklar, hücreleri uzaklaştırmak ve emilen alanların ölçülmesine izin vermek için 10 dakika ağartılmıştır. Emilen alanlar, standart ışık mikroskobu altında fotoğraflandı ve osteoklastlar tarafından emilen hidroksiapatit yüzeyinin yüzde alanını ölçmek için Ima geJ yazılımı (Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD) kullanıldı.

2.7|Lusiferaz raportör tahlilleri

NFATc1 transkripsiyonel aktivasyonunu araştırmak için RAW264.7 hücreleri, NFATc1'e duyarlı bir lusiferaz raportör yapısı ile stabil bir şekilde transfekte edildi (Cheng ve diğerleri, 2018; van der Kraan ve diğerleri, 2013). Transfekte edilmiş hücreler, oyuk başına 1.5 x 105 hücre yoğunluğunda 48 oyuklu plakalarda kültürlendi ve 1 saat boyunca çeşitli CDP konsantrasyonları ile ön işleme tabi tutuldu. Ön muameleden sonra hücreler 24 saat GST-rRANKL (100 ng/ml) ile uyarıldı ve üreticinin protokolüne (Promega) göre lusiferaz raportör tahlil sistemi kullanılarak lusiferaz aktivitesi ölçüldü.

2.8|Kantitatif ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) analizi

Toplam RNA, üreticinin protokolüne (Thermo Fisher Scientific) göre Trizol reaktifi kullanılarak hücrelerden izole edildi. Tamamlayıcı DNA, 1 ug RNA şablonu ve oligo-dT primerleri ile Moloney murin lösemi virüsü ters transkriptaz kullanılarak sentezlendi. Spesifik dizilerin polimeraz zincir reaksiyonu amplifikasyonu, aşağıdaki program kullanılarak gerçekleştirildi: 5 dakika boyunca 94 derece, ardından 30 döngü 94 derece 40 saniye, 60 derece 40 saniye ve 72 derece 40 saniye ve son uzatma adımı 5 72 derecede min. Spesifik primerler hakkında ayrıntılı bilgi Tablo 1'de gösterilmektedir. Göreceli haberci RNA seviyeleri, temizlik geni Hmbs'nin ekspresyonuna normalize edilerek hesaplandı.

2.9|Western blot analizi

BMM'ler, altı oyuklu plakalarda M-CSF içeren tam bir ortamda kültürlendi ve belirtilen süreler için GST-rRANKL (100 ng/ml) ile uyarıldı. Hücreler, radyoimmünopresipitasyon lizis tamponunda parçalandı ve proteinler, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi ile çözüldü ve poli(viniliden florür) membranlara (GE Healthcare, Silverwater, Avustralya) aktarıldı. Zarlar, 1 saat boyunca yüzde 5 yağsız süt içinde bloke edildi ve daha sonra, gece boyunca 4 derecede hafifçe çalkalanarak çeşitli spesifik primer antikorlarla problandı. Zarlar yıkandı ve ardından yaban turpu peroksidazla konjuge sekonder antikorlarla inkübe edildi. Antikor reaktivitesi daha sonra geliştirilmiş kemilüminesans reaktifi (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) ile saptandı ve Image-quant LAS 4000 (GE Healthcare) ile görselleştirildi.

2.10|Hücre içi ROS algılama

Hücre içi ROS seviyeleri, 2',7'-diklorofloresein diasetat hücresel ROS saptama tahlil kiti (Abcam, Melbourne, Avustralya) kullanılarak tespit edildi. BMM'ler (çukur başına 5 x 103 hücre), 96 oyuklu plakalarda kültürlendi ve 72 saat boyunca RANKL (100 ng/ml), M-CSF (50 ng/ml) ve CDP ile işlendi. Hücre içi ROS seviyeleri, ROS varlığında floresan BOS'a oksitlenen 2',7'-diklorofloresein diasetat kullanılarak ölçüldü. Hücreler Hank tamponunda yıkandı ve karanlıkta 30 dakika 10 uM DCFH-DA ile inkübe edildi. Görüntüler konfokal mikroskopi kullanılarak elde edildi.

2.11|istatistiksel analizler

Tüm veriler, aksi belirtilmedikçe, üç kopya halinde gerçekleştirilen en az üç deneyi temsil etmektedir. Veriler ortalama ± SD olarak ifade edilir. p < 0.05="" anlamlı="" olarak="" kabul="" edilerek,="" sonuçlar="" arasındaki="" farklılıkların="" önemini="" belirlemek="" için="" student-newman-keulspost="" hoc="" testleri="" tarafından="" takip="" edilen="" tek="" yönlü="" varyans="" analizi="">

3|SONUÇLAR

3.1|CDP, RANKL kaynaklı osteoklastogenezi ve osteoklast füzyonunu inhibe eder

CDP'nin RANKL kaynaklı osteoklast oluşumunu baskılayıp baskılayamayacağını belirlemek için önce fare BMM'lerini kullanarak bir osteoklastogenez tahlili yaptık (Liu ve diğerleri, 2013; Song ve diğerleri, 2016). BMM'ler, artan CDP konsantrasyonları ile 5 gün boyunca RANKL ve M-CSF ile tedavi edildi. CDPreached 5 µM veya daha yüksek konsantrasyonda CDP, TRAcP-pozitif çok çekirdekli hücrelerin sayısını azaltmıştır (Şekil 1a,b). CDP toksisitesini değerlendirmek ve bu sonuçların hücre ölümü veya sayısının bir yansıması olmadığını doğrulamak için bir MTS tahlili yaptık. BMM'ler, değişen dozlarda CDP ile 48 saat boyunca RANKL ve M-CSF ile tedavi edildi. CDP, 15 uMor daha az konsantrasyonda BMM proliferasyonu üzerinde hiçbir etkiye sahip değildi (Şekil 1c).

CDP'nin osteoklast füzyonu üzerindeki etkilerini test etmek için, değişen dozlarda CDP olsun veya olmasın RANKL ve M-CSF tedavisi ile osteoklastlar indüklendi. Osteoklastlar, osteoklast başına çekirdek sayısını değerlendirmek için rodamin-phalloidin ve DAPI ile boyandı (Şekil 2a). CDP tedavisini takiben hem osteoklast sayısı hem de osteoklast başına ortalama çekirdek sayısı azaldı (5–10 µM; Şekil 2b,c). Bu nedenle, CDP, RANKL ile indüklenen osteoklastogenez ve osteoklast füzyonu üzerinde doza bağlı bir şekilde inhibitör etkilere sahipti.

3.2|CDP, RANKL kaynaklı osteoklastik hidroksiapatit rezorpsiyon aktivitesini azaltır

CDP'nin osteoklast fonksiyonu üzerindeki etkisini saptamak için bir hidroksiapatit resorpsiyon tahlili yapıldı (Şekil 3a). 24 saatlik bir inkübasyondan sonra, kontrol grupları ile karşılaştırıldığında, 5 ve 10 µM CDP ile tedavi ile hidroksiapatit emilim alanı önemli ölçüde azalırken, kuyu başına osteoklast sayısı değişmedi(Şekil 3b,c). Bu sonuçlar, CDP'nin herhangi bir sitotoksik etki olmaksızın hem osteoklast oluşumu hem de osteoklast rezorpsiyon aktivitesi üzerinde güçlü inhibitör etkileri olduğunu göstermektedir.

3.3|CDP, osteoklast işaretleyici gen ekspresyonunu inhibe eder

CDP'nin osteoklastogenez ve osteoklastik kemik rezorpsiyonu üzerindeki inhibitör etkilerini daha fazla araştırmak için BMM'ler 5 gün boyunca değişen CDP konsantrasyonları ile RANKL ve M-CSF ile tedavi edildi. Ardından osteoklast belirteç genlerinin ekspresyonunu saptamak için RT-PCR yapıldı. Osteoklastogenez sırasında çok önemli bir transkripsiyon faktörü olan Nfatc1'in ifadesi, CDP tarafından doza bağlı bir şekilde inhibe edildi (Şekil 4a). Ek olarak, CDP (5 ve 10 uM), Mmp9, Ctsk ve Acp5 dahil olmak üzere kemik rezorpsiyonuyla ilgili genlerin ekspresyonunu aşağı regüle etti (Şekil 4bd).

3.4|CDP, NFATc1 aktivitesini ve aşağı akış protein ekspresyonunu baskılar

CDP'nin RANKL ile indüklenen NFATc1 aktivitesi üzerindeki etkisini incelemek için bir lusiferaz raportör tahlili yapıldı. 5 uM ve daha yüksek konsantrasyonlarda CDP ile tedavi, RANKL ile indüklenen NFATc1 aktivitesini önemli ölçüde inhibe etti (Şekil 5a). Ek olarak, western blot analizi, CDP'nin, RANKL ve M-CSF ile tedavi edilen BMM'lerde 3 ve 5 gün boyunca NFATc1 ve c-Fos'un protein ekspresyonunu önemli ölçüde baskıladığını gösterdi (Şekil 5b). Ayrıca, V-ATPase-d2 ve CTSK gibi osteoklast fonksiyonu ile ilgili proteinlerin ekspresyonu, kontrol gruplarına kıyasla CDP varlığında aşağı regüle edildi. Ancak, CDP'nin RANK ifadesi üzerinde hiçbir etkisi olmadı (Şekil 5b).

3.5|CDP, RANKL kaynaklı osteoklastojenez sırasında ROS üretimini temizlemek için antioksidan enzimlerin ekspresyonunu destekler

CDP'ye bağlı osteoklastogenez inhibisyonunun altında yatan mekanizmayı araştırmak için, BMM'ler 72 saat boyunca PBS veya CDP ile birlikte RANKL (100 ng/ml) ve M-CSF (50 ng/ml) ile tedavi edildi. CDP'nin RANKL tarafından uyarılan hücre içi ROS üretimi üzerindeki etkisini inceledik. Hücre içi ROS seviyeleri, CDP (5 ve 10 uM; Şekil 6a) ile zayıflatılan RANKL tedavisi ile arttırıldı. Hem ROS-pozitif hücre sayısı hem de ROS boyamasının yoğunluğu, CDP tedavisi ile doza bağlı bir şekilde azaldı (Şekil 6b,c). Western blot analizi, 3 gün boyunca RANKL ve –CSF ile tedavi edilen BMM'lerde indüklenebilir nitrik oksit sentaz (NOS2) ekspresyonunu baskılarken CDP'nin tioredoksin (TRX1) ve glutatyon redüktaz (GSR) ekspresyonunu desteklediğini gösterdi (Şekil 6d).

CDP'nin ROS üretimini azaltarak osteoklast farklılaşmasını baskılayıp baskılamadığını daha fazla araştırmak için, hücrelerdeki yüksek ROS durumunu taklit etmek için BMM'leri peroksit (10 uM) ile tedavi ettik. BMM'ler 3 gün boyunca RANKL ve M-CSF tarafından indüklendi ve western blot analizi ve RT-PCR sonuçları, kontrol gruplarıyla karşılaştırıldığında peroksidin NFATc1 ve c-Fos ekspresyonunu desteklediğini gösterdi. Şekil 5'teki sonuçlarla uyumlu olarak, NFATc1 ve c-Fos ekspresyonu CDP tarafından bastırılırken peroksit CDP'nin inhibe edici etkisini kurtardı (Şekil 6e,f). Bu veriler, CDP'nin ROS üretimini süpürerek NFATc1 ve c-Fos ifadesini bastırdığını gösterdi.

3.6|CDP, RANKL kaynaklı osteoklastogenez sırasında MAPK yollarını baskılar

Daha sonra, CDP tedavisinin RANKL aracılı TRAF6 ekspresyonu ve MAPK yolu aktivasyonu üzerindeki etkisini araştırdık. Serumsuz ortamda 2 saat inkübasyonun ardından, BMM'ler 60 dakika boyunca CDP'li veya CDP'siz RANKL ile uyarıldı. CDP (10 uM) ile stimülasyonun TRAF6 ekspresyonu ve 10 ve 20 dakikada JNK2 ve ERK1 / 2'nin zayıflatılmış fosforilasyonu üzerinde hiçbir etkisi olmadı (Şekil 7). Ek olarak, p38 fosforilasyonu, kontrol gruplarına kıyasla 60 dakikalık CDP tedavisi ile önemli ölçüde inhibe edildi (Şekil 7). Bu veriler, CDP'nin osteoklast oluşumu ve aktivitesi üzerindeki inhibitör etkisiyle tutarlı olarak RANKL ile indüklenen MAPK sinyal yollarını baskıladığını ortaya koymaktadır.

4|TARTIŞMA

"Çöl ginsengi" olarak bilinen Cistanche, bağışıklığı modüle etme ve yaşlanma ve oksidatif stres sırasında koruyucu davranma yeteneği nedeniyle son zamanlarda çok dikkat çekmiştir (Jia ve diğerleri, 2012; Snytnikova ve diğerleri, 2012). Cistanche'nin ana aktif bileşenleri olan fenilpropanoid ikameli diglikositlerin makrofajlardaki aktiviteyi inhibe ettiği gösterilmiştir (Ahn, Chae, Chin ve Kim, 2017). Ek olarak, bir Cistanche özütü, iskemiyi takiben reperfüze miyokardda oksidatif stresi azalttı ve kardiyoproteksiyona yol açan apoptotik yolların inhibisyonunda önemli bir rol oynadı (Yu, Li ve Cao, 2016). Cistanche'nin önemli bir bileşeni olarak CDP, çeşitli farmakolojik işlevlere sahiptir. Mevcut çalışmamız, CDP'nin ROS üretimini ve ayrıca NFAT ve MAPK aktivasyonunu azaltarak RANKL ile aktive olan osteoklast farklılaşmasını ve aktivasyonunu baskıladığını buldu.

Bir asit fosfataz olarak TRAcP, çeşitli hücrelerde bulunur ve osteoklastlarda ve alveolar makrofajlarda bol miktarda bulunur (Snipes, Lam, Dodd, Gray ve Cohen, 1986). TRAcP, osteoklastların karakteristik bir enzimidir ve ekspresyonu, osteoklast aktivitesi ve kemik rezorpsiyonunun bir göstergesi olarak kabul edilen osteoklast fonksiyonu ile yakından ilişkilidir (Minkin, 1982). Çalışmamızda CDP, RANKL ile indüklenen osteoklastogenezin CDP tarafından bloke edildiğini gösteren TRAcP-pozitif hücre sayısını inhibe etti. Kemik matrisinin osteoklastlar tarafından bozulması katepsin K (CTSK) ve MP'lere bağlıdır (Gruber, 2015). Burada CDP, Mmp9, Ctsk ve Acp5 gibi osteoklast fonksiyonel genlerinin ekspresyonunu önemli ölçüde aşağı regüle etti.

Osteoklast farklılaşması ve işlevi, çoklu sinyal yolları tarafından düzenlenir (Boyle, Simonet ve Lacey, 2003). RANK'a bağlandıktan sonra RANKL, osteoklast oluşumu için önemli bir transkripsiyon faktörü olan ve TRAcP ve CTSK dahil olmak üzere osteoklast spesifik gen ekspresyonunu etkileyen NFATc1'in ekspresyonunu aktive etmek için adaptör protein TRAF6'yı işe alır (X. Feng, 2005; Takayanagi ve ark., 2002). Bu çalışmada, CDP'nin osteoklastlarda RANK ve TRAF6 ekspresyonu üzerine etkisinin olmadığını bulduk. Bununla birlikte, CDP, BMM'lerin osteoklastogenezi sırasında RANKL kaynaklı NFATc1 aktivasyonunu inhibe etti. Ayrıca elektron verme sürecinde mitokondri tarafından üretilen ROS'un osteoklastların proliferasyonunu ve farklılaşmasını desteklediği ve kemik matriks bozulmasını düzenlediği gösterilmiştir (Ha ve ark., 2004). Yakın tarihli bir çalışma, RANKL'nin Bach1 nükleer ithalatını indüklediğini ve Nrf2 aracılı antioksidan enzim üretimini azalttığını, böylece farelerde hücre içi ROS ekspresyonunu ve osteoklastogenezi arttırdığını buldu (Kanzaki ve diğerleri, 2017). Ek olarak, homosistein tarafından artan hücre içi ROS üretimi, osteoklast oluşumunu ve aktivitesini arttırdı (Koh ve diğerleri, 2006). Çalışmamız, CDP'nin NOS2 ekspresyonunu inhibe ederek ve TRX1 ve glutatyon redüktaz gibi antioksidan enzimlerin ekspresyonunu teşvik ederek osteoklastlarda ROS birikimini azalttığını buldu. BMM'leri hücre içi ROS birikimini arttırmak için peroksit ile tedavi ettiğimizde, artan ROS'un NFATc1 ekspresyonunu iyileştirebileceği sonuçları, ROS'un NFATc1'in yukarısında olduğunu ortaya çıkardı. Ayrıca peroksitin CDPon NFATc1 ekspresyonunun inhibe edici etkisini kurtardığını da bulduk. Bu nedenle, verilerimiz CDP'nin NFATc1 ekspresyonunu inhibe etmek için ROS birikimini baskıladığını, ardından osteoklast oluşumunu ve fonksiyonunu baskıladığını göstermektedir.

ERK, JNK ve p38, osteoklast farklılaşmasının düzenlenmesinde de yer alan MAPK ailesine aittir (Seger & Krebs, 1995). RANKL, ERK, JNK ve p38'in fosforilasyonunu artırarak MAPK yolunu aktive eder (Mizukami ve ark. ., 2002). CDP'nin, MAPK yolundaki anahtar proteinlerin RANKL aracılı fosforilasyonunu bastırdığını, böylece CDPon'un osteoklast işaretleyici genlerin ekspresyonunu inhibe edici etkisine katkıda bulunduğunu gösterdik. Bildiğimiz kadarıyla bu, CDP'nin in vitro yeni etki mekanizmalarını temsil eden ROS üretimi, NFAT ve MAPK aktivasyonu üzerindeki inhibitör etkilerini gösteren ilk çalışmadır.

Özetle, CDP'nin osteoklastogenezi ve hidroksiapatit rezorpsiyonunu ve Ctsk, Mmp9 ve Acp5 dahil olmak üzere osteoklast işaretleyici genlerin ekspresyonunu azalttığını gösterdik. CDP, RANKL aracılı ROS üretimini ve ayrıca NFAT ve MAPK aktivasyonunu baskılayabildi (Şekil 8). Toplu olarak, sonuçlarımız CDP'nin ROS aşırı üretiminin eşlik ettiği osteoklast ile ilgili durumların tedavisi için aday bir ilacı temsil edebileceğini göstermektedir.

TEŞEKKÜRLER

Bu çalışma, Çin Doğa Bilimleri Vakfı (81572164), Çin Ulusal Anahtar Teknoloji Araştırma ve Geliştirme Programı (2017YFC1103300), Guangxi Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (2016GXNSFAA380295) ve Guangxi Eyaleti Üniversite Bilim ve Teknoloji Araştırma Projesi tarafından desteklenmiştir ( KY2015YB054). Ayrıca kısmen Guangxi Bilimsel Araştırma ve Teknoloji Geliştirme Planı Projesi (GKG13349003, 1598013-15), Batı Avustralya Tıp ve Sağlık Araştırmaları Altyapı Fonu, Arthritis Australia Foundation, TheUniversity of Western Australia (UWA) Araştırma İşbirliği Ödülleri ve Avustralya Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi(NHMRC, No. 1107828 ve 1027932).

ÇIKAR ÇATIŞMALARI

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

REFERANSLAR

Ahn, J., Chae, HS, Shin, YW ve Kim, J. (2017). Cistanche salsa'dan yeni fenilpropanoid ile sübstitüe edilmiş diglikositlerin dereplikasyon yönlendirmeli izolasyonu ve makrofajlarda NO üretimi üzerindeki inhibe edici aktiviteleri. Moleküller, 22(7), 1138.
Balkan, W., Martinez, AF, Fernandez, I., Rodriguez, MA, Pang, M., & Troen, BR (2009). RANK ligandı tarafından katepsin K promotör aktivitesinin uyarılmasına aracılık eden NFAT bağlanma bölgelerinin belirlenmesi. Gen, 446(2), 90-98.
Boyle, WJ, Simonet, WS ve Lacey, DL (2003). Osteoklast farklılaşması ve aktivasyonu. Doğa, 423(6937), 337-342.
Cai, RL, Yang, MH, Shi, Y., Chen, J., Li, YC ve Qi, Y. (2010). Cistanche Deserticola'dan feniletanoid bakımından zengin ekstraktın anti-yorgunluk aktivitesi. Fitoterapi Araştırması, 24(2), 313–315.

Cheng, J., Zhou, L., Liu, Q., Tickner, J., Tian, ​​Z., Li, X., … Xu, J. (2018). Siyanidin klorür, RANKL aracılı osteoklastogenezi ve ilişkili sinyal yollarını baskılayarak ovariektomi kaynaklı osteoporozu inhibe eder. Hücresel Fizyoloji Dergisi, 233(3), 2502–2512.

Cooper, C., & Melton, LJ, 3. (1992). Osteoporoz epidemiyolojisi. Endokrinoloji ve Metabolizmadaki Eğilimler, 3(6), 224–229.

Crotti, TN, Sharma, SM, Fleming, JD, Flannery, MR, Ostrowski, MC, Goldring, SR ve McHugh, KP (2008). PU.1 ve NFATc1, fare beta3 integrin promotörünün osteoklastik indüksiyonuna aracılık eder. Hücresel Fizyoloji Dergisi, 215(3), 636-644.
Feng, H., Cheng, T., Steer, JH, Joyce, DA, Pavlos, NJ, Leong, C., … Xu, J. (2009). Miyosit arttırıcı faktör 2 ve mikroftalmi ile ilişkili transkripsiyon faktörü, RANKL ile indüklenen osteoklastogenez sırasında V-ATPase d2 promotörünü transaktive etmek için NFATc1 ile işbirliği yapar. Biyolojik Kimya Dergisi, 284(21), 14667–14676.
Feng, X. (2005). Osteoklastlarda hücre içi sinyal sıralaması. IUBMB Life, 57(6), 389-395.
Gruber, R. (2015). Kemik erimesinin moleküler ve hücresel temeli. Wiener Medizinische Wochenschrift, 165(3–4), 48–53.
Guo, Y., Cao, L., Zhao, Q., Zhang, L., Chen, J., Liu, B., & Zhao, B. (2016). Cistanche Deserticola'dan elde edilen polisakkaritin ön karakterizasyonları, antioksidan ve hepatoprotektif aktivitesi. Uluslararası Biyolojik Makromoleküller Dergisi, 93, 678–685.
Ha, H., Bok kwak, H., Woong lee, S., Mi jin, H., Kim, HM, Kim, HH, & Hee lee, Z. (2004). Reaktif oksijen türleri, osteoklastlarda RANK sinyaline aracılık eder. Deneysel Hücre Araştırması, 301(2), 119–127.
Hyeon, S., Lee, H., Yang, Y., & Jeong, W. (2013). Nrf2 eksikliği oksidatif strese neden olur ve RANKL kaynaklı osteoklast farklılaşmasını destekler Serbest Radikal Biyoloji ve Tıp, 65, 789–799.
İkeda, K. (2008). Osteoporoz patogenezinde osteositler. Geriatri ve Gerontoloji Uluslararası, 8(4), 213–217.
Ishida, N., Hayashi, K., Hoshijima, M., Ogawa, T., Koga, S., Miyatake, Y., … Takeya, T. (2002). Osteoklastogenezin in vitro büyük ölçekli gen ekspresyonu analizi ve NFAT2'nin ana düzenleyici olarak açıklanması. Biyolojik Kimya Dergisi, 277(43), 41147–41156.
Jia, Y., Guan, Q., Guo, Y., & Du, C. (2012). Cistanche Deserticola'nın su özütü ile kolon kanseri eğilimli farelerde bağırsakta inflamatuar hiperplazinin azaltılması. Fitoterapi Araştırması, 26(6), 812-819.
Kanzaki, H., Shinohara, F., Itohiya, K., Yamaguchi, Y., Katsumata, Y., Matsuzawa, M., … Nakamura, Y. (2017). RANKL, Bach1 nükleer ithalatını indükler ve Nrf2 aracılı antioksidan enzimleri zayıflatır, böylece farelerde hücre içi reaktif oksijen türlerinin sinyalleşmesini ve osteoklastogenezi arttırır. FASEB Dergisi, 31(2), 781–792.
Kim, JH ve Kim, N. (2016). Osteoklast farklılaşmasında sinyal yolları. Chonnam Tıp Dergisi, 52(1), 12–17.
Koh, JM, Lee, YS, Kim, YS, Kim, DJ, Kim, HH, Park, JY, … Kim, GS (2006). Homosistein, osteoklast oluşumunu ve aktivitesini uyararak kemik rezorpsiyonunu arttırır.
hücre içi ROS üretimi. Kemik ve Maden Araştırmaları Dergisi, 21(7), 1003-1011.
van der Kraan, AGJ, Chai, RCC, Singh, PP, Lang, BJ, Xu, J., Gillespie, MT, … Quinn, JMW (2013). HSP90 inhibitörleri, osteoklast progenitörlerinde farklılaşmayı ve MITF (mikroftalmi transkripsiyon faktörü) aktivitesini arttırır. Biyokimya Dergisi, 451(2), 235–244.
Liu, Q., Wu, H., Chim, SM, Zhou, L., Zhao, J., Feng, H., … Xu, J. (2013). IKKbeta'nın seçici bir inhibitörü olan SC-514, RANKL ile indüklenen osteoklastogenezi ve NF-kappaB aktivasyonunu hafifletir. Biyokimyasal Farmakoloji, 86(12), 1775–1783.
Lorenzo, J. (2017). Osteoklast aktivasyonunun birçok yolu. Klinik Araştırma Dergisi, 127(7), 2530–2532.
Manolagas, SC (2000). Kemik hücrelerinin doğumu ve ölümü: Osteoporozun patogenezi ve tedavisi için temel düzenleyici mekanizmalar ve çıkarımlar. Endokrin İncelemeleri, 21(2), 115–137.
Manolagas, SC (2010). Östrojen merkezliden yaşlanmaya ve oksidatif strese: Osteoporozun patogenezinin gözden geçirilmiş bir perspektifi. Endokrin İncelemeleri, 31(3), 266–300.
Manolagas, SC, O'Brien, CA ve Almeida, M. (2013). Östrojen ve androjen reseptörlerinin kemik sağlığı ve hastalığındaki rolü. Doğa İncelemeleri Endokrinoloji, 9(12), 699-712.
Minkin, C. (1982). Kemik asidi fosfataz: Osteoklast fonksiyonunun bir belirteci olarak tartarat dirençli asit fosfataz. Kalsifiye Doku Uluslararası, 34(3), 285–290.
Mizukami, J., Takaesu, G., Akatsuka, H., Sakurai, H., Ninomiya-Tsuji, J., Matsumoto, K., & Sakurai, N. (2002). NF-kappaB ligandının (RANKL) reseptör aktivatörü, RANK, TAB2 ve TRAF6 içeren bir sinyal kompleksi aracılığıyla TAK1 mitojenle aktive olan protein kinaz kinaz kinazı aktive eder. Moleküler ve Hücresel Biyoloji, 22(4), 992-1000.
Nan, Z., Zeng, K., Shi, S., Zhao, M., Jiang, Y., & Tu, P. (2013). Tarim çölünde yetiştirilen Cistanche Deserticola'nın gövdelerinden anti-inflamatuar aktivitelere sahip feniletanoid glikozitler. Fitoterapia, 89, 167-174.
Seger, R., & Krebs, EG (1995). MAPK sinyalleşme kaskadı. FASEB Dergisi, 9(9), 726–735.
Snipes, RG, Lam, KW, Dodd, RC, Gray, TK ve Cohen, MS (1986). Mononükleer fagositlerde ve U937 hücre hattında asit fosfataz aktivitesi: Monosit türevli makrofajlar, tartarat dirençli asit fosfataz eksprese eder. Kan, 67(3), 729-734.
Snytnikova, OA, Tsentalovich, YP, Stefanova, NA, Fursova, AZ, Kaptein, R., Sagdeev, RZ ve Kolosova, NG (2012). Mitokondri hedefli antioksidan SkQ1 ve Cistanche Deserticola'nın terapötik etkisi, sıçan lensinde artan triptofan ve kinurenin seviyeleri ile ilişkilidir. Doklady Biyokimya ve Biyofizik, 447, 300–303.
Song, F., Zhou, L., Zhao, J., Liu, Q., Yang, M., Tan, R., … Xu, J. (2016). Eriodictyol, RANKL kaynaklı osteoklast oluşumunu inhibe eder ve NFATc1 aktivitesinin inhibisyonu yoluyla işlev görür. Hücresel Fizyoloji Dergisi, 231(9), 1983–1993.
Takayanagi, H., Kim, S., Koga, T., Nishina, H., Isshiki, M., Yoshida, H., … Taniguchi, T. (2002). Transkripsiyon faktörü NFATc1'in (NFAT2) indüksiyonu ve aktivasyonu, RANKL sinyalini osteoklastların terminal farklılaşmasına entegre eder. Gelişim Hücresi, 3(6), 889-901.
Teitelbaum, SL (2000). Osteoklastlar tarafından kemik rezorpsiyonu. Bilim, 289 (5484), 1504–1508.
Teitelbaum, SL ve Ross, FP (2003). Osteoklast gelişimi ve fonksiyonunun genetik düzenlenmesi. Doğa İncelemeleri Genetik, 4(8), 638–649.
Xu, J., Tan, JW, Huang, L., Gao, XH, Laird, R., Liu, D., … Zheng, MH (2000). NF-kappaB ligandının reseptör aktivatörünün sıçan homologunun klonlanması, dizilenmesi ve fonksiyonel karakterizasyonu. Kemik ve Maden Araştırmaları Dergisi, 15(11), 2178-2186.
Yip, KH, Zheng, MH, Steer, JH, Giardina, TM, Han, R., Lo, SZ, … Xu, J. (2005). Thapsigargin, RANKL kaynaklı sinyal yollarının ve reaktif oksijen türlerinin üretiminin düzenlenmesi yoluyla osteoklastogenezi modüle eder. Kemik ve Maden Araştırmaları Dergisi, 20(8), 1462–1471.
Yu, Q., Li, X. ve Cao, X. (2016). Sıçanlarda iskemi-reperfüzyon kaynaklı miyokard enfarktüsünde Cistanche Deserticola'dan feniletanoid glikozit bakımından zengin özütün kardiyoprotektif etkileri. Vasküler Cerrahi Yıllıkları, 34, 234-242.
Zhou, L., Liu, Q., Yang, M., Wang, T., Yao, J., Cheng, J., … Xu, J. (2016). Bir anti-sıtma ilacı olan dihidroartemisinin, östrojen eksikliğinin neden olduğu osteoporozu, osteoklast oluşumunu ve RANKL'ın neden olduğu sinyal yollarını baskılar. Kemik ve Maden Araştırmaları Dergisi, 31(5), 964-974.
Zhu, S., Yao, F., Qiu, H., Zhang, G., Xu, H., & Xu, J. (2018). Birleştirme faktörleri ve eksozomal paketleme mikroRNA'ları, kemiğin yeniden şekillenmesinin düzenlenmesinde rol oynar. Cambridge Felsefe Topluluğunun Biyolojik İncelemeleri, 93(1), 469-480.