Cistanche Deserticola Polisakkaritleri Yaşlanan Model Farelerde Bilişsel Gerilemeyi Hafifletiyor ve Belleği İyileştiriyor
Mar 30, 2022
İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com
Yuan Gao1,*, Bing Li1,*, Hong Liu1, Yajuan Tian2, Chao Gu1, Xiaoli Du1, Ren Bu1, Jie Gao1, Yang Liu1, Gang Li1
ÖZ
Son kanıtlar, bağırsak mikrobiyota-beyin eksenindeki değişikliklerin bilişsel bozulma ile yaşlanmaya neden olabileceğini düşündürmektedir. Bu çalışmada, farelere uzun süreli D-galaktoz uygulamasının bilişsel düşüşe, bağırsak mikrobiyal disbiyozuna, periferik inflamasyona ve oksidatif strese neden olduğunu gözlemledik. Yaşa bağlı bilişsel düşüşün bu modelinde, Cistanche Deserticola polisakkaritleri (CDPS), D galaktoz ile tedavi edilen farelerde, bağırsak mikrobiyal homeostazını geri yükleyerek bilişsel işlevi iyileştirdi, böylece oksidatif stresi ve periferik iltihabı azalttı. Bu yaşlanan model farelerde CDPS'nin faydalı etkileri, gutmicrobiota'nın antibiyotiklerle ablasyonu veya siklofosfamid ile immünosupresyon yoluyla ortadan kaldırıldı. Serum metabolomik profili, yaşlanan model farelerde kreatinin, valin, L-metionin, o-Toluidin, N-etilanilin, ürik asit ve prolin seviyelerinin tamamen değiştiğini, ancak CDPS tarafından restore edildiğini gösterdi. Bu bulgular, CDPS'nin, bir amino asit dengesizliğini, periferik iltihabı ve oksidatif stresi hafifleten bağırsak mikrobiyota beyin ekseninin homeostazını geri yükleyerek farelerde D-galaktoz kaynaklı bir yaşlanma modelinde bilişsel işlevi iyileştirdiğini göstermiştir. Bu nedenle CDPS, özellikle gutmikrobiyal disbiyoz ile ilgili olanlar olmak üzere, hafıza ve öğrenme bozuklukları olan hastalar için terapötik potansiyel gösterir.
GİRİİŞ
D-galaktoz (D-gal) ve berilyum tuzlarının uzun süreli uygulanması, deneysel hayvan modellerinde ve in vitro birincil hücre kültürlerinde yaşlanmayı indükler ve doğal yaşlanma sürecinin altında yatan mekanizmaları tanımlamak için kullanılır [1-4]. Önceki çalışmalar, D-galaktoz ile indüklenen yaşlanma modeli farelerdeki bilişsel düşüşün, beyindeki azalmış sinir büyüme faktörü (NGF) protein seviyeleri ve artan reaktif oksijen türleri (ROS) ile ilişkili olduğunu göstermektedir, bunların her ikisi de hipokampal nöronların dejenerasyonuna neden olur ve azalır. nörogenez [3, 4]. Yakın zamanda yapılan araştırmalar, insan bağırsağı mikrobiyotasının bileşiminin ve sayısının yaşlanma süreci boyunca önemli ölçüde değiştiğini de göstermiştir[5].
Cistanche Deserticola, esas olarak Çin'in Kuzey-Batı çöl bölgesinde yetişen ve geleneksel Çin tıbbında kullanılan bir bitkidir. Genellikle "çölün ginsengi" olarak bilinir. Cistanche Deserticola özleri, feniletanoid glikozitler, iridoidler, linyoz, oligosakkaritler, polisakaritler ve amino asitler dahil olmak üzere farmakolojik olarak aktif birkaç bileşik içerir; bu bileşikler, anti-inflamatuar, anti-oksidatif, yaşlanma önleyici, nöroprotektif ve immünomodülatör özelliklerle ilişkilidir [6, 7]. Örneğin, Cistanche Deserticola'dan ekstrakte edilen polisakkaritler, geleneksel Çin tıbbında kolorektal kanseri tedavi etmek için kullanılmıştır [8]. Chuanqiong polisakkariti, Ganoderma lucidum polisakkariti ve Lycium barbarum polisakkariti gibi çeşitli organizmalardan yararlı biyoaktivitelere sahip çok çeşitli zayıf toksik polisakkaritler izole edilmiştir [9-11]. CDA 0.05, çeşitli Bacteroides ve Lactobacillus türleri de dahil olmak üzere birkaç yararlı bağırsak bakterisinin büyümesini destekleyen Cistanche çölicola'dan izole edilen bir galaktoglukandır [12].
Normal yaşlanma sürecinin altında yatan mekanizmalar ayrıca nörodejeneratif bozukluklar, koroner ateroskleroz, tip 2 diyabet (T2DM) ve hipertansiyon gibi çeşitli insan hastalıklarında da rol oynar [13, 14]. Son çalışmalar, bağırsak florasındaki değişikliklerin insan yaşlanmasında önemli bir rol oynadığını göstermiştir [15]. Birkaç çalışma, deneysel farelerde ve sıçanlarda uzun süreli D-galaktoz uygulamasının normal yaşlanma sürecini taklit ettiğini ve bilişsel düşüş gibi yaşlanma ile ilgili fenotipleri çalışmak için yararlı bir model olduğunu göstermiştir [16]. Ayrıca, D-galaktoz ile indüklenen yaşlanma modeli fareler, bağırsak mikrobiyotasının bileşiminde değişiklikler gösterir [17]. Bu nedenle, bağırsak mikrobiyota bileşimindeki değişikliklerin D galaktoz kaynaklı yaşlanma model farelerde bilişsel düşüşe neden olabileceğini varsaydık ve Cistanche çölikola polisakaritlerinin (CDPS) bağırsak mikrobiyota disbiyozunu geri yükleyerek bilişsel düşüşü hafifletip hafifletemeyeceğini araştırdık.
cistanche sapı
SONUÇLAR
D-galaktoz kaynaklı yaşlanma modeli fareler, bilişsel düşüş ve bağırsak mikrobiyal disbiyozu gösterir
Yeni nesne tanıma ve Morris su labirenti (MWM) testleri kullanarak vahşi tip (WT) farelerin ve 2 ay boyunca Kg vücut ağırlığı başına 150 mg D-gal ile tedavi edilenlerin (model veya Mod) davranış performansını analiz ettik. Yeni nesne tanıma testindeki tercihli indeks değerleri, WT grubu farelere kıyasla Mod grubu farelerde önemli ölçüde azaldı (Şekil 1A, 1B). MWM test sonuçları, WT grubuna kıyasla Mod grubunda altıncı günden sonraki kaçış gecikme süresinin önemli ölçüde arttığını gösterdi (Şekil 1C, 1D). Ayrıca, WT grubuna kıyasla Mod grubunda hedef platform geçişleri ve hedef kadranda yüzme süreleri önemli ölçüde azaldı(Şekil 1E, 1F). Bu sonuçlar, Legal kaynaklı yaşlanma modeli farelerin öğrenme ve hafıza yeteneklerinde önemli bir düşüş olduğunu gösterdi.
Daha sonra, dışkı örneklerinden 16S ribozomal RNA (rRNA) dizileme verilerini kullanarak Mod ve WT fare gruplarının dışkı örneklerinde bağırsak mikrobiyal filumlarının, cinslerinin ve türlerinin bolluğu ve bileşimindeki farklılıkları analiz ettik. WT ve Mod grubu farelerde baskın bağırsak florası Firmicutes ve Bacteroides idi. Bununla birlikte, WT grubuna kıyasla Mod grubunda Bacteroides bolluğu önemli ölçüde azaldı ve Firmicutes bolluğu önemli ölçüde arttı (Şekil 2A). Daha sonra, WT ve Mod grubu farelerde farklı taksonların nispi bolluğunu değerlendirmek için LDA etki büyüklüğü (LEfSe) puanlarını belirlemek için lineer diskriminant analizi (LDA) ve ardından Kruskal-Wallis ve Wilcoxon testleri gerçekleştirdik. LDA sonuçları Şekil 2B'de gösterilmektedir. Ayrıca, WT ve model gruplarında Bacteriodes ve Firmicutes filumlarına ait çeşitli cins ve türlerin farklı zenginleşmesini gösteren kladogramlar oluşturduk (Şekil 2C). Genel olarak, sonuçlarımız D-galaktoz kaynaklı yaşlanma modeli farelerde bozulmuş bilişsel yetenek ve bağırsak mikrobiyal disbiyozu gösterdi.
cistanche sağlık yararları: anti-oksidasyon
CDPS tedavisi, D-gal kaynaklı yaşlanma modeli farelerde bilişsel yeteneği geliştirir
CDPS tedavisinin D-gal kaynaklı yaşlanma modeli farelerde bilişsel düşüşü hafifletip hafifletmediğini analiz ettik. Uygulamanın 2 ayı boyunca vücut ağırlığı gün aşırı ölçüldü. Modelin vücut ağırlıkları ve farelerin CDPS grupları benzerdi (Şekil 3A). Son dozdan sonra davranışsal deneyler yapın. Yeni nesne tanıma ve Morris su labirenti testi sonuçları, farelerin CDPS gruplarında kısa süreli belleğin, farelerin model grubuna kıyasla önemli ölçüde daha yüksek olduğunu gösterdi; CDPS fare grubundaki uzun süreli bellek, fare model grubuna kıyasla daha yüksekti ancak istatistiksel olarak önemsizdi (Şekil 3B, 3C). Bu, CDPS tedavisinin, D-gal ile tedavi edilen farelerde kısa süreli nesne tanıma belleği kaybını ortadan kaldırdığını gösterdi.
Bu farelerin uzamsal öğrenmesi ve hafızası Morris su labirent testi ile değerlendirildi ve sonuçlar, CDPS fare grubunun kaçış gecikme sürelerinin WT fare grubuyla karşılaştırılabilir olduğunu ve Mod grup farelerinden önemli ölçüde daha kısa olduğunu gösterdi (Şekil 3D) . Ayrıca, CDPS uygulamasından sonraki altıncı günde, model grubuna kıyasla kaçış gecikme süreleri önemli ölçüde daha düşüktü (Şekil 3E). Model grubuna göre CH ve CM gruplarında hedef kadranda yüzme süresi anlamlı olarak daha yüksekti. CL grubu, model grubundan daha yüksektir ancak istatistiksel bir önemi yoktur(Şekil 3F). Ayrıca CM ve CL gruplarında platform geçiş sayısı model grubuna göre anlamlı olarak daha fazlaydı. Ancak CH grubu, model grubundan daha yüksektir ve istatistiksel bir önemi yoktur (Şekil 3G). Bu sonuçlar, CDPS tedavisinin, D-gal ile indüklenen yaşlanma modeli farelerde uzamsal öğrenmeyi ve hafızayı geliştirdiğini gösterdi.
Şekil 1. Uzun süreli D-galaktoz uygulaması, farelerde öğrenme ve hafıza bozukluğuna neden olur.
Şekil 2. Uzun süreli D-galaktoz uygulaması, farelerde bağırsak mikrobiyal disbiyozunu indükler.
CDPS tedavisi, D-galaktoz yaşlanan model farelerde bağırsak mikrobiyota bileşiminin homeostazını geri yükler
Monosakaritler ve polisakaritler, bakterilerin büyümesi için gerekli olan temel besinlerdir [18-21]. CDPS'nin bağırsak mikrobiyotasının bileşimini düzenlediği de bildirilmektedir [22]. Bu nedenle, WT, model ve CDPS fare gruplarından dışkı örneklerinin 16S rRNA dizileme verilerini değerlendirerek, CDPS tedavilerinin model grubu farelerde bağırsak mikrobiyal disbiyozunu hafifletip hafifletmediğini analiz ettik.
İlk olarak, bu gruplar arasındaki genel fekal mikrobiyota zenginliğini ve yapısal farkı değerlendirmek için alfa çeşitlilik indekslerini hesapladık. Farklı murin gruplarının dışkı örneklerinde çeşitli bakteri türlerinin kompozisyonundaki değişiklikleri belirlemek için gözlemlenen türler, Shannon, Chao 1, ACE ve Simpson indeks değerleri gibi alfa çeşitlilik (-çeşitlilik) indekslerini analiz ettik. -çeşitlilik (gözlenen türler, Shannon, Chao 1, ACE ve Simpson indeksleri) indeksleri, farelerin WT ve CDPS gruplarında model grubuna kıyasla daha yüksekti, ancak istatistiksel anlamlılık sadece CM arasındaki Chao 1 indeks değerleri için gözlendi. grup ve Mod grubu. CDPS ile uygulamanın mikrobiyom zenginliğini arttırdığını gösterdi (Şekil 4A–4E). Daha sonra, Metrik Olmayan Çok Boyutlu Ölçekleme (NMDS), Temel Koordinatlar Analizi (PCoA) ve Temel Bileşen Analizi (PCA) kullanarak WT, model ve CDPS fare grupları arasındaki bağırsak mikrobiyal türlerindeki farklılıkları belirlemek için çeşitlilik indekslerini analiz ettik. . PCA, boyut küçültme ve kalıpların ve eğilimlerin korunması da dahil olmak üzere, yaşlanma süreci sırasında model grubu farelerin bağırsak mikrobiyal bileşiminde farklılıklar gösterdi (Şekil 4F). WT, model ve CDPS grupları arasındaki dışkı mikrobiyotasındaki farklılıklar, 16S rRNA genleri için ağırlıksız UniFrac mesafelerinin PCoA'sına göre tanımlandı (Şekil 4G). Kümeleme analizi, model grubu ile WT ve CDPS grupları arasında NMDS'de önemli farklılıklar gösterdi (Şekil 4H).
Bağırsak mikrobiyotasının ilk 10 filumunu değerlendirdik ve Bacteroides filumunun bolluğunun CH, CM ve CL gruplarında model grubuna kıyasla önemli ölçüde daha yüksek olduğunu bulduk (Şekil 4I). Bu, CDPS'nin D-gal ile tedavi edilen farelerde bağırsak mikrobiyotasının homeostazını restore ettiğini gösterdi. Kladogramlar, WT, model ve CDPS gruplarında Bacteriodes ve Firmicutes filumlarına ait çeşitli cins ve türlerin farklı zenginleşmesini gösterdi (Şekil 4J). Isı haritalarında gösterildiği gibi, CDPS tedavileri Thermoplasmata, Bacilli, tanımlanmamış Actinobacteria, Fusobacteriia ve tanımlanmamış Elusimicrobia'nın nispi bolluğunu azalttı ve Methanobacteria, Spirochaetia,Deltaproteobacteria, unidentified_Deferribacteres, Mollicutesphaeri, Nitroline, Nitroline'ın nispi bolluğunu artırdı ,Erysipelotrichia ve tanımlanamayan_Siyanobakteriler model grubuyla karşılaştırıldığında (Şekil 4K). Bu sonuçlar, CDPS tedavisinin, D-gal ile indüklenen yaşlanma modeli farelerde bağırsak mikrobiyotasının homeostazını önemli ölçüde restore ettiğini gösterdi.
Şekil 3. CDPS tedavisi, D-gal yaşlanan model farelerde öğrenmeyi ve hafızayı geliştirir.
CDPS tedavisi, oksidatif stresi azaltarak D-gal kaynaklı yaşlanma modeli farelerde nörodejenerasyonu hafifletir
Daha sonra, pro-inflamatuar sitokinlerin (IL-2 ve TNF- ) ve anti-inflamatuar sitokinlerin (IL-4 ve IL-10) serum seviyelerini analiz ederek CDPS'nin inflamasyon üzerindeki etkilerini analiz ettik. ) farklı fare gruplarında. Modele göre CH, CM ve CL gruplarında IL-2 ve TNF- serum seviyeleri anlamlı olarak daha düşüktü ve IL-4 ve IL-10 serum seviyeleri anlamlı olarak daha yüksekti. grup. CDPS'nin antiinflamatuar etkileri olduğu gösterilmiştir (Şekil 5A–5D).
Oksidatif stres, artan reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretiminden kaynaklanır ve yaşlanmayı destekleyen ana faktörlerden biridir [23]. Bu nedenle, antioksidan enzim, SOD ve lipid peroksidasyon ürünü, malondialdehit (MDA) serum seviyelerini değerlendirerek, D-gal ile indüklenen yaşlanan fare modelinde CDPS'nin oksidatif stres üzerindeki etkilerini analiz ettik. MDA'nın serum seviyeleri, WT grubuna kıyasla Mod grubunda önemli ölçüde daha yüksekti ve serum SOD seviyeleri önemli ölçüde azaldı, ancak CDPS tedavisi bu etkileri tersine çevirdi (Şekil 5E, 5F). Bu sonuçlar, D-gal ile indüklenen yaşlanma modeli farelerde oksidatif stresin arttığını, ancak CDPS tedavisi ile azaldığını gösterdi.
Ayrıca, ileri oksitlenmiş protein ürünü (AOPP), doğrudan lipid peroksidasyonu (LPO) ve MDA seviyelerinin yanı sıra glutatyon peroksidaz (GSH-Px) gibi antioksidan enzimlerin aktivitelerini analiz ederek beyin dokularındaki oksidatif stres seviyelerini değerlendirdik. ) ve beyin dokusu homojenatlarında süperoksit dismutaz (SOD). Mod grubu farelerin beyinleri, WT grubuna kıyasla SOD ve GSH-PX aktivitelerini önemli ölçüde azalttı ve AOPP, LPO ve MDA düzeylerini önemli ölçüde artırdı, ancak bu etkiler CH, CM ve CL grubunda tersine döndü (Şekil 6A– 6E).
Ayrıca, CDPS'nin D-gal ile indüklenen yaşlanma modeli farelerin beyinleri üzerindeki koruyucu etkilerini değerlendirmek için H&E ve Nissl lekeleriyle beyin bölümlerinin histolojik boyamasını gerçekleştirdik. Mod grubu fareler, WT grubuna kıyasla, nöron sayısı ve hacminde önemli bir azalma, nöronlar arasındaki boşlukta artış, nöronların düzensiz düzenlenmesi ve nükleer piknoz gösterdi, ancak bu patolojik değişiklikler, WT grubuna kıyasla önemli ölçüde azaldı ( Şekil 6F). Bu sonuçlar, CDPS tedavilerinin, D gal ile indüklenen yaşlanma modeli farelerde oksidatif stresi ve beyin patolojisini önemli ölçüde azalttığını gösterdi.
Şekil 4. CDPS tedavisi, D-galaktoz ile indüklenen yaşlanma modeli farelerde bağırsak mikrobiyal kompozisyonunu geri yükler.
CDPS tedavisi, D-gal kaynaklı model farelerde bağırsak mikrobiyal homeostazını koruyarak periferik inflamasyonu ve oksidatif stresi azaltır
Daha sonra, bağırsak mikrobiyotasının bileşimindeki değişikliklerin artan periferik inflamasyon ve yaşlanma sırasında oksidatif stres ile ilişkili olup olmadığını analiz ettik. Buna doğru, CDPS ile tedavi edilen yaşlanan model farelerde bağırsak mikrobiyotasını kesmek veya immünosupresyonu indüklemek için üçlü antibiyotik kokteyli (ABX grubu) veya siklofosfamid (Cy grubu; ayrıca bkz. Malzemeler ve yöntemler) kullandık. Antibiyotik tedavisi, yaşlanan model farelerde CDPS tedavisinin faydalı etkilerini ortadan kaldırdı. CDPS ile tedavi edilen gruba kıyasla ABX grubu farelerde bozulmuş öğrenme ve hafıza (Şekil 7A) ve bağırsak mikrobiyotasının bileşiminde (Şekil 7B, 7C) değişiklikler gözlemledik. Yukarıdaki sonuçlar, CDPS uygulamasının bile, bağırsak florasını değiştirdikten sonra farelerin öğrenme ve hafıza yeteneğini artıramayacağını göstermektedir. Ayrıca, CDPS grubuna kıyasla ABX grubu farelerin beyin ve serumunda proinflamatuar sitokin düzeylerinin arttığını gözlemledik (Şekil 7D–7N). ABX grubu ve CY grubunun sonuçları, bağırsak florası ve bağışıklık fonksiyonu yok edildikten sonra, CDPS uygulamasının bile farelerin öğrenme ve hafıza yeteneklerini geliştiremediğini gösterdi. Bu sonuçlar, CDPS tedavisinin, bağırsak disbiyozunu önleyerek Legal kaynaklı yaşlanma modeli farelerde periferik inflamasyonu, oksidatif stresi ve bilişsel düşüşü azalttığını gösterdi.
Daha sonra CDPS'nin faydalı etkilerinde inflamasyonun rolünü belirlemek için immünosupresif ilaç olan siklofosfamid [24] kullandık. Siklofosfamid ile tedavi edilen CDPS fareleri (Cy grubu), vahşi tip ve CDPS grubu farelere kıyasla beyin ve serumda bozulmuş öğrenme ve hafıza yeteneği, bağırsak mikrobiyota bileşiminde değişiklikler ve anormal pro- ve anti-inflamatuar sitokin seviyeleri gösterdi. Ancak model ve ABX grubu ile karşılaştırıldığında anlamlılık yoktur. (Şekil 7A–7N). Bu veriler, bağırsak mikrobiyotasının bileşimindeki değişikliklerin, D-gal ile indüklenen yaşlanma modeli farelerde periferik iltihabı arttırdığını göstermektedir.
Şekil 5. CDPS tedavisi, D-galaktoz ile indüklenen yaşlanma modeli farelerde pro- ve anti-inflamatuar sitokinlerin ve oksidatif stresle ilgili faktörlerin dolaşımdaki seviyelerini modüle eder.
CDPS, amino asit metabolizmasını düzenleyerek D-gal kaynaklı yaşlanmayı önler
Konağın bağışıklık sistemi, bağırsak mikrobiyotası tarafından üretilen metabolitlerden etkilenir [25]. Dışkı metabolitleri, bağırsak mikrobiyal metabolizmasının ve bağırsak mikrobiyal bileşiminin işlevsel bir okumasını temsil eder [26]. Ayrıca, bağırsak mikrobiyotasının metabolitleri kan dolaşımına girer ve konak metabolizmasını ve sağlığını etkiler [26, 27]. FWT, Mod ve CDPS farelerinden alınan serum örneklerinde toplam 1058 metabolit tanımlandı. Daha sonra, BioCyc, Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) ve İnsan Metabolom Veritabanı (HMDB) kullanarak bu metabolitleri analiz ettik ve Mod grubunda WT grubuna kıyasla 65 metabolitin farklı şekilde ifade edildiğini bulduk. Ayrıca, 8 metabolitin (kreatinin, valin, L-(-)-Metionin, o-Toluidin, N Ethylaniline, ürik asit, prolin ve fenilalanin) seviyelerinin WT, Mod ve CDPS grupları arasında önemli ölçüde farklılık gösterdiğini bulduk. MetaboAnalyst [28, 29] kullanılarak bu 8 metabolitin yol zenginleştirme analizi, bu metabolitlerin arginin, histidin, arginin, prolin ve pürin metabolizması ile ilişkili olduğunu gösterdi (Şekil 8A, 8B). WT grubunda MOD grubu ve CDPS grubunun 7 farklı metaboliti.
Daha sonra amino asit metabolizmasındaki değişikliklerin bağırsak mikrobiyotasının bileşimindeki değişikliklerle ilişkili olup olmadığını analiz ettik. WT, Mod ve CDPS gruplarının 7 farklı metabolitinin (kreatinin, valin, L-(-)-Metionin, o-Toluidin, N-Ethylaniline, ürik asit ve prolin) ABX, Cy, ve Mod grupları, WT ve CDPS gruplarıyla karşılaştırıldığında. Ayrıca ABX ve Cy grupları arasında bir anlam yoktur (Şekil 8C). Son olarak, araştırmak için, diferansiyel metabolizma ve diğer yaşlanma ile ilgili hastalıklar arasında bir ilişki vardır. MetaboAnalyst veri tabanını kullanarak bu yedi farklı şekilde eksprese edilmiş metabolit ile insan hastalıkları arasındaki korelasyonu analiz ettik ve bu metabolitlerin Alzheimer hastalığı ile ilişkili olduğunu bulduk (p=0.00173; Şekil 8D, 8E). Genel olarak, bu veriler, CDPS'nin amino asit metabolizmasını düzenleyerek D-gal kaynaklı yaşlanmaya karşı koruduğunu ileri sürdü.
Şekil 6. CDPS tedavisi, D-galaktoz ile indüklenen yaşlanan model farelerin beyinlerindeki oksidatif stresi azaltır
TARTIŞMA
Bilişsel işlevde ilerleyici bir düşüş, yaşlanmanın karakteristik bir özelliğidir. Önceki çalışmalar, CDPS tedavisinin, yaşlanan model farelerde öğrenmeyi ve hafızayı önemli ölçüde iyileştirdiğini göstermiştir [30-33]. Bu çalışmada, CDPS tedavisinin, D-gal ile indüklenen yaşlanma modeli farelerde bağırsak mikrobiyal homeostazının restorasyonu yoluyla periferik inflamasyonu ve oksidatif stresi inhibe ederek bilişsel işlevi iyileştirdiğini gösterdik (Şekil 9). Cistanche polisakkaritleri ile beslenen Sprague-Dawley sıçanları, yararlı bağırsak bakterilerinin büyümesinin arttığını ve bağırsak mikrobiyal çeşitliliğinin arttığını gösterdi [34]. Cistanche nötr bir polisakkarit olan CDA-0.05, probiyotik Lactobacilli'nin büyümesini iyileştirdi [22]. Bu veriler, Cistanche polisakkaritlerinin bağırsak bakterilerinin homeostazını iyileştirdiğini ileri sürdü.
Bu çalışmada, CDPS'nin anti-inflamatuar etkilere sahip olduğunu ve Bacteroidetes, Firmicutes ve Proteobacteria gibi bağırsak bakteri cinslerinin bolluğunu modüle ederek yaşlanan model farelerin bilişsel yeteneklerini geliştirdiğini gösterdik. Bu nedenle, CDP'ler, bağırsak mikrobiyotasının bileşimini yeniden şekillendirerek yaşlanmayla ilişkili hastalıklar için terapötik olarak faydalı olabilir [35,36]. Ayrıca, önceki çalışmalar, serum ve kolondaki inflamatuar sitokin seviyelerinin, Bacteroidetes, Firmicutes ve Proteobacteria gibi bakteri türlerinin göreceli bolluğu ile ilişkili olduğunu göstermiştir [37, 38]. Ayrıca, bağırsak mikrobiyal bileşimi, çeşitli sitokinlerin dolaşımdaki seviyelerini modüle ederek beyin fonksiyonunu düzenler [39-43]. Sonuçlarımız, CDPS tedavisinin Thermoplasmata, Bacilli, tanımlanmamış Actinobacteria, Fusobacteriia ve tanımlanmamış Elusimicrobia'nın nispi bolluğunu azalttığını ve Methanobacteria, Spirochaetia,Deltaproteobacteria, unidentified_Deferribacteres, Mollicutes, Nitrosophoreaeria'nın nispi bolluğunu arttırdığını gösterdi. Erizipelotrichia ve tanımlanamayan_Siyanobakteriler.
Bağırsak mikrobiyal metabolitleri kan dolaşımına salınır ve konağın sağlığını ve metabolizmasını düzenler [26, 27]. Bağırsak mikrobiyal metabolitleri, bağırsak mikroplarının bileşimindeki değişikliklerle değişen fekal metabolit bileşiminin değerlendirilmesiyle tahmin edilebilir [44]. Son çalışmalar sitrülin, prolin, arginin, asparagin, fenilalanin ve treonin plazma düzeylerinin Alzheimer hastalığı dahil nörodejeneratif bozukluklarla ilişkili olduğunu göstermiştir [45, 46]. Çalışmamız, kreatinin, valin, L-metionin, o-Toluidin, N etilanilin, ürik asit ve prolin serum düzeylerinin farelerde D-gal kaynaklı yaşlanma ile ilişkili olduğunu gösterdi.
Cistanche özü: anti-Alzheimer hastalığı
Bağışıklık sisteminin doğuştan gelen ve adaptif kolları, bağırsak lümen yüzeyinde konakçı-mikrobiyal homeostazın korunmasında önemli bir rol oynar [47]. Bağırsak mikrobiyotası, sitokinleri ve metabolitleri kan dolaşımına salarak merkezi sinir sistemini (CNS) ve bağışıklığı düzenlemede de önemli bir rol oynar [48, 49]. Proinflamatuar sitokinler, çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda anahtar rol oynar [50-52]. Örneğin, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ve glokom, hücre dışı amiloid birikimi (A) ve retinal ganglion hücrelerinde (RGC) hiper-fosforile tau (p tau) ve demirin hücre içi birikimi ile ilişkilidir [44]. Ayrıca inflamasyon, glokomla ilişkili patogenezde önemli bir rol oynar [53]. Görme bozukluğu Alzheimer hastalığının (AH) erken bir belirtisidir ve bilişsel gerilemenin başlangıcından önce kendini gösterir [54]. Çalışmamız, CDPS'nin bağırsak mikrobiyotasının homeostazını koruyarak bilişsel düşüşe ve periferik inflamasyona karşı koruduğunu gösterdi.
Bu çalışmanın birkaç sınırlaması vardır. İlk olarak, amino asit metabolizması ile bağırsak mikrobiyotasının bileşimi arasındaki ilişki iyi bilinmemektedir. İkinci olarak, CDPS'nin bileşimi ve moleküler yapısı bilinmemektedir. Bu nedenle, bağırsak mikrobiyota-beyin sinyali ekseni yoluyla AD'yi hafifletmede CDPS'nin düzenleyici rolünü daha fazla araştırmak için gelecekteki çalışmalara ihtiyaç vardır.
Sonuç olarak, çalışmamız, CDPS'nin, D-gal ile indüklenen yaşlanma model farelerde, bağırsak mikrobiyotasının homeostazını geri yükleyerek, böylece amino asit dengesizliğini, periferik inflamasyonu ve oksidatif stresi geri yükleyerek bilişsel yeteneği geliştirdiğini göstermiştir. Bu bulgular, CDPS'nin, özellikle bağırsak disbiyozu ile ilişkili olanlar olmak üzere, öğrenme ve hafıza bozuklukları olan hastalar için potansiyel bir terapötik olduğunu göstermektedir.
MALZEMELER VE YÖNTEMLER
CDPS'nin Hazırlanması
Yaklaşık 1.0 Kg temizlenmiş Cistanche Deserticola, fırında 40 derece C'de havayla kurutuldu ve ham toz halinde toz haline getirildi. Toz, 3 saat boyunca sıcak etanol içinde özümlendi. Tortu, süzüntüyü çıkarmak için gazlı bezden süzüldü ve daha sonra suyla (8X) seyreltildi ve 90 derece C'de sırayla 2 saat, 1.5 saat ve 1 saat geri akıtıldı. Her zaman noktasında, çözelti, süpernatantı ayırmak için santrifüjlendi ve kahverengi-kırmızı süzüntü ile birleştirilir. Daha sonra süzüntü azaltılmış basınç altında konsantre edildi, oda sıcaklığına soğutuldu, yavaş yavaş yüzde 95 etanol (3X) ilave edildi ve 24 saat boyunca 4 derece C'de beklemeye bırakıldı. Daha sonra çözelti, 4 derece C'de 20 dakika boyunca 6000 r/dk'da santrifüjlendi. Çökelti, su ekstraksiyonu ve alkol çökeltmesi üç kez tekrarlandıktan sonra toplandı. Çökelti suda yeniden oluşturuldu, proteinden arındırıldı, diyaliz edildi ve ham Cistanche Deserticola polisakaritini (CDP'ler) elde etmek için dondurularak kurutuldu. Ultraviyole spektrofotometri ile değerlendirildiğinde polisakkarit içeriği yüzde 90'dan fazlaydı.
cistanche özü
Hayvan gruplama ve tedavileri
Sekiz haftalık erkek Kunming fareleri (SCXK Lisans No.2019-0010), SPF Biotechnology Co. Ltd.'den (Pekin, Çin) satın alındı, ışık ve sıcaklık kontrollü bir odaya yerleştirildi ve yiyecek ve su ile beslendi. Tüm hayvan deneyleri, İç Moğolistan Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokollere göre yapıldı. Deneyler, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna göre yapıldı.
Yeni çevreye 1 haftalık adaptasyondan sonra 120 fare aşağıdaki 7 gruba ayrıldı: (1) vahşi tip kontrol (WT); model grubu (150 mg/Kg/gün D-gal; Mod); (3) CH: D-gal artı 100 mg/kg CDPS; (4) CM: D-gal artı 50 mg/kg CDPS; (5) CL: D-gal artı 25 mg/kg CDPS; (6) ABX grubu: antibiyotikler artı D-gal artı 50 mg/Kg CDPS; (7) Cy grubu: siklofosfamid artı D-gal artı 50mg/kg CDPS.
Model, ABX, Cy ve CDPS gruplarından fareler, 2 ay boyunca her gün tuzlu suda çözülmüş 150 mg/kg D-gal deri altı enjeksiyonları aldı. WT grubuna 2 ay boyunca eşit hacimde salin deri altından enjekte edildi. CDPS grubu farelere ayrıca 2 ay boyunca 100 mg/kg, 50 mg/Kg veya 25 mg/Kg CDPS içeren intragastrik enjeksiyonlar da uygulandı. ABX grubu farelere D-gal ve CDPS enjeksiyonlarına ek olarak 2 ay boyunca 0.1 mg/mL ampisilin ve 0.5 mg/mL streptomisin içeren içme suyu verildi. D-gal uygulanmadan önce, farelere ABX grubunda 7 gün boyunca 0.1 mg/mL ampisilin, 0.5 mg/mL streptomisin ve 0.1 mg/mL kolistin içeren enjeksiyonlar yapıldı. Cy grubu fareler, günlük D-gal ve CDPS enjeksiyonlarına ek olarak 2 ay boyunca gün aşırı (qod) 20 mg/Kg siklofosfamidin intraperitoneal enjeksiyonlarını aldı.
Yeni nesne tanıma testi
Son dozdan sonra davranışsal deneyler yapın. Nesne tanıma testi, alışma, eğitim ve test aşamalarını içeriyordu. Alıştırma aşaması sırasında, fareler iki gün boyunca 10 dakika boyunca boş bir test odasında alıştırıldı. Daha sonra, üçüncü gün (eğitim günü), aynı boyut, şekil ve renkte (A1 ve A2) iki nesne odanın karşıt uçlarına yerleştirildi. Daha sonra her fareye iki benzer nesneyi keşfetmesi için 10 dakika verildi. 1-saat (üçüncü gün) ve 24-saat (dördüncü gün) eğitim-test aralıklarından sonra, benzer nesnelerden biri (A1 veya A2) B veya C ile değiştirildi test gününde boyut, renk ve şekil olarak farklı olan nesne. Test aşaması sırasında, her fare 5 dakika boyunca test edildi ve yeni nesne (B veya C) tanıma hafızasını belirlemek için tercihli indeks aşağıdaki formül kullanılarak hesaplandı: Tercihli indeks=B veya C nesnesindeki süre/ (B veya C nesnesindeki süre artı A nesnesindeki Süre)× yüzde 100 .
Morris su labirenti testi
Morris su labirenti testi, 45 cm derinliğinde ve 90 cm çapında yuvarlak bir havuzda yapılmıştır. Ruediger S, ve ark. (2011) [55] ve Wood RA, et al. (2018) [56] burada istihdam edildi. Havuzdaki su derinliği 30 cm, su sıcaklığı 20±1 derece C idi. Platform 6 cm çapında ve 1 cm su altındaydı. Eğitim ve test süresi her biri 60 s idi. Eğitim için, kesintisiz beş gün boyunca her gün her biri gizli bir platformla 60 saniyelik dört deneme gerçekleştirdik. 60 s içinde platform fareler tarafından keşfedilmemişse, platforma yönlendirilerek 5 s boyunca platforma yerleştirildiler. Test aşamasında, eğitim ve yoklama deneme oturumlarında gizli platforma ulaşma gecikmesi, kaldırılan platform lokasyonu üzerinden geçiş sayısı ve hedef (platform) kadranında geçirilen süre kaydedildi ve analiz edildi.
ELISA testleri
IL-2(), IL-4, IL-10 ve TNF- gibi proinflamatuar sitokinlerin serum seviyeleri, Shanghai Yi Li'den satın alınan ELISA kitleri kullanılarak her bir fare grubu için analiz edildi. Biological Technology Co., Ltd. (Shanghai, China) üreticinin talimatlarına göre. Her fare grubunun serumunda antioksidan enzim, süperoksit dismutaz (SOD) ve lipid peroksidasyon ürünü malondialdehit (MDA) seviyeleri Nanjing Jiancheng Biyomühendislik Enstitüsü'nden (Nanjing, Çin) satın alınan tahlil kitleri ile analiz edildi. . Murin hipokampus numunelerindeki ileri oksidasyon protein ürünlerinin (AOPP) seviyeleri, üreticinin talimatlarına göre Shanghai Yi Li Biological Technology Co. Ltd.'den (Şangay, Çin) bir ELISA kiti kullanılarak tahmin edildi.
Murin beyinlerinde oksidatif stres tahmini
100 mg hipokampus dokusunu 0,9 ml buzla soğutulmuş salin ile homojenize ettik ve homojenat 12000 rpm'de 30 dakika boyunca 4 derece C'de santrifüjlendi. Süpernatandaki protein içeriği BCA Protein Test Kiti kullanılarak analiz edildi ( Beyotime Biyoteknoloji, Şanghay, Çin). Hipokampus örneklerinde lipid peroksidasyonu (LPO) ve malondialdehit (MDA) seviyeleri ve GSH-Px ve SOD aktiviteleri, üreticinin talimatlarına göre Nanjing Jiancheng Biyomühendislik Enstitüsü'nden (Nanjing, Çin) alınan kitler kullanılarak kolorimetri ile analiz edildi.
Cistanche takviyesi: hafızayı geliştirir
Bağırsak mikrobiyota bileşimi
Tüm farelerden dışkı örnekleri toplandı ve hemen -80 derece C'de saklandı. 16S rRNA geninin V3 artı V4 bölgesi, Illumina MiSeq (Beijing Novogene Co. Ltd., Beijing, Çin) kullanılarak dizildi ve QIIME kullanılarak analiz edildi. bağırsak mikrobiyota profillerini belirlemek için açık platform.
Serum metabolitlerinin LC/MS analizi
Serum örnekleri, proteinleri çökeltmek için 1:3 oranında önceden soğutulmuş metanol ile 10 dakika süreyle inkübe edildi. Numuneler, 4 derece C'de 15 dakika boyunca 12000r/dk'da santrifüjlendi. Süpernatantlar, Thermo Scientific Dionex UltiMate3000 Hızlı Çözünürlüklü Sıvı Kromatografisi ve QExactive kütle spektrumu ile analiz edildi. Kromatografik koşullar Tablo 1'de gösterilmiştir. Analitler, mobil fazlar A ve B olarak yüzde 0.1 formik asit ve asetonitril kullanılarak bir XBridge BEH Amid kromatografik kolonunda (2.1x100 mm; Waters Co., Milford, MA, ABD) ayrıldı. , sırasıyla. Akış hızı 0.4 ml/dk'ya ayarlandı, enjeksiyon hacmi 5 ul'ye ayarlandı ve kolon sıcaklığı 25 derece C'ye ayarlandı (Tablo 1). Kütle spektrum sinyalleri, pozitif ve negatif iyon tarama modları kullanılarak elde edildi. İyon püskürtme voltajı ve diğer spesifik MS parametreleri Tablo 2'de gösterilmektedir.
istatistiksel analiz
Statistical analysis was performed using the SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). The data plots were generated using GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). Partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) of SIMCA-P+13.0 (Umetrics, AB, Umeå, Sweden) and Principal Components Analysis (PCA) were used to assess normalized GC-MS spectral data. Variable Influence on Projection (VIP) values were used to identify significant variables with VIP values >1.0 ve p< 0.05.="" these="" significant="" variables="" were="" used="" to="" identify="" the="" spectral="" peaks.="" the="" student's="" t-test="" was="" used="" to="" analyze="" the="" differences="" between="" two="" groups="" of="" data.="" the="" taxonomic="" rank="" differential="" between="" groups="" was="" determined="" using="" student's="" test="" (v3.1.2;="" r="" programming="" language).="" the="" correlation="" between="" genera="" abundance="" and="" mouse="" behavior="" was="" calculated="" using="" spearman="" correlation="" coefficients="" (r="" language).="" p="" <="" 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" the="" data="" are="" presented="" as="">
