Kenya'daki Yabani Cistanche Bitkilerinin Tür Tanımlaması ve Kimyasal Bileşim Analizi

Soyut:Bu çalışmada Kenya'daki yabani Cistanche türlerini tanımlamak için bitki morfolojisi, histoloji ve DNA barkodlama teknikleri kullanıldı. Kenya'daki yabani Cistanche'deki feniletanoid glikozitler, şeker alkolleri ve betain dahil olmak üzere ana aktif bileşenlerin içerikleri, HPLC yöntemiyle belirlendi. Bu arada parmak izi analizi de yapıldı. Sonuçlar, Kenya'dan toplanan yabani Cistanche bitkisinin Cistanche senegalensis (Reut.) Beck olarak tanımlandığını gösterdi. Gibi aktif bileşenlerin içeriğiekinekozit,cistanosid A, akteozit, izoakteozitKenya'dan C. senegalensis'teki 2'-asetillakteosid ve 2'-asetillakteosid, yerli C. tubulosa'dakilerden daha düşük, ancak yerli C. Deserticola'dakilerden daha yüksekti. Betain içeriği evcil C. Deserticola'dakine benzerdi ancak glikoz içermiyor. Parmak izinin özellikleri evcil C. tubulosa'nınkine daha çok benzer. Bu çalışma, Kenya'daki Cistanche kaynağının kaynak korunması, derinlemesine araştırılması ve geliştirilmesi için bir temel oluşturmaktadır.

Anahtar Kelimeler: Cistanches Herba; Cistanche senegalensis (Reut.) Beck; Kenya; tür tespiti; DNA barkodlaması; içerik belirleme

 

 

 

Cistanche DeserticolaYC Ma

 

CistancheGeleneksel Çin Tıbbında değerli bir bitki olan çöl bitkilerinin kurutulmuş, pullu, sulu saplarını ifade eder.Cistanche DeserticolaYC MaVeCistanche tubulosa(Schenk) WightHer ikisi de Orobanchaceae familyasının üyeleridir. Böbrek yang'ını tonlama, özü ve kanı besleme ve kabızlığı hafifletmek için bağırsakları nemlendirme yeteneğiyle tanınan Cistanche, yüzyıllardır Çin bitkisel metinlerinde kutlanmaktadır. En eski tıbbi kayıtları antik klasiklerde görülür.Shennong'un Materia Medica KlasiğiCistanche'nin "üstün dereceli" bir bitki olarak sınıflandırıldığı yer. Tarih boyunca çok sayıda geleneksel tıp metni Cistanche'nin güçlü faydalarını belgeledi ve ona "Çöl Ginseng'i" saygın takma adını kazandırdı.

Cistanche'nin çeşitli farmakolojik etkileri, içerdiği biyoaktif bileşikler dizisine bağlanmaktadır. Bunların arasında feniletanoid glikozitler, Cistanche'nin böbrek tonlayıcı ve kemik iliği besleyici etkilerinden sorumlu olan başlıca aktif bileşenlerdir. Ekinekozit ve akteozid gibi bu bileşikler nöroprotektif, anti-demans, yaşlanma karşıtı ve hepatoprotektif aktiviteler sergiler. Çin Farmakopesi'nin 2020 baskısında belirtildiği üzere Cistanche'nin kalite kontrolü için kullanılan iki referans bileşik, ekinakozit ve akteozittir. Ek olarak, Cistanche'nin müshil etkisi esas olarak betain, mannitol, fruktoz, glikoz ve sukroz dahil olmak üzere oligosakarit alkol bileşenlerinden kaynaklanmaktadır. Bu beş bileşen, Cistanche'nin bağırsakları nemlendirme ve bağırsak hareketini destekleme yeteneğinin göstergeleri olarak geniş çapta kabul edilmektedir.

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight

Çin'de başlıca Cistanche türleri şunları içerir:Cistanche DeserticolaYC Ma,Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight,Cistanche salsa(CA Mey.) G. veCistanche sinensisG. Beck. Bu türler İç Moğolistan, Ningxia, Gansu ve Sincan gibi bölgelere özgüdür. Kuzeybatı Çin'in ötesinde, Cistanche türleri aynı zamanda İran, Afganistan, Kenya, Pakistan ve Moğolistan gibi ülkeler de dahil olmak üzere Avrasya'nın kurak ve çöl bölgelerine ve kuzey ve doğu Afrika'ya da dağılmıştır.

Doğu Afrika'da yer alan ve ekvator üzerinde yer alan Kenya, çoğunlukla ortalama yüksekliği 1.500 metre olan yaylalardan oluşsa da kuzey bölgeleri çöl veya yarı çöldür. Kenya'nın yerli halklarının şifalı bitkileri şifa amaçlı kullanma konusunda uzun bir geçmişi vardır. Bölge, diş fırçası ağacının kabuğundan ve köklerinden elde edilen özler gibi zengin bir tıbbi bitki örtüsüne sahiptir (Salvadora persikaL.) antiinflamatuar ve antibakteriyel özellikleriyle bilinir ve sıklıkla diş ağrıları ve enfeksiyonları tedavi etmek için kullanılır. Sandal ağacının kabuğu (Osiris lanceolataHochst. & Steud.) ishali tedavi etmek için kullanılırken, Masai ısırgan otunun kaynatma maddeleri (Urtica massaicaMildbr.) yaprakları mide ağrısında kullanılır. Bu zengin gelenek canlı bir şifalı bitki kültürünü beslemiştir, ancak ekonomik kalkınmadaki zorluklar nedeniyle bu şifalı bitkilerin kullanımı tam olarak belgelenmemiş veya sistematik olarak araştırılmamıştır.

İlginçtir ki, Cistanche türleri genellikle Afrika'da yabani ot olarak kabul edilir ve fazla ilgi görmez veya araştırılmaz. Aslında Afrika Cistanche'si hakkında yayınlanmış çalışma neredeyse yok. Doğu Afrika Topluluğu Kurak ve Yarı Kurak Toprakları Bölgesel Kalkınma Departmanı'nın davetine yanıt veren araştırma ekibimiz, yerel Cistanche kaynaklarını araştırmak için Kenya'da bir saha çalışması gerçekleştirdi. Yabani Cistanche örneklerini topladık, botanik tanımlama yaptık ve bunların birincil biyoaktif bileşiklerini analiz ettik. Amaç, Kenya'daki Cistanche'nin tür çeşitliliğini ve gelişme potansiyelini anlamak ve bu değerli çöl bitkilerinin daha fazla araştırılması ve kullanılması için bilimsel bir temel oluşturmaktı.

Cistanche tubulosa kurutulmuş bütün kök Çin'de Satış

Daha Fazla Bilgi İçin Whatsapp Bize Ulaşın

 

 

Malzemeler ve Yöntemler

Bitki Malzemeleri

Kenya'dan yabani Cistanche örnekleri Ağustos 2023'te Kajiado, Kenya'daki Pekin Üniversitesi Eczacılık Bilimleri Okulu'ndan Profesörler Pengfei Tu ve Yong Jiang tarafından toplandı (01 derece 50'01"G; 36 derece 47'00"E). İki yabani Cistanche bitkisi toplandı ve konakçı bitkilerinin kökleriyle birlikte K1 ve K2 olarak etiketlendi (bkz. Şekil 1). Konakçı bitki, Kenya Ulusal Müzeleri Doğu Afrika Herbaryumu'nda araştırma görevlisi olan Kennedy Matheka tarafından şu şekilde tanımlandı:Sericocomopsis hildebrandtiiAmaranthaceae familyasına ait Schinz. ÖrnekleriCistanche DeserticolaVeCistanche tubulosasırasıyla Sincan Uygur Özerk Bölgesi'ndeki Turpan Şehri ve Yutian İlçesinden toplandı ve Profesör Pengfei Tu tarafından taze etli saplar olduğu doğrulandı.Cistanche DeserticolaYC Ma veCistanche tubulosa(Schrenk) Vay be. Tüm fiş numuneleri laboratuvarımızda muhafaza edilmektedir.

Aletler

Waters Arc HPLC sistemi

Quintix125D-1CN elektronik terazi (Sartorius, Pekin)

Olympus BX-50 optik mikroskop (Olympus, Japonya)

NanoZoomer-SQ panoramik slayt tarayıcı (Hamamatsu Photonics, Japonya)

KQ500DE dijital ultrasonik temizleyici (Kunshan Ultrasonic Instruments, Çin)

MM400 DNA ekstraksiyon öğütücü (Retsch, Almanya)

PCR termal döngüleyici (Analytik Jena, Almanya)

DYY-8C elektroforez aparatı ve tankı (Liuyi Instrument Factory, Pekin)

MINI Space 1000 jel görüntüleme sistemi (Tanon, Şangay)

Sabit sıcaklıkta inkübatör (Yiheng, Şangay)

Reaktifler

Ekinakozit (lot: DST191008-038), akteozit (DSTDL006101), izoakteozit (DST210601-060), D-mannitol (DSTDG006201), Chengdu Desite Bioteknoloji Co., Ltd.'den satın alınmıştır; tubulosid A (MUST-15040115), 2'-asetillakteosid (MUST-15071504), betain (MUST-23082505), D-glikoz susuz (MUST-23030214), fruktoz (MUST-23031403) ve sükroz (MUST-23082505), Chengdu Mansite Bioteknoloji Co., Ltd.'den elde edildi. Metanol (HPLC sınıfı, Thermo Fisher), asetonitril (HPLC sınıfı, OCEANPAK), formik asitin (HPLC sınıfı, VOKA Reaktifleri) tümü kromatografik saflıktaydı. Moleküler analiz için bitki genomik DNA ekstraksiyon kiti (DP305, Tiangen Biotech, Çin) ve ultra saf su kullanıldı.

Etli Kök Bölümlerinin Hazırlanması, Boyanması ve Gözlemlenmesi

Referans [10]'daki yöntem izlenerek, taze Cistanche etli sapları uygun boyutlarda kesildi ve FAA fiksatifinde (%70 etanol: buzlu asetik asit: formaldehit=90:5:5) muhafaza edildi. Kalan fiksatifi uzaklaştırmak için akan su ile yıkandıktan sonra dokular hidroflorik asit ile yumuşatıldı, Safranin ile boyandı, kurutuldu, parafine gömüldü ve kesitlere ayrıldı. Montajdan sonra slaytlar fırınlandı, parafin eritildi ve kesitler %95 etanol Fast Green solüsyonuyla boyandı, ardından nötr reçineyle kapatıldı. Doku morfolojisi mikroskop altında incelendi ve iyi biçimlendirilmiş bölümler, yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için panoramik bir tarayıcı kullanılarak tarandı.

DNA Ekstraksiyonu, PCR Amplifikasyonu ve Sıralaması

Cistanche numunelerinden ve konakçı bitki köklerinden toplam DNA, üreticinin protokolü takip edilerek bir bitki genomik DNA ekstraksiyon kiti (Tiangen) kullanılarak ekstre edildi. Devam etmeden önce kaliteyi değerlendirmek için DNA konsantrasyonları ve OD260/OD280 oranları bir mikro hacimli UV spektrofotometre ile ölçüldü.

PCR amplifikasyonu, moleküler tanımlama için ribozomal DNA'nın dahili kopyalanmış spacer 2 (ITS2) bölgesini ve kloroplast psbA-trnH genini hedef aldı [11]. Primer dizileri aşağıdaki gibiydi:

ITS2 ileri: 5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'

ITS2 tersi: 5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'

psbA-trnH ileri: 5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'

psbA-trnH ters: 5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'

PCR reaksiyonları (25 μL), 12,5 μL 2x Taq Master Mix, ileri ve geri primerlerin her birinden 1 μL (2,5 μmol·L⁻¹), 2 μL DNA şablonu ve 8,5 μL ddH₂O içeriyordu. ITS2 amplifikasyonu: 94 derece 5 dakika; ardından 94 derece 30 saniye, 56 derece 30 saniye, 72 derece 45 saniyelik 35-40 döngü; 72 derece 10 dakikada son uzatma. psbA-trnH amplifikasyonu: 95 derece 4 dakika; 94 derece 30 saniye, 55 derece 1 dakika, 72 derece 1 dakikadan oluşan 35 döngü; 72 derece 10 dakikada son uzatma. PCR ürünleri jel elektroforezi ile analiz edildi ve hedef bantlar Sanger çift yönlü dizilimine tabi tutuldu. Dizi kromatogramları, Çin Materia Medica DNA barkod sistemi ve GenBank veritabanındaki BLAST analizi kullanılarak tanımlanan hedef DNA dizilerini elde etmek için CodonCode Aligner (v3.7.1, CodonCode Co., ABD) kullanılarak analiz edildi. Türlerin tanımlanması için MEGA X yazılımı ile filogenetik ağaçlar oluşturuldu.

Beş Feniletanoid Glikozidin Kantitatif Tayini

Beş feniletanoid glikozitin içeriği daha önce belirlenmiş yöntemler izlenerek belirlendi [13]. Referans çözeltilerinin hazırlanması: Ekinekosid, tübülosid A, akteozid, izoakteozid ve 2'-asetillakteosid'i doğru bir şekilde tartın ve önceden belirlenmiş konsantrasyonda karışık bir standart çözelti hazırlamak için %50 metanol içinde çözün. Kromatografik koşullar: Phenomenex Luna C18 kolonu (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); mobil faz A: asetonitril-metanol (6:1, v:v); mobil faz B: %0,1 formik asit tamponu; gradyan elüsyonu: 0–5 dakika, %10–%18 A; 5–15 dakika, %18–%24 A; 15–20 dakika, %24–%26 A; 20–28 dakika, %26–%30 A; 28–35 dakika, %30–%35 A. Akış hızı: 1,0 mL·dak⁻¹; sütun sıcaklığı: 30 derece; algılama dalga boyu: 330 nm. Yöntem: analiz için HPLC'ye standart ve örnek çözeltilerin her birine 10 μL enjekte edin.

Betain, Mannitol, Fruktoz, Glikoz ve Sükrozun Kantitatif Tayini

Bu bileşenler önceki yöntemlere göre ölçüldü [14]. Referans çözeltileri: betain, mannitol, fruktoz, glikoz ve sakkarozu doğru bir şekilde tartın, karışık bir standart çözelti hazırlamak için suda çözün. Örnek çözeltiler: Cistanche örnek çözeltisini (yukarıdaki gibi hazırlanmış) orijinal konsantrasyonun 1/5'ine kadar %50 metanolle seyreltin, iyice karıştırın ve 0,22 μm mikro gözenekli membrandan filtreleyin. Kromatografik koşullar: Shodex ASHAIPAK NH2P-50 4E kolonu (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); hareketli faz: asetonitril-su (77:23); akış hızı: 0,7 mL·dak⁻¹; sütun sıcaklığı: 25 derece; buharlaşmalı ışık saçılım dedektörü (ELSD) ile algılama: sürüklenme tüpü sıcaklığı 100 derece, taşıyıcı gaz akışı 3 L·min⁻¹. Miktar belirleme, 5 μL ve 10 μL standart çözeltiler ve 5 μL örnek çözelti enjekte edilerek ve harici standart iki noktalı logaritmik denklem kullanılarak içerik hesaplanarak gerçekleştirildi.

Parmak İzi Benzerliği Değerlendirmesi

Örnek çözeltiler yukarıda açıklandığı gibi hazırlandı ve HPLC koşulları ve yöntemleri feniletanoid glikozit ölçümüyle aynıydı. Kromatografik veriler "Geleneksel Çin Tıbbı Kromatografik Parmak İzi Benzerliği Değerlendirme Sistemine (2012 Sürümü)" aktarıldı. K1 numunesinin kromatogramı referans olarak kullanıldı; çok noktalı düzeltme için işaretlenmiş beş feniletanoid glikozit zirvesi, kaplama ve referans kromatogramları oluşturuldu ve parmak izi benzerliği hesaplandı.

 

 

Sonuçlar ve Analiz

1. Cistanche'nin Morfolojik Tanımlaması

Kenya'da toplanan yabani Cistanche örnekleri kendine özgü morfolojik özellikler sergiliyor. Çiçeklenme, uzun-oval-mızrak şeklinde bir brakte ve her iki tarafı da tüysüz olan iki küçük brakteolden oluşan bir başak şeklindedir. Kaliks boru şeklindedir ve tepe noktasında beş küt lob bulunur. Taç boru şeklinde-çan şeklindedir, uzunluğu 3-4 cm, kaliksin uzunluğunun yaklaşık 2,5 katıdır, tepe noktasında beş lob ve kıvrık kenarlar vardır. Taç sarı renklidir (Şekil 1A, B), kurutulduğunda kahverengiye döner. Filamentler yaklaşık 3 cm uzunluğundadır ve tabanda birkaç ince tüy bulunur. Stil stamenlerden biraz daha uzundur ve stigma neredeyse küresel, pürüzsüz ve tüysüzdür. Uzun yünlü tüylerle yoğun bir şekilde kaplanmış, uzun oval anterlere sahip dört organ vardır; anterin tabanı aniden sivri uçludur. Bu özellik, açıklamalarıyla tutarlıdır.Cistanche DeserticolaVeCistanche salsa"Çin Florası"nda; bunun tersine, anter tabanıCistanche tubulosaküt ve yuvarlak olması onu aynı cinsteki diğer türlerden belirgin biçimde ayırır [7].

Ayrıca konukçu bitki,Sericocomopsis hildebrandtiiSchinz, çok dallı bir çalıdır. Genç dalları yoğun olarak soluk sarı veya beyaz yünlü tüylerle kaplıdır. Yapraklar genişçe spatulat-obovattır ve dar tabanlıdır (Şekil 1D, E). Çiçek salkımları, çiçeklenme ekseni ile birlikte grimsi beyaz veya soluk gri veya beyaz yünlü tüylerle kaplı olan sap boyunca yoğun bir şekilde kümelenmiştir.

Yabani Cistanche'nin etli gövdesi düzleştirilmiş silindiriktir; soluk sarı veya kahverengimsi bir yüzey, sıralar halinde düzenlenmiş iğne benzeri, etli pullarla yoğun bir şekilde kaplanmıştır. Doku sağlam ancak biraz esnektir (Şekil 2A). Etli sapın kesiti soluk sarı veya kahverengimsidir ve dağınık soluk kahverengi damar demetleri çıplak gözle görülebilmektedir (Şekil 2B). Mikroskop altında, damar demetleri oval veya fusiform görünür, ksilem ve floemden oluşur, genellikle tek başına dağılmış demetler halinde bulunur veya floem çeşitli yönlere yönlendirilmiş olarak çiftler veya üçlüler halinde gruplandırılmıştır (Şekil 2C, D). Çin Farmakopesi'nin 2025 baskısına göre,Cistanche Deserticolakahverengimsidir, dalgalı bir halka şeklinde düzenlenmiş soluk kahverengi nokta benzeri damar demetleri içerir, genellikle içe doğru katlanmış halka şeklinde bir demet oluşturur; tersine,Cistanche tubulosabu iki tip Cistanche dilimini tanımlamak için önemli bir ayırt edici özellik olan dağınık nokta benzeri damar demetlerini gösterir [1]. Kenya'daki yabani Cistanche'nin enine kesitinde dağınık nokta benzeri damar demetleri de görülüyor.Cistanche tubulosa.

 

 

Şekil 2 Kenya'daki yabani Cistanche bitkisinin (K2) görünümü ve kesit özellikleri. A: Sapın görünümü; B: Etli sapın kesiti; C: Etli gövdenin parafin bölümü (safranin hızlı yeşil boyama); D: Parafin bölümündeki damar demetinin büyütülmüş görünümü