Cistanche Polisakkaritleri Vivo'da Ekinakozit Emilimini Artırır ve Bağırsak Mikrobiyotasını Etkiler

İletişim: emily.li@wecistanche.com

Zhifei Fu ve diğerleri

Soyut

Polisakkaritler vefeniletanoid glikozitleritibarencistanche çöl çiçeğiçeşitli sağlık yararları olduğu gösterilmiştir, ancak bu iki tür bileşik arasındaki in vivo etkileşimli etki ayrıntılı olarak bilinmemektedir. Bu çalışmanın amacı, cistanche polisakkaritlerinin feniletanoid glikozit ile sinerjistik etkilerini ve polisakkaritlerin bağırsak mikrobiyotası üzerindeki etkilerini araştırmaktı. Sprague-Dawley sıçanları 20 gün boyunca farklı türde cistanche polisakkaritleri ile beslendi, son gün tüm sıçanlaraekinakozit100 mg/kg'da. Sonuçlar temel olarak farmakokinetik parametrelerdeki, bağırsak mikrobiyota bileşimindeki ve kısa zincirli yağ asitleri içeriğindeki farkla karşılaştırıldı. Sonuçlar, ham polisakkaritler de dahil olmak üzere tüm cistanche polisakkaritlerinin, yüksek molekülerağırlık polisakkaritlerive düşük moleküler ağırlıklı polisakkaritler, bağırsak mikrobiyota çeşitliliğini düzenleyebilir, faydalı bakterileri artırabilir ve özellikle Prevotella spp.'nin büyümesini artırabilir. kısa zincirli yağ asitlerinin üretimini ve ekinakozit emilimini iyileştirmenin yanı sıra. Polisakkaritlerin küçük moleküllerle sinerjistik etkilerini araştıran bu bulgular, cistanche polisakkaritlerinin, özellikle düşük moleküler ağırlıklı polisakkaritlerin, sağlığın teşviki ve geliştirilmesi için bir bağırsak mikrobiyota manipülatörü olarak kullanılabileceğini göstermektedir.

Anahtar Kelimeler:cistancheçöl çiçeğipolisakkaritEkinakozitBağırsak mikrobiyotresi

Cistanche ürünleri hakkında daha fazla bilgi almak için buraya tıklayın

1. Giriş

Son yıllarda, polisakkaritlerin bağırsak mikrobiyotasının kompozisyonunu modüle ettiği ve değişikliklerin çoklu besinsel absorpsiyonlara aracılık edebileceği [1], fizyolojik fonksiyon [2,3] üretildiği netlik kazanmıştır. Geleneksel Çin tıbbından (TCM) elde edilen polisakkaritlerin, bağırsak mikrobiyota düzenlemesi için ideal adaylar olduğu ve prebiyotik etkiler gösterdiği gösterilmiştir. Sindirimde polisakkaritler ve bazı küçük moleküler bileşikler kaçınılmaz olarak biyolojik aktiviteler üzerinde bazı etkiler gösterirler [4]. Binlerce yıldır yaygın olarak kullanılan Panax ginseng'in ana aktif bileşenlerinden biri olarak, polisakkaritler iyi sonuç verdi.Gelişmeiçindebağırsakmetabolizmaveemilimnın-ninginsenosidlercanlılarda [5]. Codonopsis pilosula polisakkaritleri, dekstran sülfat sodyum ile indüklenen kolit farelerinde saponinlerin absorpsiyonunun teşvik edici etkisini göstermiştir [6]. Ganoderma lucidum polisakkaritlerinin, özellikle yüksek moleküler ağırlıklı fraksiyonunun sahip olduğu ortaya çıktı.prebiyotikfonksiyonlaryüksek yağlı diyete bağlı bağırsak dysbiosis fare modellerinde [7]. Longan polisakaritler, immünomodülatör aktiviteler üretmek için bağırsak mikrobiyotasını ve bağırsak metabolitlerini (piruvat ve bütanoat içeriğini artırarak) düzenler [8].

Geleneksel Çin Tıbbı olarak Cistanche Deserticola, Çin'de bir diyet takviyesi olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Farmakolojik çalışmalar gösterdiğini göstermiştir.sinir koruyucu, bağışıklık düzenleyici, hormonludengeleme, anti-tükenmişlik, anti-iltihaplı, hepatoproteksiyon,anti-oksitleyici, anti-bakteriyel, anti-viral, veanti-tümöretkiler [9]. Kimyasal analiz, feniletanoid glikozitlerin ve polisakkaritlerin ana aktif bileşenler olduğunu gösterdi. C. Deserticola'daki ana feniletanoid glikozit olan ekinakozit, geniş farmakolojik etkiler göstermiştir, ancak, zayıf biyoyararlanım, hızlı ve yoğun metabolizma nedeniyle in vivo olarak ilaçla kullanılabilirliği sınırlıdır. Çalışmalar, ekinakozitin in vitro olarak bağırsak mikrobiyotası tarafından metabolize edilebileceğini doğrulamıştır [10,11]. Bununla birlikte, in vivo kanıtlar araştırılmamıştır. Bildiğimiz gibi, bağırsak mikrobiyotası, bitkisel ilaçların metabolize edici biyoaktivitesine aracılık etmede önemli bir rol oynadı. Bu nedenle, bu çalışmanın temel amacı,cistanche polisakkaritlerbağırsak mikrobiyotası ve ekinakozit metabolizması üzerindeki etkileri.

2. Malzemeler ve yöntemler

2.1. Malzemeler ve kimyasallar

Cistanche Deserticola YC Ma, Alashan, İç Moğolistan Mandela kum endüstrisi geliştirme Co., LTD, Çin'den elde edildi. Profesör Lijuan Zhang (Tianjin Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi) tarafından doğrulandılar. Laboratuarımıza bir fiş örneği yatırıldı. Ekinakozit, asteozit ve klorojenik asit gibi standart madde, Ulusal Farmasötik ve Biyolojik Ürünlerin Kontrolü Enstitüsü'nden (Pekin, Çin) elde edildi. Her standardın saflığı yüzde 98'den büyük veya ona eşitti. Kromatografi dereceli asetonitril ve metanol Fisher Scientific'ten (Pitts Burg, PA) satın alındı. Formik asit, Anaqua Chemical Supply Inc.'den (Wilmington, ABD) satın alındı. Diğer kimyasal reaktifler analitik derecedeydi ve Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.'den (Shanghai, China) satın alındı.

Erkek Sprague-Dawley sıçanları (200-220 g) Beijing HFK Bioscience CO., LTD (Pekin, Çin, lisans No. SCXK (Jing) 2014- 0004) tarafından sağlandı. Tüm hayvanlar, hayvan tesisinde SPF koşulları altında yetiştirildi ve barındırıldı. Deney, hayvan bakımı tarafından oluşturulan yönergelere göre gerçekleştirildi ve bir TJUTCM komitesi kullanıldı ve ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı kılavuzuna uygundu (NIH Yayın numarası 85-23, 1996'da revize edildi) ). 1 haftalık alışma döneminden sonra sıçanlar rastgele dört gruba ayrıldı: kontrol grubu, toplam polisakkarit grubu, yüksek moleküler polisakkarit grubu ve düşük moleküler polisakkarit grubu. Her grupta aynı kafeste yetiştirilen 6 adet rat oluşturuldu.

2.2. Cistanche polisakkaritlerin hazırlanması

3.0 kg Cistanche Deserticola YC Ma temizlenmiş ve hava kurutmalı etüvde 40 derecede kurutulmuş, daha sonra ezilerek kaba bir toz haline getirilmiştir. Kuru kaba toz, 60 derecede iki kez ve her seferinde 2 saat yüzde 85 sulu etanol (h/h) ile özümlendi. Katı-sıvı oranları sırasıyla 1:12 ve 1:10 idi. Bitkisel kalıntılar iki kez daha 100 derecede su ile ekstrakte edilmiş, ekstraksiyon süresi ve katı-sıvı oranları yüzde 85 etanol ile aynı olmuştur. Su solüsyonu birleştirildi ve azaltılmış basınç altında konsantre edildi ve daha sonra yüzde 80 etanol içinde 4 derecenin altında 24 saat bekletilerek çöktürüldü. Çökelti, 4 derecede 10 dakika boyunca 8000 rpm'de santrifüjleme yoluyla izole edildi ve daha sonra toplam polisakkaritleri (ZT) elde etmek için liyofilize edildi. ZT daha sonra deiyonize su içinde çözündürüldü ve 100 kDa içi boş fiber ultrafiltrasyon membranı üzerinde süzüldü, kalıcı infiltrat yüksek moleküler polisakaritler (HM) toplandı. Geçirilen süzüntü, 6 kDa'lık bir ultrafiltrasyon membranı ile süzüldü. Kalıcı süzüntü orta moleküler polisakaritler (MM) ve geçirgen süzüntü düşük moleküler polisakaritler (LM) elde edildi.

2.3. Cistanche polisakkaritlerinin birincil karakterizasyonu

Polisakarit içeriği, standart olarak glikoz kullanılarak sülfürik asit fenol yöntemiyle belirlendi [12]. Toplam protein içeriği BCA yöntemiyle belirlendi [13]. Monosakarit kompozisyon analizi, bir SinoPak C18 kolonu (5 um, 150 mm × 4.6 mm) ve diyot dizisi detektörü (VWD-3000) ​​ile donatılmış HPLC (UltiMate 3000 sistemi) ile gerçekleştirilmiştir. PMP (1-fenil-3- metil-5-pirazolon) ön kolon türevlerinin kromatografik ayrımı, 82:18 (h/h) oranında 100 mM fosfat tamponu ve asetonitril kullanılarak gerçekleştirildi. , yüzde ) 1.0 mL/dk'lık bir akış hızında bir mobil faz olarak. Her numuneden 10 uL enjekte edildi ve 245 nm'de algılama ile 30 dakikalık bir analiz çalışma süresi kullanıldı. Veri toplama ve işleme, Chromeleon Software 7.1 (Dionex, Sunnyvale, CA, ABD) kullanılarak yapıldı.

Moleküler ağırlık (Mw), bir TSK jel G3000 PWXL ile donatılmış yüksek performanslı boyut dışlama kromatografisi (HPSEC, UltiMate 30{{10}}0 sistemi) ile belirlendi. (7.8 × 300.0 mm, Tosoh, Japonya) ve TSK jel GMPWXL (7.8 × 300.0 mm, Tosoh, Japonya) kolonu ve bir RefractoMax521 kırılma indisi dedektörü (RID). Numuneler, 0.5 mL/dk'lık bir akış hızında 0.1 mol/L Na2SO4 ile yıkandı. Kolonun sıcaklığı 35 derecede tutuldu. Standartlar olarak dekstran ve standart eğri, moleküler ağırlığın logaritmasına karşı çizilen elüsyon süresine göre çizildi.

2.4. farmakokinetik çalışma

Kan örnekleri {{0}} sa, 0'da iç kantustan toplanmıştır.083 sa, 0.167 sa, 0.25 h, 0.5 s, 0.75 s, 1.0 s, 2.0 s, 3.{{20}} h, 4.0 sa, 6.0 sa, 8.0 sa, 10 sa, 12 sa ve 24 sa. Ekinakozid (100 mg/kg) uygulamasından sonra. Plazma numuneleri 7500 pm'de 10 dakika santrifüj edilerek elde edildi. 100 μL plazma örneğine 10 μL IS (klorojenik asit) solüsyonu ve 500 μL metanol eklendi. Karışım daha sonra 3 dakika vortekslendi ve 14,000 rpm'de 10 dakika santrifüjlendi. Süpernatan toplandı ve oda sıcaklığında nitrojen içinde kurutuldu. Daha sonra kalıntı, 100 uL yüzde 50 sulu metanol içinde çözündürüldü, tekrar 14,{39}} rpm'de 10 dakika santrifüjlendi. Son olarak, analiz için LC-MS/MS sistemine 3 µL süpernatan enjekte edildi. Numuneler, daha önce bildirilen bir yöntem kullanılarak analiz edildi. Mobil faz, aşağıdaki gradyan kullanılarak CH3CN (çözücü A) ve H2O'dan (yüzde 0.1 HCOOH; çözücü B içerir) oluşuyordu: 0–1 dakika, yüzde 10 A; 1-8 dakika, yüzde 10-90 A; 8-9 dakika, yüzde 90-10 A; 9–11 dk: yüzde 10 A. Örnek, ACQUITY HSS T3 kolonunda (1.8 um, 100 mm x 2.1 mm id) ayrıldı. Akış hızı 0.3 mL/dakika idi ve kolon sıcaklığı 35 dereceye ayarlandı. MS analizinde, aşağıdaki optimize edilmiş parametrelerle negatif iyonizasyon modu kullanıldı: kapiler voltaj, 2.5 kV; desolvasyon sıcaklığı, 450 derece. Azot desolvasyon ve koni gazı olarak sırasıyla 900 L/saat ve 150 L/saat akış hızında kullanıldı. Böylece miktar tayini, ekinakozit için m/z 785.29 → 623.26, klorojenik asit (IS) için m/z 353.06 → 191.07, asteosit için m/z 623.24 → 161.09 geçişlerinin MRM'si kullanılarak yapıldı. Ekinakozit, IS ve ateozit için koni voltajı 100 V, 32 V ve 74 V idi; çarpışma enerjisi, 32 V, 14 V ve 30 V.

2.5. Kısa zincirli yağ asitleri (SCFA'lar) çalışması

Erkek Sprague-Dawley sıçanlarına 3 hafta boyunca oral olarak ZT, HM ve LM uygulandı. Gaz kromatografisi (GC) ile SCFA'ların (asetik asit, propiyonik asit, izobütirik asit, butirik asit, izovalerik asit, valerik asit ve heksanoik asit) tayini, birkaç modifikasyonla daha önce tarif edildiği gibi yapıldı [14]. Kısaca, 0,5 g dışkı numunesi 2.5 mL Milli-Q su içinde dağıtıldı, 10 dakika vortekslendi ve iç standartlar (butirik asit 24.0 ug) içeren 7.5 mL yüzde 1 HC1/etanol çözeltisi /mL ve 2- etil heksanoik asit, dahili standartlar olarak 1.32 ug/mL) eklendi. Karışımlar 5 dakika homojenize edildi ve 14,{19}} rpm'de 10 dakika 4 derecede santrifüjlendi. Beş mikrolitre süpernatan, bölünmüş modda 30:1 oranında enjekte edildi. Taşıyıcı gaz, 1 mL/dk'da N2'ydi (yüzde 99.999). Tamamlama gazı (N2) 25 mL/dk'daydı. H2 ve havanın akış hızı sırasıyla 30 mL/dk ve 300 mL/dk idi. Bu çalışmanın 20. gününde dışkı örnekleri toplandı ve hemen -80 derecede saklandı.

2.6. Dışkı toplama, DNA ekstraksiyonu ve 16S rRNA gen dizilimi

Yaklaşık 200 mg taze dışkı örneği, sıçan başına 1.5 mL steril Eppendorf tüpünde toplandı ve daha sonraki DNA hazırlığı için -80 derecede saklandı. DNA, QIAamp DNA Tabure Mini Kiti (QIAGEN) kullanılarak dışkıdan ekstrakte edildi. DNA miktarı, bir NanoDrop spektrofotometresi (Thermo Electron Corporation) kullanılarak belirlendi; bütünlük ve boyut yüzde 1.0 agaroz jel elektroforezi ile kontrol edildi. Konsantrasyona göre DNA, steril su kullanılarak 1 ng/μL'ye seyreltildi.

16S rRNA, barkodlu spesifik bir primer (V4: 515F-806R) kullanılarak amplifiye edildi. Tüm PCR reaksiyonları, Phusion® High Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs) ile gerçekleştirildi. Eşit hacimde 1× yükleme tamponunu (SYB yeşili içerir) PCR ürünleriyle karıştırın ve saptama için yüzde 2 agaroz jeli üzerinde elektroforezi çalıştırın. 400 ve 450 bp arasındaki parlak ana şeritler sonraki deneyler için seçildi. PCR ürünleri, AB yoğunluk oranlarında karıştırılmıştır. Daha sonra PCR ürünleri karışımı Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen, Almanya) ile saflaştırıldı.

Sıralama kitaplıkları, üreticinin önerileri izlenerek TruSeq® DNA PCR Free Sample Preparation Kit (Illumina, ABD) kullanılarak oluşturulmuştur ve indeks kodları eklenmiştir. Kitaplık kalitesi Qubit® 2.0 Fluorometer (Thermo Scientific) ve Agilent Bioanalyzer 2100 sisteminde değerlendirildi. Kitaplık, bir Illumina HiSeq 2500 platformunda dizildi ve 250 bp çift uçlu okumalar üretildi.

2.7. Biyoinformatik analizi

Barkod ve primer dizisi kesme, dizi montajı ve QIIME'ye (V 1.7.0) göre veri filtreleme. Yüzde 97'den büyük veya buna eşit benzerliğe sahip diziler, aynı OTU'lara atanmıştır. OTU'lar, SILVA etiketleri olarak açıklanmıştır. Bağırsak mikrobiyal topluluk zenginliğini (ACE ve Chao1 metrikleri) ve topluluk çeşitliliğini (Shannon ve Simpson metrikleri) değerlendiren alfa çeşitlilik endeksleri, Qiime (Sürüm 1.9.1) kullanılarak hesaplandı. UniFrac mesafesi kullanılarak mikrobiyal toplulukların yapısal varyasyonlarını araştırmak için beta çeşitlilik analizi kullanıldı. Tüm gruplar arasındaki farklılıklar Tukey testi ve Wilcox testi ile test edildi. R paketleri kullanılarak dört grup arasındaki bileşim farklılıklarını açıklamak için temel koordinat analizi (PCoA) uygulandı. Doğrusal diskriminant analizi etki büyüklüğü (LEfSe) yöntemi, biyobelirteç keşfi ve açıklama sıralama verileri için özel olarak tasarlanmıştır. Ve lineer diskriminant analizi (LDA), her bir farklı bağırsak mikroplarının etki büyüklüğünü ve her bir sıçan grubuyla ilişkili özellikleri hesaplamak için kullanıldı. Korelasyon analizi, gcorrplot (Sürüm 1.1.463) R paketleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

SCFA verileri, SPSS 22.0'nin ANOVA'sı kullanılarak analiz edildi.

3. Sonuçlar ve tartışma

3.1. Cistanche polisakkaritlerin hazırlanması ve kimyasal analizi

Cistanches Herba, Çin'de hem gıda hem de ilaç olarak kullanılmaktadır. Ondan izole edilen polisakkaritler, önemli aktivitelerinden dolayı büyük ilgi görmüştür. Bu çalışmada, su ekstraksiyonu, alkol çökeltme ve ultrafiltrasyon yöntemiyle dört kısım cistanche polisakaritleri (ZT, HM, MM ve LM) elde edildi. Dört kısım polisakkaritlerin kimyasal bileşimleri Tablo 1'de gösterilmiştir.

Standart bir glikoz eğrisi kullanılarak numunelerin toplam şeker içeriği. Sonuç, HM ve LM verimlerinin MM'den daha yüksek olduğunu gösterdi. Polisakaritler, çeşitli farmakolojik özellikler, özellikle bağışıklık aktivitesi gösterdi. Çalışmalar, monosakkarit içeriğinin ve tipinin, moleküler ağırlığının, ikame grubunun tipinin polisakkaritlerin aktivitelerinde önemli bir rol oynadığını göstermiştir [15]. Cistanche polisakkaritlerinin monosakkarit bileşiminin farklı kısımları benzerdi ve mannoz (Man), galakturonik asit (GalUA), glukoz (Glc), galaktoz (Gal) ve arabinoz (Ara) ana monosakkaritlerdi.

Ancak, içerik dört bölüm arasında farklıydı. ZT ve HM'nin ana bileşenleri glikoz ve arabinoz iken, LM'nin ana şeker birimi glikoz iken, ayrıca bu fraksiyonlarda az miktarda ramnoz ve glukuronik asit (GlcUA) tespit edildi.

Numunelerin bağıl moleküler ağırlıkları, yüksek performanslı boyut dışlama kromatografisi (HPSEC) ile araştırıldı. Kolonlardaki dekstranlar ve alıkonma süresinin standart eğrisine göre, ZT'deki ana pik moleküler ağırlıklar 1.68 x 106 Da ve 1.70 x 104 Da'da gözlendi, HM'de 1.54 x 106, 2.06 x 105 ve 4.81 × 104, MM ve LM'de sırasıyla 1.09 × 104 ve 2.05 × 104 olarak belirlendi. Bunların verimleri Tablo 1'de listelenmiştir ve MM verimi hayvan deneyi için düşük ve yeterli değildir. Önceki çalışmalar, cistanche polisakkaritlerinin çeşitli biyoaktiviteler üzerindeki yapıya bağlı etkilerini göstermiştir [16]. Daha ileri deneylere, özellikle saflaştırmaya hala ihtiyaç vardır, Yapı-aktivite çalışması için İnce yapısal analiz uygulanmalıdır.

3.2. farmakokinetik çalışma

Ekinakozidin farmakokinetiği, oral ekinakozid uygulamasından sonra ultra yüksek performanslı sıvı kromatografi üçlü dört kutuplu kütle spektrometrisi (UPLC ve Xevo TQ-S) ile araştırıldı. Ekinakozidin ortalama plazma konsantrasyonu-zaman profilleri Şekil 1'de gösterilmiştir. İlaç ve istatistik yazılımına (DAS, sürüm 2.0) göre, ekinakozidin farmakokinetiği tek bölmeli bir modele ve diğer bölmeli modele uygundur. ZT, HM ve LM gruplarındaki parametreler, maksimum konsantrasyona (Tmax), maksimum konsantrasyona (Cmax), konsantrasyon-zaman eğrisi altında kalan alan (AUC) ve ortalama kalış süresi (MTR) dahil olmak üzere Tablo 2'de özetlenmiştir. ). Bir farmakokinetik çalışma, ZT, HM ve LM gruplarında ortalama ekinakozit Cmax'ının 646.4 ng/mL, 732.0 ng/ml ve 898.4 ng/mL olduğunu göstermiştir; 1.6, 1.8 ve 2.2 idi. sırasıyla kontrol grubu (406.8 ng/ml) ile karşılaştırıldığında. Polisakkaritlerle ön işleme tabi tutularak, ekinakozitin AUC(0-24 h) değeri, polisakkaritlerin gösterdiğini kanıtlayan kontrol grubuna kıyasla ZT, HM ve LM gruplarında sırasıyla yüzde 6,6, yüzde 36,7 ve yüzde 63,6 arttı. küçük bir molekülün emilimini teşvik etme aktivitesi. Bu sonuçlar, kitooligosakaritlerin Fructus Forsythia özündeki [17] feniletanoid glikozitlerin biyoyararlanımını iyileştirmesine ve Polygonum multiflorum'un polisakaritlerinin 2, 3, 5, 4′-tetrahidroksi-stilbenin biyofarmasötik özelliklerini iyileştirmesine oldukça benzerdi- 2- Normal Sprague-Dawley sıçanlarında O- -D-glukozit [18]. Gut mikrobiyotası, ilaç metabolize eden çeşitli enzimler içerir ve mikrobiyom şekillerinin mekanizmaları, ilaç farmakokinetiği ve farmakodinamiği hala bilinmemektedir [19]. Polisakaritler, bağışıklık sistemini artırarak, besinleri emerek ve patojenlerin büyümesini azaltarak bağırsak mikrobiyotasını besleyebilir [20,21]. Literatürde cistanche polisakaritlerinin ekinakozid metabolitlerini (akteozid gibi) in vitro artırabildiğini bildirmesine rağmen, birlikte var olan polisakaritlerin ekinakozitlerin in vivo olarak akteositlere dönüştürülmesi için fayda sağladığını bulamadık [10,11].

3.3. Sıçan dışkısında SCFA içeriği

SCFA'lar gibi çeşitli biyoaktif polimerler ve metabolitler üreten bağırsak mikrobiyotası fermente polisakkaritler [3]. Polisakkaritlerin ana metabolitleri olan SCFA'lar dışkıda analiz edildi. Asetik asit, propiyonik asit ve bütirat dahil SCFA'ların glikoz, kolesterol ve lipid metabolizması üzerinde faydalı etkileri olduğu rapor edilmiştir. Asetat kolondaki ana SCFA'lardır ve kolesterol sentezi için önemli bir substrattır, propiyonat karaciğerde glukoneogenez için bir substrattır ve bütirat kolonositlerin tercih edilen enerji substratıdır ve bağırsakta antiinflamatuardır [22,23].

Sonuçlarımız, tüm gruplar için dışkıda oluşan ana SCFA'ların asetat olduğunu, ardından bütirat ve propiyonatın izlediğini, valerat ve dallı SCFA'ların (izobütirik asit ve izovalerik asit) konsantrasyonunun daha düşük olduğunu gösterdi. Asetatın karaciğer dokusundaki enzim aktivitesini arttırdığı ve bunun da daha iyi kan şekeri kontrolü sağladığı gösterilmiştir [24]. 2. 0. günde (Şekil 2), LM grubu önemli ölçüde daha yüksek bir asetat seviyesine (pb 0.05), propiyonat oranı düşme eğilimindeydi ve bütirat oranı artma eğiliminde olmasına rağmen, kontrol grubuna kıyasla dışkıdaki değişiklik önemsizdi.

Bununla birlikte, HM grubu, kontrol grubuna göre önemli ölçüde daha düşük bir bütirat oranına sahipti (pb 0.05). LM ve HM arasındaki toplam SCFA'ların içerikleri kontrol grubu ile karşılaştırıldığında zıt eğilimdeydi ve sadece LM grubu önemli ölçüde farklıydı.

Kompozisyon ve bağırsak mikrobiyotasının miktarı, diyet kaynağı ve yiyeceklerin sindirim sisteminden geçmesi için geçen süre dahil olmak üzere birçok faktör dışkıdaki SCFA'ların seviyesini etkiler [22]. Biriken çalışmalar, monosakarit kalıntılarının bileşimi, polimerizasyon derecesi dahil olmak üzere polisakkaritlerin yapısının hem fermantasyon özelliklerini hem de SCFA üretimini etkileyebileceğini göstermektedir [25]. Sonuçlarımızdan, cistanche polisakkaritlerinin SCFA üretimini modüle ettiği ve farklı yapıdaki polisakkaritlerin farklı etkileri olduğu sonucuna varabiliriz.

3.4. Cistanche polisakaritler, bağırsak mikrobiyotasının bileşimi ve çeşitliliğinde çekirdek değişikliklerine neden oldu

Dışkı örneklerinin (n=4) bakteri bileşimi, bir Illumina yüksek verimli sıralama tekniği kullanılarak incelendi. Kitaplık bir Illumina HiSeq2500 platformunda dizildi ve 250 bp çift uçlu okumalar üretildi. Taksonomik tanımlama ve çeşitlilik analizi için işlendiler. Nadirlik eğrileri (Şekil 3a), her örnek için, örnekleme derinliği arttıkça bakteri türlerinin zenginliğinin düzleştiğini, bu da sıralama çabasının yeterli olduğunu ve örnek içindeki toplam çeşitliliğin yakalandığını gösterdi. Shannon eğrisi (Şekil 3b), tanımlanan dizilerin sayısı arttıkça benzersiz bakteri türlerinin sayısının arttığını göstermiştir. Shannon eğrilerinin doygunluğu, sıralama verilerinin tüm bakteri türlerini kapsamak için yeterli olduğu anlamına gelir.

Alfa çeşitlilik analizi, bir örnek içindeki çeşitliliği ölçmek için kullanılır. Chao1, ACE, Shannon ve Simpson çeşitlilik indeksleri, alfa çeşitliliğini tanımlamak için Tukey testi ile hesaplandı. ACE ve Chao 1 indekslerine dayanan çeşitlilik analizi, OTU düzeyinde bağırsak mikrobiyotasının topluluk zenginliğini ortaya çıkardı. ACE ve Chao 1 indeksleri, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında (pb 0.05) LM grubunun dışkı örneklerinde önemli ölçüde daha düşüktü (Şekil 4a, b), bu da bağırsak mikrobiyotasının tür zenginliğinin azaldığını gösteriyor. LM besleme ile. Shannon ve Simpson indekslerine dayanan çeşitlilik analizi, bağırsak mikrobiyotasının topluluk çeşitliliğini ortaya çıkardı. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, cistanche polisakkaritleri ile tedavi edildiğinde Shannon ve Simpson çeşitlilik indekslerinde belirgin bir değişiklik olmadı.

Cistanche polisakkaritleri taksonlarda büyük değişikliklere neden oldu. Ayrıca, dört grupta OTU'ların yüzde N98'i filum Bacteroidetes, Firmicutes ve Proteobacteria ile ilişkiliydi. En baskın filum Bacteroidetes'ti %55.0yüzde 9, yüzde 57.89, yüzde 52.72 ve yüzde 69.{{20}}Kontrol, ZT, HM ve Sırasıyla LM grupları, bunu sırasıyla yüzde 41.39 , yüzde 38.03 , yüzde 42.15 ve yüzde 28.15 katkıda bulunan Firmicutes takip ediyor (Şekil 5a, b). Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, Aktinobakterilerin düşük bolluğunun önemli ölçüde artması dışında, ZT grubunun ana filumların nispi bolluğu üzerinde zayıf etkilerle sonuçlandığı gösterildi (MetaStat, pb 0.05). HM grubunda Proteobacteria önemli ölçüde arttı (pb 0.01). Bu, HM Cistanche polisakaritinin, sıçanlardaki maddelerin metabolizmasını etkilemek için Proteobakterilerin zenginleştirilmesini destekleyebileceğini gösterdi. LM grubunda, ana katkıda bulunanları Prevotellaceae ve Prevotellaceae_UCG-001 olan Bacteroidetes bolluğu önemli ölçüde arttı (pb 0.05) ve Peptococcaceae dahil Firmicutes bolluğu önemli ölçüde azaldı (pb 0.01) . Prevotella ve Bacteroides üyeleri daha önce süksinat ve asetat gibi metabolik son ürünler üreten diyet lifi bozundurucuları [26] olarak tanımlanıyordu [27]. Bu tür bulgular, bazı Prevotella spp. karmaşık bitki polisakkaritlerini bozabilir. Önceki raporlar ayrıca iki baskın bakteri bölümünün, artan Firmicutes/Bacteroidetes oranının obezite ile ilişkili olduğunu göstermiştir [28]. LM grubunda birincisinin daha düşük bolluğu ve ikincisinin daha yüksek bolluğu, LM'nin kilo vermeye yardımcı olabileceğini öne sürdü.

Tespit edilen 72 aileden takson top10 izole edildi ve analiz edildi (Şekil 5c, d). Lachnospiraceae ve Ruminococcaceae, memeli bağırsak ortamında bulunan en bol ailelerden ikisidir ve bağırsak sağlığının korunması ile ilişkilendirilmiştir [29]. Bu çalışmada, Bacteroidales_S24-7_grubu (yüzde 39.11 ± 6.04 , yüzde 36.88 ± 4.44 , yüzde 28.37 ± 4.01 , yüzde 35.81 ± 7.91 ), Prevotellaceae (yüzde 10.66 ± 3.84 , yüzde 15.14 ± 5.50 ) yüzde, yüzde 19,65 ± 8,97, yüzde 21,05 ± 8,39), Lachnospiraceae (yüzde 18,21 ± 5,20, yüzde 15,09 ± 3,29, yüzde 12,13 ± 7,14, yüzde 13,12 ± 6,82) ve Ruminococcaceae (yüzde 9,64 ± 0,88, yüzde 10,44 ± 2,45, yüzde 11,27) ± yüzde 4.70 , yüzde 8.19 ± 1.72 ) her grupta baskındı. S24-7 familyasının bol miktarda karbonhidrat parçalayıcı enzim içerdiği bildirilmiştir [30]. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, polisakkarit grubunda Prevotellaceae bir yükselme ve Lachnospiraceae düşme eğilimi gösterdi [31]. Bacteroidales_S24-7_grubunda ve Lachnospiraceae'de karşılık gelen cistanche polisakkarit aktif enzimlerinin veya polisakkaritlerde bakterilerin karbonhidrat bağlayıcı modüllerinin olmadığı varsayılmıştır. Prevotella cinsleri, polisakkarit kullanım lokusları ve karbonhidrat aktif enzimlerle ilişkili olarak rapor edilmiştir [32]. Bakteriler ve SCFA'lar arasındaki ilişkiyi bulmak için Spearman korelasyon analizi uygulandı. Bağırsak mikrobiyotasındaki Bacteroides, Prevotella ve Lactobacillus gibi bazı cinsler, polisakkaritlerin SCFA'lara hidrolizinde önemli bir rol oynar [33]. Sonuçlarımız ayrıca Bacteroidaceae'nin pozitif korelasyon gösterdiğini ve baskın mikrobiyotanın daha fazla butirat ürettiğini [34], Prevotellaceae'nin ise pozitif korelasyon gösterdiğini ve baskın mikrobiyotanın daha fazla asetat ürettiğini gösterdi. Lactobacillaceae ve Ruminococcaceae baskın mikrobiyota daha fazla propiyonat üretti (Şekil 6).

UniFrac mesafe ölçümleri kullanılarak numuneler arasında bağırsak mikrobiyotasının yapısal varyasyonlarını araştırmak için beta çeşitlilik analizi kullanıldı. Unifrac mesafelerindeki farklılıklar Tukey ve Wilcox testi ile analiz edildi (Şekil 7). UniFrac ağırlıksız analizini kullanarak, LM besleme farelerinin diğer gruplardan uzakta kümelendiğini bulduk. Kontrol, ZT, HM ve LM grupları için belirgin bir kümeleme modeli tanımlandı.

Bu mikrobiyallerin bolluğu, polisakarit işlemleriyle farklı şekilde modüle edildi. Her gruptaki spesifik bakteri taksonlarını belirlemek için kontrol, ZT, HM ve LM gruplarından mikrobiyotanın bileşimi lineer diskriminant analizi etki büyüklüğü (LEfSe) yöntemiyle karşılaştırıldı. Doğrusal Ayrımcılık Analizi (LDA), her bir diferansiyel olarak bol özelliğin etki boyutunu hesaplamak için kullanılır. LDA puanları eşiği, 4'lü listeden daha yüksektir, bu da ilgili grupta diğer gruplara göre daha yüksek bir göreli topluluk bolluğu olduğunu gösterir. Bu yöntemi kullanarak, 19 OTU'nun tüm gruplarda önemli ölçüde farklı olduğunu, yani kontrol grubunda 6 OTU'nun daha yüksek olduğunu, ZT grubunda sadece 1 OTU'nun daha yüksek olduğunu, HM grubunda 10 OTU'nun daha yüksek olduğunu bulduk. LM grubunda 2 OTUS ve diğer gruplara göre daha yüksekti (Şekil 8). LM'de g_Prevotellaceae_ UCG_001 bolluğu önemli ölçüde arttı (LM'de yüzde 8.47 ± 1.9, 0.40 ± {{21 }}.0Kontrol grubunda yüzde 9, pb 0.01). Sonuç, Porphyra haitanensis ve Ulva prolifera polisakkaritlerinin Prevotellaceae UGC-001 (pb 0.05) ve Rikenellaceae RC9 (pb 0.01) [35] proliferasyonunu açıkça destekleyebileceği raporuyla tutarlıydı.

4. Sonuçlar

TCM kimyasal bileşenleri, bağırsak mikrobiyotası ve bağırsak mikrobiyalinden kaynaklanan belirli metabolitler arasında bir ilişki olduğu açıktır. Mevcut bulgularımız, bağırsak mikrobiyotasına dayalı farklı polisakkarit türleri ile ekinakozit metabolizması sinerjilerini incelemek için bir yöntem sağlamıştır. Bağırsak mikrobiyotası, TCM'yi metabolize edebilir ve TCM, bağırsak mikrobiyotasının büyümesini etkileyebilir. Bir yandan, polisakkaritlerin bağırsağa oral yoldan verilmesinden sonra, çeşitli bağırsak mikrobiyotası, polisakkaritlerin parçalanmasında ve biyoaktif metabolitlerin üretilmesinde önemli bir rol oynayan metabolik enzimleri kodlar. Öte yandan, polisakkaritlerin katkıları, süreçteki bağırsak mikroçevresinin dengesi üzerinde bir miktar etkiye sahiptir. Polisakaritler olsun ya da olmasın, polisakkaritlerin doğrudan konakçı tarafından sindirilmelerine rağmen potansiyel olarak prebiyotikler gibi davrandıklarını ve probiyotiklerin büyümesini teşvik ederek bağırsak mikrobiyotasında olumlu değişikliklere yol açtığını bulduk. Cistanche polisakkaritleri bağırsak mikrobiyota çeşitliliğini düzenler, faydalı bakterileri arttırır ve özellikle düşük moleküler polisakkaritler Prevotella spp. Ayrıca, geliştirilmiş bağırsak mikrobiyotası daha sonra Cistanche Deserticola'da ekinakozit emilimini arttırdı. Ancak neden tam olarak açık değildir, bağırsak mikrobiyotasının, SCFA'ların ve bağışıklığın birleşik kusurlarının bir sonucu olabilir ve bir hastalık modeli için daha fazla araştırma gereklidir. Mikrobiyota topluluğu stabil ve dirençli olan sağlıklı hayvan modellerinde prebiyotiklerin etkilerini kanıtlamak zordur. Cistanche Deserticola polisakkaritleri, bağırsak mikrobiyotasını düzenlemek için probiyotik ürünler olarak geliştirilebilir ve gelecekte küçük moleküllerin sinerjik metabolizmasına uygulanabilir. Bu veriler, savunmasız insan gruplarının sağlıklarını iyileştirmelerini önlemek için müdahaleler tasarlamamıza yardımcı olacaktır.

Rekabetçi çıkar beyanı

Yazarlar, bu makalenin yayınlanmasıyla ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Teşekkür

Yazarlar Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'na minnetle teşekkür eder (Hibe No. 81830112 ve 81904058)

Referanslar
[1] I. Khangwal, P. Shukla, Potansiyel prebiyotikler ve bunların bulaşma mekanizmaları: son yaklaşımlar, J. Food Drug Anal. 27 (3) (2019) 649–656.
[2] XF Xu, PP Xu, CW Ma, J. Tang, XW Zhang, Gut microbiota, konak sağlığı ve polisakkaritler, Biotechnol. reklam 31 (2) (2013) 318–337.
[3] NT Porter, EC Martens, Polisakkaritlerin bağırsak mikrobiyal ekolojisi ve fizyolojisindeki kritik rolleri, Annu. Rev. Mikrobiyol. 71 (2017) 349–369.
[4] QW Guo, QQ Ma, ZH Xue, XD Gao, HX Chen, Mısır ipeğinden (Maydis stigma) farklı moleküler ağırlığa ve flavonoidlere sahip üç polisakaritin bağlanma özellikleri üzerine çalışmalar, Carbohyd. Polim. 198 (2018) 581–588.
[5] SS Zhou, J. Xu, H. Zhu, J. Wu, JD Xu, R. Yan, XY Li, HH Liu, SM Duan, Z. Wang, HB Chen, H. Shen, SL Li, Gut microbiota - ginseng kaynatmada polisakkaritlerin bir arada bulunmasıyla ginsenosidlerin sistemik maruziyetini arttırmada yer alan mekanizmalar, Sci. 6 (2016), 22474.
[6] YP Jing, AP Li, ZR Liu, PR Yang, JS Wei, XJ Chen, T. Zhao, YR Bai, LJ Zha, CJ Zhang, Codonopsis pilosula saponinlerinin bir arada bulunan polisakkaritler tarafından emilmesi, dekstran sülfat sodyum ile bağırsak mikrobiyal disbiyozunu hafifletir model farelerde indüklenen kolit, Biomed. Araş. Int. 2018 (2018), 1781036(18 sayfa).
[7] CJ Chang, CS Lin, CC Lu, J. Martel, YF Ko, DM Ojcius, SF Tseng, TR Wu, YYM
Chen, JD Young, HC Lai, Ganoderma Lucidum, bağırsak mikrobiyotasının bileşimini modüle ederek farelerde obeziteyi azaltır, Nat. Komün. 6 (2015) 7489.
[8] JC Zhang, GM Yang, YZ Wen, SX Liu, CF Li, RL Yang, W. Li, Bağırsak mikrobiyotası, longan polisakarit, Mol. Nutr. Gıda Araş. 61 (11) (2017), 1700466.
[9] T. Wang, XY Zhang, WY Xie, Cistanche Deserticola YC Ma, "Desert Ginseng": bir inceleme, Am. J.Çin. Med. 40 (6) (2012) 1123-1141.
[10] Y. Li, GS Zhou, SH Xing, PF Tu, XB Li, Ultra performans sıvısı kullanılarak insan bağırsak bakterileri tarafından üretilen ekinakozit metabolitlerinin tanımlanması
kromatografi-dört kutuplu uçuş süresi kütle spektrometrisi, J. Agr. Gıda Kimyası 63 (30) (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, Y. Peng, MY Wang, PF Tu, XB Li, Cistanches Herba suyunun in vitro insan gastrointestinal metabolizması: mide suyu, bağırsak suyu, insan bağırsağında kapsamlı metabolit tanımlamasına dayalı metabolik profilin aydınlatılması bakteri ve bağırsak mikrozomu, J. Agric. Gıda Kimyası 65 (34)
(2017) 7447–7456.
[12] M. Dubois, K. Gilles, JK Hamilton, PA Rebers, F. Smith, Şekerlerin ve ilgili maddelerin belirlenmesi için kolorimetrik yöntem, Anal. Kimya 168 (4265) (1956) 167.
[13] NH Cho, SY Seong, KH Chun, YH Kim, IC Kwon, BY Ahn, SY Jeong, Aljinat mikrokürelerinde tutulan polisakkarit-protein konjugatları ile yeni mukozal immünizasyon, J. Control. Yayın 53 (1–3) (1998) 215–224.
[14] XY Zhao, ZZ Jiang, F. Yang, Y. Wang, XM Gao, YF Wang, X. Chai, GX Pan, Y. Zhu, Fekal kısalığın dinamik ve çok yönlü değişiklikleri üzerindeki antibiyotik etkisinin hassas ve basitleştirilmiş tespiti -zincirli yağ asitleri, PLoS One 11 (12) (2016), e167032.
[15] SJ Li, QP Xiong, XP Lai, X. Li, MJ Wan, JN Zhang, YJ Yan, M. Cao, L. Lu, JM Guan, DY Zhang, Y. Lin, Polisakkaritlerin moleküler modifikasyonu ve ortaya çıkan biyoaktiviteler , Komp. Rev. Gıda. bilim F. 15 (2) (2016) 237–250.
[16] ZF Fu, X. Fan, XY Wang, XM Gao, Cistanches Herba: kimyasına, farmakolojisine ve farmakokinetik özelliklerine genel bir bakış, J. Ethnopharmacol. 219 (2018) 233–247.
[17] W. Zhou, XB Tan, JJ Shan, T. Liu, BC Cai, LQ Di, Effect of chitooligosaccharides on
Fructus Forsythia özünde feniletanoid glikozitlerin bağırsak absorpsiyonları, Phytomedicine 21 (12) (2014) 1549–1558.
[18] LL Sun, M. Wang, HJ Zhang, GJ You, YN Liu, XL Ren, YR Deng, Ophiopogon japonicus'tan polisakkaritlerin 2,3,5,4′-tetrahidroksi -stilben üzerindeki etkisi-2- Z. Fu et al. / International Journal of Biological Macromolecules 149 (2020) 732–740 739 O- -d-glucoside in vitro biyofarmasötik özellikler ve in vivo farmakokinetik hakkında, Int. J. Biol. Makromol. 119 (2018) 677–682.
[19] KN Lam, M. Alexander, PJ Turnbaugh, Hassas tıp mikroskobik hale geliyor: ilaç sonuçlarını iyileştirmek için mikrobiyomun mühendisliği, Cell Host Microbe 26 (1) (2019) 22–34.
[20] I. Khangwal, P. Shukla, Prospecting prebiyotikler, yenilikçi değerlendirme yöntemleri ve sağlık uygulamaları: bir inceleme, 3 Biotech. 9 (5) (2019) 187.
[21] GR Gibson, R. Hutkins, ME Sanders, SL Prescott, RA Reimer, SJ Salminen, K. Scott, C. Stanton, KS Swanson, PD Cani, K. Verbeke, G. Reid, Probiyotikler için uluslararası bilimsel dernek ve prebiyotikler (ISAPP) prebiyotiklerin tanımı ve kapsamı hakkında fikir birliği beyanı, Nat. Rev. Gastro. hepat. 14 (8) (2017) 491-502.
[22] JMW Wong, R. de Souza, CWC Kendall, A. Emam, DJA Jenkins, Kolon sağlığı: fermantasyon ve kısa zincirli yağ asitleri, J. Clin. Gastroenterol. 40 (3) (2006) 235–243.
[23] SI Cook, JH Sellin, İnceleme makalesi: sağlık ve hastalıkta kısa zincirli yağ asitleri, Aliment. Eczacılık orada. 12 (6) (1998) 499–507.
[24] H. Yamashita, K. Fujisawa, E. Ito, S. Idei, N. Kawaguchi, M. Kimoto, M. Hinamori, H. Tsuji, Tip 2 diyabetik Otsuka'da asetat ile obezite ve glukoz toleransının iyileştirilmesi Uzun- Evans Tokushima Fatty (OLETF) sıçanları, Biosci. Biyoteknoloji. Biyokimya. 71 (5) (2007) 1236–1243.
[25] AL Ho, O. Kosik, A. Lovegrove, D. Charalampopoulos, RA Rastall, Farklı moleküler ağırlıklara sahip ksilooligosakkaritler ve Ksilo-polisakkarit fraksiyonlarının insan fekal bakterileri tarafından in vitro fermentabilitesi, Carbohyd. Polim. 179 (2018) 50–58.
[26] TT Chen, WM Long, CH Zhang, S. Liu, LP Zhao, BR Hamaker, Fiber kullanım kapasitesi Prevotella'ya karşı Bacteroides'in baskın olduğu bağırsak mikrobiyotasında değişiklik gösterir, Sci. 7 (1) (2017) 2594.
[27] M. Sakamoto, M. Ohkuma, Bacteroides sartorii, Bacteroides chinchilla'nın daha önceki bir heterotipik eşanlamlısıdır ve önceliğe sahiptir, Int. J. Sist. Evrim. Mikr. 62 (6) (2012) 1241–1244.
[28] PJ Turnbaugh, RE Ley, MA Mahowald, V. Magrini, ER Mardis, JI Gordon, Enerji hasadı için artan kapasiteye sahip obezite ile ilişkili bir bağırsak mikrobiyomu, Nature 444 (7122) (2006) 1027-1131.
[29] LF Gomez-Arango, HL Barrett, HD McIntyre, LK Callaway, M. Morrison, NM Dekker, Aşırı kilolu ve obez kadınlarda erken gebelikte bağırsak mikrobiyomu ve metabolik hormonlar arasındaki bağlantılar, Diyabet 65 (8) (2016) 2214 -2223.
[30] KL Ormerod, DL Wood, N. Lachner, SL Gellatly, JN Daly, JD Parsons, CG Dal Molin, RW Palfreyman, LK Nielsen, MA Cooper, M. Morrison, PM Hansbro, P. Hugenholtz, Genomik karakterizasyonu Homeotermik hayvanların bağırsaklarında yaşayan kültürlenmemiş Bacteroidales ailesi S24-7, Microbiome. 4 (1) (2016) 36.
[31] JD Zhang, LJ Song, YJ Wang, C. Liu, L. Zhang, SW Zhu, SJ Liu, LP Duan, Butirat üreten Lachnospiraceae'nin sıçanlarda stres kaynaklı viseral aşırı duyarlılık üzerindeki faydalı etkisi, J. Gastro. hepatol. 34 (8) (2019) 1368-1376.
[32] T. Accetto, G. Avguštin, Rumen ve son bağırsak Prevotella türlerinin çeşitli ve kapsamlı bitki polisakkarit parçalayıcı aygıtları: her yerde bulunmalarında bir faktör mü? Sist. Uygulama Mikrobiyol. 42 (2) (2019) 107–116.
[33] KE Bach Knudsen, MS Hedemann, HN Lærke, Domuzların bağırsak sağlığında karbonhidratların rolü, Anim. Beslemek. bilim Teknoloji 173 (1–2) (2012) 41–53.
[34] SA Parker, A. Geirnaert, L. Berchtold, A. Greppi, L. Krych, RE Steinert, T. de Wouters, C. Lacroix, In vitro sürekli yetişkin fermantasyon modeli (PolyFermS) kullanarak farklı diyet liflerinin prebiyotik potansiyelini anlama, Sci. 8 (1) (2018) 4318.
[35] ZS Zhang, XM Wang, SW Han, CD Liu, F. Liu, Illumina PE250 dizilemesi ile değerlendirilen farelerde iki deniz yosunu polisakkaritinin bağırsak mikrobiyotası üzerindeki etkisi, Int. J. Biol. Makromol. 112 (2018) 796-802.