Cistanche Deserticola Polisakkaritleri, NLRP3 İnflamatuar Aktivasyonunu Engelleyerek Bağırsak Yaşlanmasını İyileştirir

 

 

Yaşlanma, birçok fizyolojik fonksiyonun kademeli olarak azalmasına yol açmakta ve yaşa bağlı hastalık riskini artırmaktadır (1). Çalışmalar yaşlanmanın bağırsak yapısı ve işlevi üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğunu göstermiştir [2]. Sindirim, metabolizma ve bağışıklık savunması için temel organ olan bağırsağın yaşlanması, besinlerin emilim bozukluğuna, metabolik bozukluklara ve bağışıklık fonksiyonunun bozulmasına neden olabilir [3-4], dolayısıyla gastrointestinal hastalıklara duyarlılığı artırabilir [5]. Kronik inflamasyon bağırsak yaşlanmasının bir işaretidir ancak moleküler mekanizmaları henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Şu anda yaşlanma karşıtı ajanlar esas olarak beta-nikotinamid mononükleotid (NMN), rapamisin, dasatinib artı kersetin ve diğerlerini içermektedir [3]. Bunların arasında NMN, temel koenzim NAD+'nın önemli bir öncüsüdür ve birçok çalışma, bunun doğal olarak yaşlı farelerde bağırsak yaşlanmasını önemli ölçüde geciktirdiğini doğrulamıştır; sahada etkili bir müdahale olarak geniş çapta tanınmaktadır [4-5]. Bu nedenle ilgili mekanizmaların ve müdahale stratejilerinin araştırılması büyük önem taşımaktadır.

Yaşlanmaya Bağlı Hastalıklar İçin Cistanche Oral Likör

Şimdi iletişime geçin Çin'deki cistanche çiftçilerini tanıyın

Wecistanche Destek Hizmeti-Çin'deki en büyük cistanche ihracatçısı:
E-posta:wallence.suen@wecistanche.com

 

 

 

 

Nükleotid bağlayıcı oligomerizasyon alanı benzeri reseptör ailesi pirin alanı içeren 3 (NLRP3) inflamatuarı, doğuştan gelen bağışıklığın önemli bir düzenleyicisidir ve yaşlanmayla ilişkili hastalıklarda önemli bir rol oynar. Etkinleştirilmesi iki sinyal gerektirir. İlk sinyal: patojenle ilişkili moleküler modeller (PAMP'ler) ve hasarla ilişkili moleküler modeller (DAMP'ler), NLRP3'ün ve interlökin-1'in (pro-IL-1) öncüsünün ekspresyonunu indükler. İkinci sinyal (potasyum akışı ve mitokondriyal hasar gibi) inflamatuar birleşimi tetikler, kaspaz-1'i aktive eder ve pro-IL-1 ve pro-IL-18'yi parçalayarak olgun IL-1 ve IL-18'yi oluşturur, böylece inflamasyonu artırır [6]. Yaşlanma sırasında bağırsak homeostazisi bozulur ve bu durum, NLRP3 inflamatuarını sürekli olarak aktive eden ve kronik düşük dereceli inflamasyonu oluşturan lipopolisakkarit (LPS) gibi proinflamatuar faktörlerin salınmasına yol açar. Bu, bağırsak bariyeri hasarını ve disbiyozisi daha da kötüleştirir, sıkı bağlantı proteinlerinin ekspresyonunu değiştirir, bağırsak geçirgenliğini arttırır ve bağırsak yaşlanmasını hızlandırır [7-10].

"Çölün ginseng'i" olarak bilinen, değerli bir geleneksel Çin şifalı ve gıda benzeri bitki olan Cistanche Deserticola, böbrek yang'ını tonlandırır, özü ve kanı besler ve kabızlığı gidermek için bağırsakları nemlendirir. Aktif polisakkaritleri yaşlanma karşıtı, antioksidan ve bağırsak koruyucu özellikler sergiler [11-12]. Bağırsak koruması açısından, Cistanche Deserticola polisakkaritleri (CDP'ler), Toll benzeri reseptör 4 (TLR4)/nükleer faktör-kappa B (NF-κB) yolunun aktivasyonunu inhibe ederek bağırsak mikrobiyota dengesini modüle edebilir, böylece LPS seviyelerini azaltabilir ve bağırsak bariyer fonksiyonunu onarabilir [13-14]. CDP'ler ayrıca AMP ile aktifleştirilen protein kinaz (AMPK)/sirtuin 1 (SIRT1) yolunun aktivasyonu yoluyla mitokondriyal fonksiyonu iyileştirebilir, hücresel yaşlanmayı geciktirebilir, lipid metabolizmasını düzenleyebilir ve bağırsak epitel hücrelerinde lipotoksik hasarı hafifletebilir [15].

CDP'lerin bağırsak koruyucu etkileri kanıtlanmış olmasına rağmen, NLRP3 inflamatuar yolunu baskılayarak bağırsak yaşlanmasını iyileştirip iyileştirmedikleri belirsizliğini koruyor. Bu çalışma, CDP'lerin NLRP3 inflamatuar aktivasyonunu inhibe ettiği mekanizmayı araştırmayı amaçlamaktadır.bağırsak yaşlanmasını iyileştirmek.

Malzemeler

 

1.1 Deney hayvanları

Elli sağlıklı erkek C57BL/6J faresi (2 aylıkken 10; 20 aylıkken 40) Beijing Speifu Bioteknoloji Co., Ltd.'den satın alındı. Üretim lisansı: SYXK (Pekin) 2023-0011. Hayvanlar, Hebei İl Geleneksel Çin Tıbbı Hastanesi Deney Hayvanları Tesisinde aşağıdaki koşullar altında bir bariyer ortamında barındırıldı: sıcaklık 22 ± 2 derece, bağıl nem %50 ± %10 ve 12 saat ışık/12 saat karanlık döngüsü. Tüm fareler 1 hafta boyunca ortama alıştırıldı. Bu çalışma, Hebei İl Geleneksel Çin Tıbbı Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC-HPHCM-2025001) tarafından onaylandı.

 

1.2 Cihazlar ve reaktifler

 

Kriyostat (Termo Fisher; CryoStar NX50)

Lazer taramalı eş odaklı mikroskop (Nikon; AX)

Gerçek zamanlı PCR sistemi (Thermo Fisher; 7500)

Çok modlu plaka okuyucu (Tecan; Spark)

Beta-nikotinamid mononükleotid (Bontac, Çin; Kat. BT05N120A005)

SA- -gal boyama kiti (Solarbio, Pekin; Cat. 250003003)

Fare LPS ELISA kiti (CUSABIO/Huamei, Wuhan; Kat. CSB-E13066m)

TransZol Up Plus RNA kiti (TransGen Biotech, Pekin; Kat. ER501-01-V2)

MonAmp ChemoHS qPCR Karışımı (Monad; Kat. MQ00501S)

Lgr5 poliklonal antikoru (Wuhan Sanying; Cat. 30007-1-AP)

ZO-1 monoklonal antikor, NLRP3 monoklonal antikor, Kaspaz-1 monoklonal antikor, ASC monoklonal antikor, GAPDH monoklonal antikor, Ki67 monoklonal antikor (Abcam; Cats. ab307799, ab263899, ab179515, ab309497, ab8245, ab15580)

Yöntemler

 

2.1 Cistanche Deserticola polisakkaritlerinin hazırlanması

Cistanche malzemesi (50 g), her seferinde 1 saat olmak üzere, 8 kat hacimli su ile kaynatma yoluyla iki kez ekstre edildi. Filtratlar birleştirildi ve oda sıcaklığına soğutuldu. Çökeltme için %80'lik nihai konsantrasyona kadar susuz etanol ilave edildi. Santrifüj sonrası süpernatant atıldı. Çökelti su içinde çözüldü, diyaliz edildi ve ardından numune elde etmek için liyofilize edildi.

 

2.2 Hayvanların gruplandırılması ve yönetimi

Alıştırmanın ardından kırk adet 20 aylık C57BL/6J faresi rastgele olarak şu gruplara atandı: doğal yaşlanma grubu, düşük doz CDP grubu (2,5 g·kg−1), yüksek doz CDP grubu (5,0 g·kg−1) ve NMN grubu (200 mg·kg−1). Ek olarak on adet 2 aylık SPF C57BL/6J faresi genç kontrol grubu olarak görev yaptı. Düşük ve yüksek CDP dozları sırasıyla 2,5 g·kg-1 ve 5,0 g·kg-1 oranında oral sondayla verildi. Vücut yüzey alanı dönüşümünü ve insandan fareye dönüşüm faktörünü 12 [16] kullanarak, bunlar yetişkin klinik eşdeğer dozunun yaklaşık 1 katı ve 2 katı kadarına karşılık gelir. NMN grubu sondayla 200 mg·kg−1 NMN aldı. Genç kontrol ve doğal yaşlanan gruplara eşit hacimde fizyolojik salin (10 mL·kg−1) verildi. Tedaviler 2 ay boyunca sürekli olarak uygulandı.

 

2.3 Dondurulmuş kesitlerin hazırlanması

Farelere intraperitoneal sodyum pentobarbital (30 mg·kg−1) enjeksiyonu yoluyla anestezi uygulandı ve ötenazi uygulandı. Karın hızla açıldı, mezenter ayrıldı ve ileal doku toplandı ve dondurulmuş kesitler için 5 mikronluk kesitlere ayrıldı [17].

 

Bağırsak -galaktosidaz aktivitesi için 2.4 SA- -gal testi

Boyama, SA- -gal kiti talimatlarına göre gerçekleştirildi. İnkübasyonun ardından boyama solüsyonu uzaklaştırıldı ve kesitler PBS ile yıkandı. Görüntüler ters bir mikroskop kullanılarak toplandı.

 

2.5 Yaşlanmayla ilişkili salgı fenotipi (SASP) için gerçek zamanlı PCR

İleal dokudan toplam RNA, TransZol Up Plus kiti kullanılarak ekstre edildi. GoScript sistemi ile ters transkripsiyon şu koşullar altında gerçekleştirildi: 15 dakika boyunca 42 derece, 15 dakika boyunca 70 derece, 10 dakika boyunca 4 derece. Gerçek zamanlı PCR, MonAmp ChemoHS qPCR Mix kullanılarak aşağıdaki döngülerle gerçekleştirildi: 95 derece 10 dakika; ardından 95 derece 15 saniyelik, 60 derece 1 dakikalık 40 döngü. Erime eğrisi: 95 derece 15 s, 60 derece 15 s, 95 derece 15 s. GAPDH dahili referans görevi gördü ve bağıl nicelik belirlemede 2^-ΔΔCt yöntemi kullanıldı. Primerler Promega'dan satın alındı. Astar dizileri Tablo 1'de gösterilmektedir.

 

2.6 ZO-1 ifadesi için immünofloresan boyama

İleal doku %4 paraformaldehit içerisinde sabitlendi ve 5 mikron'da parafinle kesildi. Kesitler, 15 dakika süreyle %0,3 Triton X-100 ile geçirgenleştirildi ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle %10 keçi serumu ile bloke edildi. ZO-1'ye (1:200) karşı birincil antikor gece boyunca 4 derecede uygulandı. PBS yıkamalarının ardından Cy3-konjuge ikincil antikor (1:500), karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edildi. Çekirdekler 5 dakika boyunca DAPI ile zıt boyandı. Slaytlar solmaya karşı ortamla monte edildi ve eş odaklı mikroskopi ile görüntülendi. Floresan yoğunluğu Image-Pro yazılımı kullanılarak ölçüldü.

2.7 Ki67 ve Lgr5 ekspresyonu için immünohistokimya

İleal kesitler, birincil antikorlar Ki67 (1:1000) ve Lgr5 (1:200) ile gece boyunca IHC kit protokolünü takiben 4 derecede, ardından karşılık gelen ikincil antikorlarla inkübe edildi. DAB kromojenik gelişim için kullanıldı. Sonuçlar ışık mikroskobu ile gözlemlendi. Ortalama optik yoğunluk, Image-Pro yazılımı kullanılarak ölçüldü.

 

2.8 LPS seviyeleri için ELISA

Plakaya standartlar ve numuneler (oyuk başına 100 μL) eklendi ve oda sıcaklığında 1,5 saat inkübe edildi. Daha sonra HRP-konjuge streptavidin çözeltisi (oyuk başına 100 μL) eklendi ve 30 dakika süreyle inkübe edildi. Substrat ışıktan korunan koşullar altında eklendi ve 30 dakika reaksiyona sokuldu. Reaksiyon durdurma solüsyonu ile sonlandırıldı ve absorbans 450 nm'de ölçüldü.

 

2.9 NLRP3, Kaspaz-1 ve ASC için Western blot

Yaklaşık 30 mg ileal doku sıvı nitrojen içerisinde öğütüldü. Proteaz/fosfataz inhibitörlerini içeren RIPA lizis tamponu eklendi; lizatlar 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edildi ve süpernatanları toplamak için 12.000 x g'de, 4 derecede 15 dakika boyunca santrifüjlendi. Protein konsantrasyonu BCA tahlili ile belirlendi ve 2 ug/μL'ye ayarlandı. Eşit miktarlarda protein (20-40 ug) SDS-PAGE ile ayrıldı ve PVDF membranlarına aktarıldı. Membranlar oda sıcaklığında 1 saat boyunca %5 yağsız süt ile bloke edildi, birincil antikorlarla (NLRP3 1:1000, Kaspaz-1 1:500, ASC 1:1000) gece boyunca 4 derecede inkübe edildi, ardından HRP-konjuge ikincil antikorlarla (1:5000) oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edildi. TBST yıkamalarından sonra sinyaller geliştirildi. Bant yoğunlukları GAPDH'ye göre normalleştirildi.

 

2.10 İstatistiksel analiz

Veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edildi. İstatistiksel analiz ve grafik oluşturma sırasıyla SPSS 26.0 ve GraphPad Prism 8.0.2 kullanılarak yapıldı. Gruplar arasındaki farklılıkları değerlendirmek için tek yönlü ANOVA kullanıldı ve ardından Tukey'in post hoc testi uygulandı. İstatistiksel anlamlılık P <0.05 olarak belirlendi.

 

Bağırsak hareketliliği ve takviye gelişimi ile ilgilenen okuyucular için pratik notlar

 

Cistanche Deserticola'nın işlevsel odağı: Geleneksel olarak bağırsakları nemlendirmek ve kabızlığı gidermek için kullanılır; modern veriler bariyer desteğini, inflamasyon modülasyonunu (TLR4/NF-κB) ve AMPK/SIRT1 yoluyla mitokondriyal fonksiyonu destekler.

Burada araştırılan potansiyel yaşlanma karşıtı bağırsak mekanizması: NLRP3 inflamatuar aktivasyonunun baskılanması; LPS kaynaklı düşük dereceli inflamasyonun azaltılması; sıkı bağlantıların korunması (örneğin, ZO-1); epitelyal proliferasyon/kök belirteçlerinin (Ki67, Lgr5) korunması.

Farelerde tipik deneysel oral dozlar: 2 ay boyunca 2,5–5,0 g·kg−1 CDP; Pozitif kontrol olarak NMN 200 mg·kg−1.

Çeviri uyarısı: Fare dozları doğrudan insanlara yönelik tavsiyeler değildir. Çalışmada vücut yüzey alanı ölçeklendirmesi kullanılıyor; Ürün geliştirmeden önce insana eşdeğer formülasyon ve güvenlik, kimlik testi ve GMP üretimi gereklidir.