Cistanche Tubulosa'dan Sükroz Sentazının Gen Klonlaması, Fonksiyonel Tanımlaması, Yapısal ve Ekspresyon Analizi Ⅲ

4 Kuraklık stresi altında Cistanche tubulosa'nın farklı kısımlarında ve hücre kültürü sisteminde CtSus'un ekspresyon analizi

4.1 Cistanche tubulosa'nın farklı kısımlarında CtSus'un ekspresyon analizi

İn vitro tüm hücre transformasyon deneyleri ve enzimatik katalitik reaksiyon deneyleri, CtSus geni tarafından kodlanan proteinin, UDP-glikoz sentezini katalize etme yeteneğine sahip olduğunu doğruladı. Bu gen ile Cistanche tubulosa'daki glikozit bileşiklerinin biyosentezi arasındaki korelasyonu daha fazla araştırmak için bu genin vücudun farklı kısımlarındaki ekspresyon seviyesi araştırıldı.Cistanche tubulosaanaliz edildi.

SATILIK YÜKSEK KALİTELİ CISTANCHE HAMMADDELERİ

Wecistanche Destek Hizmeti-İndirim hakkında bilgi almak için bizimle iletişime geçin:

E-posta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

EkinekozitCistanche tubulosa'daki en temsili glikozit bileşiğidir ve içeriği, Cistanche tubulosa bitkilerinin kuru ağırlığının %30'undan fazlasına ulaşabilir [23]. Araştırma grubu daha önce Cistanche tubulosa bitkilerinin farklı kısımlarındaki ekinekozit içeriğini ölçtü ve spesifik performans şu şekildeydi:echinacoside in different tissues was haustorium>underground part>>hava kısmı; bunlar arasında haustoryumdaki ekinekozit içeriği en yüksekti. Gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR, şablon olarak Cistanche tubulosa'nın farklı kısımlarından alınan cDNA kullanılarak gerçekleştirildi ve sonuçlar, 2.–ΔΔCT yöntemi ve diferansiyel analiz yapıldı. Sonuçlar Şekil 4A'da gösterilmektedir. Haustoryumdaki CtSus geninin ekspresyon seviyesi, yer üstü kısmının 1,5 katı ile en yüksekti ve yer altı kısmındaki ekspresyon seviyesi, feniletanol glikozitlerin birikim modeliyle tutarlı olarak yer üstü kısmındaki ekspresyon seviyesinden önemli ölçüde daha yüksekti. farklı bölgelerinde ekinakozit ile temsil edilir.Cistanche tubulosa.

Şekil 4 C. tubulosa'nın farklı kısımlarında ve PEG6000 ile tedavi edilen süspansiyon hücrelerinde CtSus'un göreceli ekspresyon seviyeleri. A: C. tubulosa'nın farklı kısımlarında CtSus'un göreceli ekspresyon düzeyi; B: Farklı zaman noktalarında n=3, 𝑥̅± s.*P ＜ 0,05,***P ＜ 0,001'de PEG6000 ile tedavi edilen C. tubulosa süspansiyon hücrelerinde CtSus'un göreceli ekspresyon seviyesi

YÜKSEK KALİTELİ CISTANCHE HAMMADDELERİ

4.2 Kuraklık stresi koşulları altında Cistanche Deserticola süspansiyon hücrelerinde CtSus'un ekspresyon analizi

Projeyle ilgili ön araştırma şunu gösterdi:PEG6000'in neden olduğu kuraklık stresiolabilmekönemli ölçüde artışthefeniletanol glikozitlerin birikmesiCistanche süspansiyon hücrelerinde. İndüksiyondan 3 ila 9 gün sonra ekinezyasit içeriği önemli ölçüde arttı. 12. günden 15. güne kadar,ekinezidin büyüme hızıiçerik yavaşladı ve 15. günde maksimum değere ulaştı. Daha sonra kültür süresi arttıkça ekinezyasit içeriğinin önemli ölçüde arttığı görüldü. Fruktozit içeriği giderek azaldı [24]. Bu araştırmaya dayanarak, bu makale, Cistanche Deserticola süspansiyonundaki CtSus genini incelemek için gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR saptaması gerçekleştirmek amacıyla, işlenmemiş Cistanche Deserticola süspansiyon hücrelerinin cDNA'sını ve PEG6000-uyarılmış Cistanche Deserticola süspansiyon hücrelerini şablon olarak kullanmıştır. Kuraklık stresi koşulları altında hücreler. ifade düzeylerinde değişiklikler. Sonuçlar Şekil 4B'de gösterilmektedir. PEG6000 ile indüklenen Cistanche Deserticola süspansiyon hücrelerinde CtSus ekspresyonu indüksiyondan sonraki 6. günde önemli ölçüde artmış, 9. günde en yüksek değere ulaşmış ve daha sonra kontrol ile aynı seviyeye gerilemiştir. aynı seviyedeki gruplar. Yukarıdaki sonuçlar, kuraklık stresinin, Cistanche Deserticola süspansiyon hücre hattında CtSus geninin ekspresyonunu önemli ölçüde artırabildiğini göstermektedir; bu, kuraklık stresi altında ekinezidin birikim modeliyle tutarlıdır. Bununla birlikte, CtSus geninin en yüksek ekspresyonu, ekinezyasit içeriğinin zirvesinden daha erken ortaya çıkar, çünkü CtSus katalizi tarafından sentezlenen aktif glikosil donörü, ekinezidin sonraki biyosentetik yolundaki çok adımlı glikosilasyon reaksiyonu için gerekli olan önemli bir öncüdür. Bu nedenle, organizmaların kuraklık stresine maruz kaldıktan sonra, aktif donörlerin birikimini sağlamak için tercihen birincil metabolizmayla ilgili genleri harekete geçireceği ve ardından önemli ikincil metabolitlerin birikimini sağlayacağı tahmin edilmektedir.

YÜKSEK KALİTELİ CISTANCHE HAMMADDELERİ

5 CtSus proteininin üç boyutlu yapı çalışması ve önemli aktif bölgelerin analizi

CtSus'un glikosil donör UDP-glikoz üretimini katalize etme fonksiyonuna dayanarak, CtSus katalitik aktivitesinin yapısal temeli daha fazla incelenmiştir. Proteinin ikincil yapısını tahmin etmek için çevrimiçi araç SOPMA kullanıldı. Sonuçlar, CtSus'un ikincil yapısının %55,28 -helisler, %25,47 rastgele bobinler, %12,80 uzatılmış şeritler ve %6,46 -dönüşler içerdiğini gösterdi (Şekil 5A), bu da -helislerin CtSus proteinindeki en önemli ikincil yapısal birimler olduğunu gösterir. bunu da proteinin büyük bir kısmını oluşturan rastgele bobinler takip eder. Uzatılmış şeritler ve dönüşler protein boyunca dağıtılır. Mevcut çalışmalara göre sükroz sentezi genellikle aktif formu olduğu düşünülen bir tetramer formunda mevcuttur. Bu nedenle, bu makale ayrıca CtSus proteininin yapısını tahmin etmek için AlphaFold2'yi kullandı ve protein tetramerlerinin üç boyutlu yapısını elde etti. PDB (Protein Data Bank) veri tabanı karşılaştırması, Arabidopsis thaliana sükroz sentaz AtSus1 (PDBID 3S28) ve CtSus arasındaki dizi benzerliğinin %77,93'e ulaşabileceğini buldu. Tahmin edilen CtSus yapısı, AtSus1'in üç boyutlu yapısıyla karşılaştırıldı ve protein süperpozisyonundan sonraki kök ortalama kare sapma (RMSD) değeri 1,11 Å idi; bu, ikisinin mekansal yapılarının oldukça tutarlı olduğunu gösterir (Şekil 5B).

Arabidopsis AtSus1'in UDP ve fruktoz (PDBID3S29) ile bildirilen protein-ligand kristal kompleks yapısı, CtSus'un UDP ve fruktoz ile bağlanma modunu analiz etmek için bir şablon olarak kullanıldı [16]. Moleküler yerleştirme sonuçları Şekil 5C'de gösterilmektedir. AtSus1 ve CtSus'un substrat bağlanma ceplerinin amino asit tipi, uzaysal dağılım ve konfigürasyon açısından çok benzer olduğu ve örtüşmenin yüksek olduğu, bu da sükroz sentaz dizisinin bitkilerde yüksek oranda korunduğunu kanıtladığı gözlemlenebilir. Protein substrat bağlama cebindeki iki ligandın (UDP ve fruktoz) konformasyonları Şekil 5D'de gösterilmektedir. UDP ve CtSus'un moleküler yerleştirmenin en avantajlı konformasyonu, AtSus1-UDP kristal kompleksindeki UDP'nin konformasyonu ile iyi bir örtüşmeye sahiptir ve bu da moleküler yerleştirme sonuçlarının doğruluğunu kanıtlar. UDP ile protein substrat bağlama cebindeki anahtar amino asit kalıntıları arasındaki etkileşim, Şekil 5E'de gösterilmektedir. UDP ve CtSus esas olarak hidrojen bağları ve hidrofobik etkileşimlerle birbirine bağlanır. Substrat bağlama cebindeki anahtar amino asit kalıntıları şunları içerir: eu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Thr678 ve Glu681.

Referanslar

[1] Song ZH, Lei L, Tu PF. CistancheHoffing bitkilerinde farmakolojik aktivite araştırmalarındaki gelişmeler. ve Bağlantı [J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2003, 34: 113-115.

[2] Liu WJ, Liu Y, Song QQ, ve diğerleri. ¹H-NMR spektroskopisi [J] kullanılarak ekili ve yabani Cistanchetubulosa arasındaki kemom karşılaştırması. Çin J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2018, 43:3506-3512.

[3] Song Y, Zeng K, Jiang Y, ve diğerleri. Nesli tükenmekte olan bir türden büyük bir Çin tıbbı markasına kadar Cistanches Herba [J]. Med Res Rev, 2021, 41: 1539-1577.

[4] Liu Y, Wang H, Yang M, ve diğerleri. Cistanche Deserticola polisakkaritleri, PC12 hücrelerini OGD/RP kaynaklı hasara karşı korur [J]. Biomed Pharmacother, 2018, 99: 671-680.

[5] Yin Y, Huang J, Gu X ve diğerleri. Bitki nükleotid-şeker dönüşüm enzimlerinin evrimi [J].PLoS One, 2011, 6: e27995.

[6] Bar-Peled M, O'Neill MA. Bitki nükleotid şekeri oluşumu, dönüşümü ve şekerin geri dönüşümü yoluyla kurtarılması [J]. Annu Rev Plant Biol, 2011, 62: 127-155.

[7] Guo H, Li L, Wang PG. Escherichia coli O86:B7'den elde edilen UDP-GlcNAc/Glc4-epimerazın biyokimyasal karakterizasyonu [J]. Biyokimya, 2006, 45: 13760-13768.

[8] Dong S, Chesnokova ON, Turnbough CL Jr, ve diğerleri. Bacillus anthracis'te [J] exosporium protein glikosilasyonunda yer alan UDP-N-asetilglikozamin4-epimerazın tanımlanması. J Bacteriol,2009, 191: 7094-7101.

[9] Li LN, Kong JQ. Ornithogalumcaudatum'daki [J] sükroz sentaz genlerinin transkriptom çapında tanımlanması. RSC İlanı, 2016, 6: 18778-18792.

[10]Schmölzer K, Gutmann A, Diricks M, et al. Sükroz sentaz: biyokatalitik glikosilasyon prosesi gelişimi için benzersiz bir glikosiltransferaz [J]. Biotechnol Adv, 2016, 34: 88-111.

[11] Cardini CE, Leloir LF, Chiriboga J. Sükrozun biyosentezi [J]. J Biol Chem, 1955,214: 149-155.[12]Stein O, Granot