1. Giriş

İmmünomodülatör özelliklere sahip gıda bileşenlerinin ilgili moleküler hedefleriyle birlikte tanımlanması son yıllarda artan ilgi görmüştür. Yüksek ligand çeşitliliği nedeniyle, iyon kanallarının (TRP kanalları) geçici reseptör potansiyeli süper ailesi, potansiyel hedef yapıların çok ilginç bir sınıfını temsil eder.

Memeli TRP kanalı süper ailesi, ankirin (TRPA), kanonik (TRPC), melastatin (TRPM), mukolipin (TRPML), polisistin (TRPP) ve vanilloid (TRPV) olmak üzere altı ilgili protein ailesini içerir; bunların tümü tipik olarak değişen katyon seçiciliği ile katyon geçirgen gözenekler oluşturmak üzere tetramerler olarak bir araya gelen altı transmembran segmentini paylaşır.[1] TRPV1 kanalı, TRP süper ailesinin açık ara en yoğun şekilde araştırılan üyesi olabilir. TRPV1 başlangıçta kırmızı biberin keskin bileşeni olan kapsaisin reseptörü olarak tanımlandı.[2] Daha sonra zencefilden elde edilen keskin içerikli gingerollerin de TRPV1'i aktive ettiği gösterildi.[3]

TRPV1'in nöronal olmayan hücre tiplerindeki biyolojik rolü hala kapsamlı bir araştırma altındadır, ancak mevcut sonuçlar duyusal ve termal algının çok ötesinde işlevlere işaret etmektedir. Örneğin, yapısal bir kapsaisin analoğu olan TRPV1 agonisti nonivamidin günlük 0,15 mg dozuyla yapılan 12 haftalık bir müdahale, sağlıklı aşırı kilolu deneklerde diyet kaynaklı vücut yağ kütlesi kazanımını önledi ve plazma serotonin düzeylerini artırdı.[4]

3T3-L1 adipositlerinde TRPV1'in nonivamid tarafından aktivasyonu, PPAR𝛾 ekspresyonunu baskılayarak farklılaşma ve olgunlaşma sırasında lipid birikimini azalttı.[5] Makrofajlarda kapsaisin ve nonivamid, TRPV1'e bağımlı bir şekilde IL6, CXCL8 ve TNF-alfa gibi proinflamatuar sitokinlerin LPS kaynaklı salınımını hafifletti.[6] Ancak TRPV1'in insan kanı lökositlerindeki özel işlevleri belirsizliğini koruyor. İnsan NK hücrelerinde, 10 ve 50 μM kapsaisin, hücre içi Ca2+ konsantrasyonlarında bir artışa neden oldu, bu da fonksiyonel bir TRPV1 kanalının olduğunu gösterdi.[7]

Bununla birlikte, hücrelerin 10-100 μM konsantrasyon aralığında kapsaisin ile 1 saat süreyle ön işleme tabi tutulmasıyla indüklenen sitotoksik degranülasyon ve sitokin sekresyonu gibi sönümlenmiş NK hücre efektör fonksiyonları, büyük ölçüde TRPV1'den bağımsızdı.[7] T hücrelerinde TRPV1'in, sitokin üretiminin yanı sıra T hücresi reseptör sinyallemesi, T hücresi proliferasyonu ve farklılaşması süreçlerinde yer aldığı belgelenmiştir.[8] Grubumuzun önceki çalışmaları da TRPV1'in insan primer T hücrelerinde fonksiyonel ekspresyonunu gösterdi.[9] Ayrıca, 0,03 ila 300 μmol L−1 aralığındaki konsantrasyonlarda doz yanıt analizleri, [6]-gingerolün, birincil insan lökositleri tarafından sitokin salgılanmasını 82,2 μmol L−1 IC50 değeriyle inhibe ettiğini ortaya çıkardı.

Bununla birlikte, sağlıklı deneklerin plazma örneklerinde [6]-gingerol miktarının belirlenmesi, 1 L zencefil çayı alımından sonra ortalama maksimum plazma konsantrasyonunun yalnızca 42,0 ± 16,3 nmol L−1 olduğunu ortaya çıkardı. Bu [6]- gingerol konsantrasyonlarının önceki çalışmalarda sitokin salgılanması üzerinde önemli bir etkisi olmadığından,[9] 1 L zencefil çayı tüketiminden sonra kan plazmasında ulaşılan diyetle ilgili 50 nmol L-1 konsantrasyonunun diğer insan birincil lökositlerindeki hücresel bağışıklık tepkilerini modüle etmek için yeterli olup olmadığı açık değildir.

İnsan nötrofilleri için TRPV1'in fonksiyonel rolü hakkındaki bilgiler sınırlıdır. Köse ve Nazıroğlu[10], 10 μM kapsaisine yanıt olarak nötrofillerdeki Ca2+-akışının TRPV1 antagonisti kapsaisin tarafından azaldığını gösterirken, diğer sonuçlar, saptanabilir bir TRPV1 RNA ekspresyonuna rağmen, 1–100 μM konsantrasyon aralığında test edildiğinde kapsaisinin Ca2+ akışına neden olduğunu göstermedi.[11]

Nötrofiller insan kanında en çok bulunan lökositlerdir ve dolaşımdaki tüm beyaz kan hücrelerinin %60-70'ini oluşturur. Enfeksiyon bölgelerine toplanan ilk bağışıklık hücreleridirler; bu nedenle genellikle ilk savunma hattı olarak anılırlar.[12] Nötrofillerin toplanması, diğerlerinin yanı sıra bakteriyel veya mitokondriden türetilmiş peptit N-Formilmetiyonin-leusil-fenilalanin (fMLF) veya CXCL8 (IL-8) gibi kemokinler tarafından tetiklenir.[13]

Nötrofillerin savunma mekanizmaları arasında fagositoz,[14] degranülasyon yoluyla antimikrobiyal enzim salınımı,[15] reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimi,[16] ve nötrofil hücre dışı tuzaklarının oluşumu yer alır.[17] Bu doğrudan savunma mekanizmalarının yanı sıra nötrofiller, çeşitli sitokinler ve kemokinlerin salınması yoluyla daha sonraki immün yanıtlara da katkıda bulunur.[18] Ayrıca nötrofiller, sonraki tam aktivasyona daha güçlü yanıt vermelerini sağlayan bir hazırlama sürecinden geçebilirler.[16b]

Son yıllarda, gıdalardan ve/veya şifalı bitkilerden elde edilen bileşenlerin, insan nötrofillerinin bahsedilen savunma tepkilerinden bir veya daha fazlasını değiştirebileceğine dair kanıtlar arttı. Bu modifikasyonlar, artan fagositotik aktiviteyi[19] ve ROS oluşumunu,[20] fMLF'ye karşı artırılmış kemotaksiyi[21] ve nötrofil hücre dışı tuzaklarının oluşumunu[20] içerir. Ancak aktif bileşik(ler) tanımlanmadı. Ferula akitschkensis'ten elde edilen bileşenler (𝛽-pinen, sabinen, 𝛾-terpinen, geranilaseton ve izobornilasetat) nötrofilleri fMLF ve CXCL8'in indüklediği Ca2+ akışına karşı duyarsızlaştırdı ve fMLF'nin indüklediği kemotaksiyi inhibe etti; burada geranilasetonun indüklediği etkilere aracılık edildi TRPV1.[22]

Mevcut verilere dayanarak, TRPV1'in [6]-gingerol tarafından ligandla indüklenen aktivasyonunun, genel nötrofil fonksiyonlarını doğrudan veya aktive edici uyaranlara tepkilerini artırarak etkileyebileceğini varsaydık. Bu hipotez kapsamında, özellikle beslenme açısından uygun olduğu doğrulanmış bir konsantrasyonun, lökosit popülasyonunun bir parçası olarak insan birincil nötrofillerindeki hücresel bağışıklık tepkilerini modüle etmek için yeterli olup olmadığını açıklamayı amaçladık. '

Ayrıca, insan lökositlerindeki TRP kanalı ekspresyonuna niteliksel ve niceliksel olarak kapsamlı bir genel bakış elde etmek amacıyla, insan kanındaki en belirgin beş hücre tipindeki memeli TRP süper ailesinin tüm üyelerinin RNA ekspresyon seviyelerini karşılaştırmaya çalıştık.

2. Sonuçlar

2.1. İnsan Lökositlerindeki TRP Kanallarının Bolluğu ve Göreceli Transkript Düzeyleri

Kan lökositlerindeki TRP kanalı RNA ekspresyonunu değerlendirmek için sağlıklı donörlerin kanından en belirgin beş lökosit hücre tipi izole edildi ve TRP kanallarının RNA ekspresyonu kantitatif RT-PCR yoluyla analiz edildi (Şekil 1).

Analiz edilen tüm hücre tiplerinde TRPV'nin yanı sıra TRPM ailesinin spesifik transkriptleri %75-100 gibi yüksek frekanslarla tespit edildi. Tüm hücre tipleri dikkate alındığında ortalama genel frekans, TRPV ailesi için %96 ve TRPM ailesi için %98 idi. TRPC'ye özgü transkriptler çok daha az miktardaydı; monositler, NK hücreleri, T hücreleri ve B hücrelerinde %0'dan NK hücrelerinde %100'e ve genel ortalama frekansı yalnızca %53 olan T hücrelerine kadar değişiyordu (Şekil 1A). TRPC5'e özgü transkript yalnızca nötrofillerde %70 sıklıkla tespit edildi.

Ayrıca TRPA1'e özgü transkript genel olarak nötrofillerde %100, monositlerde %25, NK hücrelerinde %80, T hücrelerinde %100 ve B hücrelerinde %60 sıklıkla analiz edilen hücre tiplerinde oldukça düşük bir bolluk ortaya çıkardı. Benzer şekilde TRPML3'e özgü transkript, nötrofillerde (%50), monositlerde (%25), NK hücrelerinde (%40) ve B hücrelerinde (%20) düşük bir frekans, ancak T hücrelerinde %100'lük bir frekans gösterdi. TRPV1'e spesifik transkript tüm hücre tiplerinde tespit edildi; monositler, NK hücreleri ve T hücrelerinde %100, nötrofillerde %90 ve B hücrelerinde %80 frekans gösterdi.

Göreceli RNA ifadesine ilişkin olarak, ilgili frekanslarla karşılaştırıldığında, TRP kanalları, analiz edilen farklı hücre tiplerindeki ilgili Δct değerlerinin karşılaştırılması ile açıkça görüldüğü gibi, daha hücre tipine özgü bir ifade modeli ortaya çıkardı (Şekil 1B). Örneğin TRPP3 tüm hücre tiplerinde %100 sıklıkta tespit edildi ancak monositlerde en yüksek ekspresyon düzeyini açıkça ortaya koydu.

Buna karşılık, incelenen tüm hücre tiplerinde TRPV2 kanalı, nispeten yüksek RNA ekspresyon seviyesi ve yüksek frekansla tespit edildi. Benzer şekilde TRPV1'in transkript seviyeleri incelenen tüm hücre tiplerinde benzerdi (Şekil 1B).

2.2. Nötrofillerde TRPV1 Yüzey İfadesi

TRPV1'in insan nötrofillerindeki fonksiyonu hakkındaki mevcut bilgiler hala belirsizdir. TRPV1'in insan nötrofillerindeki rollerini daha fazla araştırmak için daha sonra canlı hücre akış sitometrisi kullanılarak TRPV1 kanalının birincil insan nötrofillerinin yüzeyinde ifade edilip edilmediğini araştırdık (Şekil 2).

İzole edilmiş nötrofiller, nötrofiller için bir yüzey işaretleyicisi olarak CD15 için boyandı (Şekil 2A,B) ve aynı anda ya TRPV1 proteininin ilk hücre dışı döngüsündeki bir epitopa karşı yükseltilmiş bir antikorla (Şekil 2B) ya da ilgili izotip kontrolüyle boyandı, ikincisi spesifik olmayan bağlanmayı ölçmek için bir vekil görevi görüyor (Şekil 2A). CD15+ popülasyonu içinde, FITC'ye yönelik floresans yoğunluğu analiz edildi. Nötrofillerin TRPV1 antikoruyla boyanması, izotip kontrolüne kıyasla açıkça ayırt edilebilir bir floresan sinyaline yol açtı ve böylece birincil insan nötrofillerinde TRPV1'in yüzey ekspresyonu doğrulandı (Şekil 2C). Dört ayrı donörden alınan nötrofillerin analiz edilmesi, TRPV1'in karşılaştırılabilir bir yüzey ifadesini ortaya çıkardı (Şekil 2D).

2.3. [6]-Hücre İçi Ca'da Zencefilin Neden Olduğu Artış2+

TRPV1'in ligand kaynaklı aktivasyonu Ca2+ akışıyla sonuçlanacağından, nötrofillerin [23] hücre içi Ca2+ konsantrasyonları Ca2+- duyarlı boya Fura-2 aracılığıyla belirlendi. Önceki bulgularımıza dayanarak,[9] iyi bilinen TRPV1 ligandı [6]-gingerolün 50 nM konsantrasyonu ve 2 saatlik inkübasyon süresi seçildi. Analizler, nötrofillerin 50 nM [6]-gingerol ile inkübasyonunun, 1 μM iyonofor iyonomisin uygulanarak belirlendiği üzere maksimum değerin ortalama %18,4 ± %1,0'ı olan hücre içi Ca2+ konsantrasyonlarında artışla sonuçlandığını gösterdi. DMSO'nun neden olduğu artış %4,7 ± %1,2 düzeyindeydi (Şekil 3).

2.4. [6]-Gingerol'ün TRPV1 İfadesi Üzerindeki Etkisi

Daha sonra, [6]-gingerol ile TRPV1 stimülasyonunun, q-RTPCR yoluyla transkript seviyesinde ve ayrıca canlı hücre boyama yoluyla yüzey protein seviyesinde TRPV1 ekspresyonu üzerindeki etkisini analiz etmeyi amaçladık. Bu amaçla insan nötrofilleri 50 nM [6]- gingerol ile 2 saat süreyle inkübe edildi ve ilgili ekspresyon seviyeleri ölçüldü.

Bu 2 saatlik inkübasyon, ne TRPV1 transkriptini ne de protein seviyelerini etkiledi (Şekil 4) ve ayrıca araştırılan ortak sitokin ve kemokin genlerinin RNA ekspresyonu olan IL6, IL17A, IL24, C5 ve GDF5 dışında değişmedi (Şekil S1, Tablo S2, Destekleyici Bilgi).

2.5. [6]-Gingerolün Nötrofil Yüzey Belirteçlerinin İfadesi Üzerindeki Etkisi

1. Giriş

İmmünomodülatör özelliklere sahip gıda bileşenlerinin ilgili moleküler hedefleriyle birlikte tanımlanması son yıllarda artan ilgi görmüştür. Yüksek ligand çeşitliliği nedeniyle, iyon kanallarının (TRP kanalları) geçici reseptör potansiyeli süper ailesi, potansiyel hedef yapıların çok ilginç bir sınıfını temsil eder.

Memeli TRP kanalı süper ailesi, ankirin (TRPA), kanonik (TRPC), melastatin (TRPM), mukolipin (TRPML), polisistin (TRPP) ve vanilloid (TRPV) olmak üzere altı ilgili protein ailesini içerir; bunların tümü tipik olarak değişen katyon seçiciliği ile katyon geçirgen gözenekler oluşturmak üzere tetramerler olarak bir araya gelen altı transmembran segmentini paylaşır.[1] TRPV1 kanalı, TRP süper ailesinin açık ara en yoğun şekilde araştırılan üyesi olabilir. TRPV1 başlangıçta kırmızı biberin keskin bileşeni olan kapsaisin reseptörü olarak tanımlandı.[2] Daha sonra zencefilden elde edilen keskin içerikli gingerollerin de TRPV1'i aktive ettiği gösterildi.[3]

TRPV1'in nöronal olmayan hücre tiplerindeki biyolojik rolü hala kapsamlı bir araştırma altındadır, ancak mevcut sonuçlar duyusal ve termal algının çok ötesinde işlevlere işaret etmektedir. Örneğin, yapısal bir kapsaisin analoğu olan TRPV1 agonisti nonivamidin günlük 0,15 mg dozuyla yapılan 12 haftalık bir müdahale, sağlıklı aşırı kilolu deneklerde diyet kaynaklı vücut yağ kütlesi kazanımını önledi ve plazma serotonin düzeylerini artırdı.[4]

3T3-L1 adipositlerinde TRPV1'in nonivamid tarafından aktivasyonu, PPAR𝛾 ekspresyonunu baskılayarak farklılaşma ve olgunlaşma sırasında lipid birikimini azalttı.[5] Makrofajlarda kapsaisin ve nonivamid, TRPV1'e bağımlı bir şekilde IL6, CXCL8 ve TNF-alfa gibi proinflamatuar sitokinlerin LPS kaynaklı salınımını hafifletti.[6] Ancak TRPV1'in insan kanı lökositlerindeki özel işlevleri belirsizliğini koruyor. İnsan NK hücrelerinde, 10 ve 50 μM kapsaisin, hücre içi Ca2+ konsantrasyonlarında bir artışa neden oldu, bu da fonksiyonel bir TRPV1 kanalının olduğunu gösterdi.[7]

Bununla birlikte, hücrelerin 10-100 μM konsantrasyon aralığında kapsaisin ile 1 saat süreyle ön işleme tabi tutulmasıyla indüklenen sitotoksik degranülasyon ve sitokin sekresyonu gibi sönümlenmiş NK hücre efektör fonksiyonları, büyük ölçüde TRPV1'den bağımsızdı.[7] T hücrelerinde TRPV1'in, sitokin üretiminin yanı sıra T hücresi reseptör sinyallemesi, T hücresi proliferasyonu ve farklılaşması süreçlerinde yer aldığı belgelenmiştir.[8] Grubumuzun önceki çalışmaları da TRPV1'in insan primer T hücrelerinde fonksiyonel ekspresyonunu gösterdi.[9] Ayrıca, 0,03 ila 300 μmol L−1 aralığındaki konsantrasyonlarda doz yanıt analizleri, [6]-gingerolün, birincil insan lökositleri tarafından sitokin salgılanmasını 82,2 μmol L−1 IC50 değeriyle inhibe ettiğini ortaya çıkardı.

Bununla birlikte, sağlıklı deneklerin plazma örneklerinde [6]-gingerol miktarının belirlenmesi, 1 L zencefil çayı alımından sonra ortalama maksimum plazma konsantrasyonunun yalnızca 42,0 ± 16,3 nmol L−1 olduğunu ortaya çıkardı. Bu [6]- gingerol konsantrasyonlarının önceki çalışmalarda sitokin salgılanması üzerinde önemli bir etkisi olmadığından,[9] 1 L zencefil çayı tüketiminden sonra kan plazmasında ulaşılan diyetle ilgili 50 nmol L-1 konsantrasyonunun diğer insan birincil lökositlerindeki hücresel bağışıklık tepkilerini modüle etmek için yeterli olup olmadığı açık değildir.

İnsan nötrofilleri için TRPV1'in fonksiyonel rolü hakkındaki bilgiler sınırlıdır. Köse ve Nazıroğlu[10], 10 μM kapsaisine yanıt olarak nötrofillerdeki Ca2+-akışının TRPV1 antagonisti kapsaisin tarafından azaldığını gösterirken, diğer sonuçlar, saptanabilir bir TRPV1 RNA ekspresyonuna rağmen, 1–100 μM konsantrasyon aralığında test edildiğinde kapsaisinin Ca2+ akışına neden olduğunu göstermedi.[11]

Nötrofiller insan kanında en çok bulunan lökositlerdir ve dolaşımdaki tüm beyaz kan hücrelerinin %60-70'ini oluşturur. Enfeksiyon bölgelerine toplanan ilk bağışıklık hücreleridirler; bu nedenle genellikle ilk savunma hattı olarak anılırlar.[12] Nötrofillerin toplanması, diğerlerinin yanı sıra bakteriyel veya mitokondriden türetilmiş peptit N-Formilmetiyonin-leusil-fenilalanin (fMLF) veya CXCL8 (IL-8) gibi kemokinler tarafından tetiklenir.[13]

Nötrofillerin savunma mekanizmaları arasında fagositoz,[14] degranülasyon yoluyla antimikrobiyal enzim salınımı,[15] reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimi,[16] ve nötrofil hücre dışı tuzaklarının oluşumu yer alır.[17] Bu doğrudan savunma mekanizmalarının yanı sıra nötrofiller, çeşitli sitokinler ve kemokinlerin salınması yoluyla daha sonraki immün yanıtlara da katkıda bulunur.[18] Ayrıca nötrofiller, sonraki tam aktivasyona daha güçlü yanıt vermelerini sağlayan bir hazırlama sürecinden geçebilirler.[16b]

Son yıllarda, gıdalardan ve/veya şifalı bitkilerden elde edilen bileşenlerin, insan nötrofillerinin bahsedilen savunma tepkilerinden bir veya daha fazlasını değiştirebileceğine dair kanıtlar arttı. Bu modifikasyonlar, artan fagositotik aktiviteyi[19] ve ROS oluşumunu,[20] fMLF'ye karşı artırılmış kemotaksiyi[21] ve nötrofil hücre dışı tuzaklarının oluşumunu[20] içerir. Ancak aktif bileşik(ler) tanımlanmadı. Ferula akitschkensis'ten elde edilen bileşenler (𝛽-pinen, sabinen, 𝛾-terpinen, geranilaseton ve izobornilasetat) nötrofilleri fMLF ve CXCL8'in indüklediği Ca2+ akışına karşı duyarsızlaştırdı ve fMLF'nin indüklediği kemotaksiyi inhibe etti; burada geranilasetonun indüklediği etkilere aracılık edildi TRPV1.[22]

Mevcut verilere dayanarak, TRPV1'in [6]-gingerol tarafından ligandla indüklenen aktivasyonunun, genel nötrofil fonksiyonlarını doğrudan veya aktive edici uyaranlara tepkilerini artırarak etkileyebileceğini varsaydık. Bu hipotez kapsamında, özellikle beslenme açısından uygun olduğu doğrulanmış bir konsantrasyonun, lökosit popülasyonunun bir parçası olarak insan birincil nötrofillerindeki hücresel bağışıklık tepkilerini modüle etmek için yeterli olup olmadığını açıklamayı amaçladık. '

Ayrıca, insan lökositlerindeki TRP kanalı ekspresyonuna niteliksel ve niceliksel olarak kapsamlı bir genel bakış elde etmek amacıyla, insan kanındaki en belirgin beş hücre tipindeki memeli TRP süper ailesinin tüm üyelerinin RNA ekspresyon seviyelerini karşılaştırmaya çalıştık.

2. Sonuçlar

2.1. İnsan Lökositlerindeki TRP Kanallarının Bolluğu ve Göreceli Transkript Düzeyleri

Kan lökositlerindeki TRP kanalı RNA ekspresyonunu değerlendirmek için sağlıklı donörlerin kanından en belirgin beş lökosit hücre tipi izole edildi ve TRP kanallarının RNA ekspresyonu kantitatif RT-PCR yoluyla analiz edildi (Şekil 1).

Analiz edilen tüm hücre tiplerinde TRPV'nin yanı sıra TRPM ailesinin spesifik transkriptleri %75-100 gibi yüksek frekanslarla tespit edildi. Tüm hücre tipleri dikkate alındığında ortalama genel frekans, TRPV ailesi için %96 ve TRPM ailesi için %98 idi. TRPC'ye özgü transkriptler çok daha az miktardaydı; monositler, NK hücreleri, T hücreleri ve B hücrelerinde %0'dan NK hücrelerinde %100'e ve genel ortalama frekansı yalnızca %53 olan T hücrelerine kadar değişiyordu (Şekil 1A). TRPC5'e özgü transkript yalnızca nötrofillerde %70 sıklıkla tespit edildi.

Ayrıca TRPA1'e özgü transkript genel olarak nötrofillerde %100, monositlerde %25, NK hücrelerinde %80, T hücrelerinde %100 ve B hücrelerinde %60 sıklıkla analiz edilen hücre tiplerinde oldukça düşük bir bolluk ortaya çıkardı. Benzer şekilde TRPML3'e özgü transkript, nötrofillerde (%50), monositlerde (%25), NK hücrelerinde (%40) ve B hücrelerinde (%20) düşük bir frekans, ancak T hücrelerinde %100'lük bir frekans gösterdi. TRPV1'e spesifik transkript tüm hücre tiplerinde tespit edildi; monositler, NK hücreleri ve T hücrelerinde %100, nötrofillerde %90 ve B hücrelerinde %80 frekans gösterdi.

Göreceli RNA ifadesine ilişkin olarak, ilgili frekanslarla karşılaştırıldığında, TRP kanalları, analiz edilen farklı hücre tiplerindeki ilgili Δct değerlerinin karşılaştırılması ile açıkça görüldüğü gibi, daha hücre tipine özgü bir ifade modeli ortaya çıkardı (Şekil 1B). Örneğin TRPP3 tüm hücre tiplerinde %100 sıklıkta tespit edildi ancak monositlerde en yüksek ekspresyon düzeyini açıkça ortaya koydu.

Buna karşılık, incelenen tüm hücre tiplerinde TRPV2 kanalı, nispeten yüksek RNA ekspresyon seviyesi ve yüksek frekansla tespit edildi. Benzer şekilde TRPV1'in transkript seviyeleri incelenen tüm hücre tiplerinde benzerdi (Şekil 1B).

2.2. Nötrofillerde TRPV1 Yüzey İfadesi

TRPV1'in insan nötrofillerindeki fonksiyonu hakkındaki mevcut bilgiler hala belirsizdir. TRPV1'in insan nötrofillerindeki rollerini daha fazla araştırmak için daha sonra canlı hücre akış sitometrisi kullanılarak TRPV1 kanalının birincil insan nötrofillerinin yüzeyinde ifade edilip edilmediğini araştırdık (Şekil 2).

İzole edilmiş nötrofiller, nötrofiller için bir yüzey işaretleyicisi olarak CD15 için boyandı (Şekil 2A,B) ve aynı anda ya TRPV1 proteininin ilk hücre dışı döngüsündeki bir epitopa karşı yükseltilmiş bir antikorla (Şekil 2B) ya da ilgili izotip kontrolüyle boyandı, ikincisi spesifik olmayan bağlanmayı ölçmek için bir vekil görevi görüyor (Şekil 2A). CD15+ popülasyonu içinde, FITC'ye yönelik floresans yoğunluğu analiz edildi. Nötrofillerin TRPV1 antikoruyla boyanması, izotip kontrolüne kıyasla açıkça ayırt edilebilir bir floresan sinyaline yol açtı ve böylece birincil insan nötrofillerinde TRPV1'in yüzey ekspresyonu doğrulandı (Şekil 2C). Dört ayrı donörden alınan nötrofillerin analiz edilmesi, TRPV1'in karşılaştırılabilir bir yüzey ifadesini ortaya çıkardı (Şekil 2D).

2.3. [6]-Hücre İçi Ca'da Zencefilin Neden Olduğu Artış2+

TRPV1'in ligand kaynaklı aktivasyonu Ca2+ akışıyla sonuçlanacağından, nötrofillerin [23] hücre içi Ca2+ konsantrasyonları Ca2+- duyarlı boya Fura-2 aracılığıyla belirlendi. Önceki bulgularımıza dayanarak,[9] iyi bilinen TRPV1 ligandı [6]-gingerolün 50 nM konsantrasyonu ve 2 saatlik inkübasyon süresi seçildi. Analizler, nötrofillerin 50 nM [6]-gingerol ile inkübasyonunun, 1 μM iyonofor iyonomisin uygulanarak belirlendiği üzere maksimum değerin ortalama %18,4 ± %1,0'ı olan hücre içi Ca2+ konsantrasyonlarında artışla sonuçlandığını gösterdi. DMSO'nun neden olduğu artış %4,7 ± %1,2 düzeyindeydi (Şekil 3).

2.4. [6]-Gingerol'ün TRPV1 İfadesi Üzerindeki Etkisi

Daha sonra, [6]-gingerol ile TRPV1 stimülasyonunun, q-RTPCR yoluyla transkript seviyesinde ve ayrıca canlı hücre boyama yoluyla yüzey protein seviyesinde TRPV1 ekspresyonu üzerindeki etkisini analiz etmeyi amaçladık. Bu amaçla insan nötrofilleri 50 nM [6]- gingerol ile 2 saat süreyle inkübe edildi ve ilgili ekspresyon seviyeleri ölçüldü.

Bu 2 saatlik inkübasyon, ne TRPV1 transkriptini ne de protein seviyelerini etkiledi (Şekil 4) ve ayrıca araştırılan ortak sitokin ve kemokin genlerinin RNA ekspresyonu olan IL6, IL17A, IL24, C5 ve GDF5 dışında değişmedi (Şekil S1, Tablo S2, Destekleyici Bilgi).

2.5. [6]-Gingerolün Nötrofil Yüzey Belirteçlerinin İfadesi Üzerindeki Etkisi

Jinkui Shenqi Haplarını parçalara ayırın, yaklaşık 2,0 g numuneyi doğru bir şekilde tartın ve bunu kapaklı konik bir şişeye aktarın. 25 mL %70 metanol ekleyin, toplam kütleyi tartın ve 35 dakika boyunca ultrasonik ekstraksiyon (300 W, 40 kHz) gerçekleştirin. Oda sıcaklığına soğuduktan sonra kaybedilen ağırlığı %70 metanol ile doldurun ve iyice çalkalayın. Test çözeltisini elde etmek için çözeltiyi 0,45 μm mikro gözenekli membrandan filtreleyin.

 

Tespit dalga boyunu seçmek için tam dalga boyu tarama (190–400 nm) yapıldı. Morronisid ve loganin 230-240 nm'de maksimum absorpsiyona sahip olmasına rağmen, bu dalga boyu yüksek temel gürültüden muzdariptir. 254 nm dalga boyu kararlı yanıt ve düşük arka plan girişimi sağlar. Paeonol, sinamik asit, akteozit ve 7-hidroksikumarinin tümü 254 nm'de stabil ultraviyole emilimi sağlar. Bu nedenle, çok bileşenli senkron analiz için birleşik algılama dalga boyu olarak 254 nm seçildi.

 

Tüm doğal bitkisel hammaddeler arasında,Cistanche tubulosa (Çölde Yaşayan Cistanche)bitki olarak öne çıkıyoren yüksek akteozit içeriğiküresel olarak. Çekirdek feniletanoid glikozit olarak akteozit, anti-inflamatuar, antioksidan, nöroproteksiyon ve bağışıklık düzenlemesi ile ünlüdür. Fabrikamız, yaygın bitkisel malzemelerden çok daha yüksek seviyelerde akteozit ve diğer aktif bileşenler içeren yüksek saflıkta Cistanche tubulosa özütü konusunda uzmanlaşmıştır ve bu da onu Avrupa ve Amerika pazarları için birinci sınıf diyet takviyeleri, fonksiyonel gıdalar, bitkisel içecekler ve cilt bakım ürünleri geliştirmek için ideal bir hammadde haline getirmektedir.

 

 

Cistanche tubulosa ekstraktımızın imza bileşeni olan Acteoside, Avrupalı ​​ve Amerikalı tüketicilerin sağlık taleplerini karşılayan çok sayıda temel fayda sağlar: anti-inflamatuar, bağışıklık güçlendirme, anti-hipoksi, serbest radikal temizleme, DNA onarımı ve karaciğer koruması. Ekinekozit (antioksidan, nöroproteksiyon, kardiyovasküler koruma) ve polisakkaritler (bağışıklık düzenlemesi) ile birleştirilen ekstraktımız, yukarıda bahsedilen birinci sınıf bitkisel içeriklerin tüm ana etkinliklerini birleştirir.anti-inflamatuar, antibakteriyel, antioksidan, bağışıklık düzenleme ve kardiyovasküler koruma.