Cistanche Tubulosa Feniletanoid Glikozitler Mitokondriye Bağlı Yol Yoluyla Eca‑109 Hücrelerinde Apoptozu İndükler
Mar 06, 2022
İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com
CHANGSHUANG FU, JINYU LI, ADILA AIPIRE, LIJIE XIA, YI YANG, QIUYAN CHEN, JIE LV, XINHUI WANG ve JINYAO LI
Soyut
Cistanche tübülozaçeşitli biyolojik fonksiyonlara sahiptir. Bu çalışmada, C. tubulosa'nın (CTPG-W) suda çözünür feniletanoid glikozitlerinin özofagus kanseri üzerindeki antitümör etkisi araştırıldı. Eca-109 hücreleri CTPG-W ile işlendi ve hücre canlılığı MTT tahlili ile ölçüldü. Apoptoz, hücre döngüsü, mitokondriyal membran potansiyeli (Δψm) ve reaktif oksijen türleri, akış sitometrisi ile analiz edildi. Apoptotik yolaklardaki protein seviyeleri western blot analizi ile tespit edildi. CTPG‑W'nin apoptoz indüksiyonu ve hücre döngüsü durması yoluyla Eca-109 hücrelerinin canlılığını önemli ölçüde azalttığı belirlendi. CTPG-W tedavisinin ardından, Eca-109'nın Δψm'si belirgin şekilde azaldı, bu da B hücreli lenfoma-2 (Bcl-2) ile ilişkili X'in yukarı regüle edilmiş seviyeleri ve aşağı regüle edilmiş seviyelerle ilişkilidir. Bcl-2. Sonuç olarak, sitokrom c ve c-Jun NH2-terminal kinaz seviyeleri arttı, bu da bölünmüş poli (ADP-riboz) polimeraz ve bölünmüş kaspaz seviyelerini yükseltti-3, {{18} } ve -9, ancak kaspaz değil-8. Buna uygun olarak, Eca-109 hücrelerindeki reaktif oksijen türlerinin seviyeleri dikkate değer değişiklikler gösterdi. Bu sonuçlar, CTPG-W'nin mitokondriyal bağımlı bir yol aracılığıyla Eca-109 hücrelerinin apoptozunu indüklediğini gösterdi.
giriiş
Özofagus kanseri, dünya genelinde en yüksek 11. morbidite ve 6. en yüksek mortalite oranına sahip en yaygın kanser türlerinden biridir ve 2015 yılında ~439,000 ölüme neden olmuştur (1). Özofagus kanseri insidansı özellikle farklı bölgeler arasında farklılık göstermekte olup, doğu Asya ve doğu ve güney Afrika en yüksek insidans oranlarını sergilerken, batı Afrika 2012'de en düşük oranları sergilemektedir (1,2). Çin'de 2015 yılında tahmini özofagus kanseri vakaları ve ölümleri sırasıyla 477,000 ve 375,000 idi (3). 2005-2015 yılları arasında orta ve yüksek-orta sosyodemografik indeksli ülkelerde özofagus kanseri morbidite oranı azalmış olsa da kötü prognoz nedeniyle mortalite oranı yüksek kalmaktadır (1,4). Cerrahi rezeksiyonun kemoterapi veya radyoterapi ile kombinasyonu özofagus kanserini tedavi etmek için kullanılmıştır, ancak 2003 ve 2014 yılları arasında 5-yıllık sağkalım oranının aynı kaldığı bildirilmiştir.<20% in="" china,="" the="" usa,="" and="" europe="" (4,5).="" for="" these="" reasons,="" it="" is="" urgent="" to="" develop="" novel="" therapeutic="" agents="" to="" treat="" esophageal="">
Geleneksel Çin bitkisel tıbbı (CHM), küçük hücreli dışı akciğer kanseri (6), kolorektal kanser (7), hepatoselüler karsinom (8) dahil olmak üzere çeşitli kanser türlerini tedavi etmek için kullanılmıştır. Son zamanlarda, klinik deneyler, CHM'nin kemoterapi veya radyoterapi ile kombinasyonunun sadece yaşam kalitesi üzerinde bir takım faydalar gösterdiğini ve kemoterapi veya radyoterapinin neden olduğu yan etkileri hafiflettiğini (9,10) değil, aynı zamanda hastaların hayatta kalma oranlarını da iyileştirdiğini bildirdi. küçük hücreli olmayan akciğer, karaciğer, mide, kolorektal, nazofarenks veya rahim ağzı kanseri ile (9). Bununla birlikte, özofagus kanserinde CHM tedavisinin etkinliğine ilişkin çelişkili kanıtlar vardır (10,11). Çok sayıda çalışma, Andrographis paniculata (12,13), Daikenchuto (14), icariin (15), Rosa Roxburghii Tratt ve Fagopyrum dahil olmak üzere bir dizi bitkisel ilaç veya bileşenin in vitro ve in vivo özofagus kanseri hücrelerinin büyümesini engelleyebileceğini belirledi. Cymosum (16), Jaridonin (17), Marsdenia tenacissima (18), OP16 (yeni bir ent-kaurene diterpenoid) (19), Qigesan (20) ve Tonglian kaynatma (21). Cistanche bir tür CHM'dir ve anti-oksidasyon, anti-inflamasyon ve nöroproteksiyon dahil olmak üzere çeşitli biyolojik işlevler uygular (22,23). Daha önceki çalışmamız göstermiştir kiCistanche tubulosa feniletanoid glikozitler(CTPG), melanom B16-F10 hücrelerinin in vitro ve in vivo büyümesini baskılayabilir (24). Ancak daha önce kullanılan CTPG'nin suda çözünürlüğünün düşük olması ilaç gelişimini sınırlandırmaktadır (24). Bu nedenle suda çözünür CTPG (CTPG-W) kullanıldı ve özofagus kanseri hücreleri (Eca-109) üzerindeki antitümör etkisi araştırıldı. CTPG-W'nin mitokondriyal bağımlı bir yol aracılığıyla apoptoz indüksiyonu yoluyla Eca-109 hücrelerinin canlılığını doza bağlı olarak engelleyebildiği belirlendi.
Malzemeler ve yöntemler Hayvanlar.
Dişi C57BL/6 fareleri (6-8 hafta, ~25 g) Pekin Laboratuvar Hayvanları Araştırma Merkezi'nden (Pekin, Çin) satın alınmış ve sıcaklık kontrollü (25˚C), ışık döngülü (12/ 12) Sincan Üniversitesi Hayvan Tesisi (Urumçi, Çin). Tüm hayvanlara patojen içermeyen su ve yiyecek verildi.
Hücre çizgisi ve kültür. İnsan özofagus karsinomu hücre dizisi (Eca-109), Xinjiang Temel Biyolojik Kaynaklar ve Genetik Mühendisliği Laboratuvarı (Yaşam Bilimi ve Teknolojisi Koleji, Xinjiang Üniversitesi, Urumçi, Çin) tarafından korunmuş ve RPMI'da kültürlenmiştir{{1} } ortam (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, ABD) yüzde 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, Çin), yüzde 1 L -glutamin (100 mM), 100 U/ml penisilin ve 100 µg/ml streptomisin 37°C'de yüzde 5 CO2 içeren nemli bir atmosferde.
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC). CTPG-W (kat. no. SGJG20170410), Shanghai Upbio Tech Co., Ltd.'den (Şanghay, Çin) satın alındı. CTPG'nin ana bileşikleri, önceki çalışmamıza göre HPLC tarafından nitelendi ve nicelendirildi (24). Kısaca HPLC, 30°C'de bir ZORBAX SB‑C18 Sütunu (250x4.6 mm; 5 µm) üzerinde yürütüldü ve yüzde 0,2 formik asit çözeltisi ve yüzde 23'ten başlayarak bir metanol gradyanı ile yıkandı, çünkü her dakika 1 ml eklendi 45 dakika boyunca yüzde 31'e ulaşana kadar. Toplam 10 µl numune enjekte edildi ve 330 nm'de tespit edildi. Ekinakozit standardı, Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd.'den (Shanghai, Çin) satın alındı ve akteosit standardı, Sigma-Aldrich'ten (Merck KGaA, Darmstadt, Almanya) satın alındı. Standartlar, CTPG-W'nin bileşenlerini analiz etmek için kullanıldı.
MTT tahlili. Hücre proliferasyonu, bir MTT tahlili ile ölçüldü. Eca{{0}} hücreleri 96-kuyu plakalarına 5x103 hücre yoğunluğunda 100 µl RPMI{{5 içinde aşılandı. }} ortam/kuyucuk ve 37°C'de 24 saat kültürlendi, daha sonra farklı konsantrasyonlarda (0, 200, 400, 600 ve 800 µg/ml) CTPG-W veya yüzde 0,4 dimetil sülfoksit (DMSO) ile 24 saat işlendi, 48 ve 72 saat. Solvent kontrolü olarak DMSO kullanıldı (yüzde 0.4 DMSO içeren 800 ug/ml CTPG-W). Pozitif kontrol olarak sisplatin (20 µg/ml) kullanıldı. Ardından, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 225 x g'de santrifüjlemenin ardından süpernatan atıldı ve her bir oyuğa 100 µl MTT solüsyonu (FBS'siz RPMI-1640 ortamında 0,5 mg/ml) ilave edildi ve 37°C'de inkübe edildi. 3 saat için. Oluşan formazan kristalleri 200 ul DMSO içinde çözüldü. Optik yoğunluk (OD) değerleri, bir 96-kuyucuklu mikroplaka okuyucu (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD) ile 490 nm dalga boyunda ölçüldü. Göreceli hücre canlılığı, aşağıdaki formüle göre hesaplandı: Hücre canlılığı (yüzde)=(ODtedavi edilmiş/ODtedavi edilmemiş)x100 yüzde. Eca‑109 hücrelerinin morfolojisi, ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu (büyütme, x200) (Nikon Eclipse Ti‑E; Nikon Corporation, Tokyo, Japonya) ile gözlemlendi.
Splenositlerin çoğalması için, C57BL/6 farelerine servikal dislokasyon ile ötenazi uygulandı ve dalaklar izole edildi. Tek hücreli süspansiyon yapıldı ve splenositler, 100 µl RPMI-1640 ortamında 1x105 hücre/kuyu yoğunluğunda 96-kuyucuklu plakalara ekildi ve daha sonra farklı konsantrasyonlarla işleme tabi tutuldu. (0, 200, 400, 600 ve 800 µg/ml) yüzde 5 CO2 ile 37°C'de 24, 48 ve 72 saat süreyle CTPG-W. Splenositlerin çoğalması, yukarıda bahsedilen protokole göre MTT tahlili ile ölçülmüştür. Uyarıcı indeks=ODtedavi edilmiş/ODtedavi edilmemiş.
Apoptoz ve hücre döngüsü ölçümü. Eca{{0}} hücreleri, 24 saat boyunca 2.5x105 hücre/tabak yoğunluğunda 60 mm tabaklarda kültürlendi ve farklı konsantrasyonlarla işlendi ({{31} }, 200, 400, 600 ve 800 µg/ml) CTPG-W veya yüzde 5 CO2 ile 37°C'de 24 saat boyunca yüzde 0,4 DMSO. Hücreler toplandı ve üreticinin protokollerine göre bir Annexin V‑floresein izotiyosiyanat (FITC)/Propidium iyodür (PI) Apoptoz Tespit kiti (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Şangay, Çin) ile boyandı. Örnekler akış sitometrisi (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, ABD) ile toplandı ve FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, ABD) ile analiz edildi. CTPG-W'nin hücre döngüsü üzerindeki etkisini analiz etmek için, 2.5x105 Eca-109 hücreleri 60 mm kültür tabaklarına ekildi ve CTPG-W (0, 100, 200 ve 400 µg/ml) veya 0.4 ile işlendi. yüzde 5 CO2 ile 37°C'de 24 saat boyunca yüzde DMSO. Tüm hücreler toplandı ve iki kez buz gibi soğuk PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) ile yıkandı, ardından 30 dakika boyunca 4°C'de yüzde 70 buz gibi soğuk etanol içinde sabitlendi. Buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkamanın ardından hücreler, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 ul PI/RNase boyama tamponunda (BD Biosciences, San Jose, CA, ABD) yeniden süspanse edildi. Hücre döngüsü dağılımı, akış sitometrisi (BD FACSCalibur) ile ModFit LT 3.0 yazılımı ile analiz edildi.
Mitokondriyal membran potansiyeli (Δψm) ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) analizi. Δψm'yi analiz etmek için, Eca{{0}} hücreleri CTPG-W (0, 400, 600 ve 800 µg/ml) veya 24 için yüzde 0,4 DMSO ile işleme tabi tutuldu. saat 37˚C'de yüzde 5 CO2 ile ve üreticinin protokolüne göre JC-1 (Beyotime Biyoteknoloji Enstitüsü, Şanghay, Çin) ile mitokondriyal membran potansiyeli test kiti ile boyanmış, 37˚C'de 20 dakika . JC-1 yıkama tamponu (Beyotime Biyoteknoloji Enstitüsü) ile iki kez yıkandıktan sonra, numuneler 300 µl JC‑1 yıkama tamponu ile yeniden süspanse edildi ve akış sitometrisi (BD FACSCalibur) ile analiz edildi. Eca‑109 hücrelerinde JC‑1 boyasının floresansı, ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu (büyütme, x200; Nikon Eclipse Ti‑E) ile de gözlendi. ROS analizi için, Eca-109 hücreleri 2, 4, 6, 12 ve 24 saat CTPG-W (0, 400, 600 ve 800 µg/ml) ile işlendi ve Reaktif Oksijen Türleri ile boyandı Test Kiti (Beyotime Biyoteknoloji Enstitüsü), üreticinin protokolüne göre, 37˚C'de 20 dakika süreyle. Buz gibi soğuk PBS ile üç kez yıkamanın ardından örnekler akış sitometrisi (BD FACSCalibur) ile toplandı ve FlowJo 7.6 yazılımı ile analiz edildi.
2,2‑difenil‑1‑pikrilhidrazil (DPPH) radikal temizleme aktivitesi. CTPG-W'nin serbest radikal süpürme aktivitesi, DPPH'yi çözmek için metanol etanol ile ikame edildiğinden, küçük bir modifikasyonla yayınlanan protokole göre bir DPPH serbest radikal tahlili ile belirlendi (25,26). Kararlı durum ölçümleri için, etanol içinde 150 µl DPPH (100 mmol/l), farklı konsantrasyonlarda CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 ve 600 ug/ml) 50 ul PBS içinde ve karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edildi. 517 nm'de absorbans, CTPG-W varlığında ve yokluğunda tespit edildi. Pozitif kontrol olarak toplam 50 µl Vitamin C kullanıldı. DPPH radikal süpürme aktivitesi şu formül kullanılarak hesaplandı: Scavenging (yüzde )=[1-(A sample-Ablank)/A0] x100, burada Ablank, kontrolün absorbansıdır (DPPH olmadan), Bir numune, numunenin absorbansıdır ve A0, DPPH ile PBS'nin absorbansıdır.
Western blot analizi. Eca{{0}} hücreleri, CTPG-W (0, 200, 600 ug/ml) veya yüzde 0,4 DMSO ile 24 saat 37°C'de yüzde 5 CO2 ile işleme tabi tutuldu. Aşağıdaki iki kez PBS ile yıkama, hücreler, 20 dakika boyunca buz üzerinde Radyoimmünopresipitasyon Tahlili Lizis tamponu (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Beijing, Çin) içinde parçalandı. 4°C'de 10,000 xg'de 10 dakika santrifüj edildikten sonra süpernatanlar toplandı ve üreticinin protokollerine göre bir bisinkoninik asit kiti (Thermo Fisher Scientific, Inc.) ile protein konsantrasyonları tespit edildi. Western blot analizi, önceki açıklamamıza göre yapıldı (24). Kaspaz-7 (kat. no. D120077), kaspaz-8 (kat. no. D155240), kaspaz-9 (kat. no. D220078), B hücreli lenfoma{'ya karşı antikorlar {24}} (Bcl-2)-ilişkili X (Bax) (kat. no. D220073) ve Bcl-2 (kat. no. D260117) ve anti-fare IgG-yaban turpu peroksidaz (HRP) ) (kat. no. D111050) ve anti-tavşan IgG-HRP (kat. no. D110058) BBI Life Sciences'tan (Shanghai, Çin) satın alınmıştır. Kaspaza-3 (kat. no. E-AB-10050) ve aktif kaspaza-3 (kat. no. E-AB-22115) karşı antikorlar Elabscience'dan satın alındı ( Vuhan, Çin). Kaspaz-7 (kat. no. 9492), poli (ADP-riboz) polimeraz (PARP) (kat. no. 9542), sitokrom c (kat. no. AC909), c-Jun NH{'ye karşı diğer antikorlar {48}}terminal kinaz (JNK) (kat. no. 9252S) ve -aktin (kat. no. 58169), Cell Signaling Technology, Inc.'den (Danvers, MA, ABD) elde edildi. Tüm birincil ve ikincil antikorlar 1:1'de seyreltildi000. Birincil antikorlar gece boyunca 4°C'de inkübe edildi ve ikincil antikorlar 37°C'de 1 saat süreyle inkübe edildi.
Hedef proteinler, üreticinin protokolüne göre geliştirilmiş bir kemilüminesans tahlil kiti (Beyotime Biyoteknoloji Enstitüsü) kullanılarak saptandı.
İstatistiksel analiz. İstatistiksel anlamlılık, Tukey'in post hoc testi ile tek yönlü varyans analizi ile hesaplandı ve sonuçlar, tedavi ve kontrol grupları arasında GraphPad Prism 5.0 yazılımı (GraphPad Software, La Jolla, CA, ABD) kullanılarak analiz edildi. Tüm veriler ortalama ± standart sapma olarak sunuldu. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Cistanche tubulosa feniletanoid glikozitler(CTPG)
Sonuçlar
CTPG‑W, Eca‑109 hücrelerinin büyümesini bastırır. CTPG-W'nin bileşenleri, ekinakozit ve akteosit standartlarıyla karşılaştırılan HPLC (Şekil 1) ile kalifiye edildi ve nicelendirildi. Pik alıkonma sürelerine ve pik alanlarına göre, CTPG-W yüzde 39.16 ekinakozit ve yüzde 2.44 akteozit içeriyordu. İlk olarak, CTPG-W'nin Eca-109 hücrelerinin canlılığı üzerindeki etkisi, bir MTT tahlili ile belirlendi. CTPG-W, DMSO içinde 200 mg/ml'de çözündürüldü ve belirtilen konsantrasyonlara kadar yüzde 10 ısıyla inaktive edilmiş FBS içeren RPMI-1640 ortamı ile seyreltildi. Eca-109 hücreleri, CTPG-W ile muamele edildi ve hücre canlılığı, belirtilen zaman noktalarında bir MTT tahlili ile analiz edildi. CTPG‑W tedavisi, doza ve zamana bağlı bir şekilde Eca-109 hücrelerinin canlılığını önemli ölçüde azalttı (P<0.001; fig.="" 2a).="" the="" morphology="" of="" eca-109="" cells="" was="" observed="" with="" an="" inverted="" fluorescence="" microscope="" (magnification,="" x200)="" following="" ctpg‑w="" treatment="" for="" 24="" h,="" which="" changed="" notably="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" with="" the="" cells="" shrinking="" and="" becoming="" round="" following="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 2b).="" these="" results="" indicate="" that="" ctpg-w="" suppresses="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells.="" the="" effect="" of="" ctpg-w="" on="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" was="" also="" detected="" with="" an="" mtt="" assay.="" ctpg-w="" significantly="" promoted="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="" 2c),="" indicating="" that="" it="" has="" no="" cytotoxic="" effect="" on="">
CTPG‑W, Eca‑109 hücrelerinde apoptozu indükler. CTPG-W'nin apoptoz veya nekroz indüksiyonu yoluyla Eca-109 hücrelerinin büyümesini baskılayıp baskılamadığını araştırmak için hücreler, farklı konsantrasyonlarda CTPG-W ile tedavi edildi. 24 saat sonra, Annexin V/PI boyama ile Eca-109 hücrelerinin apoptozu ve nekrozu tespit edildi. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, Annexin V-/PI artı hücreleri nekrotik hücreler olarak kapılandı ve Annexin V artı /PI artı ve Annexin V artı /PI- hücreleri apoptotik hücreler olarak kapılandı. Nekrotik Eca{12}} hücreleri de 600 ve 800 µg/ml CTPG-W (P<0.001 at="" 600="" µg/ml="" and=""><0.05 at="" 800="" µg/ml).="" consistently,="" the="" levels="" of="" pro-apoptotic="" bax="" and="" anti-apoptotic="" bcl-2="" in="" eca-109="" cells="" were="" upregulated="" and="" downregulated,="" respectively,="" upon="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 3b).="" the="" results="" indicated="" that="" ctpg-w="" primarily="" inhibited="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells="" through="" the="" induction="" of="">
CTPG‑W, Eca‑109 hücrelerinde S fazında hücre döngüsü durmasına neden olur. Kanser hücre döngüsünün bozulması hücre büyümesini baskılayacak ve apoptozu teşvik edecektir (27). Eca-109 hücrelerinde hücre döngüsünün dağılımı, 24 saat boyunca CTPG-W işleminden sonra PI boyama ile tespit edildi. CTPG‑W tedavisi üzerine S fazındaki hücrelerin arttığı ve G0/G1 fazlarındaki hücrelerin genel olarak önemli bir düşüş gösterdiği gözlemlendi (P<0.05; fig.="" 4),="" indicating="" that="" ctpg-w="" arrests="" the="" eca-109="" cell="" cycle="" at="" the="" s="">
CTPG‑W Δψm'yi azaltır ve sitokrom c salınımını indükler. Apoptoz, mitokondriyal bağımlı bir yolak ile indüklenebilir (28,29). BCL-2 protein ailesinin pro- ve anti-apoptotik üyeleri, mitokondriyal membran bütünlüğünün düzenlenmesinde önemli rollere sahiptir (30,31). 24 saatlik CTPG-W işleminden sonra Δψm, JC‑1 boyaması kullanılarak değerlendirildi. JC‑1 agregası (FL‑2'de algılanan kırmızı floresan) Δψm azalırken monomere (FL'de algılanan yeşil floresan-1) parçalanacaktır (32). Şekil 5A'da gösterildiği gibi, FL-1 artı FL-2-/ artı hücrelerinin frekansları doza bağlı bir şekilde önemli ölçüde arttı, bu da Eca‑109 hücrelerinin Δψm'sinin azaldığını gösterir. Eca‑109 hücrelerindeki flüoresans değişiklikleri, ters çevrilmiş bir flüoresans mikroskobu ile de gözlendi (Şekil 5B). CTPG‑W'nin artan konsantrasyonlarıyla, akış sitometrisinden elde edilen verilerle tutarlı olarak kırmızı floresan azaldı ve yeşil floresan arttı. Ayrıca sitozoldeki sitokrom c seviyesinin, Δψm'lik bir azalmanın bir sonucu olarak belirgin şekilde arttığı (Şekil 5C) gözlendi. Bu, artan FL-1 artı FL-2-/ artı hücre sayısından çıkarılan sonucu CTPG-W tedavisinin bir sonucu olarak Δψm'nin azaldığı sonucu güçlendirir. JNK'nin, sitokrom c (33-35) salınımına neden olan BCL-2 protein ailesinin aktivasyonunu düzenleyebildiği bildirilmiştir. Ayrıca, CTPG-W işleminden sonra JNK seviyesinin belirgin şekilde yukarı doğru düzenlendiği belirlendi (Şekil 5C). Sonuçlar, CTPG-W'nin mitokondriyal bağımlı bir yol aracılığıyla Eca-109 hücrelerinin apoptozunu indükleyebileceğini gösterdi.
CTPG‑W'nin hücre içi ROS üretimi üzerindeki etkisi. ROS, apoptozu indüklemek için Δψm'yi azaltabilir (36). CTPG-W'nin ROS üretimini artırıp artıramayacağını araştırmak için Eca-109 hücreleri, farklı konsantrasyonlarda CTPG-W ile işlendi. Hücreler belirtilen zaman noktalarında toplandı ve DCFH-DA ile boyandı. Eca-109 hücrelerinde hücre içi ROS üretimi, akış sitometrisi ile belirlendi. Şekil 6A'da gösterildiği gibi, 800 µg/ml CTPG-W, ROS üretimini 2-6saatten önemli ölçüde arttırdı ve 12-24saatten azaldı. Ayrıca 400 µg/ml CTPG‑W, ROS üretimini 12-24 saatten önemli ölçüde artırdı. Ayrıca, 200 ug/ml CTPG-W, ROS üretimini önemli ölçüde değiştirmedi. ROS üretiminin dinamik değişiklikleri, Eca-109 hücre apoptozu ile ilişkilendirilebilir. CTPG-W'nin, 12 saat sonra 800 ug/ml CTPG-W ile tedavi edilen Eca-109 hücrelerinde ROS üretiminin azalmasıyla ilişkili olabilecek serbest radikal süpürme aktivitesine sahip olduğu da belirlendi (Şekil 6B).
CTPG‑W, kaspaz‑3, kaspaz‑7, kaspaz‑9 ve PARP'ın aktivitesini düzenler. Δψm azalmasına bağlı olarak sitokrom c salınımı, apoptozu indüklemek için kaspaz proteazlarını aktive edebilir (29,30,37). 24 saat CTPG-W tedavisini takiben kaspaz-3, 7, 8, 9 ve PARP aktivasyonu western blot analizi ile tespit edildi. Kontrol ile karşılaştırıldığında, klivad-kaspaz-9, klivad-kaspaz-7, klivaj-kaspaz-3 ve klivad-PARP seviyeleri değil, klivad-kaspaz{{ seviyeleri değil 20}}, doza bağlı bir şekilde CTPG tedavisi ile yukarı regüle edildi (Şekil 7). Bu sonuçlar, CTPG-W'nin Δψm'yi azalttığını ve Eca-109 hücrelerinin apoptozunu indükleyen kaspazları aktive etmek için sitokrom c salınımını desteklediğini gösterdi.
Cistanche tubulosa özü
Tartışma
Geleneksel CHM, dışsal ölüm reseptörü, içsel mitokondriyal ve endoplazmik retikulum stres yolları dahil olmak üzere farklı yollar yoluyla özofagus kanseri hücrelerinin apoptozunu indükleyebilir (29). Önceki çalışmamız, C. tubulosa'nın ana bileşeni olan CTPG'nin, mitokondriyal bağımlı bir yol aracılığıyla apoptoz indüksiyonu yoluyla melanom B16-F10 hücrelerinin büyümesini engellediğini göstermiştir (24). Bu çalışmada, CTPG-W'nin Eca-109 hücreleri üzerindeki antitümör etkisi araştırılmış ve CTPG-W'nin Eca-109 hücrelerinin büyümesini baskıladığı, apoptozu uyardığı ve hücre döngüsü durmasını engellediği, azaltılmış Δψm, sitokrom c ve aktive kaspazların salınımını arttırdı. CTPG ve CTPG-W, kanser hücrelerinde apoptozu ve hücre döngüsü durmasını indükleyebilir. Bununla birlikte, CTPG'nin farklı bileşenleri (yüzde 26,64 ekinakozit, yüzde 10,19 akteozit ve yüzde 1,71 izoakteozit) ve CTPG-W (yüzde 39,16 ekinakozit ve yüzde 2,44 akteozit) nedeniyle doğru mekanizmalar farklıdır. CTPG, G0/G1 fazlarında B16-F10 hücrelerini tutukladı, ancak CTPG-W, S fazında (24) Eca-109 hücrelerini tutukladı. ROS üretimi, CTPG tarafından doza bağlı olarak artırıldı, ancak CTPG-W tedavisinin başlangıcında (2-6 saat) önemli ölçüde artan yüksek dozda CTPG‑W ile zamana bağlı bir şekilde bir değişiklik gösterdi ve kontrol ile karşılaştırıldığında, 12 saat sonra önemli ölçüde azaldı. Olası bir neden, CTPG-W'nin ana bileşeninin ekinakozit olmasıdır. Bir dizi çalışma, ekinakozidin ROS üretimini ve ROS'un neden olduğu apoptozu, nöroprotektif ve yaşlanma karşıtı etkilerini uygulamak için engelleyebileceğini bildirdi (38-40). Benzer şekilde, bu çalışmada serbest radikal süpürme aktivitesi gözlendi. Bu nedenle, yüksek dozda CTPG-W'de bulunan verbascoside, izo-verbascoside ve salidrosid dahil olmak üzere bazı bileşenlerin ROS oluşumunu hemen Eca-109 hücrelerinin apoptozisine (41,42) neden olacak şekilde indükleyebileceği ve ardından ROS, ekinakozit tarafından temizlendi. CTPG ve CTPG-W tarafından ROS üretimindeki farklılıkların bir başka olası nedeni, bu çalışmada ve önceki bir çalışmada farklı hücre hatlarının kullanılmış olmasıdır (24). Dong ve arkadaşları (43) ekinakozidin, artan ROS seviyeleri olmaksızın oksidatif DNA hasarlarının üretilmesi yoluyla insan SW480 kolorektal kanser hücrelerinin apoptozunu indükleyebileceğini bildirmiştir.
CTPG-W tedavisi Δψm'yi azalttı ve kaspaz bölünmesini destekleyen sitokrom c'nin salınmasına neden oldu-9 (28). Tutarlı bir şekilde, bölünmüş kaspaz-9 seviyeleri CTPG-W tedavisi ile yukarı doğru düzenlenmiştir. Ardından, aktif kaspaz-9, apoptozu indüklemek için kaspaz-3'ı aktive edebilir (44). Bölünmüş kaspaz-3 seviyeleri de CTPG-W tedavisi ile yukarı regüle edildi. Bununla birlikte, kaspaz-8, CTPG-W tarafından aktive edilmedi, bu da dışsal ölüm reseptör yolunun CTPG-W tarafından indüklenen apoptoza dahil olmadığını gösterir. Bu gözlemler, CTPG-W'nin, mitokondriyal bağımlı bir yolun aktivasyonu yoluyla Eca-109 hücrelerinin apoptozunu indüklediğini gösterir.
PARP, genomik stabilitede önemli rollere hizmet eder ve aktif kaspazlar, özellikle kaspaz-3 ve -7 tarafından bölünebilir (45). CTPG-W tedavisinin PARP'ı parçalayarak DNA onarımını inhibe ederek apoptoza neden olabilen kaspaz-3 ve -7'yi aktive ettiği belirlendi.
CTPG-W ayrıca doza ve zamana bağlı olarak insan hepatoselüler karsinoma BEL-7404 hücrelerinin büyümesini baskılar (yayınlanmamış veriler). CTPG-W, Eca-109 ve BEL-7404 hücrelerinin büyümesini engellese de, CTPG-W'deki polisakkaritlerin (~%50) içeriğinden kaynaklanabilecek splenositlerin çoğalmasını teşvik eder (46). ). Benzer şekilde, bir dizi çalışma polisakkaritlerin splenositlerin (46-49) çoğalmasını destekleyebileceğini bildirmiştir. Fare modelinde, CTPG-W'nin kontrol grubu ile karşılaştırıldığında dalak indeksini önemli ölçüde arttırdığı, ancak vücut ağırlığını ve kalp, karaciğer, böbrek ve akciğer dahil diğer organ indekslerini etkilemediği belirlendi (yayınlanmamış veriler), CTPG-W'nin normal hücreler üzerinde sitotoksik etkisi olmadığını gösterir.
Toplu olarak, veriler, CTPG-W'nin, mitokondriyal bağımlı bir yol aracılığıyla apoptozu indükleyerek Eca-109 hücrelerinin büyümesini engellediğini gösterdi.
cistanche faydaları: anti-apoptoz
Teşekkür
Yazarlar, el yazmasını parlattığı için Dr. Jianhua Yang'a (Baylor Tıp Fakültesi) teşekkür eder.
Finansman
Bu çalışma, Temel Disiplin Biyolojisi İhale Projesi için 13. Beş Yıllık Plan (hibe no. 17SDKD0202), Xinjiang Normal Üniversitesi ve Xinjiang'daki Özel Çevre Biyoçeşitlilik Uygulama ve Yönetmeliğinin Kilit Laboratuvarı (hibe no. XJTSWZ-2017-04) tarafından desteklenmiştir. JL'ye ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Hibesi (hibe no. 31760260) XW'ye.
Veri ve materyallerin mevcudiyeti
Bu çalışma sırasında kullanılan ve analiz edilen veriler ve materyaller, makul talep üzerine ilgili yazardan temin edilebilir.
Yazar katkıları
CF, AA, YY ve QC deneyleri gerçekleştirdi. LX, JLv ve XW, verileri ve hazırlanan rakamları analiz etti. JinyuL ve JinyaoL projeyi tasarladı ve makaleyi yazdı.
Etik onay ve katılım onayı
Tüm hayvan deneyleri, Sincan Biyolojik Kaynaklar ve Genetik Mühendisliğinin Temel Laboratuvarı Hayvan Deneyleri Etiği Komitesi tarafından onaylandı (onay, no. BRGE-AE001; Xinjiang Üniversitesi).
Yayın için hasta onayı
Uygulanamaz.
rekabet eden çıkarlar
Yazarlar, rekabet eden çıkarları olmadığını beyan eder.
Referanslar
Wu CR, Lin HC ve Su MH: Su ile ters çevirmeCistanche tubulosa özleriAlzheimer hastalığı benzeri sıçan modelindeki davranışsal eksikliklerden: Amiloid birikimi ve merkezi nörotransmitter işlevi için alaka düzeyi. BMC Tamamlayıcı Alter Med 14: 202, 2014.
Li J, Aspire A, Gao L, Huo S, Luo J ve Zhang F:Cistanche tubulosa kaynaklı feniletanoid glikozitlerB16-F10 hücrelerinin büyümesini, mitokondriye bağımlı Yol yoluyla apoptoz indükleyerek hem in vitro hem de in vivo inhibe eder. J Kanser 7: 1877-1887, 2016.
Brand-Williams W, Culver ME ve Berset C: Antioksidan aktiviteyi değerlendirmek için serbest radikal yönteminin kullanılması. LWT-Food Sci Technol 28: 25-30, 1995.
