Balıkçılık Endüstrisi Kalıntılarından Elde Edilen Ekstraktların Kozmesötik Potansiyeli: Sardalya Atıkları ve Morina Balığı Çerçeveleri Bölüm 1

Soyut: Balıkçılık endüstrisi büyük miktarlarda atık üretir (toplam yakalanan balık ağırlığının yüzde 20–75'i (a/a). Biyoaktif bileşiklerin kalıntılardan geri kazanılması ve kozmetikte kullanılması umut verici bir pazar fırsatı sunar ve sektörün sürdürülebilir bir şekilde değerlendirilmesine katkıda bulunabilir. Bu çalışmada, sardalya (Sardina pilchardus) atığı ve morina balığı (Gadus morhua) çerçevelerinden yüksek basınçlı teknolojilerle (süperkritik CO2 ve kritik altı su) elde edilen protein açısından zengin ekstraktlar, kozmesötik potansiyellerine göre karakterize edilmiştir. Antioksidan, antiinflamatuar ve antibakteriyel aktiviteler, kimyasal (ORAC tahlili), enzimatik (elastaz ve tirozinazın inhibisyonu), antimikrobiyal duyarlılık (Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus ve Cutibacterium acnes) ve hücre bazlı (keratinositlerde-HaCaT) tahlillerle değerlendirildi. . Sardalya ekstreleri en yüksek antibakteriyel aktiviteyi gösterdi ve daha yüksek ekstraksiyon sıcaklıkları (25{17}} ◦C) kullanılarak ve yağ giderme adımı olmadan elde edilen kısım en düşük minimum inhibitör konsantrasyon (MIC) değerlerini gösterdi (1.17; 4.6; {{24} Sırasıyla K. pneumoniae, S. aureus ve C. acnes için },59 mg/mL). Daha düşük sıcaklıklarda (90 ◦C) ekstrakte edilen morina balığı numuneleri en etkili anti-enflamatuar maddelerdi (0,75 mg/mL'lik bir konsantrasyon IL-8 ve IL-6 düzeylerini sırasıyla yüzde 58 ve yüzde 47 azalttı) , pozitif kontrole göre). Ekstrelerdeki treonin, valin, lösin, arginin ve toplam protein içeriğinin, bildirilen biyoaktivitelerle (R2 Büyük veya 0.7'ye eşit) yüksek oranda ilişkili olduğu vurgulanmıştır. Bu sonuçlar, balıkçılık endüstrisi atıklarından elde edilen ekstraktların biyoaktif aktivitelere sahip kozmetik ürünlerdeki potansiyel uygulamasını desteklemektedir.

Cistanche glikozidi ayrıca kalp ve karaciğer dokularında SOD aktivitesini artırabilir ve her dokudaki lipofuscin ve MDA içeriğini önemli ölçüde azaltabilir, çeşitli reaktif oksijen radikallerini (OH-, H₂O₂, vb.) etkili bir şekilde temizleyerek ve neden olduğu DNA hasarına karşı koruma sağlayabilir. OH radikalleri tarafından. Cistanche feniletanoid glikozitler, serbest radikalleri güçlü bir şekilde süpürme yeteneğine, C vitamininden daha yüksek bir indirgeme kabiliyetine sahiptir, sperm süspansiyonunda SOD aktivitesini geliştirir, MDA içeriğini azaltır ve sperm zarı işlevi üzerinde belirli bir koruyucu etkiye sahiptir. Cistanche polisakkaritleri, D-galaktozun neden olduğu deneysel olarak yaşlanmış farelerin eritrositlerinde ve akciğer dokularında SOD ve GSH-Px aktivitesini artırabilir, ayrıca akciğer ve plazmadaki MDA ve kollajen içeriğini azaltabilir ve elastin içeriğini artırabilir. DPPH üzerinde iyi bir temizleme etkisi, yaşlanmış farelerde hipoksi süresini uzatır, serumdaki SOD aktivitesini geliştirir ve deneysel olarak yaşlanmış farelerde akciğerin fizyolojik dejenerasyonunu geciktirir. Hücresel morfolojik dejenerasyonla, deneyler Cistanche'nin iyi antioksidan yeteneğe sahip olduğunu göstermiştir ve cilt yaşlanması hastalıklarını önleyen ve tedavi eden bir ilaç olma potansiyeline sahiptir. Aynı zamanda, Cistanche'deki ekinacoside, DPPH serbest radikallerini temizleme konusunda önemli bir yeteneğe sahiptir ve reaktif oksijen türlerini temizleme ve serbest radikal kaynaklı kollajen bozulmasını önleme yeteneğine sahiptir ve ayrıca timin serbest radikal anyon hasarı üzerinde iyi bir onarım etkisine sahiptir.

Cistanche Tubulosa Eki'ne tıklayın

【Daha fazla bilgi için:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

anahtar kelimeler: balık atık akışlarının değerlendirilmesi; antioksidan aktivite; anti-inflamatuar aktivite; Antimikrobiyal etkinlik; yaşlanma karşıtı; anti-hiperpigmentasyon; kozmetik

1. Giriş

Özellikle aktif bileşenler için sürekli yenilik arayışıyla kozmetik endüstrisi büyüyor ve doğal bileşiklere doğru ilerleyerek petrolden türetilen bileşenleri değiştirme niyetini gösterdi [1]. Doğal aktif bileşenlerin antioksidan özellikleri, oksidatif stres ve yaşlanmanın neden olduğu çeşitli cilt sorunlarının önlenmesine yardımcı olabilir [2,3]. Cilt yaşlanması hem içsel (inflamasyon veya telomer kısalması gibi) hem de dışsal (çevresel) faktörler tarafından indüklenebilir [4]. Cilt yaşlanması, olgun kollajen kaybına ve bariyer fonksiyonunu tehlikeye atan hücre dışı matriste (ECM) değişikliklere yol açarak kuru bir görünüme ve dış saldırganlara karşı duyarlılığa neden olarak cilt bozuklukları riskini artırır [5]. Bu süreç, elastazlar, matriks metaloproteinazlar (MMP'ler) ve ECM bozulmasını indükleyebilen hiyalüronidazlar gibi çeşitli enzimler tarafından hızlandırılabilir [6] veya hatta normal hücre fonksiyonunu tehlikeye atabilen kalıcı reaktif oksijen türlerinin (ROS) birikmesi ile hızlandırılabilir. [7]. UV radyasyonuna maruz kalma gibi çevresel faktörler, içsel yaşlanma ile aynı moleküler ve hücresel tepkileri indükleyen, ancak etkileri artırılmış yüksek miktarlarda ROS üretimine yol açar. Daha da önemlisi, ROS cilt yaşlanması veya cilt pigmentasyon süreçleriyle ilgili enzimlerin aktivitesini yoğunlaştırabilir [8,9] ve bu nedenle antioksidanların varlığı kozmetik alanında önemli bir rol oynar.

2018'de FAO tarafından dünya balık tüketiminin pide başına 20,5 kg olduğu tahmin ediliyor [10], bu da çoğunlukla deri ve kemik olmak üzere büyük miktarlarda yan ürünlere yol açıyor. Üretilen kalıntılar, potansiyel olarak çevre sorunlarına yol açan toplam yakalanan balık ağırlığının yüzde 20-75'ine (w/w) karşılık gelir [11,12]. Bununla birlikte, bu kalıntılar hala önemli miktarda lipit, protein ve mineral içerir ve yeterince değerlendirilmesi gerekir. Son yıllarda, balık endüstrisi tarafından üretilen atıklardan elde edilen ekstraktlar, antihipertansif, antioksidatif, antimikrobiyal, nöroprotektif, antihiperglisemik, anti-aging ve antiinflamatuar gibi aktif özellikler göstermiştir [13-19]. Atlantik morina balığı (Gadus rhea) ve sardalya (Sardina pilchardus), Portekiz'de en çok tüketilen balıklar arasındadır ve kalıntılarından elde edilen yollar, antioksidan, antiproliferatif veya antiinflamatuar aktiviteler gibi umut verici nutrasötik potansiyel göstermiştir [11,20–22]. Bununla birlikte, balık endüstrisi atıklarının sömürülmesi ve değerlendirilmesi henüz erken bir aşamada olduğundan, endüstrinin bu atığı kozmetik bileşenler de dahil olmak üzere yüksek değerli pazar biyoürünlerine dönüştürme fırsatlarını keşfetmek için bolca alan vardır.

Önceki çalışmada, sardalya atığından ve morina balığı çerçevelerinden biyoaktif fraksiyonları izole etmek için yüksek basınçlı teknolojilerin (süperkritik CO2 ve kritik altı su) kullanımını umut verici sağlık yararları ile araştırdık [11,22]. Sardalya atıkları için, süperkritik karbon (ScCO2) (lipid fraksiyonunu uzaklaştırmak için) ile bir ilk adım uygulayarak, ardından kritik altı su (SW) ile bir ekstraksiyon işlemi uygulayarak, yüksek antioksidan potansiyele ve antiproliferatif etkiye sahip protein hidrolizatları elde etmenin mümkün olduğunu gösterdik. kolorektal kanser hücreleri [22]. Morina balığı çerçevelerinden proteinler, peptidler ve amino asitle zenginleştirilmiş özler elde etmek için kritik altı su ekstraksiyonu/hidroliz de uyguladık ve daha düşük işleme sıcaklıklarının (90 ◦C) bir insan bağırsak epitel hücresinde anti-inflamatuar potansiyele sahip bileşiklerin ekstraksiyonuna yardımcı olduğunu gösterdik. modeli [11]. Morina balığı çerçeve özlerinde bulunan proteinlerin çoğu kolajen ve kolajen parçalarıdır. Diğer bileşikler, az miktarda lipit, kül ve bazı şekerleri içerir. Sardalya özleri peptitler ve amino asitler açısından zengindi ve lipitler, kül ve şekerler de mevcuttu. Balık kaynaklı proteinler ve peptitler kozmetik endüstrileri için önemli bir kaynak haline gelebileceğinden, bu çalışma, balık işleme atıklarından ve yan ürünlerden elde edilen bu ekstraktların kozmetik potansiyellerinin değerlendirilmesinden kaynaklanan aktif potansiyelini daha fazla değerlendirmeyi amaçlamaktadır [23]. . Bu amaçla, ekstrakte edilen numunelerin antioksidan, anti-aging, anti-hiperpigmentasyon, anti-enflamatuar ve antimikrobiyal etkilerini araştırmak için bir dizi kimyasal, enzimatik ve hücre bazlı analiz uygulandı. Kozmesötik potansiyele sahip ana biyoaktif bileşenleri belirlemek için korelasyon çalışmaları da yapılmıştır.

2. Malzemeler ve Yöntemler

2.1. reaktifler

3,4-dihidroksi-l-fenilalanin (L-DOPA), mantar tirozinazı, domuz pankreas elastazı (PPE) tip III, N-süksinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilit (AAAPVN), Tris ({ {11}}amino- 2-hidroksimetil-propan-1,3-diol), 2,20 -azobis (2-metilpropionamidin)dihidroklorür (AAPH) ve 20 ,70 -diklorofloresein diasetat (DCFH-DA), Sigma-Aldrich'ten (St. Louis, MO, ABD) satın alınmıştır. Kalsiyumu ayarlanmış Mueller Hinton suyu (CAMHB) BD'den (Sparks, MD, ABD) satın alınmıştır. Beyin-kalp infüzyonu (BHI) Avantor'dan (Radnor, PA, ABD) satın alınmıştır. AnaeroGen™ Kompakt poşetler, Oxoid'den (Hampshire, BK) satın alınmıştır. PrestoBlue™, Dulbecco's Modifiye Eagle Medium (DMEM), ısıyla inaktive edilmiş Fetal Sığır Serumu (FBS) ve Penisilin-Streptomisin, Invitrogen'den (San Diego, CA, ABD) temin edildi. İnsan ölümsüzleştirilmiş tümörijenik olmayan keratinosit hücre hattı HaCaT, Cell Line Service'den (Eppelheim, Almanya) elde edildi. İnsan IL-8 ve IL-6 Mini TMB ELISA Geliştirme Kitleri, Peprotech'ten (Londra, BK) temin edildi. Bu çalışmada kullanılan diğer tüm reaktifler ve çözücüler analitik saflıktaydı ve mevcut tedarikçilerden satın alındı.

2.2. Örnekler

Bu çalışmada kullanılan özler, süreç optimizasyonuna odaklanan önceki çalışmalarımızda geliştirilenlerdir [11,22]. Kısaca, morina balığı çerçeveleri Pascoal ve Filhos SA (Gafanha da Nazaré, Portekiz) tarafından sağlandı ve balık omurgası ve yapışık kastan oluşuyordu. Başlardan, dikenlerden ve iç organlardan oluşan sardalya atığı, Conservas A Poveira SA (Póvoa de Varzim, Portekiz) tarafından sağlandı. Kullanılan hammaddelerin yaklaşık bileşimi daha önceki çalışmalarımızda sunulmuştur [11,22]. Protein (ağırlıkça yüzde 47) ve kül (ağırlıkça yüzde 39), az miktarda lipit ve karbonhidrat (sırasıyla ağırlıkça yüzde 2 ve ağırlıkça yüzde 0,3 yüzde) ile morina balığı çerçevelerinin ana bileşenleriydi. Kolajen, morina balığı çerçevelerindeki ana protein olarak bulunur ve bu durumda, ca. Orijinal atığın toplam protein içeriğinin yüzde 65'i. Aksine, sardalya yağlı bir balıktır, bu nedenle atıkları lipitler açısından morina balığı çerçevelerinden çok daha zengindir. Sardalya atıkları, ağırlıkça yüzde 26'lık bir lipid içeriği ve ağırlıkça yüzde 52'lik bir protein içeriği gösterdi, geri kalanı kül (ağırlıkça yüzde 17) ve karbonhidratlardı (ağırlıkça yüzde 3).

Bu çalışma için seçilen morina balığı çerçevelerinden (Cf1, Cf2, Cf3 ve Cf4) ve sardalya atıklarından (S1, S2 ve S3) ekstraktlar, daha önce tarif edildiği gibi laboratuvar ölçekli bir cihazda yüksek basınç teknolojisi ile elde edildi [11,22 ,24] Tablo 1'de özetlenen koşullar kullanılarak. Kısaca, 60 g öğütülmüş morina balığı çerçeveleri veya sardalya atığı (yağı alınmış veya alınmamış), bir fırın içine yerleştirilmiş yüksek basınçlı bir reaktöre yüklendi. Su pompası istenilen debide (yaklaşık 10 mL/dak) çalıştırıldı ve basınç 100 bar olarak ayarlandı. Basınç bu değere ulaşır ulaşmaz elektrikli fırın çalıştırılarak deneye başlandı. Farklı ekstraktlar, farklı sıcaklıklarda (90–250 ◦C) 30 dakika süreyle toplandı. S1 ve S3 ekstraktları, SW ekstraksiyonundan önce sardalya atığının ScCO2 ile yağlanması işleminden sonra elde edildi. Kritik altı su çıkarma deneyleri iki kez tekrarlandı. Ekstre edilen her numune için, 25 mL üç kopya halinde alındı, liyofilize edildi ve karşılık gelen ekstraksiyon verimini hesaplamak için tartıldı. Analitik veriler - protein içeriği - üç kopyanın ortalama ± standart sapması (SD) olarak ifade edilir. Bu ekstraktların protein içeriği, amino asit profili, ana mineral bileşikleri veya toksik ve ağır metaller açısından karakterizasyonuna ilişkin bilgiler önceki çalışmalarımızda açıklanmıştır [11,22].

Cf1, Cf2, Cf3, Cf4 ve S2'nin stok çözeltileri, 100 mg/mL konsantrasyonda Milli-Q H2O içinde hazırlandı. Diğer numuneler, yani S1 ve S3, suda daha düşük çözünürlükleri nedeniyle DMSO'da (sırasıyla 300 ve 550 mg/mL) çözüldü. Örnekler donduruldu ve bir sonraki kullanıma kadar -20 ◦C'de tutuldu. Hücresel tahliller için numuneler önceden bir otoklavda (Tuttnauer 3870 el, Breda, Hollanda) ısıyla (121°C, 15 dakika) sterilize edilmiştir.

2.3. Oksijen Radikal Absorbans Kapasitesi (ORAC) Testi

Huang ve ark. [25], daha önce bildirildiği gibi bazı düzeltmelerle [26]. Kısaca, siyah bir 96-kuyulu mikroplaka içinde, 25 uL numune dilüsyonlarına 150 uL disodyum floresin (0,3 uM) ilave edildi ve 10 dakika 37°C'de inkübe edildi. Daha sonra reaksiyon, 25 uL 2,20 - Azobis (2-amidinopropan) dihidroklorür (AAPH, 153 mM) ve floresan (Örn/Em 485 ± 20/528 ± 20) ilave edilerek başlatıldı. nm) bir FLx800 floresan mikroplaka okuyucusunda (FL800 Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, ABD) 37 °C'de 40 dakika boyunca ölçülmüştür. 5, 10, 20, 30 ve 40 uM (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkroman-2- karboksilik asit (Trolox) kullanılarak standart bir eğri hazırlandı. )). Tüm çözeltiler, fosfat tamponlu salin (PBS), 75 mM, pH 7.4 içinde hazırlandı. Sonuçlar, ekstraktın gramı başına Trolox eşdeğeri antioksidan kapasitesinin mikromolleri olarak ifade edilir (µ mol TEAC/g ekstrakt).

2.4. Enzimatik Testler

2.4.1. Elastaz İnhibisyon Deneyi

Bu tahlil, Wittenauer ve ark.'nın çalışmasına dayanıyordu. [27], daha önce açıklandığı gibi bazı değişikliklerle [6]. Elastaz inhibe edici aktivite, enzim-substrat olarak domuz pankreatik elastazı (PPE) ve N-süksinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid (AAAPVN) kullanan bir spektrofotometrik yöntemle, 41{'de p-nitroanilin salınımı izlenerek belirlenir. {19}} nm. KKD, 100 mM Tris (2-amino-2-hidroksimetil-propan-1,3-diol)-HCl tamponunda (pH) çözüldü=8.0) 1 mg/mL'lik bir konsantrasyona kadar ve alikotlar halinde 20°C'de saklandı. Test gününde, bir kısım alındı ​​ve tampon içinde 0.03 U/mL'lik bir konsantrasyona seyreltildi, 10 uL, 100 uL Tris-HCl tamponu ve 30 uL ile birlikte mikrotitre plakalarının oyuklarına yüklendi. her örneğin 25°C'de 20 dakikalık ön inkübasyonun ardından reaksiyon, 40 uL substrat AAAPVN (0.55 mM) ilave edilerek başlatıldı. Absorbans, bir BioTek Instruments EPOCH 2 spektrofotometre mikroplaka okuyucusunda AAAPVN eklendikten sonra 20 dakika süreyle ölçüldü. Hesaplamalar, Denklem (1)'de açıklandığı gibi yapıldı; burada A kontrol ve Asample, sırasıyla numunenin yokluğunda veya varlığında 410 nm'de absorbansı temsil eder. S1 ve S3 numunelerini çözmek için DMSO kullanıldığından, bu çözücü ayrıca test edildi ve bu numuneler için bir kontrol olarak kullanıldı. Ekstraktların elastazı inhibe etme potansiyeli, doza bağlı ilişkileri belirlemek ve yarı maksimum inhibe edici konsantrasyonları (IC50) belirlemek için artan konsantrasyonlarla değerlendirildi; bu, her numunenin enzimatik aktivite inhibisyonundaki kapasitesini yüzde 50'ye kadar gösterir.

Tüm sonuçlar, en az üç bağımsız deneyden elde edilen yüzde 95'lik bir güven aralığının alt ve üst sınırları ile IC50 ortalama değerleri olarak ifade edilir.

2.4.2. Tirozinaz İnhibisyon Deneyi

Ekstraktların tirozinaz inhibe edici potansiyeli, substrat olarak mantar tirozinazı ve L-DOPA kullanılarak spektrofotometrik olarak değerlendirildi [28]. Tirozinaz, L-DOPA'yı, dopakrom oluşturmak için sırayla siklize olacak olan dopakinona dönüştürür. Dopakrom oluşumu, 475 nm'de absorbans ölçülerek gözlemlenebilir. Substrat, 30 U/mL tirozinaz ve 2.5 mM L-DOPA nihai konsantrasyonuna numune dilüsyonlarının varlığında enzime ilave edildi. S1 ve S3 numunelerini çözmek için DMSO kullanıldığından, bu çözücü ayrıca test edildi ve bu numuneler için bir kontrol olarak kullanıldı. 37 °C'de 30 dakika inkübasyondan sonra, bir BioTek Instruments EPOCH 2 mikroplaka spektrofotometresi üzerinde 475 nm'de absorbans ölçüldü. Tüm reaktifler, sodyum fosfat dibazik dihidrat ve sodyum fosfat monobazik monohidrat karıştırılarak hazırlanan sodyum fosfat tamponunda (SPB; 0.1 M, pH 6.8) hazırlandı ve denklem (1)'de açıklandığı gibi hesaplamalar yapıldı. Tüm sonuçlar, en az üç bağımsız deneyden elde edilen, yüzde 95'lik bir güven aralığının alt ve üst sınırları ile IC50 ortalama değerleri olarak ifade edilir.

2.5. Antimikrobiyal Duyarlılık Testi

Antibakteriyel aktivite deneyleri için seçilen hedef mikroorganizmalar, gram-negatif bakteriler Klebsiella pneumoniae CECT 8453 ve gram-pozitif bakteriler Staphylococcus aureus ATCC 6538 ve Cutibacterium acnes ATCC 6919T idi. K. pneumoniae CECT 8453 ve S. aureus ATCC 6538 için deneyler, daha önce Rodrigues ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi CLSI M07-A10 yönergelerinin sıvı mikrodilüsyon yöntemine göre yapıldı. [29]. Kısacası, ekstrakt stok solüsyonları yuvarlak dipli bir mikrotiter kuyu plakasına dağıtıldı ve 2-kat, kalsiyumla ayarlanmış Mueller Hinton suyu içinde (CAMHB; BD, Sparks, MD, ABD) seri olarak seyreltildi ve bir çözeltilerin konsantrasyon aralığı. Aşı, salin solüsyonunda homojen bir süspansiyon elde etmek için büyüme yöntemi kullanılarak hazırlandı. Ayarlanan inokulum, aşılamayı takiben her kuyucuğun yaklaşık 5 x 104 CFU içerdiğini garanti etmek için CAMHB içinde ilave olarak seyreltildi. Plakalar, aerobik koşullar altında 37 ◦C'de 16 ila 20 saat süreyle inkübe edildi. C. acnes için analizler daha önce tarif edildiği gibi CAMHB yerine beyin-kalp infüzyonu (BHI) (Avantor, Radnor, PA, ABD) suyu kullanılarak ve mikrotiter plakaları 70-74 saat 37 ° C'de inkübe edilerek gerçekleştirildi. C atmosfer oluşturma sistemi AnaeroGen™ Compact (Oxoid, Hampshire, BK) içeren anaerobik kavanozlarda.

Analiz edilen her bir stok solüsyonu için, bir pozitif kontrol (CAMHB veya BHI ve seyreltilmiş inokulum), bir orta sterilite kontrolü (aşılanmamış CAMHB veya BHI) ve bir ekstrakt sterilite kontrolü (CAMHB veya BHI içinde aşılanmamış 2-kat ekstrakt stok solüsyonu) doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. Minimum inhibe edici konsantrasyon (MIC) değerleri, inkübasyondan sonra mikrobiyal büyümeyi gözle görülür şekilde inhibe eden bir numunenin en düşük konsantrasyonuydu. Gerektiğinde, üreticinin yönergeleri izlenerek hücre canlılığı reaktifi PrestoBlue™ (Invitrogen, San Diego, CA ABD) kullanılarak MİK değerleri doğrulandı. MIC* olarak adlandırılan ek bir MIC değeri de belirlendi ve bakteri üremesinin pozitif kontrole kıyasla görsel olarak ve farklı şekilde etkilendiği bir numunenin en düşük konsantrasyonu olarak tanımlandı. Minimum bakterisidal konsantrasyon (MBC) değerleri, ilk inokuluma kıyasla ve eşit inkübasyon süresi için canlı bakteri sayısında en az yüzde 99,9 azalmaya yol açan bir numunenin en düşük konsantrasyonu olarak rapor edildi. Sonuçlar, üç biyolojik kopyadan sonra elde edilen değerlerin medyanı olarak ifade edildi. DMSO, S1 ve S3 numunelerini çözmek için kullanıldığından, bu solvent, kullanılan nihai konsantrasyonun hedef mikroorganizmayı, dolayısıyla tahlili etkilemediğinden emin olmak için de test edildi.

2.6. Hücre Bazlı Testler

2.6.1. Hücre kültürü

İnsan keratinosit hücre dizisi HaCaT (CLS, Almanya), yüzde 10 (v/v) fetal sığır serumu (FBS) ve yüzde 1 (v/v) penisilin-streptomisin ile desteklenmiş standart bir Dulbecco Modifiye Eagle Ortamında (DMEM) kültürlendi. Hücreler rutin olarak 75 cm2'lik kültür şişelerinde tek tabakalar halinde tutuldu ve 37°C'de yüzde 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edildi.

2.6.2. Vitro Sitotoksisite

Sitotoksisite deneyleri önceki çalışmalara göre yapılmıştır [6]. Kısaca HaCaT hücreleri, 96 oyuklu plakalara 1.4 x 105 hücre/cm2 yoğunlukta ekildi. 3 gün sonra, hücreler her numunenin farklı konsantrasyonları ile inkübe edildi (Cf1; Cf2; Cf3; Cf4; S2—50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56, {{30}) },78, 0,39; S1—3, 1,5, 0,75, 0,38, {{40}},19, {{51 }}.{53}}9, 0.05, 0.02; S3—5.5, 2.75, 1.38, 0.69, 0.34, 0.17, 0,09, 0,04 mg/mL) kültür ortamında (yüzde 0,5 FBS içeren DMEM ortamı) seyreltildi. Kontrol olarak yalnızca yüzde 0.5 (v/v) FBS ile desteklenmiş kültür ortamı ile inkübe edilmiş hücreler içeren kuyucuklar kullanılmıştır. Bir kültür ortamında yüzde 50 su veya yüzde 1 DMSO içeren çözücü kontrolleri de çözücü toksisitesini ortadan kaldırmak için yapıldı. 24 saatlik inkübasyonun ardından hücre canlılığı, üreticinin talimatlarına göre 2 saat 37°C'de, yüzde 5 CO2'de PrestoBlue® (kültür ortamında yüzde 5 v/v) kullanılarak değerlendirildi. Bundan sonra her kuyucuğun floresansı bir FLx800 floresan mikroplaka okuyucusunda (BioTek Instruments, Winooski, VT, ABD) ölçüldü (Örn./Em. 560 ± 20/590 ± 20 nm). Hücre canlılığı, kontrole göre canlı hücrelerin yüzdesi olarak ifade edildi. Üç kopya halinde üç bağımsız deney yapıldı.

2.6.3. Hücresel Antioksidan Aktivite

Hücresel antioksidan aktivite, bazı modifikasyonlarla daha önce açıklanan yöntemler [6,30] izlenerek değerlendirildi. Kısaca, HaCaT hücreleri, 96 oyuklu plakalarda 1,4 x 105 hücre/cm2 yoğunlukta ekildi ve hücre içi ROS oluşumu, 20,70 -diklorofloresein diasetat ( DCFH-DA) floresan prob olarak. Tohumlamadan 72 saat sonra, hücreler PBS ile yıkandı ve numunelerin toksik olmayan konsantrasyonları (0.1875 mg/mL; 0.375 mg/mL; 0.75 mg/mL) artı 25 uM DCFH-DA ile PBS içinde 1 saat süreyle inkübe edildi. Daha sonra, hücreler tekrar PBS ile yıkandı ve stres indükleyici (PBS içinde 600 uM AAPH) ile 1 saat süreyle inkübe edildi. Bundan sonra, floresan bir FL800 mikroplaka floresan okuyucusunda (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, ABD) (Ex/Em 485 ± 20/528 ± 20 nm) ölçüldü. Sonuçlar, işlenmemiş kontrole (DCFH-DA ve AAPH ile işlenmiş hücreler) göre ROS yüzdesi olarak ifade edilir. Üç kopya halinde üç bağımsız deney yapıldı.

2.6.4. IL-6 ve IL-8 Salgısının Değerlendirilmesi

Deneyler, daha önce tarif edildiği gibi [31] birkaç modifikasyonla yapıldı. Kısaca HaCaT hücreleri, 12 oyuklu plakalarda 1 x 105 hücre/cm2 yoğunlukta ekilmiştir. 3 gün sonra hücreler, Escherichia coli'den alınan 15 ug/mL lipopolisakarit (LPS) ile uyarıldı ve her özütten ({{10}}.1875 mg/mL; {{ 14}}.375 mg/mL; 0.75 mg/mL) kültür ortamında (yüzde 0.5 FBS içeren DMEM ortamı) seyreltilmiştir. Sadece LPS ile inkübe edilen hücreler ve sadece kültür ortamı ile inkübe edilen hücreler sırasıyla pozitif ve negatif kontroller olarak kullanıldı. 24 saat sonra süpernatanlar toplandı, 10 dakika 2000 g'de santrifüjlendi ve sonraki analizlere kadar -80 ◦C'de saklandı. IL-6 ve IL-8 seviyeleri, ticari olarak temin edilebilen kitler (PeproTech; London, UK) kullanılarak, üreticinin talimatlarına göre, 450 nm'de absorbans ölçülerek enzim bağlantılı immünosorbent testi (ELISA) ile değerlendirildi. bir mikroplaka spektrofotometrede (EPOCH 2, BioTek Instruments, Winooski, VT, ABD) 620 nm'ye ayarlanmış dalga boyu düzeltmesi ile. Sonuçlar, pozitif kontrole (LPS ile uyarılan hücreler) göre IL-6 veya IL-8 yüzdesi olarak ifade edilir. Üç kopya halinde üç bağımsız deney yapıldı.

2.7. İstatistiksel analiz

ORAC ve hücre bazlı tahlil sonuçları, en az üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama değer ± SD olarak ifade edilir. Enzimatik ve sitotoksisite analizleri için IC50 değerleri, GraphPad Prism 8.4.3 kullanılarak log10 grafikleri aracılığıyla doz-yanıt eğrilerinden belirlendi. yazılımı (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, ABD). Sonuçlar, yüzde 95 güven aralığı ile IC50 olarak sunulur. Sonuçların istatistiksel analizi eski yazılım kullanılarak yapıldı. Verilerin homojen varyansı ve normal dağılımı doğrulandığında, sonuçlar tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından çoklu karşılaştırmalar için Tukey testi ile analiz edildi. Heterojen varyanslar durumunda veya verilerin normal dağılmaması durumunda, ortalamaların önemli ölçüde farklı olup olmadığını belirlemek için uygun bir eşleştirilmemiş Student t-testi yapıldı. 0,05'e eşit veya küçük bir p değeri, tüm durumlarda istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Antimikrobiyal duyarlılık testi sonuçları, en az üç bağımsız deneyden elde edilen medyan değer olarak ifade edilir.

3. Sonuçlar ve tartışma

This study aims to investigate the cosmeceutical potential of protein-rich extracts that were produced by high-pressure technologies from fishery industry wastes, namely sardine wastes and codfish frames [11,22]. The selection of extracts was based on previous results regarding their characterization and process conditions. For codfish, all extracts were selected aiming at evaluating the impact of the extraction temperature on the recovery of compounds with promising bioactive effects on the skin. For sardine extracts, only three extracts derived from both defatted and non-defatted raw materials, processed at higher temperatures (190  and 250 ◦C) and with the highest extraction yield (>45,7 g/100 g) seçildi. Her özütün toplam protein içeriğine ilişkin sonuçlar Tablo 1'de sunulmuştur.

3.1. Antioksidan, Yaşlanma Karşıtı ve Hiperpigmentasyon Önleyici Aktiviteler

Ekstraktların potansiyel kozmesötik etkisi başlangıçta antioksidan, anti-aging ve anti-hiperpigmentasyon etkilerini değerlendirmek için kimyasal ve enzimatik deneyler kullanılarak tarandı. Antioksidan kapasite için, numunelerin biyolojik olarak ilgili ROS'u, yani cilt yaşlanmasının ana indükleyicilerinden biri olarak kabul edilen peroksil radikallerini temizleme yeteneğini ölçtüğü için ORAC testi seçildi [2,32]. Bu enzimin elastin ve diğer ECM proteinlerinin parçalanmasından sorumlu olduğu bildirildiğinden, yaşlanma karşıtı etki elastaz inhibisyonu yoluyla da değerlendirilmiştir [6]. Anti-hiperpigmentasyon etkisi için, numunelerin melanin üretimini engelleme kapasitesini değerlendirmek üzere tirozinaz tahlili kullanıldı. Tablo 2, tüm özütlerin ORAC ve IC50 değerlerini özetlemektedir.

Sonuçlarımız, sardalya ve morina balığı özlerinin, antioksidan aktivite ve elastaz ve tirozinaz enzimlerinin aktivitesi üzerinde inhibisyon etkileri gösterdiğini göstermektedir. Sardalya numuneleri arasında S1 en yüksek ORAC değerini (1.94 ± 0.08 µmol TEAC/mg özü) gösterdi, ardından S3 ve S2 geldi. Bu sonuçlar, S1 özütünün en düşük IC50 değerlerini sunduğu alternatif bir yöntem (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil-DPPH testi) aracılığıyla daha önce yapılan bir antioksidan değerlendirmesidir [22]. S1 numunesinin peroksil radikallerine karşı daha yüksek süpürme kapasitesi, ekstraktlarda bulunan farklı amino asit dizilerine sahip peptitlerden elde edilebilir, çünkü aralarındaki etkileşimler radikal süpürme kabiliyetini etkileyebilir [33]. Ek olarak, Maillard veya diğer termo-oksidasyon reaksiyonlarında üretilen bileşikler, numunelerin antioksidan aktivitesini etkileyebilir [34]. En düşük ORAC değerine rağmen, S2 ve S3 numuneleri, sırasıyla tirozinaz ve elastaz aktivitelerini inhibe etmede en yüksek kapasiteye sahip numunelerdi.

Morina balığı ekstraktları arasında Cf4'ün en yüksek antioksidan ve antihiperpigmentasyon aktivitelerine sahip olduğu gösterilmiştir. Ekstraktların SEC-GPC analizi, ekstraksiyon sıcaklığı 250 ◦C'ye yükseltildiğinde moleküler ağırlığı azalan peptitlerin elde edildiğini göstermiştir [11]. Bu numunenin elastaz önleme kapasitesi, diğer Cf özleri, yani Cf1 ve Cf3 için bulunan değerler aralığındadır. Bununla birlikte, test edilen konsantrasyonlar için bu iki ekstrakt, tirozinaza karşı herhangi bir inhibisyon aktivitesi göstermedi.

Literatürde, deniz yan ürünlerinden elde edilen ekstraktların ilgili antioksidan aktivite ve tirozinaz inhibisyonu gösterdiğini gösteren bazı raporlar bulunmaktadır. Örneğin deniz (Scophthalmus maximus) yan ürünlerinden alkalin hidrolizle elde edilen ekstraktlar, farklı kimyasal deneylerle erişilen antioksidan aktivite göstermiştir: 1,1-difenil-2- pikrilhidrazil (DPPH) radikal süpürme yeteneği ( kontrol hakkında yüzde 36,12), ABTS (2,20 -azinobis-(3-etil-benzotiazolin-6-sülfonik asit) yöntemi (12,81 µg BHT/mL) ve krosin ağartma testi (8.{ {28}}3 µg Trolox/mL) [35].Başka bir çalışmada, şapla tuzlanmış denizanasının (Lobonema smithii) enzimatik ekstraksiyonunun yüksek antioksidan aktiviteye (IC{{20}}) sahip hidrolizatlar ürettiği gösterildi. ABTS e DPPH tahlilleri için 9 mg/mL) ve tirozinaz inhibe edici potansiyel, IC5{36}} değerleri 14,1 ile 24,5 mg/mL [36] arasında olup, bunlar bu çalışmada elde edilenlerle aynı büyüklük sırasına sahiptir • Ek olarak, benzer antioksidan değerlerine sahip özler (ORAC değerleri – 0.4 ila 3.5 µmol TEAC/mg özü), başka bir tür gıda endüstrisi kalıntısından, yani şarap yapımı atık akışlarından elde edilmiştir [6]. Bununla birlikte, bu şaraphane kalıntıları özleri, muhtemelen fenolik bileşiklerin varlığından dolayı, bu çalışmada elde edilenlerden daha yüksek tirozinaz (IC50 - 4,0 ila 0,14 mg özüt/mL) ve elastaz (IC50, 3,4 ila 0,1 mg özü/mL) önleme kapasiteleri sergiledi. birkaç biyoaktiviteye sahip olduğu kabul edilmektedir. Çalışmamızda ekstraktların anti-hiperpigmentasyon etkisini taramak için mantar tirozinazını kullandığımızı belirtmek önemlidir, çünkü bu enzim yüksek verimli deneylerde yaygın olarak kullanılmaktadır [37]. Yine de, bu enzimin memeli/insan tirozinazı ile benzerliği ve homolojisi ile ilgili bazı tartışmalar olduğundan [38-40], sardalya ve morina balığı ekstraktlarının potansiyel anti-hiperpigmentasyon etkisini değerlendirmek için gelecekte memeli hücre hatlarını içeren çalışmalar düşünülmelidir.

Ekstrelerin biyoaktif tepkisinden hangi bileşiklerin sorumlu olabileceğini belirlemek için, biyoaktivite verileri ile daha önce [11,22] bildirilen ekstrelerin amino asit bileşimi arasındaki korelasyon çalışmaları yapıldı (Tablo S1). Antioksidan aktivite için, tüm özler için ORAC değeri ile toplam treonin, serbest valin ve ayrıca serbest ve toplam lösin arasında en yüksek korelasyonlar (R2 Büyük veya eşit 0.7) elde edildi. Sardalya örnekleri durumunda, serbest ve toplam triptofan içeriği için de yüksek bir korelasyon (R2 Büyük veya eşit 0.94) elde edildi. Buna göre, tüm bu amino asitlerin daha önce çeşitli model sistemlerde antioksidan özelliklere sahip olduğu bildirilmiştir [41-43]. Elastaz ve tirozinaz inhibisyon aktiviteleri için, toplam protein içeriği ve serbest arginin için en yüksek korelasyon katsayıları (R2 Büyük veya eşittir 0.8) elde edildi, bu bileşiklerin potansiyelde önemli bir role sahip olabileceğini düşündürdü. balık endüstrisi atık akışlarının anti-aging ve anti-hiperpigmentasyon etkisi.

【Daha fazla bilgi için:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】