Escherichia Coli'de Tasarlanmış Tek Kılavuzlu RNA ile Gen İfade Düzeyinin CRISPRi Aracılı Ayarlanabilir Kontrolü

SOYUT

Precise control of gene expression is essential for flux redistribution in metabolic pathways. Although the CRISPR interference (CRISPRi) system can effectively repress gene expression at the transcriptional level, it has still been difficult to precisely control the level without loss of specificity or an increase in cell toxicity. In this study, we developed a tunable CRISPRi system that performs transcriptional regulation at various levels. We constructed a single-guide RNA (sgRNA) library targeting repeat, tetraloop, and anti-repeat regions to modulate the binding affinity against dCas9. Each screened sgRNA could regulate the gene expression at a certain level between fully repressing and nonrepressing states (>45-katlayın). Bu sgRNA'lar ayrıca çeşitli hedef DNA dizileriyle modüler düzenlemeyi de mümkün kıldı. Tahmin edilebilir bir oranda viyolasin türevleri üretmek ve likopen üretimini optimize etmek amacıyla metabolik akışı yeniden dağıtmak için bu sistemi uyguladık. Bu sistem, metabolik mühendislik ve sentetik biyolojideki akış optimizasyon süreçlerinin hızlandırılmasına yardımcı olacaktır.

cistanche tubulosa-bağışıklık sistemini iyileştirir

Cistanche Enhance Immunity ürünlerini görüntülemek için buraya tıklayın

【Daha fazlasını isteyin】 E-posta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

GİRİİŞ

Tip II Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR)/CRISPR ile ilişkili (Cas) sistemi, CRISPR RNA (crRNA), trans-aktive edici CRISPR RNA (tracrRNA) ve bir Cas9 proteininden oluşan RNA kılavuzlu bir DNA bölünme sistemidir (1) ,2). Streptococcus pyogenes'ten Cas9, iyi karakterize edilmiş özellikleri nedeniyle genom mühendisliğinde yaygın olarak kullanılmaktadır (3,4). SpCas9 proteini, tracrRNA ve crRNA'dan oluşan kompleks, 5'-NGG-3' protospacer bitişik motifinin (PAM) varlığında crRNA'nın 20 nükleotidlik (nt) spacer sekansına tamamlayıcı olan hedef DNA protospacer'ı bağlar ve ayırır. ) dizisi (5,6). Sistemi basitleştirmek için crRNA ve tracrRNA'nın tetraloop adı verilen yapay bir bağlayıcıyla birleştirildiği kimerik tek kılavuz RNA (sgRNA) kullanılabilir (5). İki ayrı RNA'nın tek bir RNA molekülüyle değiştirilmesine olanak tanıyarak sistemi daha yönetilebilir hale getirir. CRISPR tabanlı sistemlerden biri olan CRISPR girişimi (CRISPRi), her bir endonükleaz alanından belirli amino asitleri değiştirerek katalitik olarak aktif olmayan Cas9'u (dCas9) kullanır (7). Bu modifikasyon, hedef DNA'yı yönlendirebilen ve ona bağlanabilen bir ribonükleoprotein (RNP) kompleksi oluşturur ve transkripsiyonun başlatılmasını veya uzamasını engellemek için RNA polimerazına (RNAP) müdahale eder (7). CRISPR/Cas9 sistemiyle yapılan nakavtın aksine, CRISPR, indüklenebilir bir promotör altında dCas9 veya sgRNA'yı eksprese ederek genlerin tersine çevrilebilir şekilde yıkılmasına olanak tanır ve gen regülasyonunda daha fazla esneklik sağlar (7). CRISPRi sistemi hedef genleri etkili bir şekilde yüzlerce kat susturmuştur (7,8). Hedefe özgü gen baskısı, genom çapında bir sgRNA havuzu (9) kullanarak yüksek verimli fenotiplemeye olanak tanır veya tasarlanmış bakterilerdeki karbon akışını hedef kimyasala (10-12) yönlendirir. Ek olarak, multipleks CRISPRi'nin çeşitli konaklarda, uzun crRNA dizileri, tutunma anahtarı entegrasyonu ve tekrarlamayan ekstra uzun sgRNA dizileri dahil olmak üzere birden fazla sgRNA'yı stabil bir şekilde eksprese etmek için çeşitli yöntemler kullanılarak gösterilmiştir (13-16). Birden fazla genin eşzamanlı olarak engellenmesine yönelik bu teknikler, toksik ara maddelerin azaltılması veya bakteriyel fermantasyondaki rakip yolların bloke edilmesi gibi daha karmaşık görevleri gerçekleştirmek için kullanılmıştır (13,16-19). Ancak metabolik mühendislik için tam baskı her zaman arzu edilen bir durum değildir. Büyüme ve üretim yolları arasında optimal enzim aktivitesinin elde edilmesi, hücre içi öncül konsantrasyonlarının dengelenmesi ve toksik ara maddelerin birikmesinin önlenmesi için gen ekspresyon düzeyleri tam olarak kontrol edilmelidir (20-22). CRISPRi'nin baskılama verimliliğini artırmak için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. SgRNA ve dCas9 proteininin miktarı veya sgRNA seçimi gibi çeşitli faktörler manipüle edildi. dCas9 ekspresyonunun veya hem dCas9 hem de sgRNA ekspresyonunun, uyarılabilir bir promoter kullanılarak kontrol edilmesi, hedef gen ekspresyonunu sırasıyla 30- kat veya 300- kattan daha fazla bir oranda düzenler (23,24). Ancak dCas9 konsantrasyonunun modüle edilmesinin, farklı protospacer'larda tutarsız bastırma verimliliğine yol açabileceği gözlemlenmiştir (23). Mevcut uyarılabilir promotörlerin sınırlı sayıda olması, birçok çabaya rağmen tasarım zorlukları da yaratmaktadır (25). Diğer bir strateji ise liganda özgü bir RNA aptamerinin sgRNA'ya yerleştirilmesidir; burada küçük bir aynı kökenli molekül aralayıcıyı açığa çıkarabilir ve böylece CRISPRi'nin doza bağlı kontrolünü mümkün kılar (26). Uygun bir ligand ve aptamer çifti mevcutsa liganda özgü sgRNA faydalıdır. Transkripsiyonun başlangıç ​​bölgesine olan mesafe ve dCas9 bağlanma yönü de CRISPRi'nin etkinliğini etkilemektedir (7). SgRNA bağlanma bölgesi ile transkripsiyon başlangıç ​​bölgesi arasındaki mesafenin ayarlanması, metabolik mühendislikte yolu optimize edebilir (17,27,28). Spacer ve protospacer dizileri arasındaki hibridizasyon etkinliği aynı zamanda RNP kompleksi bağlanma etkinliğini de değiştirir (29-31). Bu nedenle, serbest enerjiyi değiştirmek için tohum bölgesi dışında tasarlanan uyumsuzluklar, CRISPRi verimliliğini çeşitlendirmek amacıyla uygulamaya konmuştur (31,32). Bununla birlikte, her yeni hedef dizi için sgRNA'nın tasarlanması gerekir ve yalnızca bir uyumsuzluk nedeniyle serbest enerjide önemli bir fark elde etmek zor olabilir. Ayrıca hedef dışı bağlanmanın artma olasılığı da vardır (33). Bununla birlikte, hedef diziden bağımsız olarak çoklu gen ekspresyonlarının modüler bir şekilde tam olarak bastırılmasıyla sınırlıdır. Bu çalışmada gen ifadesini yüksek hassasiyet ve öngörülebilirlikle düzenleyen, ayarlanabilir bir CRISPRi sistemi geliştirdik. Tetraloop'u ve onun yan bölgesini hedef alan sgRNA kitaplığının yinelemeli floresans bazlı hücre sıralamasıyla, hedef DNA değiştirildiğinde bile 45-kata kadar transkripsiyonel baskı verimliliği elde ettik. Bu sistem, konak genomunu veya sentetik yolları manipüle etmeden metabolik akışın öngörülebilir yeniden dağıtımına izin vererek metabolik yolları optimize etmek için umut verici bir araç sağlar.

MALZEMELER VE YÖNTEMLER

Bakteriyel suşlar, plazmitler ve reaktifler

Bu çalışmada kullanılan Escherichia coli suşları ve plazmidler Ek Tablo S1'de listelenmiştir. Bu çalışmada kullanılan primerler Ek Tablo S2'de listelenmiştir. Klonlama prosedürleri ek yöntemlerde açıklanmaktadır. CRISPR sistemi için hedef genler ve bunların hedef DNA dizileri Ek Tablo S3'te gösterilmektedir. Genel klonlama için Mach1-T1R kullanıldı. Kitaplık, NEB 5-alfa Electrocompetent E. coli (NEB) kullanılarak oluşturulmuştur. Plazmid ve suşların oluşturulmasına yönelik rutin kültürler, Luria-Bertani (LB) sıvı besiyerinde veya uygun antibiyotikler (34 g/ml kloramfenikol, 50 g/ml spektinomisin) içeren bir LB agar plakası üzerinde 37°C'de gerçekleştirildi. PCR, Q5® Yüksek Kaliteli DNA Polimeraz (NEB) kullanılarak gerçekleştirildi. Plazmitler ve PCR ürünleri, GeneAll® Exprep™ Plasmid SV Kiti ve Gel SV Kiti (GeneAll Biyoteknoloji) kullanılarak saflaştırıldı. SgRNA mutantlarının baskılama etkinliği Gecelik kültür ortamı, 0.05'in OD600'sine yenilendi ve 0,6 ile 0,8 arasında bir değere ulaşana kadar inkübe edildi. Kültür ortamı daha sonra 20 ng/ml aTc ile OD600 değeri 0,05'e seyreltildi ve 4 saat süreyle inkübe edildi. Tek bir koloninin floresansı, bir Hidex Sense mikroplaka okuyucu (Hidex) kullanılarak 575 nm/616 nm'de ölçüldü ve OD600 değeri, Jenway 7300 spektrofotometre (Jenway) kullanılarak belirlendi. Bağıl floresans, PC değeri %100 olarak ayarlanarak, OD600 değeri başına floresans birimi olarak hesaplandı.

Cistanche tubulosa'nın Etkileri-kabızlığı tedavi eder

sgRNA kütüphane taraması

Yukarıda açıklananla aynı kültürel yöntem kullanıldı. Kültür ortamı [hücre]'ye seyreltildi<10−7 cells/ml in PBS buffer (pH 7.4). The fluorescence distribution was obtained from 100,000 cells from each sample using S3e Cell Sorter (Bio-Rad), and 5000 cells for each fluorescence range were sorted in each iteration. Cells were overnight cultured in fresh media for the next iteration. Samples were obtained after the final iteration and spread to the LB agar plate. Each colony was inoculated into 100 l of LB media and overnight cultured in 96-well microplate shaking at 900 rpm by Hidex Sense microplate reader (Hidex). Overnight culture media was refreshed by diluting 3 l culture media in 97 l fresh media and incubated for 2 h. Culture media was re-diluted by mixing 6 l culture media with 94 l fresh media, and aTc was added. The fluorescence of every single colony was obtained at 575 nm/616 nm by Hidex Sense microplate reader (Hidex) after 6 h of incubation. The OD600 value from the microplate reader was converted to the OD600 value from the spectrophotometer.

RNA ekstraksiyonu

Toplam RNA, RNeasy Mini Kit (Qiagen) kullanılarak yalnızca sgRNA ölçümü için miRNeasy Mini Kit (Qiagen) kullanıldığında, RNAprotect Bakteri Reaktifi (Qiagen) ile muamele ve –80◦C'de saklama sonrasında ekstre edildi. Ekstraksiyon işlemi sırasında RNaz İçermeyen DNaz Seti (Qiagen) kullanılarak kolon üzerinde DNA sindirimi gerçekleştirildi. DNA kontaminasyonu ters transkripsiyon olmadan PCR yoluyla doğrulandı. Her numunenin konsantrasyonu ve saflığı bir NanoDrop One (Thermo Scientific) kullanılarak belirlendi ve kalite, bir LabChip GX Touch 24 (PerkinElmer) üzerinde bir DNA 5K/RNA/CZE 24 LabChip (PerkinElmer) kullanılarak değerlendirildi.

cistanche tubulosa-bağışıklık sistemini iyileştirir

RT-qPCR analizi

RT-qPCR için primerler ya laboratuvar stoklarından temin edildi ya da Primer3Plus aracı (34) kullanılarak tasarlandı ve Ek Tablo S4'te listelendi. CysG geni, tüm RT-qPCR deneyleri için referans gen (35) olarak kullanıldı. Bir şablonun 107 kopya/l'den 10−1 kopya/l'ye 10-kat seyreltilmesiyle standart bir eğri oluşturuldu. Kantifikasyon sınırı, kopya numarasının ve pozitif amplifikasyon oranının bir sigmoid fonksiyonuna uydurulması ve %95 pozitif kopya numarası değerinin hesaplanmasıyla belirlendi. Doğrusal dinamik aralık, geriye doğru hesaplanan Cq değişiminin %35'ten az olduğu en düşük kopya sayısı olarak tanımlandı. 30'un üzerindeki Cq değerleri veya şablon dışı kontrolde çoğaltılmayanlar doğrulandı. Standart eğri verileri Ek Tablo S5 ve Ek Şekil S1'de mevcuttur. Luna® Universal Tek Adımlı RT-qPCR Kiti (NEB) ile 10 l RT-qPCR reaksiyonunda toplam 2,5 ng toplam RNA kullanıldı. RT-PCR, StepOnePlus™ RealTime PCR Sisteminde (Applied Biosystems) üç kopya halinde aşağıdaki adımlarla gerçekleştirildi: (i) 55◦C'de 10 dakika boyunca ters transkripsiyon, ardından 95◦C'de 1 dakika boyunca denatürasyon; (ii) 95◦C'de 10 saniye ve 60◦C'de 1 dakika boyunca 40 termal döngü; (iii) 95◦C'de 15 saniye ve 60◦C'de 1 dakika boyunca erime eğrisi analizi, ardından 0,3◦C/dakika hızında 60◦C'den 95◦C'ye bir rampa. RNA'nın bağıl niceliği delta-deltaCt yöntemi (36) kullanılarak belirlendi ve StepOnePlus™ Yazılımı (Applied Biosystems) ile analiz edildi.

RNA dizilimi (RNA dizilimi) ve veri analizi

1.5 in biological duplicate. Total RNA was extracted by the abovementioned method, and ribosomal RNA (rRNA) was depleted using Ribo-Zero plus rRNA Depletion Kit (Illumina). cDNA libraries were constructed using KAPA Stranded RNA-Seq Kits (Kapa Biosystems), with an additional size-selection step using AMPure XP (Beckman Coulter). Adapters and primers used in this study are listed in Supplementary Table S2. The concentration was measured using a Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Scientific), and the size distribution of the cDNA was measured using X-Mark LabChip (PerkinElmer) on the LabChip GX Touch 24 instrument. The average cDNA length ranged from 390 to 450 bps. RNA-Seq was performed as >19M reads of 41 bp paired-end using NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 Cycles) (Illumina) on NextSeq 550 (Illumina). Data analysis was performed using the reference genome of E. coli BL21(DE3) complete genome (Genbank CP001509.3) with FastQC (v0.11.9) (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) (37), Bowtie (v1.2.3) (38) with trim3 option value of 3, samtools (v1.10) (39), and cufflinks (v2.2.1) (40,41). All samples between replicates had R2 >{{0}}.92, FPKM'ye (Haritalanmış Milyon okuma başına transkriptin Kilobaz Başına Parça Sayısı) dayanmaktadır. Diferansiyel olarak ifade edilen genler, 1,5 (log2-tabanlı) ve 0,01 (q-değeri) eşiğinden elde edildi.

Proviolacein ve prodeoksiviolacein üretimi ve örneklemesi

Violasin ve prodeoksiviolasein üretimi için aşağıdaki ortam bileşimi kullanıldı: 10.7 g/l K2HPO4, 5.2 g/l KH2PO4,1g/l NaCl, 1 g/l NH4Cl, 1 g/l MgSO4, { {17}},2 g/l maya ekstraktı ve 1{{20}} g/l glikoz. Bir gecelik kültür ortamı, 0.1'lik bir OD600 değerine yenilendi ve OD600, 0,6 ile 0,8 arasına ulaşana kadar kültürlendi. Kültür ortamı daha sonra 0,1'lik OD600'e seyreltildi ve 500 ng/ml aTc, 0,05 mM IPTG ve 0,1 g/l L-triptofan ile 5 ml'lik bir nihai hacme kadar desteklendi. 300 ul kültür ortamı örneklendi ve HPLC analizi için bir hücre peleti elde etmek üzere 5 dakika boyunca 14 000 rpm'de santrifüjlendi ve RNA ekstraksiyonu için 300 ul kültür ortamı örneklendi.

HPLC analizi

Violasin biyosentetik yol analizi için, hücre topağı {{{0}}hacim metanol içinde yeniden süspanse edildi, 5 dakika sonikasyona tabi tutuldu, santrifüjlendi ve bir 0.22-m naylon filtreden süzüldü. HPLC analizi, Poroshell 120 EC-C18, 4,6 × 150 mm, 4 m sütun (Agilent) ile yöntemi (42) takip etti. İki mobil faz, DDW içinde %0,1 formik asit içeren A ve asetonitril içinde %0,1 formik asit içeren B, aşağıdaki gradyan profiliyle 0,6 ml/dakikalık bir akış hızında kullanıldı: 1,5 dakika boyunca %95 A, A'yı 95'ten yükselterek 4 dakika boyunca %2'ye, 2 dakika boyunca %2 A'yı koruyarak, 30 saniye boyunca A'yı %2'den %95'e yükselterek ve 10 dakika boyunca %95 A'yı koruyarak. Numuneler bir PDA detektörü kullanılarak tespit edildi ve HPLC alanı, viyolasein için 600 nm'de ve prodeoksiviolasein için 610 nm'de belirlendi.

Likopen üretimi ve numune alınması

Likopen üretimi için aşağıdaki ortam bileşimi kullanıldı: 13,56 g/l Na2HPO4,6g/l KH2PO4,2g NH4Cl, 1 g NaCl, 2 ml 1 M MgSO4, 0,1 ml 1 M CaCl2 ve 4 g/l glikoz (22). 27 g/ml kloramfenikol ve 50 g/ml spektinomisin kullanıldı. Bir gecelik kültür ortamı, 5 ml'lik bir nihai hacme kadar OD600 / 0.1'e kadar yenilendi. OD600, 0,5 ile 0,6 arasına ulaştığında, 500 ng/ml'lik nihai konsantrasyona aTc eklendi ve OD600, 0,9 ile 1 arasına ulaştığında, 0,02 mM'lik nihai konsantrasyona IPTG eklendi. Likopen, referansta (22) açıklandığı gibi aseton kullanılarak ekstre edildi. Likopen konsantrasyonu, standart bir eğri kullanılarak bir Jenway 7300 spektrofotometre kullanılarak 475 nm'deki absorbanstan elde edildi. RNA ekstraksiyonu için 300 ul kültür ortamı örneklendi.

erkekler için cistanche faydaları-bağışıklık sistemini güçlendirir

SONUÇLAR VE TARTIŞMA

SgRNA'daki mutasyonların CRISPR sisteminin baskılama verimliliğine etkisi

CRISPRi sistemi, dCas9-sgRNA-DNA üçlü kompleksi güçlü bir şekilde birbirine bağlandığında gen ifadesini baskılayabilir. CRISPRi sisteminin baskılama etkinliğinin, RNP kompleksi oluşumunu modüle ederek belirli bir seviyeye değiştirilebileceğini varsaydık. CRISPR sisteminin baskılama verimliliğini ölçmek için, S. pyogenes'ten dCas9'un anhidrotetrasiklin (aTc) tarafından indüklendiği ve hem raportör genin (mCherry) hem de sgRNA varyantlarının yapısal olarak ifade edildiği genetik devreye dayalı bir floresan raporlama sistemi tasarladık (Şekil 1). 1 A). Ortama aTc eklendiğinde, dCas9-sgRNA-DNA üçlü kompleksi raportör genin transkripsiyonunu bloke eder ve floresans seviyesi, CRISPR sisteminin baskılama verimliliğini ters olarak gösterir. SgRNA toplamda 96 nükleotid (nts) içerir. Aralayıcı bölge (ilk 20 nt) hedef DNA dizisine bağlanır ve diğer 76 nt, kompleks oluşumuna ve stabiliteye katkıda bulunur. CRISPR tabanlı sistemde spacer bölgesindeki uyumsuzluklar spesifikliği kaybedip hedef dışı etkileri artırabileceğinden (33,43), tasarlanabilecek sgRNA'nın maksimum uzunluğu 76 nts'dir. Bu durumda 476 (yaklaşık 1045) adet kütüphane büyüklüğü elde edilmelidir ancak inşa edilemeyecek kadar büyüktür. Bu nedenle sgRNA üzerinde spesifik pozisyonlar belirlenerek kütüphanenin boyutunun daraltılması gerekmektedir. Öncelikle her bölgedeki sgRNA'daki mutasyonların CRISPR sistemindeki baskılamayı nasıl etkilediğini araştırdık. Önceki bir çalışma, kök döngü 1'deki (sg mut01 ve sg mut02) mutasyonların Cas9'un nükleaz aktivitesinde önemli bir azalmaya yol açtığını, kök döngü 2 (sg mut03) veya kök döngü 3'teki (sg) mutasyonların ise Cas9'un nükleaz aktivitesinde önemli bir azalmaya yol açtığını bildirmiştir. mut04) aktivitesini etkilemedi (44). Kök-döngü 1 bölgesi ve tekrar, tetraloop, anti-tekrar ve kök-döngü 2 bölgelerindeki mutasyonları içeren yeniden yapılandırılmış bir sgRNA (sg mut05) da nükleaz aktivitesini azaltmıştır (44). Bununla birlikte, CRISPRi sisteminde, beş sgRNA varyantının tümü, vahşi tip sgRNA'ya (sg WT) kıyasla baskı verimliliği üzerinde çok az etkiye sahipti; her varyant, aralayıcı bölgesi olmayan pozitif kontrole kıyasla %2-4'lük bir floresans seviyesi sergiledi ( sg PC) (Şekil 1B). Bu sonuçlar, dCas9-sgRNA kompleksi oluşumunun, CRISPR/Cas9 sisteminin aksine, CRISPRi sistemindeki kök-döngü 1 bölgesindeki dizi modifikasyonuna daha az duyarlı olduğunu göstermektedir. Kompleksin stabilitesi ile ilgili bölgelerin çıkarılmasının, ifadeyi birden fazla düzeyde daha fazla kontrol etmek için bir başlangıç ​​noktası olabileceğini varsaydık. Bu amaçla, bağlayıcı, kök-döngü 2 ve kök-döngü 3'ten yoksun kesik bir sgRNA (sg trcSL1) oluşturduk. Bu kesik sgRNA'nın minimum sayıda bileşeni vardır ve CRISPR/'deki nükleaz aktivitesini önemli ölçüde azalttığı gösterilmiştir. Cas9 sistemi (5,44). CRISPRi sisteminde test edildiğinde, bu kusurlu mutant, sg PC'ye kıyasla %8'lik bir floresans seviyesi sergiledi; bu, üçlü kompleks stabilitesinin azalmasına rağmen hala dCas9'a bağlanabildiğini ve ilgilenilen geni belirli bir seviyede baskılayabildiğini düşündürmektedir (Şekil 1B). RNP kompleksinin yapısal analizi, sgRNA'nın bağlayıcı, kök-döngü 2 ve kök-döngü 3 bölgelerinin, dCas9'un nükleaz alanı ile etkileşimleri yoluyla kompleksin stabilize edilmesinden sorumlu olduğunu ve bunun da indel'de önemli bir azalmaya yol açtığını göstermektedir. CRISPR/Cas9 sisteminde verimlilik (44). Buna karşılık, sgRNA'nın tekrar: anti tekrar bölgesi ve kök-döngü 1'i esas olarak dCas9'un tanıma alanı ve PAM-etkileşimli alanı ile etkileşime girer ve CRISPR/Cas9 sistemindeki indel verimliliğini önemli ölçüde etkilemez (44). Bu sonuç, sg trcSL1'in, CRISPR/Cas9 sistemindeki nükleaz aktivitesinde önemli bir azalma sergilediği ve CRISPRi sistemindeki bağlanma afinitesini yalnızca hafifçe etkilediği gözlemini desteklemektedir.

Şekil 1. Sistem yapısı ve sgRNA mutasyonunun baskı verimliliği üzerindeki etkisi. (A) Baskılama verimliliğinin ölçülmesi için iki plazmid sistemi. p15A kökenli bir plazmid, aTc ile indüklenebilir bir promoter altında dCas9 genini ve kurucu bir promoter altında mCherry genini içerir. CloDF13 orijinli diğer plazmit, yapısal bir promoter altında vahşi tipte veya mutant sgRNA içerir. (B) Her sgRNA mutantının (sg mut01 ∼ sg mut05 ve sg trcSL1) ve sg WT'nin sg PC ile karşılaştırıldığında göreceli floresansı. +1 ile + 20 arası, mCherry genine bağlanan aralayıcı dizidir. sg PC: pozitif kontrol olarak aralayıcı içermeyen sgRNA, sg WT: vahşi tip sgRNA. Hata çubukları standart sapmayı (n=3) gösterir. P değerleri eşleştirilmemiş t testi ile belirlendi. ns: anlamlı değil, **P< 0.01

Çok düzeyli bir ifade kontrolü için karmaşık oluşum verimliliğinin değiştirilmesi

Tetraloop, CRISPR-Cas9 sisteminde crRNA ve tracrRNA'yı birbirine bağlayan yapay bir bağlayıcıdır (5). dCas9, crRNA ve tracrRNA'dan oluşan üçlü kompleksin kristal yapısı, tetraloop ve onun 5 ve 3 yan bölgelerinin dCas9 ile çok az teması olduğunu göstermiştir (44). Aynı zamanda tekrar:anti-tekrar ve kök-döngü 1 bölgeleri fonksiyonel kompleks için kritik öneme sahiptir (44). Doğrudan dCas9 ile etkileşime girmediğinden, tetraloop ve yan bölgeleri, sgRNA'ya ek proteinler almak için aptamer dizilerinin dahil edilmesi gibi ek bileşenlerle sgRNA mühendisliği için potansiyel alanlar olarak araştırılmıştır (45,46). Bu bölgedeki mutasyonların, kompleksi tamamen bozmadan sgRNA ve dCas9 arasındaki bağlanma afinitesini çeşitlendirebilmesi olasıdır. Bir 12- mer rastgele kütüphane (sırasıyla tetraloop bölgesinin 4 nt'si ve 5 ve 3 yan bölgenin 4 nt'si), sgRNA ve dCas9 arasındaki kompleks oluşum verimliliğini daha da azaltmak için şablon olarak sg trcSL1 kullanılarak inşa edildi (Şekil 2A) ). Sg WT (tamamen baskılayan durum) ve sg PC (bastırmayan durum) arasındaki baskı verimliliğini kapsayan çeşitli sgRNA mutantlarını elde etmek için iki aşamalı bir sıralama stratejisi uyguladık. Orijinal kitaplığı farklı floresans yoğunluğu aralıklarına sahip daha küçük kitaplıklara böldük ve daha sonra daha küçük kitaplıktan her sgRNA varyantının floresansını ayrı ayrı belirledik. Akış sitometrisi ile elde edilen orijinal kitaplığın floresans dağılımı sg PC'ninkiyle neredeyse aynıydı (Şekil 2B). Ancak, ardışık üç sıralama adımından sonra her kitaplık (yüksek, orta ve düşük) sg PC'ye kıyasla sırasıyla %63, %24 ve %14 ortalama floresans düzeylerine sahipti (Şekil 2B). Bu küçük kitaplıklardan seksen iki koloni izole edildi ve floresans seviyeleri %8 ile %104 arasında değişiyordu (Şekil 2C). Bu sonuçlar, tetraloop ve sgRNA'nın yan bölgesinin mutasyona uğramasının, çeşitli baskı verimlilikleri için dCas9 ve sgRNA arasındaki bağlanma afinitesini modüle edebildiğini göstermektedir. 82 sgRNA kolonisi arasında sg WT ve sg PC arasında çeşitli floresans sinyalleriyle 10 sgRNA mutantının (sg trcSL1c1 – sg trcSL1c10, Ek Tablo S6) ters transkripsiyon kantitatif PCR (RT-qPCR) analizi, floresans seviyelerinin mCherry transkriptlerinin artmasıyla doğrusal olarak arttığını gösterdi. , CRISPRi sistemimizin transkripsiyonel seviyede gen ekspresyonunu kontrol ettiğini gösterir (Ek Şekil S2). Ayarlanabilir CRISPRi sistemimiz, 45-kata kadar baskılama kontrolü sağlayabilen, dCas9 veya sgRNA miktarlarını değiştirmeden baskılama verimliliğinin ince ayarına izin veren tasarlanmış sgRNA'ları kullanır. Sistemimizin dikkate değer bir avantajı, ek klonlama gerekmesine rağmen, istenmeyen sonuçlara yol açma potansiyeli olmadan, belirli sgRNA varyantları aracılığıyla baskılama verimliliğine ince ayar yapabilmesidir. Üstelik büyüme eğrisi, sistemimizin önemli bir hücresel yük getirmediğini gösteriyor (Ek Şekil S3). Ayrıca, değişen seviyelerde baskı verimliliğine sahip üç sg trcSL1 varyantındaki RNA-Seq, sg WT'de değiştirilen 262 genin aksine, 51 ila 83 genin ifadesinin değiştiğini gösterdi (Ek Şekil S4). Bu sonuçlar, sg trcSL1 varyantlarının, geleneksel CRISPRi sistemine göre daha düşük hedef dışı etkilere sahip olduğunu göstermektedir. Metabolik yolların optimize edilmesinin sıklıkla birden fazla genin manipülasyonunu içerdiği metabolik mühendislik uygulamalarıyla özellikle ilgilidir. Olumsuz yan etkilere neden olmadan gen ifadesine ince ayar yapma yeteneği, optimizasyon sürecini önemli ölçüde hızlandırabilir ve sistemin genel verimliliğini ve üretkenliğini artırabilir.

Şekil 2. SgRNA kütüphanesinin yapısı ve kütüphanenin taranması. (A) Bu çalışmada kullanılan sgRNA iskelesi. 12-mer içeren tetraloop ve onun yan dizisi, bir sgRNA kitaplığı elde etmek için sg trcSL1'den rastgele mutasyona uğratılır. (B) Sıralamadan önce (solda) ve sonra (sağda) akış sitometrisinden elde edilen floresans dağılımı. Her dağıtım 100,000 hücre içerir. (C) (B)'den elde edilen tek kolonilerin floresansı. Hata çubukları standart sapmayı (n=2) gösterir.

dCas9 ve sgRNA miktarının baskı verimliliği üzerindeki etkileri

dCas9 veya sgRNA miktarının modüle edilmesi CRISPRi sisteminin baskılama verimliliğini değiştirebileceğinden (23,24), dCas9 ve sgRNA miktarının baskılama verimliliği üzerindeki etkisini incelemek önemlidir. On sgRNA mutantı (sg trcSL1c1–sg trcSL1c10) kullanarak dCas9 ve sgRNA miktarlarını değiştirerek sistemimizin performansını farklı koşullar altında test ettik. DCas9 ekspresyonu için indükleyicinin üç farklı konsantrasyonu (20, 100 ve 500 ng/ml) kullanıldı. 20 ng/ml indükleyici kullanıldığında dCas9 mRNA seviyesi ile karşılaştırıldığında, 15-kat (100 ng/ml) ve 22-kat (500 ng/ml) daha da arttırıldı (Ek Şekil S5A) ). dCas9'un yüksek düzeyde olması hücreler için toksik olabileceğinden (47,48) veya bazen toksik olamayacağından (49) dCas9'un aşırı ekspresyonuyla ilgili endişeler vardır. Bununla birlikte, çeşitli indükleyici konsantrasyonlarındaki büyüme eğrilerine göre, 500 ng / ml'ye kadar aTc kullanıldığında büyüme oranı% 10'dan daha az azaldı (Ek Şekil S6). Bu, dCas9 miktarının, test edilen koşullar altında E. coli üzerinde toksik bir etkiye sahip olmadığını göstermektedir. Farklı miktarda dCas9 ifade edildiğinde baskı verimliliği marjinal olarak değiştirildi (Şekil 3A). CRISPRi sisteminin [aTc]'de maksimum baskılama verimliliğine ulaştığı önceki bir çalışmayla tutarlıydı.< 5 ng/ml when the same replication origin and promoter were used for the expression of CRISPRi components (24). We set the inducer concentration to 500 ng/ml to sufficiently supply dCas9 for further applications such as multiple gene regulation. The property that our system is less sensitive to the amount of dCas9 has advantages over the strategy of adjusting inducer concentration, as the dose-dependent induction of dCas9 might be varied due to the promoters, plasmid copy numbers, or host strains (50–53). Additionally, using CRISPR-based systems allows for the simultaneous targeting of multiple genes for editing or repression, making it an effective tool for multiplexing gene regulation (54). Our tunable CRISPRi system allows for the precise modulation of repression efficiency through sgRNA variants. With this approach, it would be possible to target multiple genes with varying levels of repression simultaneously. The previous study reported that stronger promoters for sgRNA expression lead to higher repression efficiency (24). To investigate the effect of the amount of sgRNA on repression efficiency in our system, two different promoters having different strengths were used (BBa J23100; J23100 and BBa K2753055; UPJ23119). Promoter UPJ23119 contains a UP element that interacts with E. coli RNA polymerase and expresses 16-fold more transcript than J23100 (55). However, the exact fold change may vary depending on the plasmids, genes, and host strains used. Our results showed that UPJ23119 doubled sgRNA expression in our system and had higher repression efficiency (Figure 3B and Supplementary Figure S5B). These results suggest that adjusting the amount of sgRNA can further expand the dynamic range of multi-level expression and provide precise modulation of repression efficiency.

Şekil 3. Ayarlanabilir CRISPRi sisteminin karakterizasyonu ve modülerliği. (A) Farklı aTc konsantrasyonları (20, 100 ve 500 ng/ml) altında bağıl floresans. (B) Farklı destekleyiciler (J23100 ve UPJ23119) altında göreceli floresans. (C) Farklı protospacers altında göreceli floresans. X ekseni, mCherry'nin göreceli floresansını gösterir ve y ekseni, lacI33-mCherry (kırmızı) ve araC33-mCherry'nin (mavi) göreceli floresansını gösterir. mCherry'nin (56) 5-ucuna lacI ve araC'den 33 bp'lik ek diziler eklendi. (D) 12-merin serbest enerjisi ve bağıl floresans. Kesikli çizgiler %95'lik bir tahmin aralığını, düz çizgiler ise bir regresyon çizgisini gösterir. sg trcSL1c2'nin dG değeri mFold kullanılarak elde edilemediğinden analiz dışı bırakıldı. (A–D) Tüm hata çubukları standart sapmayı gösterir (n=3).

Ayarlanabilir CRISPRi sisteminin modülerliği

Hedef DNA için belirli bir ifade seviyesini korumak amacıyla spesifik sgRNA varyantlarını kullanan yaklaşımımız, modüler bir sistem olarak kullanılma potansiyeline sahiptir. Farklı protospacer'ları hedeflemek için ayarlanabilir CRISPRi sisteminin fizibilitesini göstermek amacıyla, lacI ve araC'den 33 bps dizi ekleyerek iki füzyon geni (lacI{{0}}mCherry ve araC33-mCherry) oluşturduk mCherry'nin (56) 5 -sonuna kadar. E. coli BL21(DE3) (GenBank: CP001509.3) genomu, lacI33- mCherry için protospacer dizisinin iki kopyasını ve araC33-mCherry için bir kopya içerir. Ancak bu kromozomal diziler PAM dizilerine sahip değildir ve bu nedenle dCas9-sgRNA kompleksi (43) tarafından hedeflenemez. SiRNA'lar her protospacer'ı hedef alacak şekilde tasarlandığında, lacI33, araC33 ve mCherry'den gelen tüm protospacer'lar için baskı verimliliği tutarlı bir şekilde korundu (Şekil 3C). Bu bulgular, ayarlanabilir CRISPRi sistemimizin, protospacer dizisinden bağımsız olarak gen ekspresyonunu belirli bir seviyede etkili bir şekilde düzenleyebileceğini göstermektedir. RNP kompleksi oluşumu ile baskılama verimliliği arasında gözlemlenen ilişkinin olası bir açıklaması, kompleks oluştuğunda serbest enerjideki değişikliktir. Yapay tetraloop bağlayıcı ve onun yan bölgesi iki A: U ve G: C Watson-Crick baz çifti ve bir A: G Watson-Crick olmayan baz çifti içerir (44). CrRNA ve tracrRNA'nın bağlanması kompleks oluşumu için çok önemli olduğundan, tetraloop'u hedef alan mutasyonlar dCas9 ve sgRNA arasındaki bağlanma afinitesini etkileyecektir. Bu afinite, sınırlı ve sınırsız durumlar arasındaki serbest enerji farkından hesaplanabilir. Ancak sınırlı durumların serbest enerjisini hesaplamak zordur (57). Kütüphaneden ayrılan sgRNA'lar işlevini tamamen bozmadığı için sınırlı durumun genel yapısının ve stabilitesinin değişmediğini varsaydık. Ayrıca tetraloop ve yan bölgesinin dCas9 ile çok az teması vardır (44). Bu nedenle, dCas9 ve sgRNA arasındaki bağlanma afinitesi esas olarak tetraloopun ikincil yapısının ve onun yan dizisinin stabilitesinden etkilenecektir. Bu fikirden yola çıkarak tetraloop ve onun yan dizilerinin serbest enerjisini kalıp (58) kullanarak hesapladık. Mutasyonlara bağlı olarak katlanmanın serbest enerjisindeki fark, mutasyona uğramış ve vahşi tip dizilerin serbest enerjisi arasındaki fark olarak tanımlanır. Yabani tip dizinin katlanma enerjisi –4,3 kcal/mol'de sabit olduğundan, mutantların katlanma serbest enerjisinden doğrudan hesaplanabilir. Katlanmanın serbest enerjisi arttıkça floresan sinyali arttı (Şekil 3D). Tetraloop içeren bölgenin katlanma enerjisi 0 kcal/mol'e yakın veya altında olduğunda bastırma verimliliği en yüksekti ve katlama enerjisi 0 kcal/mol'ü aştığında doğrusal olarak azaldı. Bu gözlem, dCas9 ve sgRNA arasındaki kompleks oluşumunun verimliliğinin, sistemimizin modülerliğini açıklamaya yardımcı olan tetraloop bölgesinin ikincil yapısı tarafından belirlendiğini göstermektedir. Bu ilişkiyi daha da doğrulamak için kütüphaneden farklı 12-mer dizilerine sahip ek bir 85 sgRNA'nın baskı verimliliği ölçüldü. Aynı zamanda sg trcSL1 varyantlarında gözlemlenen korelasyonu da gösterdi (Şekil 3D ve Ek Tablo S7), tetraloop bağlayıcının RNP kompleksinin oluşturulmasında çok önemli bir rol oynadığını ve bu bölgedeki mutasyonların CRISPR sisteminin verimliliğini etkileyebileceğini öne sürüyor. Ek olarak bu ilişki, istenen baskılama verimliliğine sahip sgRNA varyantlarının bilgisayar tabanlı tasarımının olasılığını gösterir.

E. coli'deki viyolasinin biyosentetik yolunda akı yeniden dağıtımı için ayarlanabilir bir CRISPRi sisteminin uygulanması

Redistributing the metabolic flux is an important process in metabolic engineering to maximize the yield of target products (59,60). Because our system could precisely control gene expression by targeting any protospacer, we chose the violacein biosynthetic pathway as a model system for pathway redistribution. Violacein is an indole derivative compound that exhibits a deep purple color, originally produced by Chromobacterium violaceum (Figure 4A) (61). This compound is synthesized from L-tryptophan by five enzymes encoded by vioA, vioB, vioE, vioD, and vioC (62). Along with violacein (V), other indole derivatives such as proviolacein (PV), deoxyviolacein (DV), and prodeoxyviolacein (PDV) with different colors can also be produced (Figure 4A) (62). The production of violacein and deoxy violacein is an enzymatic process mediated by vioC, while the production of PV and PDV is a non-enzymatic process. We expressed the violacein biosynthetic pathway under the IPTG inducible promoter (63), and different trcSL1 variants were designed to target vioD to redirect the flux. It could effectively modulate the expression of vioD at the transcriptional level (Figure 4B). vioC was repressed by sg WT and showed high variation (Supplementary Figure S7), but the absolute copy number was kept at low levels (>Standart eğrilerden hesaplandığında diğer genlerle karşılaştırıldığında 100-kat). Buna karşılık, viyolasin yolundaki diğer düzenlenmemiş enzimlerin (vioA, vioB ve vioE) ekspresyonu değişmeden kaldı. Bu sonuçlar, sistemimizin, yoldaki diğer genleri etkilemeden bireysel genlerin ekspresyonunu spesifik olarak hedefleyebildiğini ve modüle edebildiğini göstermektedir. HPLC analizi için ticari olarak mevcut standartların bulunmaması nedeniyle PV ve PDV'nin doğrudan miktarının belirlenmesi mümkün değildi. Böylece, HPLC tepe alanını kullanarak titreleri isteğe bağlı birimler halinde ölçtük. Ürünün titresi indüksiyondan 8 saat sonra maksimuma ulaştı ve daha sonra yavaş yavaş azaldı (Ek Şekil S8), muhtemelen ürünün bilinmeyen bir mekanizma tarafından kromoviridanlar gibi diğer yan ürünlere dönüştürülmesi nedeniyle (42,64). HPLC spektrumunda gözlenen küçük tepe noktaları, ilave küçük yan ürünlerin varlığını gösterdi. Önceki araştırmalar, her bir ürünün titresinin keyfi birimlerdeki logaritmasının, viyolasin biyosentetik yolunda yer alan her bir genin promoter kuvvetinin doğrusal kombinasyonları ile tahmin edilebileceğini göstermiştir (42). Bu log-doğrusal regresyon modeli sistemimizde de geçerliydi ve artan vioD transkriptleri artan PV üretimiyle ilişkilendirildi (Şekil 4B). Violasin biyosentetik yolunda yer alan her bir genin promoterinin veya 5 -UTR'sinin mühendisliğinin, akışın yeniden dağıtımını ve yol optimizasyonunu mümkün kıldığı bilinmektedir (65,66). Sistemimiz, kısa olan ve tek adımlı yöntemlerle bir araya getirilebilen sentetik sgRNA'ları kullanarak yola dahil olan promotörleri manipüle etmeden transkripsiyon kontrolünü gösteren alternatif bir yöntem olarak çalışabilir. Ayarlanabilir CRISPRi sistemi aracılığıyla tarama, konakçı suşları veya gen kasetlerini doğrudan manipüle etmeden önce yolu öngörülebilir bir akışla yeniden yönlendirmeyi mümkün kılarak süreci potansiyel olarak hızlandırır.

Likopen üreten E. coli'de karbon akışını dengelemek için ayarlanabilir CRISPRi sisteminin uygulanması

Metabolik mühendislikte değerli bileşiklerin verimli üretimi, karbon akışının dengelenmesini gerektirir. Metileritritol 4-fosfat (MEP) yolu, izoprenoid yapı taşları, dimetilalil pirofosfat ve izopentenil pirofosfat üretmek için piruvat ve gliseraldehit 3-fosfat (GAP) gibi basit öncüleri kullanan metabolik bir yoldur (67,68) . Bu moleküller, farnesil pirofosfata (FPP) dönüştürülen geranil pirofosfatı sentezler (67,68). Güçlü antioksidan özellikleri ve çeşitli endüstrilerdeki çeşitli uygulamaları (69) olan oldukça değerli bir karotenoid olan likopen, crtE, crtB ve crtI'den bir dizi enzimatik reaksiyon yoluyla FPP'den sentezlenir (Şekil 4C) (22,70). GAP öncüsü sadece MEP yolu için değil aynı zamanda glikoliz yolu için de gereklidir (22). Glikoliz yolunda gliseraldehid-3-fosfat dehidrojenazı (GAPDH) kodlayan GAPA geninin azalan ifadesinin, GAP havuzunu artırarak likopen üretimini arttırdığı gösterilmiştir (22). Bu nedenle, çeşitli baskı verimliliği, sg PC ve sg WT gösteren üç sg trcSL1 varyantı (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5 ve sg trcSL1c6) dahil olmak üzere, GAPA'yı beş varyantla hedefledik. Ancak GAPA tamamen yok edilemeyen önemli bir gendir (71,72). GapA'yı geleneksel CRISPRi ile sg WT kullanarak baskılama girişimleri, tet promoteri altında dcas9'un düşük sızıntısına rağmen başarısız oldu (73). Öte yandan, ayarlanabilir CRISPRi sistemi kullanılarak GAPA gen ifadesinin çok düzeyli baskılanması, büyüme kusuru olmadan elde edildi ve GAP genini tamamen ifade eden bir türle karşılaştırıldığında sg trcSL1c6 ile likopen üretiminde 2.7-kat artışla sonuçlandı. 15 saatlik ekimden sonra (Şekil 4D ve Ek Şekil S9). GapA geninin doğal ifadesinin yalnızca %10'unun, glikoliz yolundaki 2-fosfogliserat ve 3-fosfogliserat gibi aşağı yöndeki metabolitlerde önemli bir değişiklik olmaksızın GAP havuzunda artışa yol açtığı rapor edilmiştir ( 22). Toplu olarak bu sonuçlar, ayarlanabilir CRISPRi'nin, kromozom mühendisliği olmadan gen ekspresyonunu birden fazla seviyede hassas bir şekilde baskılayabildiğini göstermektedir.

Şekil 4. Viyolasin biyosentetik yolu için ayarlanabilir CRISPRi sisteminin uygulanması. (A) Violacein biyosentetik yolu ve plazmit yapısı. Violasein üretiminden sorumlu beş gen (vioA, vioB, vioC, vioD ve vioE), dCas9-eksprese eden bir plazmide klonlandı. Dört ana ürün (violacein, proviolacein, deoxyviolacein ve prodeoxyviolacein) üretilir. vioC için sg WT ve vioD için farklı baskı verimlilikleri gösteren beş sg trcSL1 varyantı (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6, sg trcSL1c8 ve sg trcSL1c9) diğer plazmide klonlandı. Trp: L-triptofan, V: viyolacein, PV: proviolacein, PDV: prodeoksiviolacein, DV: deoksiviolacein, PDVA: protodeoksiviolaceinik asit, PVA: protoviolaceinik asit. (B) vioD transkriptleri, mCherry floresansı ve PDV ile PV titresi arasındaki ilişki. X ekseni RT-qPCR'den elde edilen göreceli vioD RNA'yı, soldaki y ekseni Şekil 3'teki göreceli mCherry floresansını gösterir ve sağdaki y ekseni HPLC alanının oranını gösterir. En yüksek vioD RNA değerine sahip örnekler normalizasyon için %100'e ayarlandı. (C) Likopen biyosentetik yolu ve plazmit yapısı. Likopen üretiminden sorumlu üç gen (crtE, crtB, crtI), dCas9-eksprese eden bir plazmide klonlandı. GapA, sg trcSL1 varyantları (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6) ile hedeflendi ve sg PC diğer plazmide klonlandı. Glc: Glikoz, GAP: gliseraldehit 3-fosfat, 1,3-BPG: 1,3-bisfosfogliserat, DMAPP: dimetilalil pirofosfat, IPP: izopentenil pirofosfat, FPP: farnesil pirofosfat. (D) GapA transkriptleri, mCherry floresansı ve likopen üretimi arasındaki ilişki. X ekseni RT-qPCR'den elde edilen göreceli boşluk RNA'sını gösterir, soldaki y ekseni Şekil 3'teki göreceli mCherry floresansını gösterir ve sağdaki y ekseni likopen titresini gösterir. (B, D) Tüm hata çubukları standart sapmayı gösterir (n=3).

ÇÖZÜM

Gen ifadesini istenilen seviyede hassas bir şekilde kontrol edebilen, ayarlanabilir bir CRISPRi sistemi tasarladık. Tetraloop ve onun yan bölgesini mutasyona uğratarak, çeşitli protospacer dizilerini hedef alan sentetik sgRNA'lar, geni belirli bir seviyede düzenleyebilir. Tahmin edilebilir bir oranda indol türevleri üretmek için viyolasin biyosentetik yolundaki ilgi konusu metabolik akışı yeniden yönlendirmek için bu sistemi başarıyla uyguladık. Ek olarak, ayarlanabilir CRISPRi kullanımının likopen üretiminde 2.7- kat artışa yol açtığını gösterdik, bu da sistemimizin diğer değerli bileşiklerin üretimini iyileştirme konusundaki çok yönlülüğünü vurguladı. Bu sistem, promotörün veya 5-UTR dizilerinin değiştirilmesi gibi ana bilgisayar genetik bilgilerini kalıcı olarak değiştirmeden önce akış optimizasyon süreçlerini hızlandıracaktır.

cistanche tubulosa-bağışıklık sistemini iyileştirir

REFERANSLAR

1. Sapranauskas,R., Gasiunas,G., Fremaux,C., Barrangou,R., Horvath,P. ve Siksnys,V. (2011) Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas sistemi Escherichia coli'de bağışıklık sağlar. Nükleik Asitler Res., 39, 9275–9282.

2. Gasiunas,G., Barrangou,R., Horvath,P. ve Siksnys,V. (2012) Cas9-crRNA ribonükleoprotein kompleksi, bakterilerde adaptif bağışıklık için spesifik DNA bölünmesine aracılık eder. Proc. Natl. Acad. Bilim. ABD, 109, E2579–E2586.

3. Cong, L., Ran,FA, Cox, D., Lin,S., Barretto, R., Habib,N., Hsu, PD, Wu,X., Jiang, W., Marraffini, LA ve diğerleri . (2013) CRISPR/Cas sistemlerini kullanan multipleks genom mühendisliği. Bilim, 339, 819–823.

4. Ran, FA, Hsu,PD, Wright,J., Agarwala,V., Scott,DA ve Zhang,F. (2013) CRISPR-Cas9 sistemini kullanan genom mühendisliği. Nat. Protokol, 8, 2281–2308.

5. Jinek,M., Chylinski,K., Fonfara,I., Hauer,M., Doudna,JA ve Charpentier,E. (2012) Uyarlanabilir bakteriyel bağışıklıkta programlanabilir bir çift RNA kılavuzlu DNA endonükleazı. Bilim, 337, 816–821.

6. Anders,C., Niewoehner,O., Duerst,A. ve Jinek, M. (2014) Cas9 endonükleazı tarafından PAM'a bağımlı hedef DNA tanımanın yapısal temeli. Doğa, 513, 569–573.

7. Qi,LS, Larson, MH, Gilbert,LA, Doudna,JA, Weissman,JS, Arkin,AP ve Lim,WA (2013) CRISPR'ın gen ifadesinin diziye özgü kontrolü için RNA güdümlü bir platform olarak yeniden kullanılması. Hücre, 152, 1173–1183.

8. Larson,MH, Gilbert,LA, Wang,X., Lim,WA, Weissman,JS ve Qi,LS (2013) Gen ifadesinin diziye özgü kontrolü için CRISPR girişimi (CRISPRi). Nat. Protokol, 8, 2180–2196.

9. McGlincy,NJ, Meacham,ZA, Reynaud,KK, Muller,R., Baum,R. ve Ingolia, NT (2021) Genom ölçeğinde bir CRISPR girişim kılavuzu kütüphanesi, mayada kapsamlı fenotipik profil oluşturmaya olanak sağlar. BMC Genomik, 22, 205.

10.Yoon,J. ve Woo,HM (2018) Homo-butirat üretimi için Corynebacterium glutamicum'un CRISPR girişim aracılı metabolik mühendisliği. Biyoteknoloji. Bioeng., 115, 2067–2074.

11. Cleto,S., Jensen,JV, Wendisch,VF ve Lu,TK (2016) CRISPR müdahalesi (CRISPRi) ile Corynebacterium glutamicum metabolik mühendisliği. ACS Sentez. Biol., 5, 375–385.

12. Zhang,GQ, Ren,XN, Liang,XH, Wang,YQ, Feng,DX, Zhang,YJ, Xian,M. ve Zou,HB (2021) Amino asitlerin mikrobiyal üretiminin iyileştirilmesi: geleneksel yaklaşımlardan son trendlere. Biyoteknoloji. Biyoprok. E, 26, 708–727.

13. Kim,SK, Seong,W., Han,GH, Lee,DH ve Lee,SG (2017) Escherichia coli'de metabolik akışın yeniden yönlendirilmesi için endojen rakip yol genlerinin CRISPR girişim kılavuzlu multipleks baskısı. Mikrop. Hücre Fact., 16, 188.

14. Ellis,NA, Kim,B., Tung,J. ve Machner,MP (2021) Legionella pneumophila'da virülans gen sorgulaması için çoklu bir CRISPR müdahale aracı. İletişim Biol., 4, 157.

15. Siu,KH ve Chen,W. (2019) Programlanabilir CRISPR-Cas9 işlevi için riboregüle edilmiş parmak geçitli gRNA. Nat. Kimya Biol., 15, 217–220.

16. Reis,AC, Halper,SM, Vezeau,GE, Cetnar,DP, Hossain,A., Clauer,PR ve Salis,HM (2019) Tekrarlamayan ekstra uzun sgRNA dizileri kullanılarak birden fazla bakteriyel genin eşzamanlı baskılanması. Nat. Biotechnol., 37, 1294–1301.

17. Tian,T., Kang,JW, Kang,A. ve Lee,TS (2019) Escherichia coli'de izopentenol üretimi için kombinatoryal multipleks CRISPRi aracılı baskı yoluyla metabolik akışın yeniden yönlendirilmesi. ACS Sentez. Biol., 8, 391–402.

18. Gattam,R., Seibold,GM, Mueller,P., Weil,T., Weiss,T., Handrick,R. ve Eikmanns,BJ (2019) Corynebacterium glutamicum'da çoklu gen hedefleme için basit, çift uyarılabilir bir CRISPR girişim sistemi. Plazmid, 103, 25–35.

19. Yao,L., Cengic,I., Anfelt,J. ve Hudson,EP (2016) CRISPRi kullanılarak siyanobakterilerde çoklu gen baskısı. Acs Synth. Biol., 5, 207–212.

20. Lim,HG, Noh,MH, Jeong,JH, Park,S. ve Jung,GY (2016) Escherichia coli'de gliserolden 3-hidroksipropiyonik asit üretim yolunun optimum yeniden dengelenmesi. ACS Sentez. Biol., 5, 1247–1255.

21. Yang,Y., Lin,Y., Li,L., Linhardt,RJ ve Yan,Y. (2015) Doğal ürünlerin gelişmiş biyosentezi için sentetik antisens RNA'lar yoluyla malonil-CoA metabolizmasının düzenlenmesi. Metab. İng., 29, 217–226.

22. Jung,J., Lim,JH, Kim,SY, Im,DK, Seok,JY, Lee,SV, Oh,MK ve Jung,GY (2016) GapA ifadesinin ince kontrolü ile izoprenoid üretimi için hassas öncü yeniden dengeleme Escherichia coli. Metab. İng., 38, 401–408.

23. Li,XT, Jun,Y., Erickstad,MJ, Brown,SD, Parks,A., Court,DL ve Jun,S. (2016) tCRISPRi: gen ifadesinin ayarlanabilir ve tersine çevrilebilir, tek adımlı kontrolü. Bilim. Temsilci, 6, 39076.

24. Fontana,J., Dong,C., Ham,JY, Zalatan,JG ve Carothers,JM (2018) E. coli'de sgRNA'ların düzenlenmiş ifadesi CRISPRi'yi ayarlar. Biyoteknoloji. J., 13, e1800069.

25. Kim,NM, Sinnott,RW ve Sandoval,NR (2020) Model olmayan bakterilerde transkripsiyon faktörü bazlı biyosensörler ve uyarılabilir sistemler: mevcut ilerleme ve gelecekteki yönler. Curr. Görüş. Biotechnol., 64, 39–46.

26. Kundert,K., Lucas,JE, Watters,KE, Fellmann,C., Ng,AH, Heineike,BM, Fitzsimmons,CM, Oakes,BL, Qu,J., Prasad,N. ve ark. (2019) CRISPR-Cas9'un ligandla aktifleştirilen ve ligandla devre dışı bırakılan sgRNA'larla kontrol edilmesi. Nat. İletişim, 10, 2127.

27. Ferreira,R., Skrekas,C., Hedin,A., Sanchez,BJ, Siewers,V., Nielsen,J. ve David,F. (2019) Mayadaki merkezi karbon metabolizmasının dCas9-tabanlı düzenleme yoluyla model destekli ince ayarı. ACS Sentez. Biol., 8, 2457–2463.

28. Su,T., Guo,Q., Zheng,Y., Liang,Q., Wang,Q. ve Qi,Q. (2019) Escherichia coli'de 5-aminolevulinik asit üretimini arttırmak için CRISPRi kullanılarak hemB'nin ince ayarı. Ön. Microbiol., 10, 1731.

29. Zheng,T., Hou,Y., Zhang,P., Zhang,Z., Xu,Y., Zhang,L., Niu,L., Yang,Y., Liang,D., Yi,F . ve ark. (2017) Tek kılavuzlu RNA özgüllüğünün profilinin çıkarılması, uyumsuzluğa duyarlı bir çekirdek dizisini ortaya çıkarır. Bilim. Temsilci, 7, 40638.

30. Jiang,W., Bikard,D., Cox,D., Zhang,F. ve Marraffini, LA (2013) CRISPR-Cas sistemlerini kullanarak bakteriyel genomların RNA rehberliğinde düzenlenmesi. Nat. Biyoteknoloji.,

31, 233–239. 31. van Gestel,J., Hawkins,JS, Todor,H. ve Gross,CA (2021) Uyuşmazlık-CRISPRi için kılavuz RNA'ların tasarlanması için hesaplamalı boru hattı. YILDIZ Protokolü, 2, 100521.

32. Hawkins,JS, Silvis,MR, Koo,BM, Peters,JM, Osadnik,H., Jost,M., Hearne,CC, Weissman,JS, Todor,H. ve Gross,CA (2020) Mismatch-CRISPRi, Escherichia coli ve Bacillus subtilis'teki temel genlerin birlikte değişen ifade-uygunluk ilişkilerini ortaya koyuyor. Hücre Sistemi, 11, 523–535.

33. Fortin,J.-P., Tan,J., Gascoigne,KE, Haverty,PM, Forrest,WF, Costa,MR ve Martin,SE (2019) Çoklu gen hedefleme ve uyumsuzluk toleransı, genom analizini karıştırabilir. geniş havuzlu CRISPR ekranları. Genom Biol., 20, 21.

34.Rozen,S. ve Skaletsky,H. (2000) Genel kullanıcılar ve biyolog programcılar için WWW'de Primer3. Yöntemler Mol. Biol., 132, 365–386.

35. Zhou,K., Zhou,L., Lim,Q., Zou,R., Stephanopoulos,G. ve Too, HP (2011) Escherichia coli'nin protein aşırı ekspresyonuna karşı transkripsiyonel tepkilerini kantitatif PCR ile ölçmek için yeni referans genler. BMC Mol. Biol., 12, 18.

36. Livak,KJ ve Schmittgen,TD (2001) Gerçek zamanlı kantitatif PCR ve 2(-Delta Delta C(T)) Yöntemi kullanılarak göreceli gen ekspresyonu verilerinin analizi. Yöntemler, 25, 402–408.

37.Andrews,S. (2010) FastQC: Yüksek Verimli Dizi Verileri için Bir Kalite Kontrol Aracı. v0.11.9 ed.

38. Langmead,B., Trapnell,C., Pop,M. ve Salzberg,SL (2009) Kısa DNA dizilerinin insan genomuna ultra hızlı ve hafıza açısından verimli şekilde hizalanması. Genom Biol., 10, R25.

39. Danecek,P., Bonfield,JK, Liddle,J., Marshall,J., Ohan,V., Pollard,MO, Whitwham,A., Keane,T., McCarthy,SA, Davies,RM ve ark. (2021) SAMtools ve BCFtools'un on iki yılı. Gigascience, 10, giab008.

40. Trapnell,C., Williams,BA, Pertea,G., Mortazavi,A., Kwan,G., van Baren,MJ, Salzberg,SL, Wold,BJ ve Pachter,L. (2010) Transkript derleme ve RNA-Seq ile niceleme, hücre farklılaşması sırasında açıklanmamış transkriptleri ve izoform değişimini ortaya çıkarır. Nat. Biotechnol., 28, 511–515.

41. Trapnell,C., Hendrickson,DG, Sauvageau,M., Goff,L., Rinn,JL ve Pachter,L. (2013) RNA-seq ile transkript çözünürlüğünde gen düzenlemesinin diferansiyel analizi. Nat. Biotechnol., 31, 46–53.

42. Lee,ME, Aswani,A., Han,AS, Tomlin,CJ ve Dueber,JE (2013) Yüksek verimli bir tahlilin yokluğunda çoklu enzim yolunun ifade düzeyinde optimizasyonu. Nükleik Asitler Res., 41, 10668–10678.

43. Hsu,PD, Scott,DA, Weinstein,JA, Ran,FA, Konermann,S., Agarwala,V., Li,Y., Fine,EJ, Wu,X., Shalem,O. ve ark. (2013) RNA rehberli Cas9 nükleazlarının spesifikliğini hedefleyen DNA. Nat. Biotechnol., 31, 827–832.

44. Nishimasu,H., Ran,F., Hsu,P., Konermann,S., Shehata,S., Dohmae,N., Ishitani,R., Zhang,F. ve Nureki,O. (2014) Kılavuz RNA ve hedef DNA ile kompleks halinde Cas9'un kristal yapısı. Hücre, 156, 935–949.

45. Fu,Y., Rocha,PP, Luo,VM, Raviram,R., Deng,Y., Mazzoni,EO ve Skok,JA (2016) CRISPR-dCas9 ve sgRNA iskeleleri, uydu dizilerinin çift renkli canlı görüntülenmesini sağlar ve tekrarla zenginleştirilmiş bireysel lokuslar. Nat. İletişim, 7, 11707.

46. ​​Khosravi,S., Schindele,P., Gladilin,E., Dunemann,F., Rutten,T., Puchta,H. ve Houben, A. (2020) Aptamer Uygulaması, Bitki Telomerlerinin CRISPR Tabanlı Canlı Görüntülemesini İyileştiriyor. Ön. Plant Sci., 11, 1254.

47. Nielsen,AA ve Voigt,CA (2014) Ana düzenleyici ağlara arayüz oluşturan çok girişli CRISPR/Cas genetik devreleri. Mol. Sistem Biol., 10, 763.

48. Lee,YJ, Hoynes-O'Connor,A., Leong,MC ve Moon,TS (2016) Bakteriyel gen ekspresyonunun 44, 2462–2473 ile programlanabilir kontrolü.

49. Vigouroux,A., Oldewurtel,E., Cui,L., Bikard,D. ve van Teeffelen, S. (2018) dCas9'un transkripsiyonu bloke etme yeteneğinin ayarlanması, bakteri genlerinin sağlam, gürültüsüz bir şekilde yok edilmesini sağlar. Mol. Sistem Biol., 14, e7899.

50. Zhang,Y., Shang,X., Lai,S., Zhang,G., Liang,Y. ve gitti. (2012) Corynebacterium glutamicum'da indükleyici alımını kolaylaştırarak arabinozla indüklenebilir bir ekspresyon sisteminin geliştirilmesi ve uygulanması. Başvuru Çevre. Microbiol., 78, 5831–5838.

51. Thompson,MG, Sedaghatian,N., Barajas,JF, Wehrs,M., Bailey,CB, Kaplan,N., Hillson,NJ, Mukhopadhyay,A. ve Keasling,JD (2018) pSC101 kökeninde kopya sayısını artıran yeni mutasyonların izolasyonu ve karakterizasyonu. Sci Rep-UK, 8, 1590. 52. Fricke,PM, Link,T., Gatgens,J., Sonntag,C., Otto,M., Bott,M. ve Polen,T. (2020) Asetik asit bakterisi Gluconobacter oxydans için ayarlanabilir bir L-arabinozla indüklenebilir ekspresyon plazmidi. Başvuru Mikrobiyol. Biotechnol., 104, 9267–9282.

53. Nguyen,TT, Nguyen,NH, Kim,Y., Kim,JR ve Park,S. (2021) Pseudomonas denitrificans'ta 3-hidroksipropiyonik dehidrojenazın uyarılabilir promoter sisteminin in vivo karakterizasyonu. Biyoteknoloji Bioproc E, 26, 612–620.

54. McCarty,NS, Graham,AE, Studena,L. ve Ledesma-Amaro,R. (2020) Gen düzenleme ve transkripsiyonel düzenleme için çoğullanmış CRISPR teknolojileri. Nat. İletişim, 11, 1281.

55.Yan,Q. ve Fong,SS (2017) Escherichia coli'de UP eleman dizileri ile birleştirilmiş kurucu destekleyiciler kullanılarak in vitro transkripsiyonel bağlanma etkileri ve gürültünün incelenmesi. J. Biol. İng., 11, 33.

56. Seo,SW, ​​Yang,JS, Kim,I., Yang,J., Min,BE, Kim,S. ve Jung,GY (2013) Prokaryotik çeviri verimliliğini kontrol etmek için mRNA çeviri başlatma bölgesinin tahmine dayalı tasarımı. Metab. İng., 15, 67–74. 57. Kappel,K., Jarmoskaite,I., Vaidyanathan,PP, Greenleaf,WJ, Herschlag,D. ve Das,R. (2019) RNA-protein bağlanma afinite tahmininin kör testleri. Proc. Natl. Acad. Bilim. ABD, 116, 8336–8341.

58. Zuker,M. (2003) Nükleik asit katlanması ve hibridizasyon tahmini için Mfold web sunucusu. Nükleik Asitler Res., 31, 3406–3415.

59. Xiong,B., Zhu,Y., Tian,D., Jiang,S., Fan,X., Ma,Q., Wu,H. ve Xie,X. (2021) Escherichia coli'de l-triptofanın verimli üretimi için merkezi karbon metabolizmasının akış yeniden dağıtımı. Biyoteknoloji. Bioeng., 118, 1393–1404.

60. Yao,R., Li,J., Feng,L., Zhang,X. ve Hu,H. (2019) (13)C metabolik akış analizi, gliserolden daha iyi asetal üretimi için Escherichia coli'nin rehberliğinde metabolik mühendisliği. Biyoteknoloji. Biyoyakıtlar, 12, 29.

61. Duran,N. ve Menck, CF (2001) Chromobacterium violaceum: farmakolojik ve endüstriyel perspektiflerin gözden geçirilmesi. Kritik. Rev. Microbiol., 27, 201–222.

62. Balibar,CJ ve Walsh,CT (2006) Chromobacterium violaceum'dan VioA-E enzimleri ile L-triptofandan viyolasinin in vitro biyosentezi. Biyokimya, 45, 15444–15457.

63. Gwon,DA, Seok,JY, Jung,GY ve Lee,JW (2021) Violasin üretimi için biyosensör destekli uyarlanabilir laboratuvar evrimi. Uluslararası J. Mol. Sci., 22, 6594.

64. Sanchez,C., Brana,AF, Mendez,C. ve Salas,JA (2006) Violasin biyosentetik yolunun yeniden değerlendirilmesi ve bunun indolokarbazol biyosentezi ile ilişkisi. Kimya Biyo. Kimya, 7, 1231–1240.

65. Jones,JA, Vernacchio,VR, Lachance,DM, Lebovich,M., Fu,L., Shirke,AN, Schultz,VL, Cress,B., Linhardt,RJ ve Koffas,MA (2015) ePathOptimize: a Metabolik yolların transkripsiyonel dengelenmesi için kombinatoryal yaklaşım. Bilim. Temsilci, 5, 11301.

66. Zhang,Y., Chen,H., Zhang,Y., Yin,H., Zhou,C. ve Wang,Y. (2021) E. coli'deki viyolasinlerin verimli üretkenliği için biyosentetik gen kümesinin Doğrudan RBS Mühendisliği. Mikrop. Hücre Gerçeği, 20, 38.

67. Hunter,WN (2007) İzoprenoid öncü biyosentezinin mevalonat olmayan yolu. J. Biol. Kimya, 282, 21573–21577.

68.Rohmer,M. (1999) Bakterilerde, alglerde ve yüksek bitkilerde izoprenoid biyosentezi için mevalonattan bağımsız bir yolun keşfi. Nat. Ürün. Temsilci, 16, 565–574.

69. Müller,L., Caris-Veyrat,C., Lowe,G. ve Bohm,V. (2016) Likopen ve kardiyovasküler hastalıkların önlenmesinde antioksidan rolü – kritik bir inceleme. Kritik. Rev. Gıda Sci. Nutr., 56, 1868–1879.

70. Miura,Y., Kondo,K., Saito,T., Shimada,H., Fraser,PD ve Misawa,N. (1998) Gıda mayası Candida utilis'te karotenoidler olan likopen, beta-karoten ve astaksantin üretimi. Başvuru Çevre. Microbiol., 64, 1226–1229.

71. Goodall,ECA, Robinson,A., Johnston,IG, Jabbari,S., Turner,KA, Cunningham,AF, Lund,PA, Cole,JA ve Henderson,IR (2018) Escherichia coli K{'nın temel genomu {2}}. Mbio, 9, e02096-17.

72. Baba,T., Ara,T., Hasegawa,M., Takai,Y., Okumura,Y., Baba,M., Datsenko,KA, Tomita,M., Wanner,BL ve Mori,H. (2006) Escherichia coli K-12 çerçeve içi, tek gen nakavt mutantlarının inşası: Keio koleksiyonu. Mol. Sistem Biol., 2, 2006.0008.

73.Bertram,R. ve Hillen, W. (2008) Prokaryotik gen regülasyonu ve ekspresyonunda Tet baskılayıcının uygulanması. Mikrop. Biyoteknoloji, 1, 2–16.