Siklopentanon, B16F10 Melanomunda Anti-Melanogenez ve Kırışıklık Karşıtı Aktiviteler Gerçekleştirir

İletişim:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hee Jin Jung 1, A Kyoung Lee 1,2, Yeo Jin Park 1,2, Sanggwon Lee 1,2, Dongwan Kang 1,2,Young Suk Jung 1,2, Hae Young Chung 1,2 ve Hyung Ryong Moon 1, 2,*

Soyut:Ultraviyole (UV) radyasyona maruz kalma, cilt hiperpigmentasyonu ve kırışma ile sonuçlanan dış cilt yaşlanmasının birincil nedenidir. Bu çalışmada (2E,5E)-2,5-bis(3-hidroksi-4-metoksibenziliden)siklopentanonun (BHCP) B16F10 melanomu ve anti-beyazlatma etkisini araştırdık. Hs27 fibroblast hücrelerinde kırışıklık aktivitesi. BHCP'nin, 1.10 μM ve 8.18 μM formikofenolat (L-tirozin) ve difenolaz (L-DOPA) yüzde 50 inhibisyon konsantrasyonu (IC50) değerleriyle tirozinazı güçlü bir şekilde inhibe ettiği bulundu ve enzim kinetiği çalışması, BHCP'nin rekabetçi tipte bir tirozinaz inhibitörü olduğunu ortaya çıkardı. . Ayrıca, BHCP, melanin içeriğini ve hücresel tirozinaz aktivitesini önemli ölçüde inhibe etti ve mikroftalmi ile ilişkili transkripsiyon faktörü (MITF), fosforile cAMP yanıt elemanı bağlayıcı (CREB) proteini ve -melanosit uyarıcı hormondaki (-MSH) tirozinaz seviyelerini aşağı regüle etti. B16F10 melanom hücreleri. Ayrıca, BHCP, Hs27 fibroblastlarında p65'in fosforilasyonunu ve matris metalloproteinazların (MMP-1, MMP-9, MMP-12 ve MMP-13) ekspresyonunu inhibe etti. UV radyasyonu ile uyarılır. Bu nedenle, sonuçlarımız BHCP'nin hiperpigmentasyon ve buruşma ile ilişkili hastalıklar için terapötik ajanların geliştirilmesi için iyi bir aday olabileceğini göstermektedir.

Anahtar Kelimeler: (2E,5E)-2,5-Bis(3-hidroksi-4-metoksibenziliden)siklopentanon (BHCP); tirozinaz inhibitörü; anti-melanogenez; Kırışıklığa karşı

Cistanchekırışıklık karşıtı.

1. Giriş

Cilt yaşlanması, hem iç hem de dış faktörlerin sorumlu olduğu ciltte fonksiyonel ve estetik değişikliklere yol açan karmaşık ve ilerleyici bir süreçtir [1]. Dış cilt yaşlanmasına ultraviyole (UV) radyasyon, stres veya sigara gibi çevresel saldırganlar neden olur. Bununla birlikte, esas olarak fotoyaşlanma olarak adlandırılan güneşten gelen UV'ye tekrar tekrar maruz kalmaktan kaynaklanır. Cilt fotoyaşlanma, kaba ve derin kırışıklıklar, kalınlık, pürüzlülük, dispigmentasyon ve histolojik değişiklikler ile karakterizedir [2-4].

Polifenol oksidaz olarak da bilinen tirozinaz (EC 1.14.18.1), melanin sentezinde yer alan çok işlevli bakır içeren enzimlerden biridir ve doğada yaygın olarak bulunur [5]. Tirozinaz tipik olarak mikroorganizmaların çoğunda bulunur, bitkiler, ve hayvanlar. Bitkilerde, tirozinaz, monofenolleri difenollere oksitleyerek (mikofenolat aktivitesi) etki eder ve o-difenollerin o-kinonlara oksidasyonunda (difenolaz aktivitesi), ardından kinonların koyu kahverengi pigmentlere oksidasyonunda yer alır [6].

Melanogenez, L-tirozinin 3,4-dihidroksifenilalanine (L-DOPA) dönüşümüdür, burada L-DOPA, DOPA kininine dönüştürülür [7]. Bu nedenle, tirozinaz, melanositlerde melanin üretiminde önemli bir rol oynar ve tirozinazın inhibisyonu, pigmentasyonla ilgili bozuklukların iyileştirilmesi ve beyazlatıcıların geliştirilmesi için çekici bir hedeftir [8,9]. Melanin sentezi, UV ve izobütilmetilksantin (IBMX) ve alfa-melanosit uyarıcı hormon (-MSH) gibi kimyasallar gibi çeşitli uyaranlarla indüklenir. -MSH, reseptörü melanokortin 1 reseptörüne (MC1R) bağlanır ve ardından sitoplazmik siklik AMP(cAMP) seviyesini arttırır. Artan cAMP seviyesi, cAMP yanıt elemanı bağlayıcı proteinin (CREB) fosforilasyonu yoluyla mikroftalmi ile ilişkili transkripsiyon faktörünün (MITF) ekspresyonunu indükleyen protein kinaz A'yı (PKA) aktive eder. MITF, tirozinaz, tirozinazla ilişkili protein(TRP)-1 ve TRP-2 ekspresyonunu indükler, bu da sonuçta artan melanin sentezi ile sonuçlanır [10]. MITF, melanogenezin bir anahtar transkripsiyon faktörü olarak kabul edilir; bu nedenle, melanogenezi inhibe etmek için MITF ekspresyonunu kontrol etmek için birçok çalışma yapılmıştır [11].

Kırışıklık oluşumunun derinin hücre dışı matrisinin bozulması ile yakından ilişkili olduğu bilinmektedir ve UV radyasyonu nükleer faktör-κB'yi (NF-κB) aktive ederek kollajen parçalanması ve matris metalloproteinazların (MMP'ler) üretimini arttırır [2]. MMP'ler, derideki hücre dışı matris yapısının yeniden şekillenmesinde önemli olan çinkoya bağımlı endopeptidazlardır. Bu nedenle, UV ile indüklenen MMP'ler tarafından kollajen ve matrisin aşırı degradasyonu, fotohasarlı cildin karakteristik bir özelliğidir ve MMP'ler, UV ile indüklenen fotoyaşlanmanın yanı sıra cilt iltihabının ana belirteci olarak kullanılır [12].

Kurkumin benzeri diarilheptanoid iskelet türevleri antioksidanlar, bildirilen antikanser, aktiviteler dahil olmuştur. (2E,5E)-2,5-bis(3-hidroksi-4-metoksibenziliden)siklopentanon dahil (BHCP) (Şekil 1),geniş bir yelpazede anti-inflamasyon, anti-melanogenez sergilemek, Özellikle, Leow ve ark. [19] biyoaktiviteler ve anti-tirozinaz [13-18]dibenziliden-siklopentanon 2014'te, Wnt/ -kateninsinyalleme yolunun düzenlenmesi yoluyla insan osteosarkomu üzerindeki koruyucu etkilere katkıda bulunabileceğini bildirdiler. Bununla birlikte, BHCP'nin anti-melanogenez ve anti-kırışıklık etkileri keşfedilmeyi beklemektedir ve aktivitesinin altında yatan moleküler mekanizmalar henüz net olarak kurulmamıştır.

Şekil 1. (2E,5E)-bis(3-hidroksi-4-metoksibenziliden)siklopentanonun (BHCP) yapısı.

Bu çalışmada, BHCP'nin anti-melanogenezi ve anti-kırışıklık potansiyelini araştırdık ve tirozinaz inhibisyon deneyi ve enzim kinetiği analizi kullanılarak keşfedilen, özellikle melanin içeriği ve hücresel tirozinaz aktivitesi ile ilgili mekanizmayı belirlemeye çalıştık. Ayrıca, BHCP'nin, -MSH ile indüklenen B16F10 fare melanom hücrelerinde CREB/MITF/tirozinazın aşağı regülasyonu ve UV ile indüklenen Hs27 insan fibroblastlarında p65 ve MMP ekspresyonunun fosforilasyonunun inhibisyonu ile ilişkili melanogenez ve kırışıklıklar üzerinde inhibitör bir etki uyguladığını gösterdik.

ejderha otları cistanche

2. Sonuçlar ve Tartışma

2.1. (2E,5E)-2,5-Bis(3-hidroksi-4-metoksibenziliden)siklopentanon (BHCP) sentezi

Bir {{0}}hidroksi-4-metoksibenzaldehit (100 mg, 0.66 mmol, izovanillin) ve siklopentanon (0.03 mL, 0.33) çözeltisi mmol) 1 N HC1-asetik asit çözeltisi (0.02 mL) içinde 2 saat 25 ◦C'de karıştırıldı. 1 gün bekletildikten sonra reaksiyon karışımı, az miktarda metanol varlığında soğuk su ile işlendi, süzüldü ve yüzde 56.9 verimle BHCP (65.9 mg) üretmek üzere soğuk su ile yıkandı. BHCP, aşağıdakileri içeren spektroskopik yöntemlerle tanımlandı: 1H ve 13C-NMR'nin yanı sıra yayınlanmış spektral verilerle karşılaştırma ve İnce Katman Kromatografisi (TLC) analizi [19]. Yapı Şekil 1'de gösterilmektedir.

BHCP: sarı amorf toz (CHCl3); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 9,25 (s, 2H, 2 x OH),7,28(s,2H,2×vinilH), 7,14 (d, 2H) , J=2.0 Hz, 2 × 2-Y), 7.11 (gg, 2H, J=8.5, 2.0 Hz, 2×6- H),7.01 (d, 2H, J=8.5 Hz, 2 × 5-H), 3.81 (s, 6H, 2 × OMe), 3.01 (s, 4H, 2 × CH2) ; 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) 8: 195.5, 149.9, 147.2, 136.0, 133.1, 129.1, 124.3, 117.5, 112.8, 56.3, 26.6; ESI-MS: m/z 351 (M − H)−.

2.2. BHCP'nin Mantar Tirozinaz Aktivitesi Üzerindeki İnhibitör Etkisi

Tablo 1'de gösterildiği gibi, BHCP, 1,10 ± 0,12 μMand 8,18 ± 0,44 μM IC50 değerleriyle tirozinazı inhibe ederken, kojik asit (pozitif kontrol) 18,68 ± 1,40 μMand 33,89 ± 1,16 IC50 değerlerine sahipti. sırasıyla monofenolaz ve difenolaz için μM. Tirozinazın sentetik potansiyel inhibitörlerine ilişkin önceki çalışmamızda, benzilidenin 3-hidroksi ve 4-metoksi gruplarının tirozinaz aktif bölgesine doğru büyük bağlanma eğilimlerine sahip olduğu moleküler modelleme çalışmaları yoluyla mekanizmayı bulduk [20]. Bu çalışma sonucundan, fonksiyonel gruplarının (3-hidroksi ve 4-metoksi grupları) tirozinaz inhibitör aktivitesinde önemli bir artış ile ilişkili olduğu gösterilmiştir.

Tablo 1. BHCP'nin tirozinaz inhibitör aktivitesi ve enzim kinetik analizi.

Ayrıca, bu çalışmada BHCP tarafından tirozinaz inhibisyonundan sorumlu mekanizma, enzim kinetik analizi ile araştırılmıştır (Tablo 1 ve Şekil 2). Lineweaver-Burk grafikleri, kinetik çalışmalardan elde edilen veriler kullanılarak çizilmiştir ve inhibisyon sabiti (Ki), Dixon grafiklerinden elde edilmiştir. Lineweaver–Burk ikili karşılıklı grafikleri, rekabetçi tipte inhibisyonu gösterdi. Şekil 2a-c'de gösterildiği gibi, BHCP hem L-tirozin hem de L-DOPA'nın rekabetçi bir inhibitörü olarak görev yaptı. Ayrıca, Dixon grafiklerinin x ekseni üzerindeki kesişmeler genellikle bir enzim-inhibitör kompleksi [21,22] için enzim inhibisyon sabitlerinin (Ki) tiplerini belirlemek için kullanılır, burada thex ekseninin değeri −Ki değerini gösterir. Şekil 2b–d'de gösterildiği gibi, BHCP'nin Ki değerleri, sırasıyla L-tirozin ve L-DOPA için substratlar olarak 1,7 μMand 10,5 μM idi. Ki değeri, bir enzim-inhibitör kompleksi oluşturmak için gereken konsantrasyonu temsil ettiğinden, daha düşük bir Ki değeri, tirozinaza karşı daha etkili inhibisyon anlamına gelir.

Şekil 2. BHCP tarafından tirozinaz enzim inhibisyonu için Lineweaver–Burk (a,c) ve Dixon (b,d) grafikleri.

2.3. BHCP'nin B16F10 Melanom ve Hs27 Fibroblast Hücrelerinin Hücre Canlılığı Üzerindeki Etkileri

BHCP'nin herhangi bir anti-melanogenez ve kırışıklık karşıtı aktivite gösterip göstermediğini belirlemeden önce, farklı zaman aralıkları için farklı BHCP konsantrasyonları ile muamele ederek BHCP'nin B16F10 hücrelerine ve Hs27 hücrelerine sitotoksisitesini inceledik ve hücre canlılığı EZ-Cytox tahlili ile ölçüldü. Şekil 3a,b'de gösterildiği gibi, 48 saat boyunca 10 μM'ye kadar BHCP, B16F10 hücrelerinin veya Hs27 hücrelerinin hayatta kalmasını azaltmadı. Daha sonra, BHCP'nin anti-melanogenez ve anti-kırışıklık aktiviteleri üzerine in vitro çalışmalar 1, 5 ve 10 uM ile yürütülmüştür.

2.4. BHCP'nin B16F10 Melanom Hücrelerinde Melanin İçeriğine ve Hücresel Tirozinaz Aktivitesine Karşı İnhibisyonu

BHCP'nin -MSH ile indüklenenB16F10 hücrelerinin melanin içeriği üzerinde inhibitör potansiyel uygulayıp uygulamadığını belirlemek için hücreler, belirtilen farklı konsantrasyonlarda (1, 5 ve 10 uM) BHCP veya kojik asit (5 mM) ile 24 saat boyunca ön işleme tabi tutuldu ve daha sonra uyarıldı. -MSH ile 48 saat. Şekil 4a'da gösterildiği gibi, -MSH varlığında BHCP ile tedavi edilen hücrelerdeki melanin içeriği, konsantrasyona bağlı bir şekilde azaldı, 1 μM'de yüzde 113, 5 μM'de yüzde 106 ve 10 μM'de yüzde 102 gösterdi. sadece -MSH ile tedavi edilen kontrol grubu (yüzde 186). İlginç bir şekilde, BHCP (1 μM), melanin içeriğini kojik asitten (5 mM) daha güçlü bir şekilde inhibe etti. Ayrıca, BHCP'nin B16F10 hücreleri üzerindeki inhibitör etkisini ölçmek için bir hücresel tirozinaz aktivite tahlili yapıldı. Şekil 4b'de gösterildiği gibi, BHCP, sadece -MSH ile tedavi edilen kontrol grubuna kıyasla, tirozinaz aktivitesi ile konsantrasyona bağlı bir şekilde 1 μM'de yüzde 120, 5 μM'de yüzde 116 ve 10 μM'de yüzde 105 azaldı (181 yüzde ).BHCP'nin önleyici etkisi, kojik asitten çok daha güçlüydü; 1 uM'de BHCP'nin inhibisyonu, 5 mM'de (yüzde 131) kojik asitten daha üstündü. Bu sonuçlar, BHCP'nin B16F10 melanositlerinde melanin biyosentezini ve hücre içi tirozinaz sentezini inhibe ederek beyazlatma etkisine sahip olduğunu göstermektedir.

Şekil 4. BHCP'nin melanin içeriğinin (a) ve hücresel tirozinaz aktivitesinin (b) B16F10melanom hücreleri üzerindeki inhibisyonu.

2.5. BHCP'nin B16F10 Hücrelerinde MITF/Tirozinaz ve Fosforillenmiş CREB Ekspresyonu Üzerindeki Etkileri

Spesifik bir transkripsiyon faktörü olan MITF, tirozinaz dahil olmak üzere melanojenik genleri etkin bir şekilde aktive etmede, melanin biyosentezindeki hız sınırlayıcı adımı katalize etmede çok önemli bir rol oynar: TRP-1 ve TRP-2. CREB'nin fosforilasyonu ile arttırılabilir [23]. CREB önemli bir MITF promotörüdür [24,25] ve melanositlerde CREB'nin fosforilasyonu, melanositlerdeki CREB'ye (c-AMP yanıt elementi bağlayıcı protein) bağlanarak MITF ekspresyonunu arttırır [26]. BHCP'nin B16F10 hücreleri üzerindeki anti-melanojenik etkisinden sorumlu moleküler yolakları aydınlatmak için, Western blot analizi ile melanogenezde önemli rol oynayan CREB ve MITF dahil olmak üzere anahtar moleküllerin protein seviyelerini inceledik. Hücreler, BHCP veya kojik asit ile muamele edildi ve daha sonra -MSH ile 48 saat boyunca uyarıldı. Ölçümler için zaman aralığı, önceki çalışmalarda [27] açıklanan metodolojiyi takip etti. Şekil 5'te gösterildiği gibi, tirozinaz ve MITF seviyeleri -MSH ile arttı, ancak BHCP bu protein seviyelerini düşürdü. Ayrıca, CREB'nin fosforilasyonu BHCP tarafından önemli ölçüde bastırılmıştır. -MSH ile indüklenen CREB fosforilasyonunun düzenlenmesinin, pigmentasyonun düzenlenmesinde potansiyel olarak önemli olduğu bilinmektedir [28]. Bu sonuçlar, BHCP'nin anti-melanojenik etkilerinin, fosforlanmış CREB'nin aşağı regülasyonu yoluyla MITF ve tirozinazın aşağı regülasyonundan kaynaklandığını göstermektedir. Bu çalışma, BHCP'nin tirozinaz ve melanogenez üzerindeki inhibisyon mekanizmasının aydınlatılmasının çok önemli olduğunu ve gelecekte daha fazla araştırılması gerektiğini ileri sürmektedir. B16F10 melanom hücre dizisi genellikle sinyal mekanizmalarını in vitro araştırmak için daha uygun olsa da, B16F10 hücre dizisi bir kemirgen melanomudur. Bu nedenle, bulguları doğrulamak için insan melanositleri üzerinde daha fazla araştırma yapılması gerekecektir.

2.6. BHCP'nin Hs27 Hücrelerinde UV ile İndüklenen NF-κB p-p65 Aktivasyonu Üzerindeki Etkisi

Daha sonra BHCP'nin, Hs27 fibroblastlarını kullanan UV kaynaklı inflamatuar mediatör ekspresyonu üzerindeki etkisini araştırdık. Daha önce, p65'in (Ser536) fosforilasyonunun, genleri transaktive etme kapasitesi için gerekli olduğu bildirilmişti [29]. Bu nedenle, p-p65 (Ser536) ve p65'in protein seviyeleri, Western blot ile çekirdek fraksiyonunda incelenmiştir. Şekil 6a,b'de gösterildiği gibi, Hs27hücrelerinde UV, çekirdekteki p-p65 (Ser536) protein seviyelerini arttırırken, BHCP tedavisi, çekirdek p-p65 (Ser536) protein seviyelerini azalttı. Buna uygun olarak, sitoplazmada toplam p65 miktarı UV ile azaltıldı ve BHCP tarafından restore edildi (Şekil 6c,d). UV indüksiyonundan sonra p65'in protein ekspresyon seviyeleri sitoplazmada azalmasına ve çekirdekte artmasına rağmen, BHCP ile ön tedavi, bu eğilimleri doza bağlı bir şekilde tersine çevirdi. Bu nedenle, bu sonuçlar, p-p65'in BHCP tarafından inhibisyonunun, UV'ye karşı cilt pigmentasyonu ve kollajen yıkımı üzerindeki koruyucu etkilere katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir.

Şekil 6. UV ile indüklenen Hs27 insan fibroblast hücrelerinde p-p65 (Ser536) ekspresyon seviyeleri üzerinde BHCP'nin etkileri.

2.7. BHCP'nin Hs27 Hücrelerinde MMP'lerin Ekspresyonu Üzerindeki Etkisi

MMP'ler cilt yaşlanmasında hayati bir rol oynar. UV ışınlaması, MMP'lerin ekspresyonunu yukarı doğru düzenleyerek derinin bağ dokularını değiştirir [30,31]. MMP-1, tip I prokollajenden sentezlenen kolajenin parçalanmasını hızlandıran bir kolajen ayrıştırıcı enzimdir. MMP-9, MMP-1 tarafından kesilen kolajen liflerini parçalayan, kırışıklık üretimini ve elastikiyet kaybını artıran jelatin ayrıştırıcı bir enzimdir. BHCP'nin UV indüksiyonuna karşı kırışık önleyici etkisini incelemek için, Western blot yöntemiyle MMP-1 ve MMP-9 protein seviyelerini belirledik. Ayrıca, UV ile indüklenen hücreler, MMP-1 yerine tip I ve III kollajenin bozulmasını başlatan önemli ölçüde yüksek MMP-13 seviyesi gösterdi [32]. UV kaynaklı Hs27 hücrelerinin 1 ve 10 μM'de BHCP ile işlenmesinden sonra MMP'lerin (MMP1, MMP9, MMP12 ve MMP13) artışını araştırdık. Şekil 7'de gösterildiği gibi, UV indüksiyonundan sonra MMP-1, MMP-9, MMP-12 ve MMP-13 ekspresyon seviyeleri arttı, ancak BHCP tedavisi bir dozda ekspresyonu azalttı -bağımlı bir şekilde. Sonuçlarımız, BHCP'nin UV'ye maruz kalmanın neden olduğu anormal MMP üretimini azaltarak kırışıklık oluşumunun önlenmesine katkıda bulunabileceğini göstermektedir. Bu sonuçlar, BHCP'nin, kollajen ayrışmasını ve dolayısıyla kırışıklık üretimini önlemek için Hs27fibroblastlarda MMP ekspresyonunu inhibe ettiği anlamına gelir. Bu nedenle, BHCP, ciltle ilgili hastalıkların önleyici ve tedavi edici bir ilacı olarak kullanım potansiyeli sergiler.

cistanche sapı faydaları

3. Gereç ve Yöntemler

3.1. Kimyasallar ve Enstrümantasyon

Mantar tirozinaz (EC 1.14.18.1), -MSH, L-tirozin, 3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA), dimetil sülfoksit (DMSO) ve kojik asit Sigma-Aldrich'ten (St. Louis, MO, ABD).Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM), fetal sığır serumu, streptomisin ve amfoterisin, Gibco Life Technologies Inc.'den (Carlsbad, CA, ABD) satın alınmıştır. MITF,CREB, p-CREB, p-p65 (Ser536), p65, tirozinaz, MMP-1, MMP-9, MMP-12, MMP-13, TFIIB'ye karşı antikorlar ve -aktin Santa Cruz Biotechnology'den (Santa Cruz, CA, ABD) satın alındı. Poliviniliden diflorür (PVDF) membranları Millipore Corporation'dan (Bedford, MA, ABD) elde edildi. Doku kültürleri için steril plastik kaplar SPL Labware'den (Seul, Kore) satın alındı. UV ışık kaynağı Crosslinker 800 serisi (UVP, CA, ABD) 6 lambalı ünite (8 watt/lamba) tarafından sağlandı. Silika jel üzerinde ince tabaka kromatografisi ve silika jel 60 (ağ 230-400) yapıldıF{{27} }Merck Millipore'dan (Darmstadt, Almanya) önceden kaplanmış plakalar. NMR spektrumları, bir Varian Unity INOVA 400 (1H için 400 MHz, 13C için 100 MHz) ve Varian Unity AS 500 (1H için 500 MHz) aletleri kullanılarak kaydedildi. Kimyasal kayma değerleri (δ), ilgili kalıntı çözücü veya döteryumlu piklere (DMSO için δH 2.50 ve δC 39.51) atıfta bulunularak rapor edilir. Düşük çözünürlüklü kütle spektrometrisi verileri, bir Expression CMS kütle spektrometresi (Advion, Ithaca, NY, ABD) ile elde edildi.

3.2. Mantar Tirozinaz İnhibisyon Testi

Mantar tirozinaz inhibitör aktivitesi, Jung ve diğerleri tarafından açıklanan prosedüre dayalı olarak hem L-tirozin hem de L-DOPA alt-tabakaları kullanılarak belirlendi. [23]. Kısaca, bileşiklerin varlığında veya yokluğunda 190 μL tirozinaz enzimi (1 mM L-tirozin ve L-DOPA çözeltisi dahil mantar tirozinaz tamponu ile seyreltilmiş 1000 U) ilave edildi (1 ila 20 μM arasında değişen nihai konsantrasyon, içinde çözülmüş) Yüzde 100 DMSO), bir 96-kuyulu plakanın her kuyucuğuna, 200 μL'lik bir nihai hacim sağlamak için. Plak 37 ◦C'de 30 dakika inkübe edildi. Tirozinaz aktivitesi, bir mikroplaka okuyucu (TECAN, Salzburg, Avusturya) kullanılarak 492 nm'de absorbans ölçülerek nicelendirildi ve inhibisyon yüzdesi (yüzde) aşağıdaki denklemden elde edildi:

yüzde engelleme=(Ac − As)/Ac × 100 (1)

burada Ac, kontrolün absorbansı ve As ise numunenin absorbansıdır. IC50 değerleri log-lineer eğrilerden ve bunların denklemlerinden hesaplanmıştır. Üç belirleme için ortalama sonuçlar gösterilmektedir. Pozitif kontrol olarak kojik asit kullanıldı.

3.3. Tirozinaz İnhibisyonunun Kinetik Analizi

Kinetik mekanizmaları belirlemek için iki kinetik yöntem (Lineweaver-Burk ve Dixon çizimleri) tamamlayıcı olarak kullanıldı [21,22,33]. Lineweaver–Burk ikili karşılıklı grafikler için (1/substrat konsantrasyonuna (1/[S]) karşı 1/enzim hızı (1/V) grafiği), inhibisyon tipi, çeşitli L-tirozin konsantrasyonları (1, 2, ve 4 mM) ve L-DOPA (0.5, 1 ve 2 mM), farklı BHCP konsantrasyonlarının varlığında substrat olarak. BHCP konsantrasyonları aşağıdaki gibidir: L-tirozin için 0, 0.5, 1.{{20}} ve 2.0 μM; ve L-DOPA için 0, 2.5, 5 ve 10 μM. Dixon grafiği, enzim inhibisyonunun tipinin belirlenmesi için inhibitör konsantrasyonuna (I) karşı 1/enzim hızı (1/V) grafiği) ve enzim-inhibitör kompleksi için ayrışma sabitini veya Ki'yi belirlemek için kullanıldı. 1, 2 ve 4 mM ve {{40}}, 0.5, 1.{ L-tirozin substrat varlığında inhibisyonun Dixon grafikleri (tek karşılıklı grafikler) elde edildi. {47}} ve BHCP için 2.0 μM; ve BHCP için {{50}}.5, 1.0 ve 2.0 mM ve 0, 2.5, 5.0 ve 10.0 μM'de L-DOPAsubstrat.

sans bitkisibir tirozinaz inhibitörüdür.

3.4. Hücre Çizgileri ve Hücre Kültürü

Murin B16F10 melanom hücreleri, Korean Cell Line Bank'tan elde edildi. İnsan derisi fibroblast hücre çizgisi Hs27, American Type Culture Collection'dan (ATCC, Manassas, VA, ABD) satın alındı. Bu hücreler, yüzde 10 fetal bovineserum, 100 U/mL penisilin ve 100 mg/mL streptomisin ile desteklenmiş DMEM'de, 37 ◦C nemlendirilmiş yüzde 5 CO2 inkübatöründe tutuldu. 100 mm'lik bir tabak üzerindeki dermal fibroblastlar, BHCP ile işlendi ve serumsuz DMEM (UV ışık kaynağı, UVP) içinde 50 mJ/cm2UV'ye maruz bırakıldı. Hs27 hücreleri, 100 mm çaplı bir plakada yüzde 70-80 birleşme noktasına kadar kültürlendi ve 5 ve 15 numaralı geçitler arasında kullanıldı.

3.5. Hücre Canlılığı Testi

Hücrelerin canlılığı, EZ-Cytox kiti testi kullanılarak değerlendirildi. Kısaca, B16F10 hücreleri ve Hs27fibroblastlar, 1 x 104 hücre/kuyu yoğunluğunda bir 96-kuyu plakasına ekildi ve 24 saat 37 ◦C'de inkübe edildi. Hücreler, farklı konsantrasyonlarda (0, 1, 2, 5 ve 10 uM) BHCP içeren taze, serumsuz DMEM ile beslendi ve 24 ve 48 saat süreyle inkübe edildi. Daha sonra her kuyuya 10 μL EZ-Cytox solüsyonu yüklendi ve hücreler 2-4 saat inkübe edildi. Herhangi bir muamelenin yokluğunda hücrelerin absorbans ölçümü, yüzde 100 hücre sağkalımı olarak kabul edildi. Her muamele üç kopya halinde gerçekleştirildi ve her deney üç kez tekrarlandı.

3.6. Melanin İçeriği Tayini Tayini

BHCP'nin B16F10 hücrelerinde -MSH ile indüklenen melanogenez üzerindeki etkisi, hafif modifikasyonlarla daha önce kullanılan bir yönteme dayanmaktadır [34]. Kısaca, 6-kuyulu plakalardaki B16F10 hücrelerinin (5 x 104 hücre/kuyu) yüzde 70-80 birleşme noktasına kadar büyümesine izin verildi. Hücreler daha sonra farklı konsantrasyonlarda BHCP (1, 5 ve 10 uM) veya kojik asit (5 mM) ile 24 saat muamele edildi ve daha sonra 48 saat boyunca -MSH (5 uM) ile uyarıldı. İşlemden sonra hücreler iki kez buz gibi soğuk PBS ile yıkandı, DMSO içeren 90 μL 1 M NaOH solüsyonunda (yüzde 5) 60 oC'de 1 saat çözüldü ve absorbans 405 nm'de bir mikroplaka spektrofotometresi (TECAN, Salzburg) ile ölçüldü. , Avusturya). Deneydeki melanin miktarını ölçmek için, tedavi gruplarındaki inhibisyon oranı, hücre lizatlarının süpernatanında bulunan toplam protein miktarına göre düzeltilen bilinen sentetik melanin konsantrasyonlarının absorbansından hesaplandı. Muamele edilmemiş hücrelerin absorbansı üç kopya halinde ölçülmüştür.

3.7. Hücresel Tirozinaz Aktivite Deneyi

Hücresel tirozinaz aktivite tahlili, L-DOPA'nın oksidasyon hızı ölçülerek gerçekleştirilmiştir [35]. 5 x 104/hücre yoğunluğundaki B16F10 hücreleri, 6-kuyucuklara yerleştirildi ve gece boyunca inkübe edildi. Hücreler daha sonra çeşitli konsantrasyonlarda BHCP (1, 5 ve 10 uM) veya kojik asit (5 mM) ile 24 saat muamele edildi ve daha sonra 48 saat boyunca -MSH (5 uM) ile uyarıldı. Hücreler PBS ile yıkandı ve 100 uL 50 mM fosfat tamponu (pH 6.5), 0.1 mMfenilmetilsülfonilflorür (PMSF) ve yüzde 1 Triton X-100 içeren bir çözelti içinde lize edildi. Daha sonra hücreler derin dondurucuda (-80 ◦C) 30 dakika bekletildi. Hücrelerin buzları çözüldükten sonra, hücresel ekstraktlar 12, 000 rpm'de 30 dakika 4 ◦C'de santrifüj edilerek saflaştırıldı. Bir 96-kuyu plakasına toplam 80 μL süpernatant ve 20 μL ofL-DOPA (2 mg/mL) ilave edildi ve 492 nm dalga boyundaki absorbans 1 saat boyunca 37 ◦'de her 10 dakikada bir ölçüldü. ELISA plaka okuyuculu C (TECAN, Salzburg, Avusturya).

3.8. Hs27 Hücrelerinin Sitosolik ve Nükleer Ekstraktlarının Hazırlanması

Hs27 hücreleri, buz gibi soğuk PBS ile yıkandı ve toplandı. 10 mM Tris(pH 8.0), 1.5 mM MgCl2, 1 mM DTT, yüzde 0.1 NP-40 ve proteaz inhibitörleri içeren bir tampon, sitozolik fraksiyonların ekstraksiyonu için kullanıldı. 12, 000 rpm'de 4 oC'de 15 dakika santrifüj edildi ve 10 mM Tris, 50 mM KCl, 100 mM NaCl ve proteaz inhibitörleri içeren bir tampon kullanılarak peletlerden nükleer fraksiyonlar ekstrakte edildi, buz üzerinde 30 dakika inkübe edildi, ve daha sonra nükleer fraksiyonlar elde etmek için 13,000×g'de 30 dakika 4 ◦C'de santrifüjlendi.

3.9. Western Blotlama

Lizat numuneleri jel yükleme tamponunda (125 mM Tris-HCl, yüzde 4 sodyumdodesil sülfat (SDS), yüzde 10 2-merkaptoetanol ve yüzde 0,2 bromofenol içinde 10 dakika kaynatıldı mavi; pH 6.8) 1:1 hacim oranında. Her numune için toplam protein eşdeğerleri, Laemmli [36] tarafından açıklanan prosedüre göre akrilamid jeller kullanılarak SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile ayrıldı ve ıslak transfer sistemi kullanılarak 2 saat boyunca 80 V'ta PVDF membranlarına aktarıldı. Zarlar hemen 10 mM Tris, pH 7.5, 100 mMNaCl ve yüzde 0.1 Tween-20 içinde bir bloke edici tampona (yüzde 5 yağsız süt) yerleştirildi. Blotlar, 2 saat boyunca 25 ◦C'de spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için bloke edildi. Ardından, membranlar 4 ◦C'de gece boyunca spesifik bir birincil antikor ile inkübe edildi, ardından yaban turpu peroksidaz konjuge sekonder antikor ile 1 saat boyunca 25 ◦C'de inkübe edildi. . Antikor etiketlemesi, üreticinin talimatlarına göre geliştirilmiş kemilüminesans ile saptandı. Protein miktar tayini, Davinch-Chemi TM.Chemiluminescence Imaging System CAS-400SM (Core Bio, Seul, Kore) kullanılarak yapıldı. Moleküler ağırlığın belirlenmesi için önceden boyanmış protein belirteçleri kullanıldı.

3.10. İstatistiksel analiz

Tüm veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. Veriler, tedaviler arasındaki farklar için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile analiz edildi ve ardından Bonferroni post-hoc testi yapıldı. p < 0.05="" değeri="" istatistiksel="" olarak="" anlamlı="" kabul="">

4. Sonuçlar

Özetle, bu çalışmanın bulguları, BHCP'nin -MSH ile indüklenen B16F10melanositlerde melanin biyosentezi için anahtar bir enzim olan tirozinazın inhibisyonu yoluyla cilt beyazlatma etkisine sahip olduğunu göstermiştir. Ayrıca BHCP, kırışıklık önleyici etkiye sahip olması beklenen UV kaynaklı fibroblastlarda MMP protein seviyelerinin ekspresyonunu azalttı. BHCP'nin beyazlatma ve kırışıklık karşıtı etkilerini hayvan ve klinik çalışmalar yoluyla doğrulamak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Son olarak, BHCP'nin hem beyazlatıcı hem de kırışık önleyici etkilere sahip olduğu belirlendi, bu da hiperpigmentasyon ve buruşma ile bağlantılı hastalıklar için terapötik ajanların geliştirilmesi potansiyelini gösteriyor.

cistanche nedir

Daha fazla bilgi için lütfen buraya tıklayın.