Danegaptide, Böbreğin İnsan Proksimal Tübül Epitel Hücrelerinde TGF 1-Endüklenen Hasarı Önler

edmund.chen@wecistanche.com

Soyut:Kronikböbrek hastalığı(KBH), bir dizi komorbidite ile ilişkili küresel bir sağlık sorunudur. Son kanıtlar, CKD'nin ana altta yatan patolojisi olan tubulointerstisyel fibrozisin ilerlemesinde adenozin trifosfatın (ATP) hemikanal aracılı salınımının arttığını göstermektedir. Burada, tübüler epitelde hastalık ilerlemesi ile ilişkili proteinlerin ekspresyonu ve işlevindeki hemichannel aracılı değişiklikleri bloke etmede danegaptid'in etkisini değerlendiriyoruz.böbrekhücreler. Birincil insan proksimal tübül epitel hücreleri (hPTEC'ler), pro-fibrotik sitokin dönüştürücü büyüme faktörü (TGF 1) ± danegaptid'in beta1 izoformu ile tedavi edildi. qRT-PCR ve immünoblotlama, mRNA ve protein ekspresyonunu doğrularken, bir sitokin antikor dizisi proinflamatuar ve profibrotik sitokinlerin ekspresyonunu/salgısını değerlendirdi. Karboksifloresein boya alımı ve ATP biyoalgılama, hemikanal aktiviteyi ve ATP salınımını ölçerken, paraselüler geçirgenliği değerlendirmek için transepitelyal elektrik direnci kullanıldı. Danegaptide, karboksifloresein boya alımını ve ATP salınımını olumsuzladı ve tübüler yaralanma ile bağlantılı protein değişikliklerine karşı koruma sağladı. Cx43-aracılı ATP salınımının bloke edilmesi, hücre döngüsü inhibitörlerinin, yapışıkların ve sıkı bağlantı proteinlerinin ekspresyonunun kısmi restorasyonu ve azalmış paraselüler geçirgenlik ile paralel olmuştur. Ayrıca, danegaptid, anahtar adipokinlerin, sitokinlerin, kemokinlerin, büyüme faktörlerinin ve interlökinlerin ekspresyonu ve salgılanmasında TGF'nin 1- indüklediği değişiklikleri inhibe etti. Veriler, bir boşluk bağlantı modülatörü ve hemichannel bloker olarak danegaptid'in CKD'nin gelecekteki tedavisinde potansiyele sahip olduğunu göstermektedir.

Anahtar Kelimeler:danegaptid; konneksin; yarı kanal; ATP; kronik böbrek hastalığı; iltihap; fibroz; hPTEC'ler; TGF1; böbrek, böbrek

CISTANCH BÖBREK/BÖBREK HASTALIĞINI İYİLEŞTİRECEK

giriiş

Kronikböbrek hastalığı(KBH), artan kardiyovasküler hastalık ve morbidite riski ile ilişkili büyüyen bir sağlık sorunudur [1]. Küresel nüfusun yüzde 10'unu etkilediği tahmin edilen [2], risk faktörleri arasında yaş, diyabet, hipertansiyon, dislipidemi ve obezite yer almaktadır [3]. Hastalık, yaygın histopatolojik değişiklikler olan glomerüloskleroz, tübüler atrofi ve tübülointerstisyel fibrozis (TIF) ile proteinüriye ek olarak glomerüler filtrasyon hızında (GFR) azalma ile karakterizedir [4]. Epitelyal stabilite kaybı, kalıcı inflamasyon ve ekstraselüler matriksin artan birikimi ile sonuçlanan [5,6], TIF ve ilerlemiş KBH tedavisi karşılanmamış bir klinik ihtiyacı temsil eder [3]. Sonuç olarak, acil terapötik yaklaşımlar gereklidir. Değişen konneksin (Cx) ekspresyonu ve işlevi, CKD dahil ([8,9]'da gözden geçirildiği gibi) hastalığın çeşitli formlarının patolojisinde ([7]'de gözden geçirildiği gibi) yer almıştır. Konneksinler, konneksonlar olarak adlandırılan heksamerik yapılara oligomerize olan zara bağlı proteinlerin bir ailesidir [10]. Komşu hücreler hizalandığında, konneksonlar, doğrudan bir iletişim yoluna izin vererek, haberci moleküllerin değiş tokuş edilebileceği sürekli gözenekler olan boşluk bağlantılarını oluşturmak üzere kenetlenir [10]. Bağlanmadıklarında, konneksonlar, moleküllerin, örneğin, adenozin trifosfatın (ATP), purinoreseptörlerin aktivasyonu yoluyla komşu hücreleri etkilemek için lokal hücre dışı boşluğa salınabileceği hemikanallar oluştururlar [11]. Purinerjik P2X7 reseptörünün (P2X7R) ekspresyonu,böbrekdiyabetli bireylerin tübülleriböbrek hastalığı[12] ve fibrozisin ilerlemesinde hemböbrek[13-17] ve diğer doku tiplerinde [18-21]. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, purinerjik sinyallemeyi hedeflemek büyük ilgi gördü. Bununla birlikte, bugüne kadar, klinik deneyler, P2X7R antagonizmasının çeşitli inflamatuar koşullarda yararlı etkilerini göstermede başarısız olmuştur, bu etki belki de reseptör içindeki genetik varyasyonla ilişkili bir etkidir [22]. ATP salımının yukarı akışını hedeflemek bu sorunları ortadan kaldıracaktır.

Kanıtlar, konneksinlerin anormal ifadesini ve/veya aktivitesini çeşitli CKD formlarıyla ilişkilendirir [12,23-26]. Abed ve ark. tek taraflı üreter obstrüksiyonu (UUO) olan heterojen (Cx43 plus /-) farelerin, hücre dışı matris (ECM) birikiminin azaldığını ve inflamasyonun azaldığını [27], Cx43-spesifik mimetik, GAP{{6} gösterdiğini bildirdiler. }, monosit yapışmasını engelleyebildi ve renin bağımlı CKD'nin renin transgen (RenTG) fare modelinde kollajen I ekspresyonunu köreltti [25]. Daha yakın zamanlarda, proksi mal tübülde eksprese edilen baskın konneksin izoformu Cx43'ün diyabetik nefropatili bireylerden izole edilen biyopsi materyalinde yükseldiğini belirledik; bu gözlem, TGFp1-tedavi edilmiş primerde hemikanal aracılı ATP salınımının artmasıyla paraleldir. proksimal tübül hücreleri [12]. Hücre dışı ATP konsantrasyonlarındaki lokal artışların etkisini değerlendirirken, anormal Cx43-aracılı iletişimin, P2X7R'nin aktivasyonu yoluyla yapışıkların (örneğin, E-cadherin) ve sıkı (örneğin, Zona Occludens) bağlantı komplekslerinin sökülmesini başlattığını belirledik. UUO'nun heterojen bir Cx43 plus /- fare modelinde reddedilen bu etkiler [12], Cx43 ile tübüler yaralanma arasında açık bir bağlantı olduğunu düşündürür. Cx43'ün kısmi ablasyonu, tübüler hasarın fenotipik değişikliklerini başlatmada connexinlerin bir rolünü teyit ederken, Cx43 hemichannel bloker peptit5 ile farmakolojik müdahale, bu azalan Cx43 aktivitesinin koruyucu yapısının, hemichannel aracılı ATP salınımının inhibisyonundan kaynaklandığını ortaya koydu. Bloke edici yarı kanal aktivitesinin arkasındaki koruyucu yapının altını çizmek için mimetik peptitlerin kullanımı, retinopati [28], nöroinflamasyon [29], glioma [30,31] ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu [32, 33]. Sonuç olarak, çalışmalar değişen connexin aktivitesini artan inflamasyon [34-36] ve fibrozis [37-40] ile ilişkilendiriyor ve hemichannel- ve/veya gap-junction-aracılı iletişimin (GJIC) stabilize edilmesinin hasarın başlangıcını geciktirebileceğini öne sürüyor. çeşitli yaralanma modellerinde gözlemlenmiştir. Sonuç olarak, connexin hemichannels'in inhibe edilmesi, inflamasyonu azaltmak için çekici bir araç sağlar ve önemli ölçüde terapötik açıdan ilgi çekicidir.

Danegaptide ((2S, 4R)-1-(2-aminoasil)-4-benzamidopirrolidin2-karboksilik asit), ayrıca ZP1609 veya GAP-134 olarak da bilinir, küçük bir rotigaptidden türetilen dipeptid (AAP10, ZP123). Başlangıçta bir anti-aritmik ajan olarak geliştirilmiş [41], Cx43 [42] ile etkileşime girer ve güçlü bir boşluk bağlantı değiştiricisi [43] olarak görev yapar. Bileşik koruyucu ve anti-aritmik özellikler göstermiştir ve daha önce yerleşik kardiyak iskemik-reperfüzyon yaralanmaları modellerinde önemli etkiler göstermiştir [44,45]. Faz 2 insan klinik denemeleri, ne yazık ki, son noktalarını karşılayamasa da [46], diğer gruplardan yapılan çalışmalar, diğer doku tipleri ve hastalık modellerinde danegaptid'in terapötik potansiyelini araştırmıştır [41,47-49]. Ayrıca, hemikanal aktivitesini modüle etmedeki rolü hakkında çok az şey bilinmesine rağmen, danegaptid'in C6 glioma hücrelerinde hemichannel aracılı boya alımını azalttığı gösterilmiştir [43]. Buna rağmen, bu bileşiğin diğer doku tiplerinde hemichannel aracılı ATP salınımını bloke etmedeki rolü henüz doğrulanmamıştır.

CISTANCH BÖBREK/BÖBREK YETMEZLİĞİNİ İYİLEŞTİRECEK

Mevcut çalışma, birincil TGF 1- ile tedavi edilen insan proksimal tübül epitel hücrelerinde (hPTEC'ler) connexin aracılı hemichannel ATP salımını olumsuzlamada danegaptid'in etkinliğini araştırdı, progresyonla yaygın olarak ilişkili olan ekspresyona ve fonksiyonel değişikliklere karşı koruyucu rolünü tanımlamadan önce tubulointerstisyel fibrozis. İfade (qRT-PCR, immünositokimya, immünoblotlama, antikor dizileri) ve işlevdeki (ATP biyoalgılama, boya alımı, transepitelyal elektrik direnci, antikor dizileri) değişiklikleri belirlemek için teknikler kullanarak bulgularımız, nanomolar danegaptid konsantrasyonlarının Cx hemichannel aracılı ATP'yi bloke ettiğini göstermektedir. hücre döngüsü proteinlerinin (örn., p16, p21, siklin D1) ve reno-koruyucu faktörlerin (örn., Klotho) ekspresyonunda TGF 1-indüklenen değişiklikleri serbest bırakır ve kısmen hafifletir. Ayrıca, danegaptid, yapışık bağlantıların sökülmesi (E-kadherin kaybı dahil) ve sıkı bağlantıların (zona okludens 1 (ZO-1) ve claudin 2 kaybı dahil) dahil olmak üzere tübüler yaralanmada sıklıkla gözlenen değişiklikleri azaltır. Önemli olarak, proteom profil oluşturucu dizisi, danegaptid'in TGF 1 tarafından indüklenen anahtar hücre dışı matris proteinleri, adipokinler, kemokinler ve büyüme faktörlerinin ekspresyonu ve salgılanmasındaki değişiklikleri geri yükleme yeteneğini göstermiştir. Sonuç olarak, in vitro verilerimiz, danegaptid'in (50-100 nM) ), birincil hPTEC'lerde hemichannel aracılı ATP salınımını başarılı bir şekilde bloke edebilir ve geç evre KBH'de gözlendiği gibi, inflamasyon ve fibrozis ile ilişkili değişikliklere karşı kısmen koruma sağlayabilir.

2. Sonuçlar

2.1. Danegaptide Tübüler Epitel Hücre Canlılığını Etkilemezİnsanböbrek2 (HK2) hücresi, gece boyunca serumsuz bırakılmadan önce 48 saat boyunca düşük glikoz (5 mM) içinde kültürlendi ve ardından optimum TGF 1 konsantrasyonu (10 ng/mL) [12,24] ± kanegaptid (50) ile işleme tabi tutuldu. nM–1 µM) 48 saat (Şekil 1A, n=3). Bir 3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) tahlili, hiçbirinin TGF 1 (yüzde 101,9 ± 11,7) olmadığını doğruladı ne de danegaptid tek başına hücre canlılığını değiştirmedi (yüzde 95.2 ± 7 (50 nM), yüzde 103 ± 5.7 (100 nM) ve yüzde 96.6 ± 5.3 (1 uM)) kontrollere kıyasla. TGF 1- ile muamele edilmiş hücreler danegaptid (yüzde 104.1 ± 2.2 (50 nM), yüzde 93.4 ± 1.6 (100 nM) ve yüzde 89.3 ± 3.7 (1 uM)) ile birlikte inkübe edildiğinde hiçbir etki gözlenmedi. Bu verileri doğrulamak için bir kristal menekşe (CV) ve laktat dehidrojenaz (LDH) tahlili yapıldı. TGF 1- ile tedavi edilen hücrelerde LDH salınımı, kontrollerle karşılaştırılabilir (yüzde 109.3 ± 11.3) ve danegaptid ile birlikte inkübasyonun ek bir etkisi olmadı (106,4 ± 11,6 (50 nM), yüzde 113.9 ± 15.6 (100 nM)). ve 113.2 ± 4.3 yüzde (1 uM)). Beklendiği gibi, tek başına danegaptid, kontrollere kıyasla (yüzde 104.4 ± 4.3 (50 nM), yüzde 95.3 ± 4.7 (100 nM) ve yüzde 92.6 ± 3.3 (1 uM)) LDH salınımını önemli ölçüde değiştirmedi. Kristal viyole kullanılarak hücre boyaması, TGF 1 (10 ng/mL; yüzde 96.9 ± 7.3) ve TGF 1 artı danegaptid (50 nM–1 uM) için veriler kontrollerle karşılaştırılabilir (yüzde 98.2 ± 1.9 (50 nM) ile) bu bulguları özetledi. , yüzde 97.5 ± 1.8 (100 nM) ve yüzde 85.8 ± 5.3 (1 µM) Son olarak, tek başına danegaptid kristal mor boyamayı değiştirmedi (yüzde 98.3 ± 2.5 (50 nM), yüzde 99.6 ± 2.7 (100 nM) ve 98.5 ±) Kontrollerin yüzde 2,2'si (1 µM) Bu veriler ışığında, sonraki çalışmalar için 50-100 nM'lik bir konsantrasyon seçildi.

Şekil 1. Danegaptide, hemichannel aracılı boya alımında TGF 1-uyarılmış artışları önler. (A) panelinde, insanböbrek2 (HK2) hücresi, 48 saat boyunca düşük glikoz (5 mM) ± TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptid (50, 100 ve 1000 nM) içinde kültürlendi ve hücre canlılığı değerlendirildi. Sonuçlar ortalama ± SEM (n=3) olarak sunulmuştur. TGF 1 (10 ng/mL ± danegaptid (50–1000 nM)) ile inkübasyon 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,{{'yi değiştirmedi 19}}difeniltetrazolyum bromür (MTT) alımı, laktat dehidrojenaz (LDH) salınımı veya kristal viyole (CV) boyama. (B) ve (C) panellerinde, HK2 hücrelerinde ve insan proksimal tübül epitel hücrelerinde (hPTEC'ler) hemichannel aktivitesini değerlendirmek için karboksifloresein boya alımı kullanıldı, boya yükleme derecesi açılma ile doğru orantılıydı. Hücreler, 48 saat boyunca düşük glikoz (5 mM) ± TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptid (50 veya 100 nM) içinde kültürlendi. Danegaptide, HK2 hücrelerinde (panel (B)) ve hPTEC'lerde (panel (C)) karboksifloresein boya alımında TGF 1-uyarılmış artışları önledi. Kontrol hücrelerinde minimum boya yüklemesi meydana gelirken, TGF 1 ile muamele edilmiş hücrelerde boya yüklemesi önemli ölçüde arttı. Danegaptidin (50 veya 100 nM) eklenmesi boya alımını azalttı ve FL floresan yoğunluğunu kontrol seviyelerine geri döndürdü. Yoğunluk, düşük glikozlu kontrollere kıyasla yüzde olarak ifade edilir ve 3 ayrı deneyi temsil eder. Veriler, ortalama ± SEM (n=3) olarak sunulur, anahtar anlamlılık belirtilir (** p < 0.01,="" ***="" p="">< 0.001;="" tek="" yönlü="" anova="" ve="" tukey'nin="" son="">

2.2. Danegaptide, TGF'yi Engeller 1-Tübüler Epitel Hücrelerinde Hemichannel-Aracılı Boya Alımında Uyarılmış DeğişikliklerTGF 1'in Cx43-aracılı hemichannel aktiviteyi ve proksimal tübül epitel hücrelerinden ATP salınımını arttırdığını daha önce göstermiştik [24]. Danegaptidin, HK2 hücrelerinde ve birincil hPTEC'lerde hemikanallar yoluyla TGF 1- ile indüklenen boya alımını engelleyip engelleyemeyeceğini belirlemek için bir karboksifloresein boya alım tahlili kullanıldı. Beklendiği gibi, TGF 1 (10 ng/mL), HK2 hücrelerinde boya alımını kontrollerin yüzde 354.9 ± 32.6'sına yükseltirken, danegaptid (50 nM ve 100 nM) ile birlikte inkübasyon önemli ölçüde köreldi sırasıyla yüzde 165.5 ± 17.9 ve yüzde 147.6 ± 18.1'e yanıt (Şekil 1B; p 0.001'den küçük veya buna eşit n=4). Danegaptide tek başına boya alımını değiştirmedi. Karboksifloresein boya alımı, birincil hPTEC'lerde (kontrollerin yüzde 310.8 ± 38.6) TGF 1 (10 ng/mL) kadar arttı; bu yanıt, kontrollere kıyasla danegaptidin (100 nM; yüzde 145 ± 19.7 ) birlikte kuluçkalanmasıyla kısmen reddedildi. (Şekil 1C; p 0,01'den küçük veya eşit, n=4).

2.3. Danegaptide, HK2 Hücrelerinde TGF 1-İndüklenen Hemichannel-Aracılı ATP Salınımını OlumsuzlarDanegaptidin (5{{10}}–100 nM) TGF 1 (10 ng/mL) ile indüklenen ATP salınımını önleyip önleyemeyeceğini belirlemek için HK2 hücrelerindeki yarı kanallardan ATP biyoalgılama [24,50] kullandık. TGF 1 (10 ng/mL), ATP salınımını 0.33 ± 0.11 µM'den 3.60 ± {{40}'e yükseltti }.29 µM (Şekil 2A,B,E; p 0.001'den küçük veya buna eşit), hem 50 nM'de (1.90 ± 0.26 µM; p 0.01'den küçük veya eşit) danegaptid tarafından kısmen reddedilen bir etki ) ve 100 nM (0,79 ± 0,19 µM; p 0,001)'den küçük veya buna eşit (Şekil 2D,E, n=3, altı tekrar/örnek sayısı). Danegaptide tek başına ATP salınımını etkilemedi (Şekil 2C,E), kontrollere kıyasla ATP seviyeleri 0.35 ± 0.10 µM (50 nM) ve 0.31 ± 0.09 µM (100 nM) olarak kaydedildi (Şekil 2E).

2.4. Danegaptide, TGF'yi Tersine Çevirir 1-Hücre Döngüsü Proteinlerinde İndüklenen Değişiklikler ve hPTEC'lerde Reno-Koruma İşaretiDanegaptidin ortak hücre döngüsü ve reno-koruyucu belirteçlerin hemikanal aracılı düzenlemesini olumsuzlayıp engelleyemeyeceğini belirlemek için, hPTEC'ler TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptid (100 nM) ile inkübe edildi. 12 saat ve aday gen mRNA'sının ifadesi, qPCR analizi ile değerlendirildi. TGF 1- ile tedavi edilen hPTEC'lere danegaptid eklenmesi, p16 ifadesini kontrollerin yüzde 358.8 ± 21,1'inden yüzde 193 ± 18,5'e, p21 ifadesini yüzde 221,8 ± 12,9'dan yüzde 142,2 ± 6,2'ye ve siklin D1 ifadesini 253.2 ± 7.7'den döndürdü. yüzde 132,9 ± 15,0 (Şekil 3; p 0.001'den küçük veya buna eşit n=3). Ayrıca, danegaptid, Klotho'daki düşüşü kontrollerin yüzde 43,3 ± 3,8'inden yüzde 59,9 ± 11,7'sine kısmen tersine çevirdi (Şekil 3, n=3).

2.5. Danegaptide, TGF'yi Geri Yükler 1-hPTEC'lerde Adherens ve Sıkı Bağlantı Proteinlerinde ve Paraselüler Geçirgenlikte Aracılı Değişikliklerİçindeböbrekazaltılmış E-kadherin (ECAD) aracılı hücre yapışması, kısmi epitelyal-mezenkimal dönüşüm ile bağlantılı aralıklı bir fenotiple sonuçlanan bir dizi olayı başlatır. Başlatma, hem yapışıkların hem de sıkı bağlantı komplekslerinin sökülmesini kolaylaştırır, adezyon kaybı, hücrelerarası iletişimde azalma ve sızdıran epitel ile sonuçlanır [12,24,51]. Danegaptidin yapışma ve sıkı bağlantı proteinlerinde TGF 1-aracılı değişiklikleri engelleyip engellemediğini belirlemek için, hPTEC'ler TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptid (10{{41) ile inkübe edildi. }} nM) 48 saat ve aday proteinlerin ekspresyonu değerlendirildi. Danegaptide kısmen geri yüklenen E-kadherin ifadesi yüzde 33,3 ± 3,3'ten yüzde 89 ± 7,6'ya, N-kadherin (NCAD) ifadesi yüzde 224.4 ± 29.6'dan 161.9 ± 27,4'e ve vimentin ifadesi yüzde 212,9 ± 13'ten yüzde 147,3 ± 8,8'e ( Şekil 4A; p 0'e eşit veya daha az.001, p 0,01'e eşit veya daha küçük ve p Sırasıyla, 0,01'e eşit veya daha küçük; n {{43} }). -katenin ekspresyonu, hemichannel bloker tarafından yüzde 149.2 ± 11,2'den (tek başına TGF 1) yüzde 151.6 ± 16.8'e (TGF 1 artı danegaptid, Şekil 4B; p=NS, n=3) değişmeden kaldı. Danegaptidin sıkı bağlantı proteinleri üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi, boşluk bağlantı modülatörünün claudin-2 ifadesini kontrollerin yüzde 44,5 ± 5'inden yüzde 74.6 ± 5'e ve ZO-1 ifadesini 27,8 ± 11,3'ten kısmen geri yüklediğini doğruladı. kontrollere kıyasla yüzde 52,8 ± 5,4 (Şekil 4B; p 0,05'e eşit veya daha küçük, n=3). Transepitelyal elektrik direncini inceleyen çalışmalar, TGF 1 (10 ng/mL) ile görülen sıkı bağlantı proteinlerinin ekspresyonunun azalmasının, 57.33 ± 1'den transepitelyal direnç kaybıyla paralel olduğunu doğruladı86 Ω·cm2'den 10 ± 1.53 Ω· cm2 (p 0.001'den küçük veya buna eşit n=3). Bu artan sızıntı, danegaptid (36 ± 2.08 Ω·cm2) (Şekil 4C; p 0.001'den küçük veya buna eşit n=3) ile birlikte kuluçkalama ile kısmen düzeltildi.

2.6. Danegaptide, hPTEC'lerde Hücre Dışı Matriks Proteinlerinin TGF 1-Uyarılmış Yukarı Düzenlenmesini Önleroluşum ve bozulma arasındaki dengesizliğin neden olduğu ECM birikimi, CKD'nin önemli bir özelliğidir. TGF 1'in bu süreçteki rolü iyi bilinmektedir [52] ve bu değişikliklerin nasıl reddedileceğinin anlaşılması, hastalığın ilerlemesinde açık çıkarımlara sahiptir. Danegaptidin ECM proteinlerinin ekspresyonundaki TGF 1-uyarılmış değişiklikler üzerindeki etkisini incelemek için, hPTEC'ler 48 saat boyunca düşük glikozda (5 mM) kültürlendi, gece boyunca serumda aç bırakıldı ve TGF 1 (1{{{{{ 28}} ng/mL) ± danegaptid (100 nM) 48 saat süreyle. Kontrollerle karşılaştırıldığında, TGF 1, ECM proteinleri kollajen I (yüzde 334.6 ± 30.14), kollajen IV (yüzde 354.5 ± 16.9), fibronektin (yüzde 301.7 ± 50.4) ve laminin (yüzde 324.8 ± 36.4) ekspresyonunu arttırdı (Şekil 5A, B; p 0.001'den küçük veya buna eşit n=3). Danegaptid ile birlikte inkübasyon, ifadeyi yüzde 180,7 ± 27,3 (kollajen I), yüzde 164 ± 6,9 (kollajen IV), yüzde 161,3 ± 4 (fibronektin) ve yüzde 149 ± 20,4'e (laminin) geri getirerek bu değişiklikleri önemli ölçüde azalttı (p Daha az 0.001'den büyük veya eşittir; n=3 her durumda). Danegaptide (100 nM) ayrıca integrin bağlantılı kinaz 1'de (ILK1) TGF 1 (10 ng/mL) ile uyarılmış değişiklikleri yüzde 378,9 ± 16,8'den yüzde 251,8 ± 33'e (p 0,001'den az veya buna eşit) azalttı, ancak minimum etkiye sahipti matris metalloproteinaz 3 (MMP3) üzerinde, sadece sitokin ile ifadeyi yüzde 185,3 ± 19,6'dan danegaptid ile birlikte inkübe edildiğinde yüzde 147.1 ± 12,2'ye düşürür (Şekil 5B)

2.7. Danegaptide, TGF'yi Azaltır 1-hPTEC'lerden Adipokinler, Kemokinler, Büyüme Faktörleri ve İnterlökinlerin İfadesinde Uyarılmış Değişiklikler

Proksimal tübüllerin içindeki ve etrafındaki inflamatuar yanıt, hem çoklu hücre tiplerinin aktivasyonunu hem de çok sayıda inflamatuar belirteçlerin salgılanmasını içerir. Spesifik olarak, çözünür kemokinler, sitokinler ve büyüme faktörleri, sızan bağışıklık hücrelerini toplar ve aktive eder ve yerleşik fibroblastları uyarır. Bu hücrelerin sürekli aktivasyonu, tubulointerstisyel fibrozise aracılık eder. Danegaptidin, anahtar proininflamatuar mediatörlerin ekspresyonunda ve salgılanmasında TGF'nin 1-indüklediği değişiklikleri etkisiz hale getirip getirmediğini belirlemek için proteom profil oluşturucu dizisini kullandık. Birincil oteller yukarıda tarif edildiği gibi kültürlendi ve 48 saat boyunca TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptid (100 nM) ile işleme tabi tutuldu. Birincil fonksiyona göre gruplandırılmış 31 aday protein için lizat (Şekil 6) ve süpernatandaki (Şekil 7) değişikliklerin bir listesi sağlanır.

3. Tartışma

2017 yılında, küresel KBH insidansı 697,5 milyon vakaydı ve bu durum dünya çapında 12. önde gelen ölüm nedeni olarak tanımlandı [53]. Bugüne kadar, son dönem için küratif tedavi seçenekleri yoktur.böbrek hastalığı(ESRD). Ayrıca, düşük diyaliz sağkalım oranları ve küresel kıtlık ileböbrekdonörler, KBH ilerlemesini önleyebilecek ve hastanın yaşam kalitesini iyileştirebilecek tedaviler geliştirmeye acil bir ihtiyaç vardır. KBH'de proksimal tübüldeki inflamasyonun şiddeti, ne kadar hızlı birböbrekbaşaramayacak. Birden fazla hücre tipinin aktivasyonunun katkısıyla, kısmen, konneksin aracılı hücreden hücreye iletişimi içerdiği görülüyor [9]. Connexin'ler, heksamerik konneksonlara oligomerize olma yetenekleriyle doğrudan ve yerel parakrin aracılı hücre iletişimini kolaylaştırır. Komşu hücreler hizalandığında, bağlantı noktaları boşluk bağlantılarını oluşturmak üzere kenetlenir [10]. Bu sürekli kanallar, hücrelerin belirli bir frekansa kilitlenmesine ve aktiviteyi senkronize etmesine izin vererek, bilgi aktarımı için doğrudan bir yol sağlar. Tipik olarak fizyolojik koşullar altında açılan boşluk bağlantılarının aksine, hemikanal olarak da adlandırılan kenetlenmemiş konneksonların açık olma olasılığı düşüktür ve yaralanmaya yanıt olarak açıktır [10]. Değişen yarı kanal aktivitesi, değişen hücre-hücre iletişimini artan yaşlanma [54], inflamasyon [34,55,56] ve fibrozis [18-21] ile ilişkilendiren kanıtlarla birlikte, çoklu hastalık durumlarının patofizyolojisi ile ilişkilidir. Kendi laboratuvarımızdan elde edilen veriler, proksimal tübüldeki (Cx43) baskın konneksin izoformunun ilerlemiş KBH'de yukarı regüle edildiğini ve yüksek TGF 1 seviyeleri ve fibroz ve inflamasyonun şiddeti ile ilişkili olduğunu göstermektedir [24]. Ayrıca, bu değiştirilmiş ifade, artmış yarı kanal aracılı ATP salınımının ve erken tübüler hasarın göstergesi olan değişikliklerin eşlik ettiği boşluk bağlantısı hücreler arası iletişim kaybına dönüşür. Sonuç olarak, Cx43-aracılı hemichannel ATP salınımını bloke etmek, CKD'li bireylerde gelişen geç evre hasarın tedavisi için uygun bir hedefi temsil edebilir.

Danegaptide, yakın zamana kadar iskemi [43,44] ve retinopati [49] dahil olmak üzere birçok yaralanma modelinde boşluk bağlantı eşleşmesini yeniden oluşturma kapasitesinde kullanılan küçük bir terapötik peptittir. Danekaptidin hemikanal aktivitesini bloke ettiği ve C6 glioma hücrelerinde boya alımını engellediği gösterilmiştir [43]; bununla birlikte, bileşiğin hemichannel aracılı ATP salınımını bloke etmedeki rolü henüz doğrulanmamıştır ve henüz hiçbir çalışma danegaptid'in yaralılar üzerindeki etkilerini değerlendirmemiştir.böbrektübüller. Mevcut çalışmada, danegaptid'in birincil insan proksimal tübül epitel hücrelerinde TGF 1- ile indüklenen hemichannel aracılı ATP salınımını bloke ettiğine dair ikna edici kanıtlar sunduk. Ayrıca, TGF'yi restore eden bileşik, iltihaplanma ve fibroz ile bağlantılı proteinlerin ekspresyonu ve salgılanmasında değişikliklere neden oldu. KBH'de tubulointerstisyel fibroz, epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT), inflamatuar hücre infiltrasyonu, fibroblast aktivasyonu ve hücre dışı matris (ECM) yeniden şekillenmesi dahil olmak üzere çeşitli morfolojik ve fenotipik değişikliklere yanıt olarak gelişir [57]. Son kanıtlar, hücresel yaşlanmanın kronik hastalıkların ilerlemesinde önemli bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir.böbrek hastalığı[58], EMT ile bağlantılı yaşlanma, bir proinflamatuar sekretom ve hücre dışı matriks birikimi ile [59-62]. Senesans, kromatin organizasyonu, gen transkripsiyonu ve protein sekresyonunda ilişkili değişikliklerle birlikte geri dönüşü olmayan proliferatif büyüme durmasını ifade eder [63,64]. Sonuç olarak, yaşlanan hücrelerin, p21Cip1 (p21) ve p16Ink4a (p16) dahil olmak üzere sikline bağımlı kinaz (CDK) inhibitörlerinin (CKI'ler) artmış ekspresyonunu ve reno-koruyucu Klotho'nun değiştirilmiş ekspresyonunu sergiledikleri bilinmektedir [65-68]. Mevcut çalışmada, CDK inhibitörleri p16, p21 ve siklin D1'in mRNA ekspresyonu, TGF 1- ile tedavi edilen tübüler epitel hücrelerinde önemli ölçüde yükselirken, reno-koruyucu yaşlanma karşıtı protein Klotho, kontrollere kıyasla azalmış ekspresyon gösterdi. İlginç bir şekilde, hücreler danegaptid ile birlikte inkübe edildiğinde p16, p21 ve siklin D1'in ekspresyonu iyileştirildi. Bu gözlemin önemi, p16 INK4a çift devre dışı bırakılmış fare modelindeki son çalışmalar da dahil olmak üzere çok sayıda in vivo çalışma [69,70] tarafından desteklenmektedir. UUO ile gelişmiş interstisyel inflamasyon ve fibroz sergilemek üzere uyarıldığında, bu fareler, vahşi tip hayvanlara kıyasla azalmış apoptoz, yaşlanma, azalmış TGF 1/Smad sinyalleme seviyeleri ve inflamatuar hücre infiltrasyonunda bir azalma sergiledi [70]. Ayrıca, UUO modelinden izole edilen proksimal tübül hücreleri, baskılanması yaygın olarak EMT ile ilişkilendirilen belirteçlerde bir azalma ile paralel olarak artan p21 seviyeleri sergilemiştir [71,72]. Hücre yaşlanması ve EMT'nin uyarılmasıyla doğrudan bir bağlantı zaten kurulmuştur [73].

E-kadherin aracılı hücre yapışmasının kaybı, N-kadherin'de (kadherin anahtarı) eşlik eden bir artışla birlikte, EMT'nin bir başlatıcı tetikleyicisidir, buna, adherens bağlantısının sökülmesi ve yaygın olarak bir fibroblast fenotipi ile bağlantılı proteinlerin alınması, örn. , vimentin ve fibroblasta özgü protein [74]. İçindeböbrektübüler hasarın, tam değilse de kısmi EMT'nin karakteristiği olan bir dizi morfolojik ve fenotipik değişikliği uyandırdığı iyi bilinmektedir. Son çalışmalarımız, glikozun TGF 1'deki değişiklikleri uyardığını, yapışma (ECAD, NCAD, -katenin) ve sıkı bağlantı (ZO-1) protein ekspresyonundaki değişiklikleri düzenleyerek yapışkanların ve sıkı bağlantı kompleksinin sökülmesine aracılık ettiğini göstermiştir. Ayrıca, hidrolize edilemeyen ATP'nin in vitro uygulaması, proksimalde E-cadherin ekspresyonunu aşağı regüle etti.böbrekkaybı, hücreler arası ligasyon kuvvetlerinde bir azalma ile paralel olan hücreler, bağ kopma olaylarını ve hücre iskeletinin yeniden şekillenmesini azalttı [51]. P2X7R'nin aracılık ettiği etkiler, heterojen Cx43 plus /- UUO modelinde tersine çevrildi [12]. Bu bulgulara dayanarak, danegaptid'in etkinliği, anahtar epitelyal (ECAD, -catenin, ZO-1, claudin 2) ve mezenkimal (NCAD, vimentin) ekspresyonunun değişmesini önlemede hemichannel aracılı ATP salınımını bloke etmede koruyucu bir rolün altını çizer. etkileri terapötik açıdan ilgi çekici olan proteinler.

CISTANCH BÖBREK/BÖBREK AĞRILARINI İYİLEŞTİRECEK

E-cadherin'in sitoplazmik kuyruğu -katenin'e bağlandığında, yapışık kavşak toplanır, hücre iskeleti ağına bağlanmaya aracılık eder ve hücre polaritesinin ve mimarisinin korunmasını sağlar [75]. Hücre polaritesini korumadaki rolüne rağmen, bu bağlantıların sökülmesi, -katenin'in sitozole salınmasına izin verir, bu da Wnt proteinleri veya diğer yukarı akış düzenleyiciler, örneğin integrin bağlantılı kinaz (ILK) tarafından aktive edildiğinde çekirdeğe yer değiştirebilir. ve hücreye özgü etkileri düzenler. İntegrine bağlı kinaz, hücre yapışması, hayatta kalma, çoğalma ve hücre dışı matris (ECM) birikiminin düzenlenmesinde temel bir rol oynayan bir hücre içi serin/treonin-protein kinazdır [76]. Önemli olarak, ILK'nin inhibisyonu azalırböbrekCKD'nin çoklu modellerinde fibrozis [77]. Mevcut çalışmada, ILK1 ekspresyonunda TGF'nin 1- indüklediği artışlar, hücreler danegaptid ile birlikte inkübe edildiğinde kısmen restore edildi; bu, -katenin ekspresyonunda ve ECM ile ilgili proteinlerde bir azalmaya paralel olan bir etkidir. İlginç bir şekilde, danegaptid, -katenin ekspresyonunda TGF 1- ile indüklenen artışı önemli ölçüde değiştiremese de, ekspresyonda bir değişiklik olmamasının, hücre içindeki fonksiyonunun yokluğunu yansıtmadığını belirtmek önemlidir. Kanonik Wnt yolu, -katenin'in nükleer translokasyonunu ve T hücre faktörü/lenfoid güçlendirici faktörler (TCF/LEF) olarak adlandırılan bir grup transkripsiyon faktörü aracılığıyla hedef genlerin aktivasyonunu içerir [78]. Normalde, Wnt/ -katenin sinyali sessizdir, ancak bir dizi farklı kronik modelde yaralanmadan sonra yeniden etkinleştirilir.böbrek hastalığı[79,80]. Ayrıca, anormal Wnt/-katenin sinyali, kanonik Wnt yolunun negatif düzenleyicisi olarak görev yapan yaşlanma karşıtı bir protein olan Klotho'nun ekspresyon kaybına paralel olan bir etki olan yaşlanmanın başlamasıyla yüksek oranda ilişkilidir [81] ve mevcut çalışma, TGF 1- ile tedavi edilen hücrelerde aşağı regüle edilmiştir (Şekil 3). Sonuç olarak, Wnt/ -katenin sinyallemesinin sürekli aktivasyonu, her iki durumda da fibrozisin ilerlemesi ile bağlantılıdır.böbrekve diğer doku tipleri [79,82,83]. Çekirdeğe bir kez yer değiştirdiğinde, -katenin, transkripsiyon faktörü SNAIL ve matris metalloproteinaz MMP7'nin artan ekspresyonu ile ilişkilidir. İlginç bir şekilde, bu olaylar, E-cadherinin transkripsiyonel baskılanması ve hücre dışı alan membran dökülmesi ile ilişkilidir; bunlardan ikincisi, sitoplazmik serbest -katenin havuzunda bir artış görür [84]. Buna göre, Wnt sinyali, yaralanma koşullarında EMT'nin önemli bir aktivatörüdür [85]. Ayrıca, Wnt/-katenin sinyallemesinin, fibronektin, FSP1, Snail1, MMP7 ve siklin D1 dahil olmak üzere çok sayıda genin ekspresyonunu desteklediğine dair kanıtlarla birlikte, bu sinyalleme kaskadının zayıflamasının, gelişmiş bir iyileşme ile ilişkili olması şaşırtıcı değildir.böbrek fonksiyonu, EMT'yi [86] azalttı ve inflamasyonu [87] ve fibrozu [80,88] azalttı. Sonuç olarak, kısmen, bu çalışmada gözlemlenen TGF 1-ekstraselüler matriks proteinlerinin (Şekil 5), proinflamatuar sitokinlerin ve kemokinlerin artmış ekspresyonunu ve salgılanmasını açıklayabilir (Şekil 6 ve 7). Artmış ECM birikimi ve proinflamatuar moleküllerin salgılanması, farklı hücre tipleri ile tubulointerstisyel fibrozisin ayırt edici özellikleridir.böbrektopluca CKD ile ilişkili salgı fenotipi (CASP) olarak tanımlanan çok sayıda faktörü salgıladığı bilinen tübüler epitel hücreleri. İnterlökinler, hücre dışı matris proteinleri ve kemokinler dahil olmak üzere çok sayıda molekül ile karakterize edilen bu CASP, tübülointerstisyel fibrozis patolojisi ile güçlü bir şekilde ilişkili olan CASP bileşenleriyle, yaşlanmayla ilişkili salgı fenotipine (SASP) çarpıcı benzerlikler gösterir [89]. Serbest bırakıldığında, bu pro-inflamatuar faktörler, komşu sağlıklı hücrelere parakrin bir şekilde etki eder ve böylece CKD'de fibrozisin ilerlemesini sağlar. CASP ile ilişkili birçok faktörün vücutta fibrozisi indüklediği bilinmektedir.böbrek(örneğin, TGF , interlökin (IL)-1 ve interlökin (IL)-6), bu inflamatuar sinyalleme ara maddelerinin yukarı akışını hedeflemek, CKD tedavisi için etkili bir alternatif strateji kanıtlayabilir. Bir proteom profil dizisi kullanılarak, TGF 1±danegaptid ile muamele edilmiş hücrelerden hücre süpernatanı, temel enflamatuar proteinlere karşı yükseltilmiş antikorlarla önceden emilmiş bir hücre zarı üzerinde inkübe edildi. Şekil 6 ve 7'de vurgulandığı gibi, hücrelerin TGF 1 ve danegaptid ile birlikte inkübasyonu, rolü olan bir dizi aday proteinin ekspresyonunu ve salgılanmasını restore etti.böbrek hastalığıya zararlı (tümör nekroz faktörü-alfa, interlökin 1-alfa, interferon-gamma) veya koruyucu (hepatosit büyüme faktörü) olarak iyi bilinmektedir. Ayrıca, CKD'de çözünür kemokinler, adezyon molekülleri ve büyüme faktörleri, infiltre edici immün hücreleri ve yerleşik fibroblastları, yaralılarda inflamasyon ve fibrozise aracılık etmek için toplar ve aktive eder.böbrek. Dizi verilerimiz, tübüler epitel hücrelerinde Cx43'ün modüle edilmesinin ve hemichannel aracılı ATP salımının bloke edilmesinin, kemokinler, monosit kemo-çekici protein (MCP1) ve Aktivasyonda Düzenlenmiş Normal T dahil olmak üzere birçok enflamatuar aracının salgılanmasını kısmen veya tamamen reddettiğini doğrulamaktadır. Her ikisi de monosit alımında yer alan Hücre Eksprese Edilmiş ve Salgılanmış (RANTES). Hem insan hem de deneysel olarak yüksekböbrek hastalıkları, MCP1 salgılanması interlökin-1, tümör nekroz faktörü-alfa [90] ve interferon-gama [91] tarafından tetiklenir, bunların hepsi modelimizde TGF 1 tarafından indüklenir, ancak danegaptid ile birlikte uygulandığında bloke edilir. Ayrıca, danegaptid'in TGF 1-indüklenen hücreler arası hücre yapışma molekülü (ICAM1) [92], granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) [93] ve epitelyal-nötrofil aktive edici peptidin salgılanmasını önlediği de gözlendi. (ENA78) [94]. Toplu olarak bunlar, CKD'nin ilerlemesiyle ve dipeptidil peptidaz 4 (DPPIV) [95] ve vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) [96] dahil olmak üzere diğer önemli patojenik proteinlerle bağlantılıdır ve potansiyel terapötik hedefler olarak tanımlanmıştır. Bu gözlemlere rağmen, dizi analizi 48 saatte bir dizi protein tanımladı, burada TGF 1- tarafından indüklenen düzenlemenin hemichannel aracılı ATP salınımından bağımsız olduğu görüldü. Hücre lizatındaki FLT3 ligandının ekspresyonu ile kanıtlandığı gibi, danegaptid, tam hücre ekspresyonunda TGF'nin 1- indüklediği değişiklikleri önemli ölçüde değiştiremedi. FLT3 ligandı başlangıçta çözünür bir büyüme faktörü haline gelmesi için parçalanması gereken zara bağlı bir protein olarak sentezlenir. TGF 1- ile tedavi edilen hücrelerde, hücre lizatındaki kontrollere kıyasla membrana bağlı FLT3L'de bir artış gözlendi, bu, hücreler danegaptid ile birlikte inkübe edildiğinde etkilenmeyen bir yanıt. FLT3L'nin proteolitik bölünmesinde ve salınımında rol oynayan enzim hakkında çok az şey bilinmesine rağmen, Horiuchi ve ark. FLT3L'nin dökülmesinin ve membrandan salınmasının metaloproteaza bağımlı olduğunu ve fibroblastlardaki bu etkinin TNF-dönüştürücü enzime (TACE) bağlı olduğunu göstermiştir [97]. Sadece tahminde bulunabilsek de, Cx43-aracılı ATP salımının bloke edilmesinin FLT3 membran dökülmesi için gerekli protein(ler)in aktivitesini ve dolayısıyla FLT3L salımının yokluğunda süpernatandaki FLT3L seviyelerini köreltmesi mümkündür. TGF 1 artı danegaptid ile tedavi edilen hücrelerde, TGF 1- ile tedavi edilen kontrollere kıyasla önemli ölçüde daha azdır. İlginç bir şekilde, danegaptid, FLT3L hücre lizatında TGF 1- ile indüklenen artışı tersine çevirmiyor gibi görünse de, proteinin salgılanan formu üzerinde bir etkisi oldu.

Gelişmiş Glikasyon son ürünleri (RAGE) için çözünür Reseptör, inflamasyon ve oksidatif stresin potansiyel bir biyolojik belirtecidir [98]. Gelişmiş glikasyon son ürünlerinin membrana bağlı RAGE ve RAGE ile ilgili zararlı etkilere bağlanmasını önleyen bir tuzak reseptör görevi görür. Mevcut çalışmada, danegaptid tarafından kontrole geri yüklenen bir etki olan TGF 1 ile sRAGE salgılanmasında yüzde 70'lik bir artış gözlemledik. sRAGE işlevseldir ve salgılandığında bir etki indükleyebilir. Danegaptidin bu salgıyı önemli ölçüde olumsuzlama potansiyeli, açık bir terapötik ilgi konusudur. Ancak ilginç bir şekilde, TGF 1 ± danegaptid ile 48 saatte RAGE lizatında bir artış gözlemlemedik. Bu deneyler insan birincil proksimal tübül hücrelerinde gerçekleştirilirken, modelimizin sınırlamaları hücre, zaman ve konsantrasyona bağlı etkilere sahip olabilir. Sonuç olarak, danegaptid'in etki mekanizmasının daha iyi anlaşılmasına ihtiyaç duyulmasına rağmen, bu çalışmadan elde edilen bulgular, inflamasyon belirteçlerinde TGF'nin neden olduğu değişiklikleri ve tübüler hasarın blokajı yoluyla ortadan kaldırmak için danegaptid kullanmanın faydalarına dair önemli ilk kanıt sağlar. hemichannel aracılı ATP salınımı. İn vitro verilerimizin, tubulointerstisyel fibrozise yol açan çok faktörlü olayların minimalist bir modelini sağladığını kabul ediyoruz ve özellikle diğer türler ve yaralanma modelleri üzerinde yapılan çalışmaların değişken etkiler gösterdiği durumlarda, bu yeni bulguları in vivo duruma tercüme ederken dikkatli olunmasını öneriyoruz. [41,44,46-49]. Bu hemikanalların seçiciliğini ve ilacın klinik öncesi kronik hasar modellerindeki kapasitesini belirlemek için, insan klinik deneylerinde etkinliği test etmeden önce daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.

4. Malzemeler ve Yöntemler

4.1. Malzemeler

klonal insanböbrek2 (HK2) epitel hücresi ve birincil insan proksimal tübül epitel hücreleri (hPTEC'ler), American Type Culture Collection'dan (ATCC) (LGC Standards) satın alındı. Doku kültürü malzemeleri Invitrogen'den (Paisley, İngiltere) satın alındı. Immobilon-FL PVDF membranı Millipore'dan (Watford, UK) idi ve Odyssey bloke tamponu ve ikincil FL floresan antikorları LI-COR'dan (Cambridge, UK) satın alındı. E-cadherin, N-cadherin, ILK1, MMP-3, -katenin, vimentin ve ZO-1 antikorları Cell Signaling Technologies'den (Hertfordshire, UK) elde edildi, claudin-2, laminin, kolajen I ve kolajen IV antikorları, ABCAM'den (Cambridge, UK) elde edildi. Fibronektin antikoru, Santa Cruz'dan (Santa Cruz, CA, ABD) satın alındı. Rekombinant hTGF 1, diğer tüm genel kimyasallar gibi Sigma'dan (Poole, UK) elde edildi. Danegaptide, Zealand Pharmaceuticals tarafından sağlandı. ATP biyosensörleri Sarissa Biomedical Ltd.'den (Coventry, UK) ve un kapları WPI'den (Hertfordshire, UK) idi. Transwell'in filtreleri Corning'den (Nottinghamshire, İngiltere) satın alındı. Proteome Profiler İnsan Sitokin Dizi Kiti, R&D Systems'den (Oxfordshire, İngiltere) elde edildi.

4.2. Doku kültürü

Birincil insan proksimal tübül epitel hücreleri (hPTEC'ler), birböbrekATCC'den epitel hücre bazal ortamı, 0.5 yüzde fetal buzağı serumu (FCS ağırlık/hacim, triiyodotironin (10 nM), rhEGF (10 ng/mL), hidrokortizon hemisüksinat (100 ng/mL) ile desteklenmiştir), rhİnsülin (5 µg/mL), epinefrin (1 µM), transferrin (5 µg/mL) ve L-alanil-glutamin (2.4 mM), 37 ◦C'de yüzde 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde Hücreler gece boyunca tedaviden önce serum açlığı.böbrek2 (HK2) hücresi (pasaj 18-30), Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM)/Hams F12 ortamında büyütüldü, yüzde 10 FCS wt/vol, glutamin (2 mmol/L) ve epitelyal büyüme faktörü (EGF) ile desteklendi ( 5 ng/mL), yüzde 5 CO2 ile 37 ◦C'de nemli bir atmosferde. HK2 hücreleri, insan papilloma virüsü 16 (HPV-16) E6/E7 genlerinin transdüksiyonu ile ölümsüzleştirildi ve mikoplazmasızdı. Tüm deneylerde hücreler, 48 saat boyunca düşük glikozlu DMEM/F12 (5 mmol/L) içinde tohumlandı ve ardından tedaviden önce gece boyunca serumda aç bırakıldı.

4.3. MTT Testi 3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) testi, değerlendirmek için daha önce açıklandığı gibi yapıldı. danegaptid'in hücre proliferasyonu üzerindeki sitotoksik etkileri [99]. HK2 hücreleri 96-kuyulu plakalara ekildi ve gece boyunca serum açlığından önce 48 saat boyunca düşük glikozlu DMEM/F12 (5 mM) içinde kültürlendi ve ardından 48 saat boyunca TGF 1 (10 ng/mL) ile uyarıldı ) ± danegaptid (50–1000 nM). Formazan üretiminin kolorimetrik ölçümü, canlı hücre sayısına karşılık geldi.

4.4. Laktat Dehidrojenaz TestiPlazma zarı hasarının bir sonucu olarak ortama laktat dehidrojenazın (LDH) salınması, hücre ölümünü veya sitotoksisiteyi değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. HK2 hücreleri 96-yuvalı plakalara ekildi ve gece boyunca serum açlığından 48 saat önce düşük glikozlu DMEM/F12 (5 mM) içinde kültürlendi. Hücreler daha sonra 48 saat süreyle TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptid (50-1000 nM) ile uyarıldı. Üreticinin talimatlarına göre LDH'yi ölçmek için LDH sitotoksisite tahlil kiti II (Abcam) kullanıldı.

4.5. Kristal Menekşe DeneyiBu basit tahlil, çok kuyulu tabaklara yapıştırılan hücrelerin nispi yoğunluğunu ölçmek için kullanılır. Kristal menekşe DNA'yı boyar ve çözündürüldükten sonra kolorimetrik olarak ölçülebilir. HK2 hücreleri 12-kuyucuklu plakalara ekildi ve gece boyunca serum açlığından önce 48 saat boyunca düşük glikozlu DMEM/F12 (5 mM) içinde kültürlendi ve ardından 48 saat boyunca TGF 1 (1{{16) ile uyarıldı. }} ng/mL) ± danegaptid (50–1000 nM). Test daha önce tarif edilmiştir [99]. Kısaca hücreler, 10 dakika boyunca paraformaldehit kullanılarak sabitlendi, fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkandı ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) yüzde 0.1 kristal menekşe çözeltisi içinde inkübe edildi. Birkaç yıkamadan sonra, leke yüzde 1 SDS kullanılarak çözündürüldü ve absorbans bir plaka okuyucu ile ölçüldü.

4.6. Western BlotlamaHK2 hücrelerinden ve hPTEC'lerden sitozolik proteinin hazırlanması, bunların SDS jel elektroforezi ile ayrılması ve Immobilon-FL PVDF membranlarına transfer edilmesi daha önce tarif edilmiştir [12]. Zarlar, Odyssey bloke etme tamponu (LI-COR) kullanılarak bloke edildi ve daha sonra gece boyunca E-cadherin (1:1000), N-cadherin (1:1000), claudin-2 (1:500), ZO'ya karşı antikorlarla problandı. -1 (1:1000), kolajen I (1:1000), kolajen IV (1:2000), fibronektin (1:2000), laminin (1:500), ILK1 (1:500), -katenin (1:2000), vimentin (1:500) ve MMP3 (1:500). Bantlar OdysseyFC kullanılarak görselleştirildi ve ImageStudio (v5.2, LI-COR, Lincoln, NE, ABD) kullanılarak yarı nicelleştirildi.

4.7. Transepitelyal DirençHK2 hücreleri (6 x 1{4}}4 hücre/mL) Transwell filtrelerine (12 mm çap, gözenek boyutu 0.4 uM; Corning, NY, ABD) ekildi ve düşük glikozlu DMEM/F12 (5 mM) içinde kültürlendi. 48 saat, seruma gece boyunca aç bırakıldı ve ardından 48 saat boyunca TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptid (100 nM) ile uyarıldı. Transepitelyal elektrik direnci (TER), EVOM aparatı (World Precision Instruments, Sarasota, FL, ABD) kullanılarak ölçüldü. Tek başına ortam içeren bir kuyudan ölçülen boş bir direnç, her bir direnç okumasından çıkarıldı.

4.8. Boya Alım ÇalışmalarıHK2 hücreleri ve hPTEC'ler, florodişler (22 mm çap) üzerine ekildi ve 48 saat boyunca düşük glikozlu DMEM/F12 (5 mmol/L) içinde kültürlendi. Gece boyunca serum açlığının ardından hücreler, 48 saat boyunca TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptid (50–100 nM) ile inkübe edildi. Sonraki adımlar için, NaCl (137 mM), KCl (5.4 mM), MgS04 (0.8 mM), Na2HP04 (0.3 mM), KH2P04 (0.4 mM), NaHC03 (4.2 mM) içeren dengeli bir tuz çözeltisi (BSS, pH 7.0) ), HEPES (10 mM) ve glikoz (5 mM) kullanıldı. Boya alımını indüklemek için hücreler, Ca2 artı içermeyen BSS'ye (sıfır CaCl2 artı EGTA (1 mM)) artı karboksifloresein'e (200 uM), ardından Ca2 artı içeren BSS'de (1.3 mM) 5 dakikalık bir süre boyunca maruz bırakıldı. artı karboksifloresein (200 uM). Bulaşıklar daha sonra Ca2 artı içeren BSS (12 mL) ile yıkandı. Görüntüler Cool Snap HQ CCD kamera (Roper Scientific, Göttingen, Almanya) ve Metamorph yazılımı (Universal Imaging Corp., Marlow, Bucks, UK) ile elde edildi. ImageJ, boya alımını ölçmek için kullanıldı, burada her hücrenin etrafına bir ilgi alanı (ROI) çizildi (yaklaşık 10-15 hücre/tabak) ve ortalama piksel yoğunluğu ölçüldü. Her bir ROI'den bir arka plan floresan değeri çıkarıldı.

CISTANCHE BÖBREK/BÖBREK DİYALİZİNİ İYİLEŞTİRECEK

4.9. ATP BiyoalgılamaATP biyosensörleri (Sarissa Biomedical, Coventry, UK) daha önce tarif edildiği gibi eş zamanlı çift kayıt amperometrik kurulumda kullanıldı [12]. Spesifik olmayan elektro-aktif artefaktları hesaba katmak için boş bir biyosensör kullanıldı ve ATP izinden çıkarıldı. ATP saptamasını etkinleştirmek için tüm kayıt çözümlerine gliserol (2 mM) dahil edildi. HK2 hücreleri, gece boyunca serum açlığından 48 saat önce düşük glikozlu DMEM/F12 (5 mmol/L) içinde cam lameller (10 mm çap) üzerine ekildi. Hücreler daha sonra 48 saat boyunca TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptid (100 nM) ile inkübe edildi. Lameller, 6 mL/dak (37 ◦C) ile perfüze edilmiş Ca2 artı içeren BSS içeren bir odaya aktarıldı ve iklime alışması için 10 dakika bırakıldı. ATP ve boş biyosensörler, elektrotun hücresel tek tabakaya paralel uzanması için büküldü ve indirildi. Stabil bir taban çizgisi oluştuğunda, Ca2 artı içermeyen BSS perfüzyonu hemikanal açılmasını uyardı. ATP salınımından sonra, hemikanalları kapatmak için Ca2 artı içeren BSS kullanıldı, ardından ATP'nin (10 mM) bir kalibrasyon solüsyonu kullanıldı. Kayıtlar, Spike (v8.03) yazılımı kullanılarak bir Micro CED (Mark2) arayüzü ile 4 Hz'de alındı.

4.10. Enflamasyon Antikor Dizisi,Bir enflamasyon antikor dizisi (RnD Systems), 31 enflamatuvar belirtecin TGF 1-indüklediği düzenlemeyi değerlendirdi. Dizi, üreticinin talimatları izlenerek gerçekleştirildi. Kısaca, hPTEC'ler, gece boyunca serum açlığından önce 48 saat boyunca düşük glikozlu DMEM/F12 (5 mM) içinde kültürlendi ve ardından 48 saat boyunca TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptid (100 nM) ile uyarıldı. Hücre lizatları ve süpernatan toplandı ve yakalama antikorları ile iki kopya halinde lekelenen önceden bloke edilmiş membranlar ile gece boyunca inkübe edildi. Odyssey FC kullanılarak ekspresyon proteini/antikor komplekslerini görselleştirmek için 800 CW'lik bir FL floresan streptavidin/biyotinlenmiş kokteyl karışımı kullanıldı ve ImageStudio (v5.2, LI-COR) kullanılarak yarı nicelleştirildi.

4.11. Kantitatif Gerçek Zamanlı PCRRNA, bir RNeasy mini kiti (QIAGEN) kullanılarak ekstre edildi ve ters kopyalandı (Invitrogen). Gerçek zamanlı PCR (SYBR GreenER, Invitrogen), bir StepOne Plus cihazı (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, ABD) kullanılarak yapıldı. cDNA ifadesi, seri olarak seyreltilmiş cDNA'nın standart bir eğrisi ile karşılaştırılarak elde edildi. The following primers were used: p16 (forward: CTCGTGCTGATGCTACTGAGGA, reverse: GGTCG GCGCAGTTGGGCTCC), p21 (forward: AGGTGGACCTGGAGACTCTCAG, reverse: TCCTCTTGGAGAAGATCAGCCG), cyclin D1 (forward: TCTACACCGACAACTCCATCCG, reverse: TCTGGCATTTTGGAGAGGAAGTG), Klotho (forward: CCTCCTTTACCTGAAAATCAGCC, reverse CAGGTCGGTAAACTGAGACAGAG) ve GAPDH (ileri: GTCTC CTCTGACTTCAACAGCG, geri: ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA). Erime eğrisi analizi, primer spesifikliğini doğruladı ve potansiyel kontaminasyon için kontrol edildi.

4.12. analizTüm deneyler için, düşük glikoz kontrolü (5 mM) yüzde 100'a normalize edildi ve diğer tüm koşullar ilgili kontrolleriyle karşılaştırıldı. İstatistiksel analiz, Tukey'nin çoklu karşılaştırma son testi ile tek yönlü bir ANOVA testi kullanılarak yapıldı. Veriler, ortalama ± SEM olarak ifade edilir ve n, numune numarasını gösterir. 0,05'ten küçük veya buna eşit bir p değeri istatistiksel anlamlılığı ifade eder.