De Novo Transkriptom Düzeneği ve Cistanche Deserticola Etli Kökünün Gen Keşfi-Ⅱ

İfade Edilen Tüm Transkriptlerin Gen Ontolojisine ve KEGG Veritabanlarına Dayalı Fonksiyonel Sınıflandırması

Gen Ontolojisi (GO) ek açıklaması, UniProt ek açıklaması ve kimlik ilişkilendirme dosyasından elde edildi. Toplamda, ifade edilen toplam dizilerin %32,69'unu oluşturan 20.907 transkript, 1.745 fonksiyonel terime atanmıştır. Toplam fonksiyonel GO terimlerinin çoğunluğunu biyolojik sürece yönelik atamalar oluşturdu (1.116, %63,95), bunu hücresel bileşen (329, %18,85) ve moleküler fonksiyon (300, %17,20) takip etti. İfade edilen transkriptlerin atanan işlevleri, geniş bir GO kategorisi aralığını kapsıyordu ve en fazla açıklamalı transkriptlere sahip ilk 10 GO terimi Tablo 3'te listelendi. İfade edilen tüm transkriptlerin dağılımını üç Gen Ontolojisi kategorisinde sağlıyoruz (Moleküler Fonksiyon, Hücresel bileşen ve biyolojik süreç) ek dosyada (S3 Veri Seti). Bağlanma fonksiyonları ve transferaz aktivitesi ile ilgili GO terimleri ağırlıklı olarak moleküler fonksiyon kategorisinde temsil edilmiştir. Bağlanma fonksiyonlarına ilişkin olarak, katyon bağlanması (4.394 transkript) en fazla olanı temsil ederken bunu nükleotid/nükleosid bağlanması (ortalama 3.404 transkript) ve protein bağlanması (2.422 transkript) takip etmektedir. Transferaz aktivite grubunda en fazla transfer edici fosfor içeren gruplara sahip olanlardır (2.256 transkript, %65,77). Hücresel bileşen kategorisinde, transkriptler daha çok hücre içi yerleşime sahipti (ortalama 10.581 transkript), biyolojik süreç kategorisinde ise transkriptler biyopolimer metabolik sürecine daha fazla dahil oldu (ortalama 6.683 transkript), bunu hücresel sürecin düzenlenmesi izledi (4.841 transkript) ), gen ekspresyonu (4.678 transkript) ve taşıma (3.512 transkript).

ALZHEIMER HASTALIĞINI ÖNLEMEK İÇİN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Lignin ve PhG biyosentezinde yer alan genleri çıkarmak için, KEGG veritabanındaki 13 bitki organizmasının gen dizilerine karşı 21.358 gereksiz potansiyel protein dizisi araştırıldı ve bunlar, en az 5 isabetli 275 KEGG yoluna atandı. En hizalanmış sekanslara sahip ilk 10 yol Tablo 4'te listelenmiştir. Yolların çoğu, amino asit veya protein metabolizması (ko01230, ko04141 ve ko04120), karbonhidrat metabolizması (ko01200 ve ko00500) ve nükleotid veya protein metabolizması gibi birincil metabolik süreçlerde yer almıştır. nükleosid metabolizması (ko03018, ko00230 ve ko00240). Ayrıca terpenoid omurga biyosentezi, fenilpropanoid biyosentezi, karotenoid biyosentezi, izokinolin alkaloid biyosentezi ve tropan, piperidin ve piridin alkaloid biyosentezi gibi 27 ikincil metabolizma ile ilgili yol vardır (Şekil 2). Bu sonuçlar, aktif metabolik süreçlerin devam ettiğine dair daha fazla gösterge sağlar.C. Deserticolakök dokusu. KEGG yollarıyla ilişkili tüm ifade edilen transkriptler ek dosyada (S4 Veri Seti) listelenmiştir. Her ne kadar C. Deserticola ile pirinç gibi diğer bitkiler (S5 Veri Seti) arasında önemli ölçüde değiştirilmiş bazı yollar olsa da, bu çalışmadaki ana amacımız C. Deserticola sapının tüm transkriptom profilini ortaya çıkarmak ve PhG biyosentezinin ilgili yollarını resmetmektir. ekimi yönlendirmek için faydalı olabilir.

Lignin Biyosentezinde Yer Alan Enzimleri Kodlayan Aday Genler

Lignin, bitkiler aleminde en bol bulunan ikinci doğal karasal polimerdir ve bitki hücre duvarlarında bulunan malzemenin üçte birini oluşturur. Hücre duvarlarının önemli bir bileşeni olan ligninler suyun taşınmasına yardımcı olur, mekanik destek ve yapısal bütünlük sağlar ve patojenlere ve otçullara karşı savunma sağlar. Ligninin bu rolleri, çölde C. Deserticola'nın yeraltındaki ereksiyon halindeki büyümesini desteklemede çok değerlidir. Bu çalışmada, lignin monomerlerinin hidroksilasyon, metilasyon, indirgeme ve oksidatif polimerizasyon sürecini içeren bir dizi enzimatik reaksiyon yoluyla fenilalaninden biyosentezlendiği C. Deserticola'daki lignin biyosentez yollarının tam resmini sunduk (Şekil 3). Lignin biyosentezi ile ilgili enzimler, vasküler dokuda sentezlenen başlıca üç form (p-hidroksil-fenil (H), guaiasil (G) ve siringil (S) lignin) ve yalnızca tanımlanmış olan 5-hidroksil-guaiasil lignin için tespit edilmiştir. COMT (kafeik asit 3-O-metiltransferaz, EC 2.1.1.68) eksikliği olan (yıkma gibi) bitkilerde.

Fenilalanin amonyak-liyaz (PAL, EC 4.3.1.24), fenilalanini oksidatif olmayan deaminasyon yoluyla sinamik asite dönüştüren lignin biyosentez yolundaki (Şekil 3) ilk anahtar enzimdir. Toplam 6.297 PAL okuması sıralandı ve 7 PAL transkripti C. Deserticola'da toplandı (Tablo 5). Dizi benzerlikleri karşılaştırmasıyla, bunlardan 4'ünün (comp28550_c1_seq1/2/3/5) C. Deserticola'nın (gi|) bilinen mRNA dizisiyle %95'ten fazla benzerliğe sahip olduğunu bulduk. 289595227|gb|ADD12041.1|), comp28550_c1_seq4 ve comp25940_c0_seq1'in sırasıyla %77 ve %82 benzerliği vardı. ORF tahmini, 5 transkriptin proteinleri kodlama potansiyeline sahip olduğunu ve aromatik amino asit liyaz alanı (PF00221.14) ile taşındığını ortaya çıkardı. Bunlar arasında yalnızca comp28550_c1_seq4 transkripti, 718 amino asit kalıntısından oluşan tam bir protein dizisini kodlayabilir. PAL'ın, Arabidopsis thaliana'da 4, Populus trichocarpa'da 5, Scutellaria baicalensis'te 3 ve Cucumis sativus'ta 7 gibi çoğu bitki türünde küçük bir multigen ailesi tarafından kodlandığı rapor edilmiştir. Filogenetik analizimiz 4 tane olduğunu ileri sürdü. C'de PAL kodlayan genler.

Deserticola ve bunları sırasıyla CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 ve CdPAL4 olarak adlandırdık (S2 Şekil). 4-kumarat-CoA ligaz (4CL, EC 6.2.1.12) ve trans-sinnamat 4-monooksijenaz (CYP73A, EC 1.14.13.11), sinnamik asidin dikumarol-CoA'ya iki ters yönde dönüştürülmesinden sorumlu iki enzimdir siparişler. Onlar da omurgada yer almakta olup ifade FPKM değerleri sırasıyla 39,57 ve 51,93'tür.

Dört tür lignin, üç anahtar enzim tarafından kontrol edilen farklı yollarla biyosentezlendi: sinamoil-CoA redüktaz (CCR, EC 1.2.1.44), şikimat o-hidroksisinamoiltransferaz (HCT, EC 2.3.1.133) ve ferulat{{1{ {56}}}}hidroksilaz (F5H, EC 1.14.-.-). CCR, X-CoA'yı (X, dikumarol, kafeoil, feruloil, 5-hidroksil-feruloil ve sinapoili içerir) Y-aldehit'e (Y, p dahil) katalize eden lignin yolunun bir kontrol noktası olarak rapor edilmiştir [50, 51] -puma, kafeoil, koniferil, 5-hidroksil-koniferil ve snap), HCT ise p-kumaroil-CoA'yı p-kumaroil şikimik asit/p-kumaroil kinik asit'e katalize etti. İki enzim, tıpkı bir anahtar gibi, P-hidroksil-fenil ligninlerin veya diğer üç tip ligninin biyosentezini düzenledi. F5H, siringil lignini ve 5-hidroksil-guaiasil lignini düzenleyen başka bir dal anahtarıydı. Kafeik asit 3-O-metiltransferaz (COMT, EC 2.1.1.68), kafeoil-CoA O-metiltransferaz (CCoAOMT, EC 2.1.1.104) ve sinnamil-alkol dehidrojenaz (CAD, EC 1.1.1.195) dahil olmak üzere diğer önemli enzimler ) da ifade edildiği tespit edildi. Ayrıntılı ekspresyon bilgileri Tablo 6'da listelenmiştir. Bu çalışmada tanımlanan bu enzim genleri, bu önemli şifalı bitkide fonksiyonel genomik çalışmalar için değerli bir kaynak sağlayacaktır. Tablo 6'daki lignin biyosentez yolu ile ilgili 10 gen, RNAseq sonuçlarımızı doğrulamak için RT-qPCR doğrulaması için seçildi (Şekil 4) ve bunların yüksek korelasyonları (Pearson korelasyon katsayısı: 0,90343), transkriptom analizimizin yüksek doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini gösterdi. S1 Veri Kümesi bu analizde kullanılan primer dizilerini listeler.

CİNSEL FONKSİYONU GELİŞTİREN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

PhG'lerin Biyosentezinde Yer Alan Enzimleri Kodlayan Aday Genler

Feniletanoid glikozitlerin (PhG'ler), cinsel gücü artırma, serbest radikalleri temizleme ve yaşlanmayı önleme faaliyetleriyle C. Deserticola'daki birincil aktif bileşenler olduğu bilinmektedir. PhG'lerin üç kimyasal bileşeni organik asit, sakkarit ve feniletanol aglikondur (Şekil 3). Kafeik asit, ferulik asit ve kumarik asit dahil organik asitler, fenilpropanoid biyosentez yolunun ürünleridir. Glikoz ve ramnoz dahil sakarit bileşenleri, nişasta ve sakaroz metabolizması, amino şeker ve nükleotid şeker metabolizması, fruktoz ve mannoz metabolizması vb. gibi karbonhidrat metabolizması yollarının ürünleridir. Bununla birlikte, feniletanol kısmının biyosentez yolu henüz net değildir. Burada dizi verilerimize dayanarak iki olası feniletanol biyosentez yolu önerdik. Bunlardan biri, lignin biyosentezi omurga yoluna benzer olan, sinamik asit yolu olarak da bilinen, bildirilen kafeik asit veya ferulik asit yoludur. Bir diğeri, fenilalanin metabolizma yoluna (Şekil 3) dayanır; burada fenilalanin feniletanole, ilk olarak bir yüzyıl önce mayada bulunan ve petunya çiçekleri, domates ve gülde doğrulanan bilinen bir 'Enrlich yolu' ile elde edilir. Fenilalaninin feniletanole dönüşümünden sorumlu olan aspartat/tirozin aminotransferaz, histidin-fosfat aminotransferaz ve primer-amin oksidazı kodlayan dört enzim geninin C. Deserticola'nın sapında ifade edildiği tespit edildi. Fenil etanolün ürünü ayrıca monooksijenaz tarafından oksitlenebilir veya metiltransferaz tarafından PhG biyosentezinde yer alan türevlerine (fenil etanol aglikon) metillenebilir. Özet olarak, feniletanol aglikonunun iki varsayılan biyosentez yolu önerilmiştir.C. Deserticolaancak yine de daha fazla çalışmaya ihtiyaç var.

Tartışmalar

Son yıllarda yeni nesil dizileme teknolojisinin uygulanmasıyla bitki genomiği hızla gelişirken, çöl şifalı bitkilerinin genomiği üzerine çok az araştırma odaklandı. Kuraklık ve tuzluluk ortamlarına adaptasyonunu ve ana biyoaktif bileşenlerin biyosentez yolunu anlamak için genomik veya transkriptomik araştırmaların yapılması acilen gereklidir. Bazı tıbbi bitkiler için de novo transkriptom keşfi,

Panax ginseng, Ginkgo biloba ve Glycyrrhiza uralensis gibi bitkilerden, uzun okuma uzunluğu nedeniyle ilk kez Roche 454 platformu kullanılarak yararlanılmıştır. Kısa okumalarla etkili birleştirme yeteneği, özellikle de avantajlı çift uçlu okumalar nedeniyle, Illumina bazlı transkriptom dizilimi ve montajı da model ve model olmayan organizmalar için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada, yaklaşık 8G 101 bp çift uçlu okuma ürettik ve 725 bp ortalama uzunluğa sahip daha uzun tekgen diziler ürettik. Büyük ölçekli gövdeye özgü transkriptom verileri, faydalı referans verileri sağlayabilir ve C. Deserticola'nın biyoaktif bileşenlerinin ikincil metabolizmasını araştırmak için kullanılabilir. Toplam ham okumaların %81,62'si montajdan önce sıkı kalite filtrelerinden geçmiştir (adaptör kırpma ve düşük kaliteli okumaların atılması dahil), bu da sıralama verilerimizin yüksek kalitesini göstermektedir ve yüksek kaliteli okumaların %82,08'i montaj için yararlı olmuştur. Montaj için kullanılamayan diğer okumalar sıralama hatalarından, montaj parametrelerinden vb. kaynaklanabilir. Kullanılmayan bu yüksek kaliteli okumalar, gelecekte başka bir platformdan (Roche 454 gibi) daha uzun okumalarla birlikte yeni derlemenin iyileştirilmesine yardımcı olmaya devam etti.

CİNSEL FONKSİYONU GELİŞTİREN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Çok sayıda birleştirilmiş transkript (30.098), halka açık veritabanlarındaki bilinen genlerle yüksek sekans benzerlikleri gösterdi; bu, Illumina bazlı eşleştirilmiş uç verilerimizin, C. Deserticola transkriptlerinin önemli bir kısmını kapsadığını ortaya koyuyor. BLAST isabeti olmayan transkriptler, 3' veya 5' çevrilmemiş bölgelere, kodlamayan RNA'ya veya C. Deserticola'nın yeni gen dizilerine bağlı olabilir. Eksprese edilen transkriptler, birçok transkriptin ikincil metabolizma ile ilgili yollara atandığı çok çeşitli GO kategorilerine ve KEGG yollarına (Tablo 3 ve 4) eklenmiştir. Bildiğimiz gibi fenilpropanoid, yeraltı yaşam tarzı için büyük fayda sağlayan uyarılabilir bir antimikrobiyal bileşik olarak işlev görebilir [1] ve ayrıca tıbbi kullanımının yanı sıra bitki-mikrop etkileşimlerinde bir sinyal molekülü olarak da görev yapabilir [68, 69]. Terpenoid, biyoaktif bileşenlerin (6- deoksikatalpol gibi) biyosentezi için kullanılır [70]. Fenilpropanoid ve terpenoid omurga biyosentez yolunda yer alan genlerin C. Deserticola'da oldukça bol olduğunu bulduk. Daha da önemlisi, lignin biyosentezinin iyi temsil edilen yollarının keşfi (Şekil 3), C. Deserticola sapındaki ligninin aktif metabolik sürecini göstermiştir. Lignin biyosentezinde yer alan bilinen tüm enzim genlerinin (Şekil 3) eksprese edildiği tespit edildi ve PAL, CCR, HCT ve F5H dahil dört anahtar enzimin ekspresyon bolluğu daha düşüktü (sırasıyla FPKM 26.47, 3.89, 3.4 ve 3.83). diğer enzim genleri (Tablo 6). Bu üç genin ifade değişikliğinin C. Deserticola'daki lignin üretimini etkileyip etkilemeyeceği daha fazla çalışmaya değer. PAL, lignin biyosentezinde anahtar bir enzimdir ve aynı zamanda fenilpropanoid, resveratrol, flavonoid ve kumarinin biyosentezinde de rol oynar [71-74]. C. Deserticola genomunda (S2 Şekil), PAL'in küçük bir multigen ailesi tarafından kodlandığı [39, 43, 45-49] ile çakışan dört farklı PAL geni tespit ettik ve ayrıca metabolik karbon akışında önemli roller oynayabileceğini kanıtladık. .

PhG, C. Deserticola'daki birincil aktif maddedir. Feniletanolün biyosentezinde yer alan genler C. Deserticola'nın kalitesi açısından önemlidir. C. Deserticola sapında fenil etanolün iki farklı biyosentez yolunu ve PhG biyosentezinde rol oynayan 17 enzim genini çıkardık. Olası kafeik/ferulik asit sonrası işlemler (Şekil 3), ara maddelerin yapısal formülüne ve karşılık gelen enzimlerin katalitik özelliklerine dayanarak ilk kez çıkarılmıştır; burada kafeik/ferulik asit ilk önce fenilpiruvat türevine oksitlenecektir; daha sonra karboksil grubu dekarboksilazlar tarafından yoksun bırakıldı; son olarak aldehit grubu dehidrojenaz ile tekrar alkol grubuna dönüştürüldü. Bu, Illumina çift uçlu dizileme teknolojisinin, C. Deserticola'nın tüm transkriptomunu araştırmak ve referans genom olmadan RNA-seq okumalarını birleştirmek için yapılan ilk uygulamasıdır. Bu çalışma gelecekte C. Deserticola üzerinde fonksiyonel genomik ve proteomik araştırmaları için faydalı kaynaklar ve gen dizileri sağlayacaktır.

Sonuçlar

Bu çalışmada, yüksek verimli sıralama verilerine dayanarak C. Deserticola sapının transkriptomunun profilini çıkardık, ligninin biyosentez yollarında yer alan genleri belirledik ve aynı zamanda ilk kez PhG'lerin potansiyel biyosentez yolunu çıkardık; bu, anlayışı kesinlikle hızlandıracaktır. belirsiz fizyolojik süreçler ve moleküler düzeyde büyük tıbbi değer. Şimdiye kadar bu, C. Deserticola sapının tüm transkriptomunu yeniden bir araya getirmeye ve Illumina bazlı sıralama veri kümelerini kullanarak tıbbi bileşenlerin biyosentez yolunu tespit etmeye yönelik ilk girişimdir. Çalışmamız doğal ilaçların geliştirilmesine ve tıbbi özelliklere sahip çeşitlerin seçimine katkıda bulunabilir.

CİNSEL FONKSİYONU GELİŞTİREN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%