Alox15'in Silinmesi Böbrek Bozukluğunu İyileştirir ve Böbrekte Artan PGD2 İle Fbrozisi Önler
Mar 12, 2022
CISTANCH BÖBREK/BÖBREK ENFEKSİYONUNU İYİLEŞTİRECEK
giriiş
Çoklu doymamış yağ asitleri (PUFA) ve bunların metabolitleri, çeşitli organlarda iltihaplanma ve çözünürlüğü ile bağlantılıdır [1]. PUFA'nın oksidasyonu ile üretilen oksilipinler, lipid mediatörleri olarak PUFA'nın biyolojik aktivitesi için önemlidir [1, 2]. Oksilipinlerin biyosentezine lipoksijenaz (LOX), siklooksijenaz (COX) ve sitokrom P450 (CYP) gibi çeşitli enzimler aracılık eder [3]. Bu enzimler prostaglandinler, lökotrienler ve lipoksinler gibi çeşitli lipid metabolitleri üretirler ve bunların tümü inflamasyonun düzenlenmesinde yoğun bir şekilde yer alır [1, 4]. Örneğin, LOX'un önemli bir alt tipi olan ALOX15, metabolitleri aracılığıyla proinflamatuar ve anti-inflamatuar özelliklerin ikili bir yönüne sahiptir [5]: ALOX15, patolojik olmayan koşullar altında eozinofillerde, bronkoalveolar epitel hücrelerinde ve alveolar makrofajlarda yüksek oranda eksprese edilir [5, 6 ] ve astımın şiddetini [7], akciğer hasarını [8] ve kalp yetmezliğini [9] desteklerken, artritte [10] ve iskemik beyinde [11] enflamasyonu önler. Ek olarak, lipid mediyatörleri ve bunların enzimleri, inflamasyonun yanı sıra organ fibrozisini de etkiler. Akciğer [12], karaciğer [13] ve kalp [14] fibrozunun patogenezinde spesifik lipid aracıları rol oynar. Benzer şekilde, yukarıda bahsedilen ALOX15 de dermal fibroz gibi fibrozisin patogenezi ile bağlantılıdır [15].
Sık görülen kronik hastalıklardan biri kroniktir. böbrek hastalığı(CKD) tüm evrelerde genel popülasyonun yaklaşık yüzde 8-16'sını etkiler [16]. KBH patogenezi karmaşık olmasına ve altta yatan hastalığa bağlı olarak değişiklik göstermesine rağmen,böbrekdoku genellikle işlevsiz hale gelir ve son aşamaya yol açar.böbrek yetmezliğikronik inflamasyon ve müteakip fibrozdan kaynaklanır [17]. Belirtildiği gibi, PUFA'lardan türetilen lipid aracıları, iltihaplanma ve bunun sonucunda ortaya çıkan fibrozis ile güçlü bir şekilde bağlantılıdır. Örneğin, lipoksinler ve resolvinler renal fibrozu inhibe eder [18, 19], ancak bu etkiler, bozulmuş KBH modelinde henüz incelenmemiştir.Böbrek fonksiyonu.Ayrıca, CKD'de kapsamlı lipidomik profillerböbrekdokular hala bildirilmemiştir. Bu nedenle, lipid metabolik enzimlerin ve ürünlerinin CKD patogenezindeki rolü tam olarak anlaşılamamıştır.Bu çalışma, yağ asidi metabolize eden enzimlerin ve bunların ürünlerinin yağ asitlerine katılımını açıklamayı amaçlamıştır.böbrek5/6 nefrektomize (Nx) CKD model farelerin bozulması. Bu çalışma, Alox15'in hem transkripsiyon hem de protein ekspresyon seviyelerinin CKD'de arttığını ortaya koydu.böbrekler, ve Alox15−/− fareler iyileştiğini gösterdiböbrekCKD modelinde disfonksiyon ve fibroz. Ayrıca, CKD'de artan lipid metaboliti olan PGD2böbreklerAlox15−/− farelerin, proksimal tübüler kültürlenmiş hücrelerde epitelyal-mezenkimal geçişi (EMT) inhibe etti. Bu nedenle, Alox15 inhibisyonu ve/veya PGD2 uygulaması, CKD ve fibrozisin yeni bir terapötik hedefi olabilir.
Anahtar Kelimeler:kronik böbrek hastalığı; lipoksijenaz; ALOX15; Aracı lipidomik; Çoklu doymamış yağ asitleri; böbrek
CISTANCH BÖBREK/BÖBREK FONKSİYONUNU İYİLEŞTİRECEK
Malzemeler ve yöntemler
Hayvanlar ve deneylerBu çalışmada, tüm deneyler yapılmadan önce 1 hafta boyunca iklime alıştırılan 8-haftalık erkek C57BL/6 J fareleri (CLEA Japan) kullanıldı. Ayrıca, Alox15−/− fareleri C57BL/6 J arka planında (Jackson Laboratuvarı) üretildi ve 5/6 Nx modeli önceki bir çalışmaya göre kuruldu [20]. değerlendirilmesi için kan örnekleri topladık.böbrek fonksiyonuveböbrek5/6 Nx'ten 8 hafta sonra immünoblotlama ve polimeraz zincir reaksiyonu için ve 5/6 Nx'ten sonra 40 haftada histolojik analiz için doku örnekleri. Tüm deneyler, TMDU'nun hayvan araştırmalarına yönelik yönergelere uygundur ve TMDU'nun Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi, çalışma protokolümüzü onayladı (onay numarası: A2019-117C4).
LC–MS/MS tabanlı aracı lipidomikleriLC-MS/MS analizini daha önce tarif edildiği gibi yaptık [21, 22]. Prosedürün detayları Ek Yöntemlerde açıklanmıştır,Diğer deneysel yöntemlerDiğer deneysel yöntemleri Ek Yöntemlerde tanımladık.
Sonuçlar
Alox15'in mRNA seviyesi 5/6 Nx böbrekte arttıCKD'deki oksilipin enzimlerinin kantitatif değişiklikleriböbreksahte operasyona C57BL/6 fareleri veya daha önce tarif edildiği gibi 5/6 Nx uygulanarak araştırıldı [20]. Böbrekte (Alox15, Alox5, Ptgs1 (COX1), Ptgs2 (COX2), Cyp4a12 ve Cyp2c44) eksprese edilen majör oksilipin enzimlerinin ekspresyonunu analiz etmek için [23, 24],böbrekörnekler. Enzimler arasında, 5/6 Nx'de Alox15böbreklersham ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde yüksek bir mRNA düzeyine (P=0.0004) sahiptiböbrekler(Şek. 1). Tersine, diğer ana enzimlerin mRNA seviyeleri bu CKD modelinde önemli ölçüde değişmedi.
Renal proksimal tübüler hücrelerde Alox15'in protein seviyesi arttı5/6 Nx'deböbrekler, ALOX15 protein seviyeleri de, artan transkripsiyonel seviyelerden beklendiği gibi (P=0.0078) arttı (Şekil 2a). CKD'de hangi hücre tiplerinin Alox15 protein düzeyini artırdığını belirlemek içinböbrek,Alox15 mRNA'nın lokalizasyonunu in situ hibridizasyon ile inceledik. mRNA'ya in situ hibridizasyon, Alox15'in yüksek ekspresyon seviyesininböbrek5/6 Nx modelindeki tübüler hücreler, ancak glomerüllerde değil (Şekil 2b). Histolojik özellikler, Alox15 mRNA'nın proksimal tübüllerde güçlü bir şekilde eksprese edildiğini gösterdi.
Alox15−/− fareleri, 5/6 Nx modelinde böbrek hasarına ve fibrozise dirençliydi5/6 Nx CKD'deböbreklerALOX15'in transkripsiyonel ve protein ekspresyon seviyeleri yükselmiştir. Bu nedenle, ALOX15'in CKD'de aşağıdakiler açısından bir rol oynayıp oynamadığını ve nasıl oynadığını araştırdık.böbrekdisfonksiyon ve böbrek fibrozu. Bu amaçla, 5/6 Nx CKD modeline Alox15−/− fareler uygulandı. İlginç bir şekilde, Alox15−/− 5/6 Nx farelerinde serum Cre ve kan üre nitrojen (BUN) seviyeleri daha düşüktü.
Alox15 tükenmesinin CKD patogenezinde koruyucu bir etki gösterdiğini gösteren vahşi tip (WT) farelerdekinden daha fazla (Şekil 3a). Buna göre, NGAL (aböbrek hasarıMarker) protein ekspresyonu, WT farelerindekiyle karşılaştırıldığında Alox15−/− farelerinde baskılanmıştır (Şekil 3b). Ayrıca, Alox15−/− fareböbreklerazalmış Col1a1, Fn ve Açta2 (SMA) mRNA seviyeleri gösterdi (Şekil 3c) ve ayrıca azalmış fibronektin ve SMA protein ekspresyonu gösterdi (Şekil 3d). Ayrıca, Alox15−/− fareböbreklerMasson'un trikrom boyamasında gösterilen açıkça bastırılmış interstisyel fibrotik değişiklikler sergiledi (Şekil 3e). Bu nedenle, Alox15 silme işlemi iyileşirböbrekCKD hayvan modelinde disfonksiyon ve fibroz.
Mediatör lipidomikleri, Alox15−/− CKD böbreklerinde değişmiş PUFA metabolizmasını ortaya çıkardıBu makalenin Giriş bölümünde bahsedildiği gibi, Alox15'in biyolojik etkileri, Alox15 tarafından üretilen lipid aracıları ile ilgilidir. Alox15 tarafından CKD'de üretilen lipid metabolitlerinin profilini aydınlatmak içinböbrek,sham ve 5/6 Nx'i inceledik ve karşılaştırdıkböbrekWT fareleri ve Alox15−/− CKD fareleri arasındaki lipid aracı profillerini belirlemek için LC-MS/MS tabanlı aracı lipidomikleri ile örnekler (Ek Tablo 1). Tablo 1, 5/6 Nx koşulu altında Alox15 plus / plus ve Alox15−/− fareler arasında önemli ölçüde farklı olan lipid metabolitlerini göstermektedir. Ek olarak, substratları ve metabolize edici enzimleri ile sınıflandırma ile lipid mediatörlerinin yol haritalarını yaptık (Şekil 4). 14-HDoHE, 17-HDoHE ve 15-HEPA [5, 25–27] gibi bir dizi Alox15-türevi PUFA metaboliti, korelasyon gösteren CKD modellerinde önemli ölçüde artmıştır. ALOX15 ifadesinin artan seviyesine iyiböbrekler (P=0.0018, 0.0008,<0.0001, respectively),="" and="" their="" elevations="" under="" ckd="" conditions="" were="" completely="" suppressed="" in="" alox15−/−="" mice="" (fig. 5).="" besides="" 14-hdohe,="" 17-hdohe,="" and="" 15-hepa,="" the="" levels="" of="" 18-hepa,="" 10-hdohe,="" 11-hdohe,="" 13-hdohe,="" 16-hdohe,="" and="" dgla="" were="" also="" significantly="" decreased="" in="" alox15−/−="" ckd="">böbreklerWT CKD böbreklerindekilerle karşılaştırıldığında, Alox15−/− CKD böbreklerinde sadece PGD2 önemli ölçüde arttı (Şekil 6).
PGD2, kültürlenmiş böbrek hücrelerinde EMT'yi bastırdı5/6 Nx koşulunda Alox15 plus / plus ve Alox15−/− fareler arasında önemli ölçüde farklı olan lipid metabolitlerinin etkileri, bu lipidler pro-fibrotik sitokin TGF ile aktive edilen NRK-52E hücrelerine uygulanarak incelenmiştir. - 1. Bu lipidlerin kültürdeki etkilerini belirlemek için TGF- 1'a yanıt olarak Cola1a ve Acta2'nin (SMA) mRNA ekspresyonunu değerlendirdik (Şekil 7a). Bunlar arasında, PGD2, TGF'ye- 1 yanıt olarak NRK-52E hücreleri üzerinde güçlü bir antifibrotik etki sağladı. PGD2'nin COL1A1 ve SMA ekspresyonu üzerindeki baskılayıcı etkisi, sırasıyla 7.12 μM ve 6.48 μM EC50 ile doza bağımlıydı (Şekil 7b). Ek olarak, aynı deneyleri normal yetişkin insandan ölümsüzleştirilmiş proksimal tübül epitel hücreleri olan HK-2 hücrelerinde gerçekleştirdik.böbrekler,ve benzer bir sonuç, yani PGD2 ile tedaviye yanıt olarak doza bağlı bir şekilde COL1A1 ve SMA inhibisyonu bulmuştur (Şekil 7c). Bu nedenle, Alox15−/− CKD'de artan PGD2 seviyeleriböbreklerKBH'de antifibrotik etkilere katkıda bulunabilir.
CISTANCH BÖBREK/BÖBREK AĞRILARINI İYİLEŞTİRECEK
Önemli bir PGD2 metabolize edici enzim olan 15‑PGDH, Alox15−/− CKD böbreklerinde azaldıPGD2'deki artışın mekanizmasını netleştirmek içinböbreklerAlox15−/− CKD model farelerde, PGD2 sentazın mRNA seviyesini ölçtük. PGD2 sentazın (PGDS) iki izoformu vardır: lipokalin PGDS (L-PGDS) ve hematopoietik PGDS (H-PGDS) [28]. Hem L-PGDS hem de H-PGDS seviyeleri, 5/6 Nx koşulları altında plasebo koşullar altında olanlara kıyasla önemli ölçüde arttı.böbreklerWT farelerinin (Şekil 8a, her ikisi de P<0.0001) indicating="" that="" increased="" pgd2="" in="" ckd="" is="" due="" to="" increased="" pgd2="" synthases.="" conversely,="" the="" increase="" in="" l-pgds="" and="" h-pgds="" under="" 5/6="" nx="" conditions="" was="" significantly="" inhibited="" in="" alox15−/−="" mice="" (fig. 8a)="" indicating="" that="" the="" increase="" in="" pgd2="" in="" alox15−/−="" ckd="" model="" mice="" was="" not="" due="" to="" increased="" production="" by="" pgds.="" then,="" we="" examined="" mrna="" levels="" of="" cox-1="" and="" cox-2="" as="" more="" upstream="" synthases="" of="" the="" prostaglandin-producing="" pathway.="" we="" also="" measured="" mrna="" levels="" of="" 15-pgdh="" and="">Ana PGD2-metabolize edici enzimler olduğu bilinen 1C18 [29, 30]. COX-1, COX-2 ve AKR1C18'in mRNA seviyeleri değişmezken, CKD'de 15-PGDH'nin mRNA seviyesi önemli ölçüde azaldıböbreklerAlox15−/− farelerin WT farelerinkiyle karşılaştırıldığında (Şekil 8b, P=0.0325), bu da potansiyel olarak CKD'de PGD2'de artışa yol açarböbreklerAlox15−/− farelerin.
Tartışma
Bu çalışma göstermiştir ki, CKD'deböbrekAlox15'in hem transkripsiyon hem de protein seviyeleri arttırıldı veböbrekAlox15−/− farelerde işlev bozukluğu ve fibrozis iyileştirildi. Ek olarak, LC-MS/MS tabanlı aracı lipidomikleri, Alox15−/− CKD faresininböbreklerWT fareleri ile karşılaştırıldığında, önemli ölçüde artan PGD2 seviyelerine sahipti. PGD2, NRK-52E ve HK-2 hücrelerinin EMT'sini inhibe etti; bu nedenle, PGD2 artışı, Alox15−/− farelerinböbrek hasarıve fibrozis. Aralarındaki ilişkiböbrek hastalığıve insan serumu veya plazmasında lipidomik kullanan lipid profilleri kapsamlı bir şekilde araştırılmıştır [31-33], ancakböbrekdoku. Benzer şekilde, CKD hayvan modellerini kullanan lipidomiklere ilişkin raporlar az olsa da [34-36], bu çalışmaların tümü bir CKD hayvan modelinden alınan plazma numuneleri üzerinde lipidomikler gerçekleştirmiştir; bununla birlikte, kapsamlı lipidomik yokböbrekCKD modelinden dokular henüz rapor edilmemiştir. Doku üzerindeki doğrudan lipidomikler, fonksiyonel metabolitlerin tanımlanmasında plazma örneklerinin yanı sıra etkilidir. Ayrıca, dokulardaki ve kan örneklerindeki metabolit değişiklikleri organlara göre oldukça farklıdır [20]. Bu çalışmada, PUFA'dan türetilmiş lipid mediatörlerinin profilini kapsamlı bir şekilde analiz ettik.böbrekbir CKD hayvan modelinin dokuları.
Bu çalışma, PUFA'ları metabolize eden ana enzimlerden biri olan ALOX15'e odaklandı. Bu çalışmada, ALOX15'in hem protein hem de mRNA ekspresyon seviyeleri CKD'de açıkça artmıştır.böbrekler. CKD'deki ALOX15 ifadesinden sorumlu hücre tiplerini ele aldık.böbrekler,ve in situ hibridizasyon ile, ALOX15 mRNA'nın artan bir ifadesini bulduk.böbrek5/6 Nx modelindeki tübüler hücreler.
ALOX15, ateroskleroz gibi kronik hastalıklarda rol oynar ve hayvan hastalığı modellerinde silinmesi bu hastalıkları iyileştirir [5]. ALOX15 ile ilişkisi hakkındaböbrek hastalığı, streptozotosin ile indüklenen diyabetik nefropati modeli ile glomerüler hasar altındaki Alox15−/− farelerinde proteinüri azalır [37]. Bununla birlikte, bu diabetes mellitus fare modeli, herhangi bir düşüş göstermez.Böbrek fonksiyonu; bu nedenle, ALOX15'in bozulma ile nasıl ilişkili olduğuna dair mekanizmaBöbrek fonksiyonuCKD modellerinde belirsiz kalmıştır. Bu çalışmada, 5/6 Nx fare modelini kullanarak ALOX15 silme işleminin düzeldiğini bulduk.böbrekişlev bozukluğu veböbrekCKD modelinde fibroz. Bugüne kadar sadece monositlerdeki IL-4 ve IL-13'in ALOX15'in ekspresyonunu doğrudan artıran düzenleyici faktörler olduğu bilinmektedir [5]. Bununla birlikte, ALOX15'i neyin arttırdığı belirsizliğini koruyor.böbrektübüler hücreler. KBH'de plazma ve böbreklerde çeşitli sitokinler ve üremik toksinlerin arttığı bilinmektedir [38, 39]. Bunların arasında ALOX15'in yeni düzenleyicileri olabilir. ALOX15'in CKD'deki başlıca düzenleyici faktörlerini aydınlatmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Alox15 delesyonunu 5/6 Nx modelindeki renoprotektif etkisine bağlayan spesifik araya giren oksilipinleri belirlemeye yönelik çalışmalarımızda, PGD2'nin dirençte rol oynayabileceğini bulduk.böbrek hasarıALOX15'in silinmesi nedeniyle. Genel bir anlayış olarak, PGD2, COX-1 ve
CCOX-2, daha sonra PGH2'ye dönüştürülen araşidonik asitlerden PGG2 üretir. PGH2, PGD2 sentaz (PGDS) tarafından metabolize edildiğinde, PGD2 üretilir [28]. PGDS'nin genetik olarak farklı iki izoformu vardır, bunlar lipokalintip PGDS (L-PGDS) ve hematopoietik tip PGDS (H-PGDS) [28]. Alox15−/− CKD farede PGD2 artırılmış olsa daböbrekler, Alox15−/− CKD farede ne L-PGDS ne de H-PGDS arttırılmadıböbrekler, WT CKD faresinde PGDS'deki büyük artışa rağmenböbrekler(Şekil 8a). Ayrıca, Alox15−/− CKD fare böbreklerinde ne COX-1 ne de COX-2'un artmadığını da ortaya çıkardık (Şekil 8b). Bu sonuçlar, Alox15−/− CKD fare böbreklerindeki PGD 2'deki artışın, sentazlardaki bir artıştan değil, artan substrat mevcudiyeti veya bozunma inhibisyonundan kaynaklandığını ve aslında, {{ 7}}PGDH, Alox15−/− CKD fare böbreklerindeki başlıca PGD2 metabolize eden enzimlerden biri [29] (Şekil 8b). Alox15'in silinmesinin neden 15-PGDH'de bir azalmaya yol açtığını açıklamak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.
Yukarıda bahsedildiği gibi, PGD2 dirençte rol oynayabilir.böbrek hasarıALOX15 kaybından kaynaklanır. Bu çalışmada, PGD2, proksimal tübüler hücreleri temsil eden NRK-52E ve HK-2 hücrelerinde TGF- 1 tarafından EMT'yi inhibe etti. PGD2, işlevleri farklı olan DP1 ve DP2 olmak üzere iki farklı G protein-bağlı reseptöre bağlanır [28]. Bununla birlikte, in vitro deneylerimizde, DP1 ve DP2'nin Ki değerlerinin sırasıyla 1.7 nM ve 2.4 nM olduğu düşünüldüğünde, PGD2 nispeten yüksek olan 4 ila 32 μM arasında değişen konsantrasyonlarda etkili olmuştur [28]. Bu sonuç, PGD2'nin, G proteinine bağlı reseptörler yoluyla değil, PPAR gibi diğer yollar aracılığıyla antifibrotik etkiler gösterebileceğini gösterir; bu yollar aracılığıyla, aşağı akışlı bir PGD2 metaboliti olan 15-d-PGJ2'nin etkilerini uyguladığı bilinmektedir [28]. Lipid metabolik enzimler ve metabolitlerine odaklanan bu çalışmada, ALOX15 inhibisyonu ve/veya PGD2 uygulaması, CKD için umut verici bir terapötik hedef olabilir. Ne yazık ki, klinik uygulamada kullanılabilecek ALOX15'e özgü bir inhibitör geliştirilmemiştir [40, 41]. Çeşitli metabolitleri etkileyen yağ asidi metabolize edici enzimlerin inhibisyonu yerine PGD2 gibi aşağı akış fonksiyonel metabolitlerin terapötik olarak hedeflenmesi, yeni bir ideal CKD tedavisi olabilir.
CISTANCHE BÖBREK/BÖBREK DİYALİZİNİ İYİLEŞTİRECEK
