İnsan Böbreklerinde Mineralo-organik Nanopartiküllerin Tespiti ve Karakterizasyonu

Tsui Yin Wong^1,2,*, Cheng-Yeu Wu^1,2,3,* ve diğerleri

Ektopik kalsifikasyon, ateroskleroz, kanser,kronikböbrekhastalık, vediyabetşeker hastalığı. Kalsifiye kan damarlarında mineral nanopartiküller tespit edilmiş olsa da, bu partiküllerin insan vücudundaki doğası ve rolü belirsizliğini koruyor. Burada ilk kez insan olduğunu gösteriyoruz.böbrekson aşamadan elde edilen dokularkronikböbrekhastalıkveya böbrek kanseri hastaları 50 ila 1.500 nm'lik yuvarlak, çok katmanlı mineral partikülleri içerirken sağlıklı kontrollerde partikül gözlenmez. Mineral partiküller esas olarak kıvrımlı tübülleri çevreleyen hücre dışı matriste, Henle'nin toplama kanalları ve halkalarının yanı sıra tübül sınırlayıcı hücrelerin sitoplazmasında bulunur ve kemiklerde ve ektopik kalsifikasyonlarda bulunan minerale benzer polikristal kalsiyum fosfattan oluşur. buböbrekmineral nanopartiküller, albümin, fetuin-A ve apolipoprotein A1 dahil olmak üzere vücut sıvılarında ektopik kalsifikasyonu inhibe eden birkaç serum proteini içerir. Mineraller-organik nanopartiküller sadece kalsifiye tortular içinde değil, aynı zamanda mikroskobik kalsifikasyonlardan yoksun alanlarda da bulunduğundan, gözlemlerimiz nanopartiküllerin insanlarda kalsifikasyon ve böbrek taşlarının öncülerini temsil edebileceğini göstermektedir.

İletişim:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Ektopik kalsifikasyon ateroskleroz, kanser,kronikböbrekhastalıkve diyabetes mellitus1–3. Son çalışmalar, aterosklerozun vekronikböbrekhastalıkvasküler kalsifikasyon belirtileri olan hastalarda artmış morbidite ve mortalite riskleri görülür, bu da ektopik kalsifikasyonun insan sağlığına zararlı olduğunu düşündürür1,3. İstenmeyen kireçlenme yaşlanan bireylerde de gözlenir ve 60 yaşın üzerindeki çoğu kişide damar kireçlenmesi belirtileri görülür4. Bu nedenlerle ektopik kalsifikasyona neden olan faktörlerin deşifre edilmesi ve etkin tedavi geliştirilmesi önemli hedefleri temsil etmektedir.

Ektopik kalsifikasyon, vücuttaki kalsifikasyon inhibitörleri ve indükleyicileri arasındaki dengesizlik olarak tanımlanabilir. Kalsifikasyon inhibitörleri, albümin, fetuin-A, osteopontin ve matris GLA proteini gibi serum proteinlerinin yanı sıra pirofosfat gibi küçük bileşikleri içerirken, hiperfosfatemi ve inflamasyon, kalsifikasyonun başlıca indükleyicilerini temsil eder5-7. Son çalışmalar, kalsifikasyon indükleyicilerinin, vasküler kalsifikasyon7,8 sırasında kemik oluşumuna benzer bir hücresel süreci aktive ettiğini göstermektedir. Gelişmekte olan kemiklerde mineralizasyonu indükleyenlere benzer matriks vezikülleri, kalsifiye yumuşak dokularda da tespit edilmiştir7-9. Bu matriks vezikülleri muhtemelen osteoblast benzeri hücrelere farklılaşan ve kalsifikasyonu indükleyen vasküler düz kas hücreleri tarafından salınır7.

Ektopik kalsifikasyon belirtileri gösteren yumuşak dokularda mineral nanopartiküller (NP'ler) tespit edilmiştir. Fiyat et al. bifosfonat etidronat veya D vitamini ile tedavi edilen sıçanların serumunun, kalsifikasyon inhibitörleri fetuin-A ve matris GLA protein10,11 içeren mineraller-protein kompleksleri barındırdığını buldu. Benzer şekilde, Jahnen-Dechent ve ark. kalsifiye peritonitli hastaların asit sıvısında kalsiprotein partikülleri (CPP'ler) olarak adlandırılan fetuin-A içeren mineral komplekslerinin tespit edilebileceğini gözlemledi12. Bertazzo ve ark. hem aterosklerotik hem de romatizmal ateş hastalarının aort kapaklarında ve koroner arterlerinde mineral NP'lerin varlığını göstermiştir13. Mineral parçacıklarının oluşumuna ilişkin çalışmalar genellikle insan kardiyovasküler sistemine odaklanmış olsa da, parçacıkların diğer dokularda bulunup bulunmayacağı ve bu varlıkların sağlıkta veya hastalıkta bir rol oynayıp oynamadığı belirsizliğini koruyor.

Mineraller-organik NPS'nin insan ve hayvan vücut sıvılarında kendiliğinden oluştuğunu daha önce gözlemledik14–28. Bu mineral NP'ler başlangıçta nanobakteriler (NB) olarak tanımlandı ve yalnızca dünyadaki en küçük hücreler 29 değil, aynı zamanda Alzheimer hastalığı, ateroskleroz, kanser,böbrektaşoluşum, polikistikböbrekhastalık, ve prostatit30-32. Bununla birlikte, sonuçlarımız NB'nin aslında morfolojileri, büyümeleri, çoğalmaları ve alt kültürleri açısından ortak bakterileri taklit eden canlı olmayan mineral NP'ler olduğunu göstermiştir15,18,22. Sözde NB'ye benzer mineral parçacıkların insan dokularında bulunma olasılığı ve bu parçacıkların hastalıkta bir rol oynayıp oynamadığı incelenmeyi beklemektedir.

Bu çalışmada, hastalıklı insanda mineral-organik NP'leri tespit etmek ve analiz etmek için bir nanomalzeme yaklaşımı geliştirdik.böbrekDokular. Son dönem kronik böbrek hastalığı ve böbrek kanseri hastalarından alınan böbrek dokularının, vücut sıvılarında in vitro olarak kendiliğinden çöken biyomimetik mineral parçacıklarına benzer çok katmanlı mineral NP'ler içerdiğini gösterdik. Sonuçlarımız, bu mineral-organik parçacıkların biyokimyasal bileşimi, oluşum mekanizması ve biyolojik işlevi ile ilgili kritik bilgileri ortaya koymakta ve insan vücudunda ektopik kalsifikasyon ve hastalık başlatma mekanizmalarına ışık tutmaktadır.

Sonuçlar

Son dönem kronik böbrek hastalığı (n=2) veya böbrek kanseri (n=18) olan insan hastalardan cerrahi olarak çıkarılan böbrek dokularını inceledik; böbrek kanseri örnekleri için, - dokunun kanserli kısmı). Sağlıklı kontroller olarak, travma veya hematomu olan ancak önceden anormal böbrek fonksiyonu olmayan hastalardan alınan böbrek biyopsilerini inceledik (n=2; Tablo 1).

Sağlıklı bireylerden alınan böbrek dokuları normal histolojik özellikler gösterdi ve von Kossa boyamasını takiben ektopik kalsifikasyon gözlenmedi (Şekil 1A, B). Öte yandan, hastalıklı bireylerden elde edilen ve hematoksilen ve eozin (H&E) ile boyanmış böbrek dokuları, doku hasarı kanıtı gösterdi (Şekil 2A–C, oklarla gösterilmiştir) ve incelenen hastalıklı dokuların yüzde 80'i ortaya çıkarıldığı gibi mineralize tortular gösterdi. von Kossa boyaması ile (Şekil 1C–T, Şekil 2E,F, kalsifikasyon siyah oklarla gösterilen siyah materyal olarak görülebilir; ayrıca bkz. Tablo 1). Korteks ve medullada, distal kıvrımlı tübülleri çevreleyen hücre dışı boşluk, proksimal kıvrımlı tübüller, toplama kanalları ve Henle halkalarının yanı sıra tübülleri ve kanalları sınırlayan hücrelerin sitoplazması da dahil olmak üzere kalsifiye tortular fark edildi (Şekil 1C–T ve Şekil 1C–T ve Şekil 1C–T). 2E, F). Renal korpüskülde kalsifikasyon saptanmadı (Şekil 2D).

Mineral çökeltilerinin doğasını incelemek için transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile gözlem için ultra ince böbrek kesitleri hazırladık. Mikroskopik mineral birikintileri içeren örneklerde, renal epitel hücrelerinin sitoplazmasında, bazal membranın altındaki ekstrasellüler matrikste ve proksimal ve distal kıvrımlı tübüllerin lümeni içinde mineral partiküller veya granüller tespit edildi (Şekil 3A, B, partiküller büyütüldü). A1–A4 ve B1–B4) panellerinde. Henle halkalarını ve toplama kanallarını kaplayan hücrelerde de mineral NP'ler gözlendi (Şekil 3C, D, C1, C2 ve D1 panellerinde büyütülmüş). Böbrek hücrelerinde hücre içi kesecikler içinde bazı parçacıklar bulundu (Şekil 3A, paneller A1 ve A2). Burada kullanılan elektron mikroskobu yaklaşımı, mineral parçacıkların içini görselleştirmemize de izin verdi; bazı parçacıklar, hafif, elektron geçirgen katmanlarla değişen elektron yoğun halkaları barındırıyordu (Şekil 3A, paneller A3 ve A4, Şekil 3C, panel C1). Vasa recta rants (böbreğin düz arterleri) gibi birkaç kan damarı, çok sayıda mineral NP ile çevriliyiz (Şekil 3D, panel D1). Mineral NP'ler bu nedenle ektopik kalsifikasyon belirtileri gösteren tüm insan böbrek dokularında çeşitli yerlerde bulunurken, incelenen sağlıklı kontrollerde partikül bulunmadı.

Böbrek dokularında bulunan mineral partiküller, daha önceki çalışmalarımızda15,17 vücut sıvılarında kendiliğinden oluştuğunu tarif edilen mineralo-organik NP'lere çok benzer görünmektedir15,17 (bion24 olarak adlandırdık). Bu olasılığı doğrulamak için, daha önce tanımladığımız gibi bir çökeltme yöntemi kullanarak mineral organik NP'ler (veya biyonlar) hazırladık15. Bu yöntem, insan serumu (HS) gibi bir vücut sıvısı içeren bir hücre kültürü ortamına (Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı veya DMEM) kalsiyum ve fosfat gibi çökeltici iyonların eklenmesini ve ardından hücre kültürü koşullarında inkübasyonu içerir (Yöntemlere bakınız). Bu şekilde üretilen parçacıklar (HS-NPS) ya küresel ya da elipsoiddi ve daha önce vücut sıvılarında22,23 ve insan asitlerinde12 ve kalsifiye arterler13. Mineral partiküller, genel morfolojileri, çok katmanlı yapıları ve yüzey özellikleri bakımından böbrek dokularında gözlenen mineral NP'lere veya granüllere çok benzerdi (Şekil 4F–J). HS'den türetilen partiküllerin ve böbrek granüllerinin boyutu da benzerdi, çapları 50 ila 1.500 nm arasında değişiyordu (Şekil 4A–E,F–J). Yukarıda belirtildiği gibi, bazı böbrek granülleri, muhtemelen hücre içi kargo keseciklerini veya hücre dışı zar keseciklerini temsil eden bir lipit zar ile çevrelenmiştir (Şekil 4H,I, zarlar oklarla gösterilmiştir); in vitro olarak hazırlanan HS-NP numunelerinde bu tür membranöz yapılar yoktu (Şekil 4A–E). Bu gözlemler, böbrek granüllerinin serumda toplanan mineralo-organik NP'lere benzer olduğunu göstermektedir.

Seçilen alan elektron kırınım analizini kullanarak, in vitro olarak hazırlanan HS-NP'lerin mineral fazının polikristalin bir nanomalzemeden oluştuğunu gözlemledik (Şekil 4E, iç metin; soluk eşmerkezli halkalara dikkat edin). Böbrek granülleri (Şekil 4J, iç metin) ve kemikler ve ektopik kalsifikasyonlar için önceki çalışmalarda33,35 açıklandığı gibi benzer sonuçlar elde edilmiştir.

Enerji dağıtıcı X-ışını spektroskopisi (EDX) kullanarak HS-NP'lerin ve böbrek granüllerinin kimyasal bileşimini inceledik. HS-NP'ler, bir kalsiyum fosfat mineralinin mevcudiyeti ile tutarlı olarak karbon (C), kalsiyum (Ca), oksijen (O) ve fosfor (P) (Şekil 4K) ana zirveleri gösterdi. HS-NP'lerde (Şekil 4K) düşük bir silikon tepe noktası (Si) de not edildi, bu muhtemelen küçük bir parçacık bileşenini temsil ediyor. Böbrek granülleri ayrıca, bir kalsiyum fosfat mineralinin göstergesi olan karbon, kalsiyum, oksijen ve fosfor zirvelerinin yanı sıra ek silikon ve demir (Fe) zirveleri gösterdi (Şekil 4L). Uranyum zirveleri (U), numune hazırlama sırasında kontrast oluşturan bir reaktif olarak kullanılan uranil asetata atfedilmiştir (böbrek granülleri gibi bazı mineral partikül numunelerinde uranyum bulunması ve Şekil 4M'deki kontrol dokusunda olmaması, yüksek daha önce bildirildiği gibi, uranyumun fosfata afinitesi35). Partikülleri çevreleyen böbrek dokusunun kontrol EDX spektrumu, karbon ve oksijen zirveleri gösterdi (Şekil 4M), bu da kalsiyum ve fosforun esas olarak mineral partiküllerinde bulunduğunu düşündürdü.

HS-NP'lerin ve böbrek granüllerinin Kalsiyum: fosfor (Ca:P) oranları 0.65 ila 1.18 arasında değişmiştir. Bu oranlar, stokiyometrik hidroksiapatit için gözlemlenen teorik 1,67 değerinden farklıdır, ancak yine de, çeşitli kristalleşme derecelerinde gözlenen kalsiyum fosfat ve apatit kristalleri için daha önce görülen aralık içindedir15. Birlikte, bu bulgular böbrek granüllerinin kalsiyum fosfat NP'lerinden oluştuğunu doğrulamaktadır.

Çeşitli proteinlerin vücutta ektopik kalsifikasyonu sistemik bir şekilde inhibe ettiği bulunmuştur36,37. Ek olarak, sentetik NP'lerin yüzeyinde bulunan protein koronasının, in vivo38,39 parçacıkların hücreler üzerindeki biyolojik dağılımını ve etkilerini belirlediğine inanılmaktadır. Öte yandan, insan böbrek dokularında bulunan mineralo-organik NP'lerin protein bileşimi tam olarak anlaşılamamıştır. Daha önce albümin, fetuin-A ve apolipoprotein-A1'in (apo-A1) vücut sıvılarında oluşan mineralo-organik NP'lerle etkileşime giren ana proteinleri temsil ettiğini bulmuştuk17,20. Burada, bu proteinlerin böbrek granülleri içindeki varlığını ve ultrastrüktürel konumunu incelemek için immunogold etiketlemesini kullandık.

HS-NP'lerde ve böbrek granüllerinde serum proteinlerinin varlığını incelemek için insan serum albümini (HSA), insan serum fetuin-A (HSF), insan apo-1A ve tam HS'ye karşı poliklonal antikorlar kullandık. Poliklonal antikorların özgüllüğü (daha önce tarif edildiği gibi hazırlandı25) Western blot kullanılarak doğrulandı (Şekil 5). Poliklonal antikorların her biri, in vitro hazırlanan HS-NP'lerin yanı sıra insan böbrek dokularında bulunan mineral granüllerle pozitif reaksiyona girdi (Şekil 6A,B, paneller A1–A3 ve B1–B3; siyah noktalar). Antikorlar, esas olarak elektron yoğun katmanlarla veya HS-NP'lerin ve böbrek granüllerinin karanlık çekirdeğiyle (Şekil 6A, B) reaksiyona girerek, bu karanlık alanların elektronlu alanlara kıyasla daha yüksek seviyelerde protein içerebileceğini gösterir. Primer antikor olmadan gerçekleştirilen negatif kontroller reaksiyon oluşturmadı (Şekil 6A, B, paneller A4 ve B4, kontrol). Böbrek granüllerinin HS-NP'lere benzer mineralo-organik NP'leri temsil ettiği sonucuna vardık, sadece morfolojilerine ve mineral bileşimlerine değil, aynı zamanda serumda bulunan ana kalsifikasyon inhibitörlerine bağlanmalarına da bağlı olarak.

İmmünofloresan mikroskopi, hastalıklı insan böbreklerinde HSA ve HSF içeren mineral granüllerin varlığını doğrulamak için kullanıldı. Bu tekniği kullanarak, insan böbrek dokuları gösterdi

böbrek tübüllerini çevreleyen interstisyum ve tübül sınırlayıcı hücrelerin sitoplazması dahil olmak üzere çeşitli alanlarda iki protein için pozitif boyama (Şekil 7A, paneller A1 ve A2). Hem albümin hem de fetuin-A içeren protein agregatları, tek proteinlerin boyanmasına kıyasla daha düşük miktarlarda olsa da bu alanlarda da fark edildi (Şekil 7A ve panel A3, birleştirilmiş boyama sarı). Özellikle, immünofloresan ile tespit edilen protein boyamasının, von Kossa boyaması kullanılarak gözlemlenen ektopik kalsifikasyon modeliyle yakından örtüştüğünü fark ettik (Şekil 7A,B, kalsifikasyon, B'de oklarla gösterilen siyah materyal olarak görülebilir). Bu sonuçlar, incelenen insan böbrek dokularında mineralo-organik parçacıkların varlığı için daha fazla destek sağlar.

Tartışma

Sentetik NP'ler ve insan hücreleri arasındaki etkileşimleri anlamamızda ilerlemeler kaydedilmiş olsa da, vücut sıvılarında kendiliğinden oluşan mineralo-organik NP'lerin etkileri hakkında çok daha az şey biliyoruz. Önceki çalışmalarımız, kalsiyum ve fosfat konsantrasyonları doygunluğu 15,16 aştığında bu parçacıkların biyolojik sıvılarda oluştuğunu göstermiştir. Ayrıca bu parçacıkların bağışıklık hücreleri tarafından içselleştirildiğini ancak yalnızca büyük parçacıkların iltihaplanma önleyici bağışıklık tepkilerini indüklediğini gözlemledik23. Ancak bu parçacıkların insan dokularındaki dağılımı ve vücutta herhangi bir fizyolojik veya patolojik rol oynayıp oynamadıkları şimdiye kadar incelenmemişti.

Bu çalışmada, son dönem böbrek hastalığı veya böbrek kanseri olan insan hastaların böbreklerinde ilk kez mineralo-organik NP'leri tespit ettik. Tespit edilen mineralo-organik NP'ler, vücut sıvılarında sistemik kalsifikasyon inhibitörleri olarak işlev gören albümin, fetuin-A ve apo-A1'in yanı sıra kemik mineraline benzer zayıf kristalize kalsiyum fosfat içerir. Sonuçlarımız, vasküler dokularda ve vücut sıvılarında mineral-protein komplekslerinin varlığını tanımlayan önceki raporlarla uyumludur12,13,34,40. Gözlemlediğimiz partiküller, mikroskobik kalsifikasyon içermeyen alanlarda bulunduğundan, gözlemlerimiz partiküllerin insan dokularında ektopik kalsifikasyonun öncülerini temsil edebileceğini düşündürmektedir. Mineralo-organik NP'lerin kademeli olarak büyüyebileceği ve daha önceki çalışmalarımızda15,18 tarif edildiği gibi uygun koşullar altında partikülden filme dönüşüm geçirme olasılığı göz önüne alındığında, burada sunulan gözlemler, mineral öncüllerinin oluşumuna yol açabileceğini düşündürmektedir. Randall's plak ve böbrek taşları gibi in vivo mineral birikintileri.

Böbreklerin çeşitli anatomik yapılarında mineral ektopik kalsifikasyonlar ve mineralo-organik NP'lerin bulunduğuna dair gözlemlerimiz, bu organdaki ektopik kalsifikasyonların önceki bulgularıyla tutarlıdır41. Evan ve arkadaşlarının gözlemleri nefrolitiazisli hastaların böbreklerindeki mineralizasyonun başlayabileceğini ve ağırlıklı olarak Henle kıvrımlarının interstisyel dokusunda oluşabileceğini göstermiştir40,42. Bu yazarlar, bu bölgede oluşan mineral birikintilerinin ürotelyumun bazal tarafından dışarı taşarak böbrek taşı oluşumuna yol açabileceğini gözlemlemişlerdir. Gözlemlerimiz, Henle kıvrımlarına ek olarak, diğer böbrek bölgelerinin, sonunda insan böbreklerinde büyük mineral birikintileri oluşturmak üzere gelişebilecek mineral NP'leri içerebileceğini göstermektedir. Ayrıca kan dolaşımında oluşan mineral NP'lerin böbrek dokularına yer değiştirmesi ve böbreklerde ektopik kalsifikasyon ve taş oluşumuna neden olma olasılığını araştırıyoruz.

Bu çalışmada tespit edilen birkaç böbrek granülü, hücre içi veya hücre dışı veziküller içinde bulunur (Şekil 4H, I) ve bunlar, kemiklerde ve dişlerde kalsifikasyonu indüklediği gösterilen matris veziküllerine benzerdir7,8. Yakın zamanda insan ve hayvan serumundan izole edilen veziküllerin in vitro25 mineral NP'lerin ve mikroskobik çökeltilerin oluşumunu indüklediğini gözlemledik. Schlieper ve ark.34 ayrıca arterlerde bulunan mineral partiküllerin membran yapıları ile ilişkili olduğunu gözlemlediler ve matris veziküllerin veya apoptotik cisimlerin bu dokulardaki mineral partiküllerinin nükleatörlerini temsil edebileceğini öne sürdüler. Benzer şekilde, Khan ve ark. idiyopatik böbrek taşı olan insan hastaların böbreklerinde bulunan kalsiyum fosfat birikintilerinin kollajen lifleri ve matriks vezikülleri ile ilişkili olduğunu bildirmiştir9. Bu sonuçlar, böbrek dokularında saptanan mineralo-organik NP'lerin, aterosklerotik arterlerde görülene benzer bir durum olan membran veziküllerini içeren bir mekanizma yoluyla oluşabileceğini düşündürmektedir7,8. Öte yandan, yakın tarihli bir çalışma, kadın meme arterlerinde bulunan ektopik kalsifikasyonun osteojenik veya apoptotik hücre belirteçleri ile ilişkili olmadığını göstermiştir43, bu da kalsifikasyon mekanizmasının ilgili organa veya biyolojik bağlama özgü olabileceğini düşündürmektedir. Ek olarak, burada insan böbrek dokularında tarif edilenler gibi mineralo-organik NP'ler de iyonların (örn., kalsiyum ve fosfat) ve kalsifikasyon inhibitörlerinin (örn., albümin, fetuin-A ve apolar) fizyolojik konsantrasyonlarının sürdürülememesi nedeniyle oluşabilir. -A1) insan vücut sıvılarında.

Sonuçlarımız, elektron yoğun katman ve mineral-organik NP'lerin çekirdeğinin, parçacıkların elektron-lüsent alanlarına kıyasla daha yüksek seviyelerde proteinler ve organik moleküller içerebileceğini göstermektedir (Şekil 6A, B). Bu elektron yoğun katmanlar, TEM altında bu malzemenin kristal yapısından görüldüğü gibi mineralize olmuş gibi görünmektedir (bkz. Şekil 4A–J). Ryall41 ve Evan et al.44 dahil olmak üzere diğer yazarlar, elektron yoğun tabakaların organik moleküllere karşılık gelebileceği halde elektron-saydam tabakanın mineralleri temsil edebileceğini öne sürmüşlerdir. Bu yorumlar, en azından kısmen, örneklerin her çalışmada işlenme ve incelenme şeklinin yanı sıra kullanılan başlangıç ​​dokularının doğasından kaynaklanabilir.

Ektopik kalsifikasyonda rol oynamanın yanı sıra mineral-organik partiküller böbrek dokularında inflamasyona neden olabilir. Yakın zamanda, mineralo-organik NP'lerin insan makrofajları tarafından pro-inflamatuar interlökin-1 salgılanmasını indüklemede başarısız olurken, 1 μm'den büyük mineral agregatlarının bunu yapabildiğini gösterdik23. Kristalli materyallere yanıt olarak interlökin-1 salınımının, inflamatuar olarak adlandırılan hücre içi moleküler komplekslerin aktivasyonuna dayandığı gösterilmiştir45-47. Ek olarak, tümörleri barındıran böbreklerde mineral parçacıkları tespit edildi ve kanser ile iltihaplanma arasındaki ilişki artık iyi biliniyor48. Toplanan mineral parçacıklarının bir iltihaplanmayı aktive etme ve böbreklerde veya diğer dokularda iltihaplanma ve kanser gelişimine katkıda bulunma olasılığı araştırılmayı beklemektedir.

Ektopik kalsifikasyona ek olarak, burada açıklanan mineral granüller diğer hastalık süreçlerine katılabilir. Örneğin, mineral NP'lerin vücut sıvılarındaki çeşitli proteinlere bağlanabileceğini ve bu organik molekülleri vücut sıvılarından20,26 tüketebileceğini daha önce önermiştik. Öte yandan, insan vücudu kalsifikasyon inhibitörlerinin ve retiküloendotelyal sistemin (yani makrofajların) varlığına güvenerek normal koşullar altında mineral NP'lerin oluşumunu ve birikimini önleyebilir. Mineral NP'ler bu nedenle ancak sistemik veya lokal kalsiyum homeostazı bozulduğunda ve insan vücudunda koruyucu mekanizmalar başarısız olduğunda birikebilir.

Burada geliştirilen nanomalzeme yaklaşımının, hayvan ve insan dokularında mineralo-organik NP'lerin oluşumunu incelemek için kullanılabileceğini öneriyoruz. Örneğin, albümin, fetuin-A ve apo-A1 gibi kalsifikasyon önleyici proteinlere karşı yükseltilmiş antikorlar, hayvan modellerinin dokularında mineralo-organik NP'lerin oluşumunu saptamak ve karakterize etmek için mineral analizi ile kombinasyon halinde kullanılabilir. Bu yaklaşım kullanılarak elde edilen sonuçlar, vücuttaki mineral partikül oluşumu ve ektopik kalsifikasyon durumunu yansıtan biyolojik parametreleri belirlemek için insan vücut sıvıları üzerinde yapılan klinik ölçümlere uygulanabilir. Bu bilginin, ektopik kalsifikasyon ile ilişkili insan hastalıklarını ve durumlarını önlemek ve tedavi etmek için yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesine yol açabileceğini umuyoruz.

yöntemler

Böbrek dokuları.İnsan dokularının kullanımı ve bu çalışmada gerçekleştirilen deneyler, Chang Gung Memorial Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı; yöntemler ve deneyler, onaylanmış kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Kontrol sağlıklı böbrek dokuları, böbrek hastalığı öyküsü olmayan (n=2); böbrek dokuları ayrıca böbrek kanseri hastalarından (n=20) ve böbrekleri transplant cerrahisi sırasında alınan veya biyopsi yapılan son dönem böbrek hastalığı hastalarından (n=2) elde edildi (Tablo 1). Böbrek kanseri dokuları için, dokunun kanserli olmayan kısmı bu çalışmada diseke edildi ve analiz edildi.

Histolojik analiz.Böbrek dokuları parafin bloklara yerleştirildi. Bloklar kesildi ve doku dilimleri, parafini çıkarmak için 30 dakika boyunca 70 derecede sıcak bir plaka üzerinde ısıtıldı. Kesitler, kalan parafini tamamen çıkarmak için 15 dakika boyunca üç kez taze bir ksilen çözeltisine daldırıldı. Kesitler, her seferinde 5 dakika boyunca yüzde 95, yüzde 80 ve yüzde 70 etanol ile rehidre edildi. Rehidre edilmiş numuneler, 5 dakika boyunca çift damıtılmış su (ddH2O) ile yıkandı. Hücre çekirdekleri 8 dakika hematoksilen ile boyandı. Boya, numunelerden 10 dakika boyunca ılık su ile çıkarıldı. Böbrek örnekleri ddH2O içinde durulandı ve yüzde 95 etanol içinde 10 kez daldırıldı. Etanol ile muamele edilmiş numuneler, 1 dakika boyunca eozin Y ile karşıt olarak boyandı. Numuneler, her seferinde 10 dakika boyunca yüzde 95 ve yüzde 100 etanol ile dehidre edildi, ardından 10 dakika boyunca ksilen içinde bir dehidrasyon aşaması yapıldı. Nihai dehidrate böbrek örnekleri, yüzde 50 gliserol içeren cam slaytlara yerleştirildi ve dijital kamera ile donatılmış bir ışık mikroskobu altında gözlemlendi.

Parafinden arındırılmış ve rehidre edilmiş numuneler, H&E boyaması için tarif edildiği gibi hazırlandı. Rehidre kesitler gümüş nitrat (yüzde 5) ile boyandı, ardından 20 dakika UV ışığına maruz bırakıldı. Çözelti ddH2O ile 15 dakika yıkandı. Kesitler, 5 dakika boyunca sodyum tiyosülfat (yüzde 5) ile boyandı, ardından 15 dakika boyunca ddH2O ile yıkandı. Kesitler nükleer hızlı kırmızı (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) ile 5 dakika boyandı. Lekeli numuneler, 10 dakika boyunca ksilen içinde dehidrasyondan önce, her biri 10 dakika süreyle yüzde 95 ve yüzde 100 etanol ile art arda kurutuldu. Böbrek örnekleri cam slaytlar üzerine yerleştirildi ve yukarıda tarif edildiği gibi incelendi.

Elektron mikroskobu ve EDX analizi.Böbrek örnekleri, bir LGPS diseksiyon mikroskobu (Olympus, Tokyo, Japonya) kullanılarak 1 mm'den daha az kalınlıkta küçük parçalar halinde kesildi. Dokular, gece boyunca 4 derecede 0.1 M kakodilat tampon içinde yüzde 2.5 glutaraldehit ve yüzde 1 paraformaldehit ile sabitlendi. Sabit numuneler, 10 dakika boyunca buz üzerinde yüzde 8 sakaroz (pH 7.2) içinde 0.1 M kakodilat tamponu ile üç kez yıkandı. Yıkanan dokular, 2 saat boyunca buz üzerinde yüzde 1 osmiyum tetroksit ve yüzde 1.5 potasyum ferrosiyanür içeren fosfat tamponlu tuzlu su (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HP04) içinde inkübe edildi. Dokular, buz üzerinde 10 dakika ddH2O ile üç kez yıkandı. Yıkanan dokular, buz üzerinde ddH2O ile üç kez yıkanmadan önce 1 saat boyunca ddH2O içinde yüzde 1 uranil asetat ile buz üzerinde lekelendi. Böbrek dokuları, etanolün yüzde 70'e ulaştığı durumlar haricinde, her seferinde 10 dakika boyunca yüzde 30, 50, 70, 80 ve 90 etanol ile dehidre edildi, bu durumda numuneler gece boyunca 4 derecede saklandı. Dokular, 5 dakika boyunca yüzde 95 etanol ile dehidrasyondan önce, 15 dakika boyunca yüzde 95 etanol içinde yüzde 1 fosfotungstik asit ile lekelendi. Numuneler, her seferinde 10 dakika süreyle etanol içinde yüzde 40, 57, 67 ve yüzde 100'de propilen okside daldırıldı, ardından 5 dakika boyunca yüzde 100 propilen okside daldırıldı. Böbrek dokuları, her seferinde 1 saat süreyle yüzde 50, 70 ve yüzde 100 Eponate 812 (Ted Pella, Redding, CA) ile infiltre edildi. Eponate 812-gömülü böbrek örnekleri, yüzde 100 Eponate içinde iki kez inkübe edilerek hazırlandı. Gömülü numuneler, reçine polimerizasyonuna izin vermek için gece boyunca 60 derecelik bir fırında inkübe edildi.

Yukarıdaki gibi elde edilen yıkanmış HS-NP topakları, glutaraldehit (yüzde 2.5) ve paraformaldehit (yüzde 1) ile ddH2O içinde 4 saat boyunca 4 derecede sabitlendi. Sabit peletler, her seferinde 10 dakika olmak üzere üç kez ddH2O ile yıkandı. Peletler, peletlerin gece boyunca 4 derecede saklandığı, etanolün yüzde 70'e ulaştığı durumlar haricinde, her seferinde 10 dakika boyunca yüzde 30, 50, 70, 80, 90, 95 ve 100 etanol içinde ardışık inkübasyonlarla kurutuldu. Diğer etanol çözeltileri, yalnızca 10 dakika boyunca topaklarla temas ettirildi. Kurutulmuş peletler, her biri 30 dakika boyunca farklı oranlarda etanol ve LR ortamı (3:1, 1:1 ve 1:3) kullanılarak LR beyaz gömme ortamı (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) ile süzüldü. Peletler, polimerizasyondan önce gece boyunca taze LR ortamı (yüzde 100) ile süzüldü. LR ortamı ile süzülmüş peletler, reçine polimerizasyonuna izin vermek için 2 gün boyunca 60 derecede bir fırında inkübe edildi. Böbrek ve HS-NP blokları, bir Reichert Ultracut S mikrotomu (Leica, Wetzlar, Almanya) kullanılarak 70-100 nm kalınlığında dilimler üretmek için kesitlere ayrıldı. Doku kesitleri, 100 kV'da çalıştırılan bir JEM 1230 transmisyon elektron mikroskobu (JEOL, Tokyo, Japonya) altında görselleştirilmeden önce yüzde 4 uranil asetat ile boyandı. Elektron kırınım desenleri aynı sistem kullanılarak elde edildi. Destek olarak nikel ızgaralar kullanıldı.

EDX analizi için, böbrek dokularının ince bölümleri uranil asetat ile boyandı ve yukarıdaki gibi ddH2O ile yıkandı, ardından bir elektronik desikatör kabininde kurutuldu. Örnekler, 120 kV'da çalıştırılan yüksek çözünürlüklü bir JEM 2100 transmisyon elektron mikroskobu (JEOL) altında gözlemlendi. EDX spektrumları, bir INCA Energy EDS sistemi (Oxford Instruments, Abingdon, UK) kullanılarak üç kopya halinde elde edildi. HS-NP'lerin ince bölümleri boyanmadan gözlendi.

Mineralo-organik NP'lerin hazırlanması.Tüm başlangıç ​​çözeltileri pH 7.4'e ayarlandı ve kullanımdan önce 0.2 um membranlardan süzülerek sterilize edildi. HS, sağlıklı insan gönüllülerden geleneksel bir damar delme tekniği kullanılarak elde edildi. Bu çalışmada insan biyolojik sıvılarının kullanımı Linko Chang Gung Memorial Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı ve gönüllülerden yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. HS-NP'ler, yüzde 10 HS içeren DMEM'e (Gibco, Carlsbad, CA) her biri 3 mM CaCl2 ve Na2HP04 eklenerek ve ardından hücre kültürü koşullarında (37 derece, yüzde 5 CO2, nemli hava) bir hafta süreyle inkübasyonla hazırlandı. Parçacıklar, 16,000 xg'de 15 dakika boyunca 4 derecede santrifüj edilerek peletlendi ve aynı santrifüj prosedürü kullanılarak iki kez HEPES tamponu (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 2 mM Na2HP04, 150 mM NaCl) ile yıkandı.

SDS-PAGE ve Western blotlama.SDS-PAGE ve Western blot analizi esasen daha önce olduğu gibi yapıldı15. Kısaca, 0.2 ug (Şekil 5A,D) veya 1.2 ug (Şekil 5B,C) HS proteinleri, 47 ug (Şekil 5A,B,D) veya 590ug HS-NP proteinleri (Şekil 5C), 0.1ug HSA (Şekil 5A–D) ve 0.6ug (Şekil 5A, C, D) veya {{23} }.15ug HSF (Şekil 5B) 5 x "yükleme tamponu" (0.313 M Tris-HCl pH 6.8, yüzde 10 SDS, yüzde 0.05 bromofenol mavisi, yüzde 50 gliserol, yüzde 12.5 - merkaptoetanol) bir mini jel sistemi (Hoefer, Holliston, MA) kullanılarak yüzde 10'luk bir SDS-PAGE üzerinde denatüre edici ve indirgeyici koşullar altında 5 dakika boyunca 95 derecede ısıtmadan ve ayırmadan önce 1x'lik bir nihai konsantrasyona kadar. NP kontrolü (Şekil 5A–D'deki şerit 1'de kullanılır), her biri 3 mM CaCl2 ve Na2HP04'ün DMEM'e (nihai hacim 1 ml) eklenmesi ve ardından hücre kültürü koşullarında bir gün kuluçkalanmasıyla hazırlanan mineral NP'lerden oluşuyordu; partiküller, 15 dakika boyunca 16,{49}} xg'de santrifüj edilerek topak haline getirildi, iki kez HEPES tamponu ile yıkandı ve 50ul HEPES tamponu içinde yeniden süspanse edildi. 20 ul yeniden süspanse edilmiş partikül alikuotu, yukarıdaki gibi SDS-PAGE için işlendi. PVDF membranları, oda sıcaklığında yüzde 5 (a/h) yağı alınmış sütte 1 saat bloke edildi. Daha önce tarif edildiği gibi kurum içinde üretilen birincil antikorlar25, 1:1,000 ( -apo-A1 ve -HS-NP), 1:3,000 ( -HSF) dilüsyonunda kullanıldı. veya 1:6,000 ( -HSA). Keçi anti-tavşan yabanturpu peroksidazla konjuge ikincil antikor, üretici tarafından sağlanan talimatlara göre kullanıldı (Millipore, Billerica, MA). Lekeler, geliştirilmiş kemilüminesans (Amersham Biosciences, Amersham, UK) ve otoradyografik filmler kullanılarak ortaya çıkarıldı.

İmmünogold etiketleme.TEM gözlemi için örnekler hazırlandı. HS-NP blokları 70 nm'den daha az kalınlıkta dilimlere ayrıldı. Izgaralar üzerindeki numune kesitleri, 0.1 M HEPES tamponu (pH 8.0) içinde yüzde 1 balık jelatini (Sigma) ile 25 dakika süreyle bloke edildi. Izgaralar, aşağıdaki birincil antikorlarla inkübe edildi: -HSA, 1:30; -HSF, 1:50; -apo-A1, 1:30; -HS-NP, 1:60. Negatif kontrol, birincil antikor içermiyordu (HEPES tamponunda yüzde 1 balık jelatini). İnkübe edilen kesitler HEPES tamponu ile 15 dakika yıkandı. Durulanan kesitler, 20 dakika boyunca HEPES tamponunda yüzde 1 balık jelatini ile bloke edildi. Örnekler, 1 saat boyunca ikincil 5-nm-altın-eşlenik keçi anti-tavşan IgG'si ile işlendi. Numuneler, 10 dakika boyunca ddH2O ile yıkanmadan önce, 10 dakika boyunca HEPES tamponu ile yıkandı. TEM gözlemleri yukarıdaki gibi yapılmıştır.

Floresan mikroskobu.Yukarıdaki gibi hazırlanan histolojik böbrek dokusu slaytları, oda sıcaklığında 1 saat boyunca yüzde 1 bovin serum albümini ile bloke edildi. Slaytlar, 1:4,000 dilüsyonunda birincil poliklonal antikorlarla inkübe edildi. Yıkama adımlarından sonra, numuneler ikincil antikorlar keçi anti-tavşan-FITC (492/520nm) ve keçi anti-tavşan-TRITC (550/570nm) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) ile 1:100'de inkübe edildi. 1 saat Kompleksler PBST ile 15 dakika yıkandı. Floresan boyası 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), 15 dakika boyunca 10 ug/ml'de kullanıldı. DAPI lekeli numuneler, her biri 10 dakika boyunca yüzde 95 ve 100 etanol ile dehidre edildi, ardından 10 dakika daha ksilen içinde dehidrasyon yapıldı. Kurutulmuş böbrek örnekleri, Vectashield floresan H-1000 montaj ortamı (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ile monte edildi ve Spot Flex kamera ile donatılmış bir konfokal mikroskop (LSM510 Meta; Zeiss, Oberkochen, Almanya) altında gözlemlendi.

Cistanche tubulosa böbrek hastalığını önler, numuneyi almak için buraya tıklayın

Referanslar

1. Giachelli, CM Ektopik kalsifikasyon: yumuşak doku mineralizasyonu hakkında kesin gerçeklerin toplanması. Am J Pathol 154, 671-675 (1999).

2. Abedin, M., Tintut, Y. & Demer, LL Vasküler kalsifikasyon: mekanizmalar ve klinik sonuçlar. Arterioscler Tromb Vasc Biol 24, 1161–1170 (2004).

3. Alexopoulos, N. & Raggi, Aterosklerozda P. Kalsifikasyon. Nat Rev Cardiol 6, 681–688 (2009).

4. Allison, MA, Criqui, MH & Wright, Sistemik kalsifiye ateroskleroz için CM Paternleri ve risk faktörleri. Arterioscler Tromb Vasc Biol 24, 331–336 (2004).

5. Ketteler, M. et al. Diyaliz hastalarında kalsiyum düzenleyici proteinlerin eksiklikleri: üremide yeni bir kardiyovasküler kalsifikasyon kavramı. Böbrek Uluslararası Suppl 84, S84-87 (2003).

6. Kapustin, A. & Shanahan, CM Vasküler kalsifikasyonu hedefleme: sert bir hedefi yumuşatma. Curr Opin Pharmacol 9, 84-89 (2009).

7. Kapustin, AN & Shanahan, CM Vasküler düz kas hücresi kaynaklı matris veziküllerinin Kalsiyum regülasyonu. Trendler Cardiovasc Med 22, 133–137 (2012).

8. Doherty, TM ve ark. Aterosklerozda kalsifikasyon: arter kavşağında kemik biyolojisi ve kronik inflamasyon. Proc Natl Acad Sci USA 100, 11201–11206 (2003).

9. Khan, SR, Rodriguez, DE, Gower, LB & Monga, M. Randall plaklarının kolajen lifleri ve zar vezikülleri ile birlikteliği. J Urol 187, 1094–1100 (2012).

10. Price, PA, Nguyen, TM & Williamson, MK Serum fetuin-mineral kompleksinin biyokimyasal karakterizasyonu. J Biol Chem 278, 22153–22160 (2003).

11. Price, PA, Williamson, MK, Nguyen, TM & Than, TN Fetuin-mineral kompleksinin serum seviyeleri, sıçandaki arter kalsifikasyonu ile ilişkilidir. J Biol Chem 279, 1594–1600 (2004).

12. Heiss, A. ve diğerleri. Kalsiyum fosfat partiküllerinin oluşumu ve stabilizasyonunda fetuin-A ve asidik serum proteinlerinin hiyerarşik rolü. J Biol Chem 283, 14815–14825 (2008).

13. Bertazzo, S. ve ark. Nano-analitik elektron mikroskobu, insan kardiyovasküler doku kalsifikasyonuna ilişkin temel bilgileri ortaya koymaktadır. Nat Mater 12, 576-583 (2013).

14. Martel, J. & Young, JD İnsan kanında kalsiyum karbonat nanoparçacıkları olarak sözde nanobakteriler. Proc Natl Acad Sci USA 105, 5549–5554 (2008).

15. Young, JD ve ark. Varsayılan nanobakteriler, normal kalsiyum homeostazının fizyolojik kalıntılarını ve kültür yan ürünlerini temsil eder. Plos Bir 4, e4417 (2009).

16. Young, JD ve ark. Serumdaki kalsiyum ve apatit granülasyonlarının pleomorfik mineralo-protein kompleksleri ve varsayılan nanobakterilerin öncüleri olarak karakterizasyonu. Plos Bir 4, e5421 (2009).

17. Wu, CY, Martel, J., Young, D. & Young, JD Fetuin-A/albümin-mineral kompleksleri, serum kalsiyum granüllerine ve varsayılan nanobakterilere benziyor: ikili inhibisyon-tohumlama konseptinin gösterilmesi. Plos Bir 4, e8058 (2009).

18. Young, JD & Martel, J. Nanobakterilerin yükselişi ve düşüşü. Sci Am 302, 52–59 (2010).

19. Martel, J., Wu, CY & Young, JD Kültürde besleyici olarak kullanılan gama ışınlı serumun kritik değerlendirmesi ve varsayılan nanobakterilerin ve kalsifiye nanopartiküllerin gösterilmesi. Plos Bir 5, e10343 (2010).

20. Martel, J. ve ark. İnsan vücudu sıvılarından türetilen ve sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi ile analiz edilen mineral nanopartiküllerin kapsamlı proteomik analizi. Anal Biyokimya 418, 111–125 (2011).