Cistanche Herba'nın Su Ekstraktında HPLC ile Ekinacoside Tayini

XU Shanshan1 ,WU Kangyu2 ,TU Xingming2 （1. Guangzhou Çin Tıbbı Üniversitesi Üçüncü Klinik Tıp Fakültesi, Guangzhou 510405 Guangdong, Çin; 2. Guangzhou Çin Tıbbı Üniversitesi Üçüncü Bağlı Hastanesi,Guangzhou 510378 Guangdong,Çin） 

Soyut: Amaç belirlenmesi için bir HPLC yöntemi oluşturulmuştur.ekinekosidC'nin su özündeistanche çölü tatlısı. YöntemlerEkinakozit, HPLC ile belirlendi. Ayırma, Inertsil ODSSP C üzerinde gerçekleştirildi.18 asetonitrilden oluşan mobil fazlı kolon（A）ve yüzde 0,4 fosforik asit çözeltisi（B）,gradyan elüsyon ile. Algılama dalga boyu 333 nm'ye ayarlandı,ve sütun sıcaklığı 30 derece idi. Akış hızı 1,0 mL·dak idi-1 ve enjeksiyon hacmi 10 uL idi.SonuçlarEkinakosidin 44.939 7-539.276 4 ug ·mL konsantrasyon aralığındaki doğrusal ilişkisi- 1 iyiydi（r = 0.999 8）. Geri kazanımlar yüzde 94,59 -105,31 idi（MSB= 2,93 yüzde,n = 9）. Cistanche bitkisinin su ekstraktlarındaki ekinakozit içeriği 15.527 idi.,7.347,12.267 mg·g-1 . 

Çözüm: İyi tekrarlanabilirliğe sahip yerleşik HPLC yöntemi doğrudur,basit ve yapılabilir. Su ekstraktında ekinakozit tayini için uygundur.Cistanche Deserticola ma. 

anahtar kelimeler:HPLC;su özüCistanche Deserticola;ekinekosid;içeriğin belirlenmesi

Cistanche Deserticolageleneksel Çin tıbbında klinik uygulamada yaygın olarak kullanılan bir toniktir ve "çöl ginsengi". Çin Farmakopesi'nin 2015 baskısında yer alan Cistanche Deserticola, Orobaceae bitkisi Cistanche Deserticola YC Ma veya Cistanche tubulosa (Schenk) Wright'ın kurutulmuş, pullu, etli sapıdır. Sıcak bir doğası, tatlı ve tuzlu bir tadı vardır ve böbrek ve kalın bağırsak meridyenlerine aittir. Böbrek yangınını tonlama, öz ve kandan yararlanma, bağırsakları nemlendirme ve kabızlığı giderme etkileri vardır. [2]. 

Çöl ginsengi

"Shennong Materia Medica Classic", "ortayı besleyebileceğini, beş iç organı besleyebileceğini ve yin'i güçlendirip özü besleyebileceğini" belirtir.Cistanche Deserticola esas olarak feniletanoid glikozitler, iridoidler ve glikozitler, lignanlar ve glikozitler, polisakkaritler, esterler ve alkaloidler içerir [3].feniletanol glikozitlerana aktif bileşenleridir.Cistanche DeserticolaEkinezya ve havuz kenarı, Çin Farmakopesinde Cistanche Deserticola'nın tanımlanması ve içerik tayini için indikatör bileşenlerdir.. 

Feniletanol glikozit, Cistanche Deserticola'nın ana aktif bileşenidir.

Farmakolojik çalışmalar [4] şunu göstermektedir: Cistanche DeserticolaBağırsakları nemlendirerek kabızlığı giderici, karaciğeri koruyucu, osteoporoza karşı dirençli, antioksidan, yaşlanma karşıtı, yorgunluk önleyici gibi çeşitli farmakolojik etkilere sahiptir.. sulu ekstraktıCistanche Deserticolasıçanlarda osteoblastların kemik morfogenetik protein 2 genlerini ve ayrıca ovariektomi uygulanmış farelerin serumunda tartrat dirençli asit fosfataz ve osteokalsini teşvik edebilir, yanı sıra kemik iliğindeki Smad1 ve Smad5 genleri ve dönüştürücü büyüme faktörleri- vb. ifadesinin biranti-osteoporoz etkisi [5-6]. ekinosid osteoblastların proliferasyonunu teşvik edebilir ve kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin in vitro olarak osteoblastlara farklılaşmasını teşvik edebilir[7-9]. 

Cistanche Deserticola'nın ana kimyasal bileşeni olan Echinoside

Natural Cistanche Echinacoside ürünlerini incelemek için tıklayınız

【Ask for more】 Email: xue122522@foxmail.com /  Whats App:  0086 18599088692 /  Wechat:  18599088692

Son yıllarda, Cistanche Deserticola ve bileşik müstahzarlarının [10-12] alkol ekstraktında ekinakozit ve havuz kenarı içeriğinin belirlenmesine ilişkin birçok rapor bulunmaktadır, ancak Cistanche Deserticola'nın su ekstraktındaki indikatör bileşenleri. Bu çalışmada, Cistanche Deserticola'nın su ekstraktındaki ekinakozit içeriğini belirlemek için yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılmıştır.

1. Malzeme

1.1 Aparat

LC-20AT yüksek performanslı sıvı kromatografisi, SPD-20A dedektörü, SIL-20Otomatik numune alıcı, CTO-10ASvp sütun sıcaklık kutusu, LCsolution sıvı kromatografisi iş istasyonu, Shimadzu Corporation Japonya'nın; MES125P-OCE-DU Elektronik Analitik Terazi, Sartorius, Almanya; SHZ-D (III) sirkülasyon suyu çok amaçlı vakum pompası, Henan Yuhua Instrument Co., Ltd;

1.2RC2BSO25 döner buharlaştırıcı soğutma sirkülasyon sistemi, RV10DS96 döner buharlaştırıcı, IKA, Almanya; DK-S26 Elektrikli Termostatik Su Banyosu, Shanghai Jinghong Deneysel Ekipman Co., Ltd; UPR serisi ultra saf su makinesi, Sichuan Youpu Ultra Pure Technology Co., Ltd.

1.2 Tıbbi Malzemeler ve Reaktifler

Meat Rong tıbbi malzemesi, Guangzhou Lingnan Geleneksel Çin Tıbbı Slices Co., Ltd.'den satın alındı, parti numarası: 18010011806001, 181001. Üçüncü Bağlı Kuruluşun Çinli Baş Bitki Uzmanı Tu Xingming tarafından tanımlanan Leobaceae bitkisi Cistanche Deserticola'nın kurutulmuş, pullu, etli gövdeleri Guangzhou Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Hastanesi, Guangzhou Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Üçüncü Bağlı Hastanesinin İlaç Muayene Odasında saklanmaktadır; Echinoside referans maddesi, içerik yüzde 89,7 , Çin Gıda ve İlaç Kontrol Kontrolü Enstitüsü, parti numarası: 111670-201706; Asetonitril kromatografik olarak saftır (Merck, Almanya); Metanol ve fosforik asit analitik olarak saftır (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); Su ultra saf sudur.

2. Yöntemler ve Sonuçlar

2.1 Cistanche Deserticola'dan Su Ekstraktının Hazırlanması

alcistanche tozu, 10 katı damıtılmış su, ısı ve geri akış miktarını her seferinde 1 saat olmak üzere iki kez ekstrakte edin. Süzün, süzüntüyü birleştirin ve süzüntüyü 0,100 g · mL-1 ham ilaç içeriğine konsantre etmek için bir döner buharlaştırıcı kullanın. Bekleme için 4 derecede saklayın. 2.2 Kromatografik koşullar ve sistem uygunluğu Kromatografik kolon: InertsilODS SPC18 kolonu (150mm × 4.6mm,5 μm);Mobil faz: asetonitril (A) - 0.4 yüzde fosforik asit solüsyonu (B), gradyan elüsyon: 0~ 5 dk, yüzde 17 A; 5~25 dk, yüzde 20 A; 25~30 dk, yüzde 17 A; Algılama dalga boyu: 333nm; Sütun sıcaklığı: 30 derece ; Akış hızı: 1,0 mL · dk-1; Enjeksiyon hacmi: 10 μ L. Bu kromatografik koşul altında, ekinezya pikleri ve bitişik bileşenler arasındaki çözünürlük 1,5'ten büyüktür ve ekinezya pikleri için teorik sütun sayısı 4000'den az olmamalıdır. Kromatogram Şekil 1'de gösterilmiştir.

Şekil 1 Echinacoside (A) ve Cistanche bitkisinin (B) su ekstraktının HPLC kromatogramları

2.3 Çözeltinin hazırlanması

2.3.1 Referans çözüm

Uygun miktarda tartınekinesetinreferans maddesini doğru bir şekilde tartın, 10 mL'lik ölçülü bir şişeye koyun, çözünmesi için metanol ekleyin ve bekleme için 4 derecede saklanan referans solüsyonun mililitre μ G'si başına 898,794 Ekinesetin içermesini sağlayın.

Cistanche Deserticola'nın Echinoside'ı

2.3.2 Test çözümü

2.0 mL Cistanche Deserticola sulu ekstraktını doğru bir şekilde ölçün, bir su banyosunda buharlaştırın, metanol içinde çözün, 10 mL'lik ölçülü bir şişede sabit bir hacme getirin, iyice çalkalayın, 0,22 μ M mikro gözenekli membran filtrasyonu, yani.

2.4 Doğrusal bir ilişkinin incelenmesi

{{0}.25, 0.50, 1.00, 2.00, 2.50'yi doğru bir şekilde ölçün, ve 3.{11}} mL 2.3.1 altındaki referans solüsyonu ve bunları 5 mL'lik ölçülü bir şişeye koyun, sabit hacme kadar metanol ekleyin ve 44.9397, 89.8794, 179.7588, 359.5176, 449.3970 gradyan konsantrasyonları elde etmek için iyice çalkalayın ve 539,2764 μ G · mL-1 referans solüsyon, 0,22 μ M Mikro gözenekli membran filtrasyonu. Belirlemeyi 2.2'deki kromatografik koşullara göre yapın ve pik alanını kaydedin. Referans maddenin kütle konsantrasyonu apsis olarak kullanıldığında (X, μ G · mL-1), tepe alanı ordinattır (Y) ve doğrusal regresyon denklemi elde edilir: Y=13185. 0X-32273.0, r=0.9998. Sonuçlar, ekinezanın 44,9397 ile 539,2764 μ arasında değiştiğini gösterdi. g · mL-1 konsantrasyon aralığındaki doğrusal ilişki iyidir.

2.5 Kesinlik testi

539.2764 μ G · mL-1 referans solüsyonu alın, numuneyi 2.2'deki kromatografik koşullara göre 6 kez sürekli olarak enjekte edin ve pik alanını kaydedin. Sonuçlar Ekinezanın pik alanının RSD'si yüzde 1.81 idi ve bu, aletin iyi bir kesinlik gösterdiğini gösteriyor.

2.6 Stabilite testi

2.0 mL'yi doğru bir şekilde ölçünCistanche Deserticolasulu ekstrakt, su banyosunda kuruyana kadar buharlaştırın, metanolde çözün, 10 mL'lik ölçülü bir şişede sabit hacme getirin, iyice çalkalayın, 0,22 μ Mikro gözenekli bir zarla filtreleyin, enjekte edin 2.2'deki kromatografik koşullara göre 0, 2, 4, 8, 12 ve 24 saatte belirleme için örnekler alın ve pik alanını kaydedin. Sonuçlar Ekinezanın pik alanının RSD'si yüzde 1.16 idi, bu da test solüsyonunun 24 saat içinde iyi bir stabiliteye sahip olduğunu gösterir.

2.7 Tekrarlanabilirlik testi

2.0 mL sulu 6 porsiyonu doğru bir şekilde ölçünCistanche Deserticola özü6 porsiyon test solüsyonunu 2.3.2'de açıklanan yönteme göre paralel olarak hazırlayın, 2.2'de açıklanan kromatografik koşullara göre belirleme için numuneler enjekte edin ve pik alanını kaydedin. Sonuçlar Ekinezanın kütle konsantrasyonunun RSD'si yüzde 1,28 idi, bu da yöntemin iyi bir tekrarlanabilirliğe sahip olduğunu gösteriyor.

Cistanche Deserticola deneyi

2.8 Numune Ekleme Kurtarma Testi

1.0 mL'lik 9 porsiyonu doğru bir şekilde ölçünCistanche Deserticolasulu özütleyin, {{0}}.8, 1.0 ve 1.2 mL referans solüsyonu (101.552 mg · mL - 1) ​​ekleyin, su banyosunda buharlaştırın, içinde eritin metanol ve bir mL hacimsel şişede hacme getirin; Yüksek, orta ve düşük konsantrasyonlu test solüsyonu hazırlamak için m mikrogözenekli filtre membranlı 0,22 μ Filtreyi iyice çalkalayın. Her konsantrasyondan 3 parçayı paralel olarak hazırlayın, 2.2'deki kromatografik koşullara göre ölçün, pik alanını kaydedin ve numune bağımlılığı geri kazanımını hesaplayın. Sonuçlar Tablo 1'de gösterilmiştir.

2.9 Numune içeriğinin belirlenmesi

2.0mL'lik 3 porsiyonu doğru bir şekilde ölçünCistanche Deserticola'dan su özü, su banyosunda kuruyana kadar buharlaştırın, metanol içinde çözün, 10mL'lik ölçülü bir şişede sabit bir hacme getirin, iyice çalkalayın, 0,22 μ Mikro gözenekli bir zarla filtreleyin, 2.2'deki kromatografik koşullara göre ölçün, pik alanını kaydedin ve ekinezya içeriğini hesaplayın. Sonuçlar Tablo 2'de gösterilmiştir.

Tablo 1 Ekinakozidin geri kazanım testlerinin sonuçları

Tablo 2 Cistanche bitkisinin su ekstraktındaki ekinakozidin içerik belirleme sonuçları

3.Tartışma

3.1 Test maddesinin hazırlanma yöntemi

sulu ekstraktıCistanche Deserticolatest edilecek bileşenlerle belirli etkileşime neden olan fenil etanol glikozitler ve polisakkaritler gibi çeşitli kimyasal bileşenler içerir. Bu çalışma, iki farklı çözücü konsantrasyonu, yüzde 50 metanol ve metanol araştırdı. Sonuçlar, çözücü olarak yüzde 50 metanol kullanılan test ürününün kromatogramındaki zirvelerin ayırma etkisinin ekinezya ve bitişik bileşenler arasında zayıf olduğunu gösterdi; Bir çözücü olarak metanol kullanıldığında, ekinezya glikozit pikinin çözünürlüğü iyidir ve diğer safsızlık piklerinden herhangi bir girişim olmaz. Bu nedenle, test çözeltisi için çözücü olarak metanol seçildi. Çözücü olarak metanol kullanılarak, Cistanche Deserticola'nın su ekstraktı bir su banyosunda kuruyana kadar buharlaştırıldı. İki arıtma yöntemi kullanıldı: metanol çözünmesi, sabit hacim çalkalama ve metanol ultrasonik (10 dakika) çözünme. Sonuçlar, iki yöntem arasında anlamlı bir fark olmadığını gösterdi. Bu yöntem, metanol çözünmesinin basit işleyişi ve sabit hacim çalkalaması nedeniyle test solüsyonunu hazırlamak için seçilmiştir.

Çin otu cistanche

3.2 Mobil faz seçimi

Bu çalışmada, Çin Farmakopesi'nde (Cilt I) (2015) Cistanche Deserticola'nın içerik tayini için kullanılan mobil faza (metanol{0}}yüzde 1 formik asit) atıfta bulunulmuştur. Sonuçlar, ekinezya glikozit zirvesinin genişlediğini ve hareketli fazın zayıf elüsyon kabiliyeti ile ilişkili olabilecek bir öncü fenomen olduğunu gösterdi; İlgili literatüre [12-13] atıfta bulunularak, mobil faz olarak asetonitril-0,5 oranında asetik asit kullanıldı, ancak ekinezyanın tepe şekli zayıftı ve bir tortulanma olayı vardı. Mobil fazın pH değeri göz önüne alındığında, son olarak mobil faz olarak asetonitril-0.4 yüzde fosforik asit kullanıldı. Sonuç olarak, ekinezya piklerinin teorik plaka sayısı 4000'den fazlaydı ve ekinezya ile komşu bileşen pikleri arasındaki çözünürlük 1,5'ten fazlaydı. Pik şekli, safsızlık piklerinden etkilenme olmaksızın simetrikti ve taban çizgisi stabildi. Bu nedenle, bu çalışmada, ekinezya içeriğinin belirlenmesi için kromatografik mobil faz olarak asetonitril - 0.4 yüzde fosforik asit kullanılmıştır. Bu çalışmada,Cistanche Deserticola sulu ekstraktında Ekinezya'yı belirlemek için HPLC yöntemi kullanıldı.

Cistanche özü tozu

Yöntem basit, doğru ve tekrarlanabilir. Cistanche Deserticola sulu ekstraktında ekinezya tayini için uygundur ve Cistanche Deserticola sulu ekstraktı için kalite kontrol yöntemi olarak kullanılabilir.Bu çalışma sadece Cistanche Deserticola'nın su ekstraktındaki ekinezya içeriğini belirlemiştir.Gelecekte,çeşitli faktörlerin ekinezya içeriği üzerindeki etkisini araştırmak için Cistanche Deserticola'nın bileşik kaynatmasındaki ekinezya içeriğinin belirlenmesi planlanmakta ve Cistanche Deserticola içeren kaynatmanın kalite kontrolü için bir referans sağlanmaktadır.

referans:

[1] Zhong Ping Çölü ginsengi ve cistanche [J] Orman ve İnsanlar, 2004, 24 (11): 25

[2] Çin Halk Cumhuriyeti Ulusal Farmakopesi Komisyonu Farmakopesi (Bölüm I) [M] Pekin: China Medical Science and Technology Press, 2015:135-136

[3] Chen Fei, Chen Zhuo, Xing Xuefei ve diğerleri Cistanche Deserticola'da araştırma ilerlemesi [J] İlaç Değerlendirme Çalışması, 2013, 36 (6): 469-475

[4] Fang Jian, Cistanche Deserticola [J] Guangming Geleneksel Çin Tıbbı, 2017, 32 (14): 2140 - 2142

[5] Xing Xiaoxu, Liu Zhongjie, Han Bo Cistanche Deserticola sulu ekstraktının sıçan osteoblastlarında kemik morfogenetik protein 2 gen ekspresyonu üzerindeki etkisi [J] Çin HayvanıHayvancılık ve Veterinerlik, 2013, 40 (1): 17-21

[6] LIANG H,YU F,TONG Z,ve ark. Osteoporoz hastalığında [J] serum BGP ve TRAP ve kemik iliği Smad1 mRNA, Smad5 mRNA, TGF- 1 mRNA ve TIEG1 mRNA ekspresyon seviyelerini etkileyen Cistanches herba sulu özü. Moleküler Biyoloji Raporları, 2013, 40 （2）:757-763.

[7] Fang Hailin, Li Junkao, Yao Senming, ve arkadaşları Echinoside'ın ERK/BMP-2 Sinyal Yolu [J] Grassroots Medical Forum'u, 2015, 19 (4): {{5 }}

[8] Tian Yuan Kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin ekinasidin neden olduğu osteoblastlara farklılaşması ve mekanizması üzerine çalışma [D] Shenyang: Liaoning Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi, 2015

[9] Wei Dawei, Ge Ziyu, Liu Yihan, vb. Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin Osteoblastlara Ekinosid Kaynaklı Farklılaşması Üzerine Çalışma [J] Geleneksel Çin Tıbbı Farmakolojisi ve Kliniği, 2017, 33 (2): 48-52

[10] Tian Yubiao, Yang Guang'an, Huang Weijie, et al HPLC [J] Anhui Ziraat Üniversitesi, 2015, 43 (3): 171-173

[11] Yang Sude, Hu Junhua, Li Jiachun, et al HPLC ile Toplam Cistanche Glycoside Kapsüllerinde Echinoside, Piloside ve Isopiloside'nin Eşzamanlı Belirlenmesi [J] Dünya Bilimi ve Teknolojisi - Geleneksel Çin Tıbbının Modernizasyonu, 2015, 17 (3) : 609-613

[12] Xu Xiaoxue Cistanche Deserticola'nın ve etkili bileşenlerinin osteoporoza karşı etkileri üzerine farmakodinamik ve metabonomik çalışmalar [D] Yinchuan: Ningxia Tıp Üniversitesi, 2017

[13] Yan Yao, Meng Xinyuan, Xu Huanhuan, et al.