Diyet Kakao Flavanolleri Sağlıklı Farelerde İskelet Kasındaki Mitokondriyal Fonksiyonu Geliştirir ve Tüm Vücut Metabolizmasını Değiştirir

daha fazla bilgi için iletişim:tina.xiang@wecistanche.com

Soyut: Mitokondriyal disfonksiyon, çeşitli hastalıklarda yaygın olarak bildirilmektedir ve bunların patogenezine katkıda bulunmaktadır. etkisini değerlendirdik.kakao flavanollerimitokondriyal fonksiyon ve tüm metabolizma üzerine takviye ve mitokondriyal deasetilaz sirtuin-3 (Sirt3)'ün dahil olup olmadığını araştırdık. Yabani tipte ve Sirt3-/farelerde 15 günlük CF takviyesinin etkilerini araştırdık. Tüm vücut metabolizması dolaylı kalorimetri ile değerlendirildi ve değerlendirmek için oral glukoz tolerans testi yapıldı.glikoz metabolizması. Mitokondriyal solunum fonksiyonu, geçirgenleştirilmiş liflerde değerlendirildi ve piridin nükleotid içeriği (NAD artı ve NADH) ölçüldü. Yabani tipte, CF takviyesi, karbonhidrat kullanımını ve gelişmiş glikoz toleransını teşvik ederek tüm vücut metabolizmasını önemli ölçüde değiştirdi. CF takviyesi, mitokondriyal kütlede önemli bir artışa neden olurken, H2O2 üretimini ve hücresel oksidatif stresi korumak için önemli kalitatif adaptasyon meydana geldi. CF takviyesi, NAD plus ve NADH içeriğinde önemli bir artışa neden oldu. Yukarıda bahsedilen tüm etkiler Sirt3-7farelerinde körelmiştir. Toplu olarak, CF takviyesi, sirtuins metabolizmasını uyaran NAD metabolizmasını ve en azından kısmen Sirt3 aracılığıyla karbonhidratları daha fazla kullanma yeteneği ile gözlemlenen tüm vücut metabolizması adaptasyonuna katkıda bulunan mitokondriyal işlevi iyileştirdi.

anahtar kelimeler: kakao flavanolleri; NAD metabolizması; mitokondriyal kütle; glikoz metabolizması; iskelet kası

daha fazla bilgi almak için tıklayın

1. Giriş

Mitokondri, mitokondriyal oksidatif fosforilasyon yoluyla enerji iletimi ve mitokondriyal hidrojen peroksit üretimi veya mitokondriyal aracılı hücre ölümü aktivasyonu [1-3] gibi çoklu hücresel işlevlerde yer alan hücre altı organellerdir. Ortaya çıkan kanıtlar, mitokondriyal disfonksiyonun birçok patolojide yer aldığını ve patogenezinde merkezi bir rol oynadığını göstermektedir [4]. Grubumuz, klinik komplikasyonlardan çok önce tip 1 diyabetli hastalarda mitokondriyal bozulma bildirmiştir [5]. Ayrıca, sağlıklı insanlarda bile yaşlanma ile birlikte mitokondriyal oksidatif kapasitede bir azalma meydana gelir [6]. Bu nedenle, bu işlev bozukluklarını hafifletmek veya mitokondriyal kütleyi artırmak için stratejilerin tanımlanması, birçok bozukluğun görülme sıklığını önlemek veya en azından azaltmak veya sağlıklı deneklerin aerobik kapasitesini artırmak için fırsatlardır.

Bu bağlamda, sınırlı yan etkileri olan veya olmayan mitokondriyal fonksiyonu ve tüm vücut metabolizmasını geliştiren güvenli ve doğal bileşiklerin belirlenmesi ilgi çekicidir. Doğal bileşikler arasında,kakao flavanolleri(CF), tüketimlerinin kardiyovasküler sağlığı, insülin direncini veya bağışıklık fonksiyonunu olumlu etkilediği gösterildiğinden umut verici moleküller olarak kabul edilir [7]. Gerçekten de, KF'nin glukoz metabolizmasını iyileştirdiği gösterilmiştir ve kısa süreli KF uygulamasını, glukoz intoleransı olan hipertansif hastalarda bile insülin duyarlılığında bir artış izler [8,9].

Flavanoller arasında, (-)-epikateşin (EPI), CF'de en yaygın bulunan monomerdir ve EPI, CF'nin başlıca biyoyararlı ve biyoaktif molekülü olarak kabul edilir [10]. Tutarlı bir kanıt grubu, EPI takviyesinin iskelet kasındaki mitokondriyal işlevi ve/veya içeriği iyileştirdiğini göstermektedir [11]. EPI takviyesi, peroksizom proliferatörü ile aktive olan reseptör gama koaktivatörü 1-alfa(PGCl) ve büyük nükleer transkripsiyonel kompleksler üzerinde yakınlaşan çoklu yolları uyarır. EPI, mitokondriyal biyogenezi uyaran nitrik oksit oluşumunu doğrudan artırır [11]. Aynı zamanda, sirtuin 1 ve 3 de EPI takviyesi ile uyarılır [11]. Proantosiyanidinlerin kullanımı, oligomerikflavonoidlerEPI içeren, NAD biyosentezi için çeşitli öncüllerin artması yoluyla hücre içi nikotinamid adenin dinükleotit (NAD plus ) seviyelerini arttırdığı ve sıçan karaciğerinde sirtuin-1 mRNA seviyelerini yukarı regüle ettiği gösterilmiştir [12]. NAD'ye bağımlı bir deasetilaz olan sirtuin ailesi (Sirt), hücre içi dağılımları, substrat özgüllüğü ve hücresel işlevleri açısından farklılık gösteren yedi üyeden oluşur [13]. Bu ailenin kapsamlı bir şekilde çalışılmış bir üyesi olan Sirt1, PGCl'nin deasetilasyonunu teşvik ederek mitokondriyal biyojenezi uyarır ve böylece onun transkripsiyonel aktivitesini arttırır [14]. Önemli bir metabolik sensör olan Sirte, EPI uygulamasının ardından [12,15-17] uyarıldı. Ancak, EPI'nin diğer sirtuinler üzerindeki etkisi araştırılmamıştır. EPI etkisinin değerlendirilmesi, Krebs döngüsü ve solunum zinciri enzimlerinin aktivitesini modüle ettiği bilinen mitokondri (Sirt3, Sirt 4 ve Sirt5) içinde bulunan sirtuinler üzerinde özellikle ilginç olacaktır [18]. Metabolik cirosu ve mitokondriyal içeriği yüksek dokularda yüksek oranda eksprese edilen Sirt3, tersinir protein lizin deasetilasyonu yoluyla normal mitokondriyal fonksiyonun korunmasındaki kritik rolü nedeniyle özellikle ilgi çekicidir [19-21]Ayrıca Sirt3, tüm vücut metabolizmasının düzenlenmesi [20. Sirt3'ün tip 1 ve tip 2 diyabet ve kardiyovasküler hastalık modellerinin iskelet kasında değiştiği gösterilmiştir [22,23]. Ayrıca, Sirt3'ün aktivasyonunun, mitokondriyal fonksiyon ve metabolizmayı iyileştirmek için umut verici bir terapötik stratejiyi temsil edebileceği öne sürülmüştür [23,24]. Bu nedenle, Sirt3'ün CF takviyesinin tüm vücut metabolizması ve mitokondriyal fonksiyon üzerindeki yararlı etkilerinin bir kısmının altında olup olmadığını belirlemek ilgi çekicidir.

Bu çalışmada, farelerde 15-gün KF takviyesinin etkisini araştırmak için bütünleştirici bir yaklaşım kullandık. KF takviyesinin (i) tüm vücut metabolizmasını değiştireceğini veglikoz metabolizması, (ii) geçirgenleştirilmiş liflerdeki oksidatif ve glikolitik kastaki mitokondriyal fonksiyonu arttırır ve (ii) NAD metabolizmasını arttırır. Ayrıca Sirt3'ün CF kaynaklı mitokondriyal biyogenez ve tüm vücut metabolizmasına olası katılımını da araştırdık. Hipotezlerimiz, CF'nin tüm vücut metabolizması ve mitokondriyal kütle üzerindeki etkilerinin Sirt3-7farelerinde köreleceğiydi.

2. Yöntemler

2.1. Hayvanlar ve Diyet

Bu çalışma için Jackson Laboratories'den (Bar Harbor, ME, ABD) 129S1/SvlmJ 10-haftalık erkek fareler satın alındı. Sirtuinlerin CF uygulamasının neden olduğu mitokondriyal kütle ve fonksiyon adaptasyonuna dahil olup olmadığını belirlemek için, vahşi tip ile aynı suş üzerinde 10-haftalık Sirt3 tüm vücudu nakavt erkek fareler de kullandık [25]. Sirt3/fareler, Sirt3'ün CF kaynaklı mitokondriyal biyogenez ve tüm vücut metabolizması adaptasyonlarına katılımını araştırmak için kullanıldı. Fareler, 23-25 derecelik düzenlenmiş bir sıcaklıkta ve kontrollü aydınlatmada (12-saat aydınlık ve karanlık döngüleri) bir odada tutuldu. Hayvanlar, ad libitum olarak kemirgen yemi ve musluk suyuna erişebildi.

Hayvan tesisinde en az bir haftalık alışmadan sonra deney hayvanlarına, bir karboksimetilselüloz (Sigma-Aldrich, St. Louis) içinde yeniden süspanse edilen doğal bir özütün (15 gün boyunca günde iki kez 302.1 mg/kg vücut ağırlığı) oral gavaj yoluyla CF takviyesi verildi. , Mo, ABD). Kakao tozunun bileşimi Tablo 1'de anlatılmıştır ve Naturex'ten (Quart de Poblet, İspanya) elde edilmiştir. Kompozisyon, yüksek performanslı sıvı kromatografi yöntemiyle oluşturulmuştur ve 100 mg ekstrakt, ortalama 475 mg kuru kakao tohumuna eşdeğerdir. Kontrol fareleri, oral gavaj yoluyla karboksimetilselüloz içinde çözülmüş benzer teobromin ve kafein içeriğinden oluşan bir araç aldı. Günlük doz, endüstrinin insan dozunu vücut yüzey alanına dayalı olarak hayvan eşdeğer dozlarına dönüştüren rehberliğine göre belirlendi ve insan dozunu 12,3 ile çarptık [26]. Oral gavaj deneyimli bir teknisyen tarafından yapıldı.

2.2. Doku Koleksiyonu1

Son oral gavajdan yirmi dört saat sonra, aç olmayan hayvanlara ketamin ve ksilazin (sırasıyla: 100 ve 10 mg/kg) kullanılarak anestezi uygulandı. Anestezi sağlandıktan hemen sonra dokular alındı. Gastroknemius'un soleus ve beyaz kısmı eksize edildi. Numuneler ya hemen sıvı nitrojen içinde donduruldu ve sonraki analizler için -80 derecede saklandı ya da derili kas liflerini hazırlamak için kullanıldı.

2.3. Metabolik ve Fiziksel Aktivite Değerlendirmeleri

Dolaylı kalorimetri ve spontan fiziksel aktivite, Comprehensive Laboratory Animal Monitoring System (CLMS; Columbus Instruments, Columbus, OH, ABD) kullanılarak ölçüldü. Fareler, 07h00 ila 19h00 arası ışık ve kemirgen yemi ve musluk suyuna ad libitum erişim ile 28 derecede ayrı ayrı odalara yerleştirildi. Fareler, veri toplamanın birinci gününden üç gün önce metabolik kafeslere alıştırıldı. Veri toplama, takviyenin on beşinci gününde yapıldı. Oksijen tüketimi (VO2), karbondioksit üretimi (VCO2) ve solunum değişim oranı (RER), 0.5 L/dk hava akışı ve 0.4 L/ örnek hava ile ölçülmüştür. dk. RER'nin yüzde göreli kümülatif frekansı (PCRF), daha önce Riachi ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi 24-h bir süre boyunca belirlendi. (2004). Kısaca, PCRF, her veri noktasının frekansının bir önceki artış dizisine eklenmesiyle belirlendi (0.65'ten 1.20'ye 0.01'lik bir artışla)[27]. Metabolik esneklik, PRCF eğrisinin Hill eğimi (H değeri) ve 50. persentil (EC50) ile ve 24 saat boyunca RER amplitüdü ölçülerek belirlendi (Riachi ve ark.2004). Genel fiziksel aktivite, x ve z ekseni aktivitesini tespit eden kızılötesi ışınla çalışan bir sensör sistemi kullanılarak izlendi. Hem toplam sayımlar (her ışın kırıldığında) hem de ayaktan sayımlar (her yeni ışın kırıldığında) değerlendirildi. Hayvan yatay olarak 0,5 inçten fazla hareket ettiğinde ve kaşıma ve tımarlama gibi küçük ölçekli, tekrarlayan aktiviteleri temsil ettiğinde bir X-toplam (X-TOT) sayısı kaydedilir. X-ambulatory sayımı (X-AMB), yalnızca hayvan yeni bir ışını kırdığında bir sayı kaydederek gerçek hareketi ölçer. 1,5 inçlik dikey hareket, yani yetiştirme (Abreu-Vieira 2016) gerçekleştiğinde bir Z-toplam (Z-TOT) sayısı kaydedilir. Karbonhidrat ve yağ tahmini içinoksidasyonVO2 ve VCO2'den yola çıkarak, daha önce farelerde kullanılan Péronnet ve Massicotte'den alınan protein olmayan solunum katsayısı tablosunu kullandık [28,29].

2.4. Toplam Vücut ve Yağ Kütlesi

Toplam yağ kütlesi ve toplam yağsız kütle, anestezi uygulanmamış farelerde, EchoMRI tüm vücut manyetik rezonans analizörü (Echo Medical System, Houston, TX, ABD) kullanılarak nicel rezonans girişim analizi ile belirlendi. Toplam yağ kütlesi, vücuttaki tüm yağların toplamını temsil ediyordu. Toplam yağsız kütle, esas olarak kas ve iç organları içerir. İskelet kası kütlesinin toplam yağsız kütlenin en büyük kısmını oluşturduğu bilinmektedir.

2.5.Oral Glikoz Tolerans Testi (OGTT)

Glisemi, bir glukometre (Accu-Chek Performa, Roche, Arjantin) ile kuyruktan alınan bir damla kan kullanılarak ölçüldü. OGTT, 5 ila 6 saat aç bırakılan farelerde yapıldı. Ölçüm, CF takviyesinin son gününde yapıldı. Bazal gliseminin (zaman O) ölçülmesinden sonra, farelere steril su içinde yüzde 20 glikoz solüsyonu, 1.5 g glikoz·kg vücut ağırlığı-1 dozunda her os enjekte edildi. Glisemi, glikoz çözeltisinin enjeksiyonundan 15, 30, 60, 90 ve 120 dakika sonra ölçüldü. Glikoz eğrisinin artan alanı daha sonra glikoz toleransının bir ölçüsü olarak hesaplandı.

2.6.qRT-PCR Analizi

The forward (F) and reverse (R) primers of the selected genes used in this study are presented in Table 2. Total RNA was obtained from pulverized frozen white gastrocnemius muscle using Trizol reagent (Invitrogen Life Technologies, Rockville, MD, USA). The purity, integrity, and quantity of RNA were evaluated using a microplate reader (Synergy H1(Biotek Instruments, Winooski, Vermont). The sample was considered pure when the ratio OD260/OD280 was>1.8. cDNA, RT-qPCR (Biorad, Hercules, CA, ABD) için iScript ters transkripsiyon süper karışımı kullanılarak toplam RNA （2 μL）'den sentezlendi. Toplam RT ürünleri, üreticinin spesifikasyonlarına göre (Invitrogen Lige Technologies, Burlington, Kanada) 2x Platinium SYBR Green qPCR SuperMix-UDG kullanılarak nicel polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile analiz edildi. Bisiklete binme bir CFX96 döngüleyicide (Biorad, Hercules, California; koşullar: 95 derece C 10 dakika ve 40 döngü 95 derece 30 saniye, 55 derece 45 saniye ve 72 derece 45 saniye). Her çalışmanın sonunda, primer-dimer oluşumunun yokluğu ve benzersiz bir amplikonun varlığı, erime eğrisi kullanılarak doğrulandı. Eşik döngüsü (Ct) değerleri, bir temizlik geni olarak ß-Actin veya HPRT1 ile qPCR verilerini analiz etmek için 2-A△Ct yöntemi izlenerek kullanıldı[30]. Kantitatif RT-PCR değerleri, 1'e ayarlanan kontrol grubununkilerle ilişkiliydi.

2.7. Enzim Aktiviteleri

Elektron taşıma zinciri komplekslerinin ve sitrat sentazın spesifik aktivitesinin ölçümü, daha önce tarif edildiği gibi spektrofotometrik olarak yapıldı [31]. Toz haline getirilmiş donmuş beyaz gastroknemius kasları (~30 mg), 500 uL homojenizasyon tamponu (120 mM KCl, 20 mM HEPES, 2mM MgCl2,1 mM EGTA ve 5 mg·mL-Iof BSA) içinde titreşen bir mikro boncuk homojenleştirici ile homojenize edilmiştir. , pH7.4) ardından 500 μL hipotonik ortam （25 mM potasyum fosfat ve 5 mM MgCl, pH 7.2) ilave edildi. Numuneler daha sonra sıvı nitrojen içinde üç tur dondurma-çözülme döngüsüne tabi tutuldu. Örnekler 4 derecede 600xg'de 10 dakika santrifüj edildi ve süpernatant analize kadar buz üzerinde tutuldu. Protein içeriği süpernatanda üç kopya halinde bir Pierce BCA Protein Test Kiti (Thermo Scientific, Rockford, IL, ABD) kullanılarak belirlendi.

Sitrat sentazın (CS) aktivitesi, 0.1 mM asetil varlığında 2 mM 5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoik asit)'in indirgenmesinin ardından 412 nm'de spektrofotometrik olarak belirlendi. -CoA ve 200 mM Tris tamponu (pH 7.4) içinde 12 mM oksaloasetik asit. Rotenona duyarlı NADH-desilubikinon oksidoredüktaz(kompleks I) tahlili, alıcı 2,3-dimetoksi-5-metil-6-n-desil-14-benzokinon （ kullanılarak 340 nm'de gerçekleştirilmiştir. Elektron donörü olarak 80 μM） ve NADH 10 mM Tris tamponunda（200 μM）（pH 8.0）. Rotenona duyarlı aktiviteyi ölçmek için 4μM rotenon ilavesi kullanıldı. Sitokrom oksidaz （kompleks IV）'nin aktivitesi, 100 mM potasyum fosfat tamponunda (pH 7.0) her iki mitokondriyal membranı geçirgenleştirmek için bir donör olarak 10μM indirgenmiş sitokrom c ve 2.5 mM n-dodesil-ß-maltozid kullanılarak 550 nm'de gerçekleştirildi.

Tüm enzim deneyleri üç kopya halinde belirlendi ve sonuçlar, 100'e ayarlanan kontrol grubununkilerle ilgiliydi.

2.8. Mitokondriyal Değerlendirme

Mitokondriyal solunum ve mitokondriyal H2O2 üretimi, beyaz gastroknemius ve soleus kasları|1] kullanılarak saponin geçirgenleştirilmiş liflerde yerinde incelenmiştir. Kısaca lifler, A solüsyonunda 4 derecede (mM:2.77 CaK2 EGTA,7.23 K, EGTA,6.56 MgCl2, 20 taurin,0.5 DTT,5{ olarak) binoküler mikroskop altında ayrıldı. {50}} K-metan sülfonatlar,20 imidazol, 5.7 Na2 ATP ve 15 kreatin-fosfat, pH 7.1) ve çözelti A'da 50 ug·mL-Iof saponin ile 4 derecede 30 dakika geçirgenleştirildi. Mitokondriyal solunum fonksiyonu, Clark tipi elektrot (Oxygraph, Hansatech Instruments, Glasgow) ile donatılmış bir oksimetrede belirlendi. Bölme 1 mL Solüsyon B (mM:2.77 CaK, EGTA, 7.23 K, EGTA,6.56 MgCl2, 20 taurin, 0.5 DTT, 50 K-metan sülfonat ve 20 imidazol, pH 7.1 olarak) ile dolduruldu ve kayıttan sonra haznedeki temel oksijen içeriği, bir demet 1-2 mg kuru ağırlıktaki geçirgenleştirilmiş miyolifleri hazneye yerleştirildi, ardından sızdırmaz şekilde kapatıldı. Başlangıç ​​okumalarından sonra, aşağıdaki eklemeler sırayla yapılmıştır: palmitoil karnitin ve malat（160 μM∶5 mM）, glutamat（10 mM）, süksinat（25 mM）, rotenon（0.5 μm）, ayırıcı CCCP（1 μM）, antimisin -A -8 uM8 ve N,N',N'-tetrametil-p-fenilendiamin dihidroklorür ve askorbat(0.9:9 mM). Solunum sürekli karıştırılarak 23 derecede ölçüldü. Her testin sonunda, lifler ksilografik hücreden dikkatlice çıkarıldı, lekelendi ve lif ağırlığının belirlenmesi için en az 24 saat ~80C'de kurutuldu. O2 tüketim oranları (JO2) nmol O2 min-1 olarak ifade edildi.(mg kuru ağırlık)-I. Tüm ölçümler en az iki kez yapıldı.

Mitokondri soluyarak net H2O2 salınımı, daha önce açıklandığı gibi floresan probu Amplex Red（20 μM∶eksitasyon-emisyon∶563-587 nm） ile geçirgenleştirilmiş fiber demetlerinde ölçülmüştür [32]. Geçirgenleştirilmiş liflerin hazırlanmasını takiben, numuneler

H2O2 ölçümleri için hedeflenenler üç kez tampon Z (mM:110 K-Mes, 35 KCl,1 EGTA,5 K2HP04, 3MgCl,6H2O ve 0.5 mg:mL olarak) içinde durulandı. {14}} BSA, pH7.3, 4 derecede). Elyaf demetleri ({{20}}.3-1.0 mg kuru ağırlık) 600 uL tampon Z(37°C'de pH 7.3) içinde sürekli manyetik karıştırma ile bir kuvars mikro küvet içinde 37 derecede inkübe edildi. 1.2 U·mL-I yaban turpu peroksidazı ile desteklenmiştir. Bazal floresan okumaları, herhangi bir eksojen solunum substratının yokluğunda alındı. Daha sonra sırasıyla şu eklemeler yapılmıştır: glutamat(5 mM), süksinat(5 mM), rotenon (0.5 uM), ADP(10 mM) ve antimisin-A （8 μM）. Her testin sonunda lifler küvetten dikkatlice çıkarıldı, lekelendi ve lif ağırlığını belirlemek için kurutuldu. H2O2 üretim oranları AU·min-1.(mg kuru ağırlık)-I ve fosforilasyon durumunda maksimum mitokondriyal solunuma karşılık gelen oksfos kapasitesi başına ifade edildi. Tüm ölçümler en az iki kez yapıldı.

Mitokondriyal kalsiyum tutma kapasitesi (CRC), daha önce tarif edildiği gibi beyaz gastroknemius kas hayalet liflerinde değerlendirildi [33]. Kısaca, lifler 600 uL CRC tamponu (mM∶250 sakaroz,10 MOPS,0.005 EGTA ve 10P;-Tris, pH7.3) içinde sürekli karıştırma altında bir kuvars mikro küvet içinde inkübe edildi. Fiberler daha sonra tek bir 20 nM Ca2 plus darbesine maruz bırakıldı. Ekstramitokondriyal kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikler, Kalsiyum yeşili 5N(1 mM: uyarma-emisyon:505-535 nm) kullanılarak florometrik olarak izlendi. Geçirgenlik geçiş gözenek duyarlılığı (PTP), PTP açılması için gereken süre ölçülerek değerlendirildi ve CRC, serbest bırakılmadan önce mitokondri tarafından biriken toplam Ca' miktarı olarak alındı. Her testin sonunda, lifler küvetten dikkatlice çıkarıldı, lekelendi ve lif ağırlığını belirlemek için kurutuldu. CRC değerleri, kuru ağırlığın mg'ı başına nM Ca2 artı olarak ifade edildi.

2.9. Western Blot Analizi

Beyaz gastroknemius ve soleus kaslarından alınan proteinler, Laemmli tamponunda seyreltildi ve Mini-PROTEAN TGX Stain-Free yüzde 10 prekast poliakrilamid jelleri (Biorad) üzerinde ayrıldı; her jele bir dahili standart yüklendi. Elektroforetik ayırma, göç tamponunda (25 mM TrisBase,0.2 M glisin ve yüzde 1 SDS (p/v)) 35 dakika süreyle 2{11}}0 V'de yapıldı. Stain-Free(SF) teknolojisi, proteinlerle reaksiyona girerek onları UV'ye maruz kalma yoluyla tespit edilebilir hale getiren tescilli bir tri halo bileşiği içerir. SF görüntüleme, ChemiDoc MP Imager ve Image Lab4.0.1 yazılımı (Biorad, Hercules, California, ABD) kullanılarak 5-dakikalık leke aktivasyon süresi ile yapıldı ve bu nedenle toplam protein desenleri görselleştirildi. Proteinler daha sonra Trans-Blot Turbo Transfer Sistemi (Biorad) kullanılarak 0.2 um nitroselüloz tabakasına aktarıldı. Transfer kalitesi, SF teknolojisi kullanılarak membranların görüntülenmesiyle kontrol edildi. Transfer adımını takiben, karbonil proteinleri, 2N HCL içinde seyreltilerek dinitrofenilhidrazin ile türevlendirildi ve son olarak metanol ile kapsamlı bir şekilde yıkandı. Zarlar, Tween-20 (TBST:15 mM Tris/HCl, pH7.6,140 mM NaCl ve yüzde 0.05 Tween-20) içeren Tris-tamponlu tuzlu su içinde yüzde 5 yağsız kuru süt ile bloke edildi. 1 saat oda sıcaklığında. Zarlar daha sonra aşağıdaki birincil antikorlarla 4 derecede gece veya 2 saat oda sıcaklığında inkübe edildi: protein karbonil birincil antikoru(Anti-DNP;#STA-308, Cell Biolabs) ve SOD2 (#Ab13533, Abcam). TBST'de 10 dakikalık üç yıkamadan sonra, membranlar, protein karbonil (HRP-konjugat;#STA-308, Cell Biolabs) ve SOD2 (anti-tavşan IgG-HRP bağlantılı;#7074, Cell Signalling) için ikincil antikorlarla problanmıştır. 2 saat boyunca oda sıcaklığında bloke edici solüsyonda tutuldu ve son olarak TBST ile kapsamlı bir şekilde yıkandı. Birincil ve ikincil antikorların seyreltilmesi, her antikor için optimize edildi. Kemilüminesans tespiti, ECL Clarity (Biorad) kullanılarak gerçekleştirildi ve ChemiDocMP ile görüntü yakalama yapıldı. Tüm görüntüler Image Lab 4.0.1 yazılımı kullanılarak analiz edildi. Protein sinyal yoğunluklarının normalleştirilmesi, SF görüntüleri, numune kontrolü ve dahili standartlar üzerinde ilgili toplam protein seviyelerinin ölçülmesinin ardından gerçekleştirildi.

2.10. NAD Ölçümü

Toplam NAD ve NADH seviyeleri homojenize beyaz gastroknemiusta ticari bir kit (#K337-100, Biovision, ABD) kullanılarak ve üreticinin talimatları izlenerek ölçüldü. Kısaca, toplam NAD havuzu (NADt= NADt ve NADH) çıkarıldı. Ekstrakte edilen numunelerin her biri için numunenin yarısı, NADH'yi sağlam tutarken NADt'yi ayrıştırmak için 30 dakika boyunca 60 dereceye ısıtıldı. Hem NADt hem de NADH numuneleri, NAD döngü enzimi ile karıştırıldı ve 450 nm'de absorbans ölçüldü. NADt ve NADH, NADH standart eğrisi ile karşılaştırılarak ve mg proteine ​​normalize edilerek nicelendirildi. Son olarak, NAD plus'ın (NADt-NADH) NADH'ye oranı hesaplandı. Tüm tahliller üç kopya halinde yapıldı.

2.11. İstatistik

Veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak rapor edilir. Veri normalliği, D'Agostino-Pearson normallik testi kullanılarak değerlendirildi. Veri analizi, tekrarlanan ölçümler için Student t-testi ve iki yönlü ANOVA (grup ve zaman) ve ardından Prism8.4.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, ABD) kullanılarak Bonferroni'nin post hoc testi kullanılarak yapıldı. Tip I hata için yüzde 5'lik iki taraflı bir seviye uygulandı.

3. Sonuçlar

3.1. Vücut Kompozisyonu ve Tüm Vücut Metabolizması

Vahşi tip (WT) farelerde on beş günlük CF takviyesi, vücut ağırlığını(p=0.091), yağsız kütleyi(p=0) değiştirmedi.{{24} }73) ve EchoMRI ile değerlendirilen yağ kütlesi (p=0.89;Şekil 1A). Yağsız kütle başına ifade edilen O2 tüketim oranları, karanlık döngüde (yüzde 8±8, p=0.042) önemli ölçüde daha yüksek iken, ışık döngüsünde benzer kalmıştır (p =0 .392; Şekil 1B.). Lokomotor aktivitede herhangi bir değişiklik olmadı (veriler gösterilmemiştir). CF fareleri tüm vücut enerji harcamasında yüzde 15±15 oranında önemli bir artış gösterdi (p =0.042;Şekil 1C)ve gıda alımı (0.08±0.01 vs.0.11±0.01 g yağsız vücut ağırlığı, sırasıyla CF grubu ve WT, p=0.013, Şekil 1D).

KF takviyesi tüm vücut metabolizmasını önemli ölçüde değiştirdi: KF grubunda yüksek RER'nin ana etkisi 24 saat boyunca gözlemlendi(p=0.023, Şekil 2A) ve 12 saatin üzerindeki ortalama RER daha yüksekti CF grubunda aydınlık ve karanlık döngülerde( artı yüzde 5±3 ,p=0.035 ve artı yüzde 9±4 , p=0.026). Ayrıca, CF takviyesi karbonhidrat (CHO) kullanımını destekledi (CF grubunda enerji tüketiminin yüzde 51±13'ü CHO oksidasyonuna bağlıyken, ışık döngüsü sırasında kontrol grubunda yüzde 37 ±12,p=0.108 ve Karanlık döngü sırasında KF grubunda yüzde 71±21'e karşı kontrol grubunda yüzde 47±24,p=0.004; Şekil 2B.). Bununla birlikte, kJ olarak ifade edildiğinde, CHO oksidasyonunda veya yağ asidi oksidasyonunda hiçbir fark yoktu (CHOoksidasyon: kontrolde 3,7±1,4 kcal·d-1 vs.4.4±1.7 kcal.yağsız vücut kütlesi-1. CF'de d-1,p=0.33 ve yağ asidi oksidasyonu: 2.3± 1.0 kcal·d-Iin kontrol vs.2.6±0.87 kcal.yağsız vücut kütlesi-1.d{{ 50}}CF'de,p=0.608).RER'nin PRCF'sinin analizi, CF grubunda (p=0,009; Şekil 2D), CF'nin bir kaymaya neden olduğu anlamına gelen EC50 değerlerinde bir artış ortaya çıkardı daha fazla karbonhidrat kullanımına doğru KF grubunda Hill eğiminde azalma gözlendi (H değerleri: kontrollerde 25.16±4.44'e karşılık KF grubunda 12.79±3.96,p<0.001). moreover,="" the="" rer="" amplitude="" over="" 24h="" was="" increased="" by="" 31±="" 31%="" in="" the="" cf="" group="" (p="0.035)." cf="" supplementation="" improved="" glucose="" tolerance="" following="" oral="" glucose="" administration="" from="" unchanged="" baseline="" blood="" glucose="" levels="" after="" an="" overnight="" fast="" (figure="" 2e,p="0.003)." the="" area="" under="" the="" capillary="" blood="" glucose="" curve="" was="" lower="" in="" the="" cf="" group(1018±135="" vs.="" 1181±="" 170="" mm·120="" min,="" p="0.005;" figure="">

3.2. Mitokondriyal Biyoenerjetik

CF takviyesinin, WT farelerinde beyaz gastroknemius ve soleus kasındaki mitokondri enerjileri üzerindeki etkisini test ettik. Beyaz gastroknemius ve soleus kaslarında karmaşık IV substratlar kullanılarak daha yüksek mitokondriyal solunum gözlendi (sırasıyla p=0.004 ve p=0.028; Şekil 3A, B). CII/CI ve CIV/CI solunum oranlarında herhangi bir değişiklik gözlemlenmedi (beyaz gastroknemius için p =0.899 ve p =0.701 ve p=0.693 ve p{{ 11}}.912, sırasıyla soleus kasları için, veriler gösterilmemiştir). Ayrıca, beyaz gastroknemius kasında kompleks,I, IV ve sitrat sentaz aktiviteleri önemli ölçüde arttı (sırasıyla: artı yüzde 31 ± 27 ,p=0.004; artı yüzde 28 ± 38 ,p=0 .027; artı yüzde 35±38 ,p= 0.009; artı yüzde 14±13 ,p=0.040;Şekil 3C).Mitokondrinin palmitoil-karnitini oksitleme yeteneği, beyaz gastroknemius( artı yüzde 24±12 ,p =0.096; Şekil 3D), tabanda hiçbir fark gözlenmedi(p =0.363). Palmitoil-karnitin ile uyarılan solunumun nispi oranları, kompleks I solunumun fonksiyonunda ifade edildiğinde değişmemiştir (kontrol grubunda 62±11'e karşılık beyaz gastroknemiusta CF grubunda 64±20 ve 70 ± 18'e karşı 72±16). soleusta). Daha sonra, beyaz gastroknemiusta Ca artı ile indüklenen PTP açılışına duyarlılığı araştırdık. Şekil 3E'de gösterildiği gibi, CF takviyesinin ardından ne PTP açılma zamanı ne de Ca² tutma kapasitesi değişmedi (sırasıyla p=0.608 ve p=0.943).

Mitokondriyal biyogenezde yer alan genlerin mRNA değerlendirmesi, NRF1 mRNA'nın yüzde 70 yukarı regülasyonunu gösterirken, PGCl , Tfam, CS, ND1, ND2, SDHa ve Cox2 için hiçbir fark bildirilmemiştir (Tablo 3). Birkaç örnek üzerinde CF takviyesinin mitokondriyal süper kompleksler üzerindeki etkisini araştırdık (Şekil S1, Ek Malzemeler). Dansitometrik analiz, CF takviyesinin, kalitatif adaptasyon veya yeniden düzenlemeler olmaksızın genel süper kompleks içeriğini arttırdığını göstermektedir. Gerçekten de solunum yoğunluğu, kompleks I ve kompleksⅡ probları kullanılarak yüzde 58 ve kompleks I probu kullanılarak yüzde 93 oranında iyileştirildi. Benzer şekilde, süper komplekslere gömülü kompleks I ve kompleks III içeriği CF grubunda daha yüksekti.

CF takviyesi mitokondriyal ROS emisyonunu düşürür. H2O2 emisyonu, kuru ağırlık başına ifade edildiğinde hem beyaz gastroknemiusta hem de soleusta değişmeden kalırken (sırasıyla Şekil 4A, B), mitokondriyal içerik başına ifade edildiğinde oranlar azaldı (Şekil 4C). Beyaz gastroknemiusta çeşitli koşullarda CF takviyesinin ana olumlu etkisi gözlendi (p<0.048; figure="" 4c).="" the="" mitochondrial="" h2o2="" emission="" was="" also="" significantly="" reduced="" when="" expressed="" peroxidative="" phosphorylation="" capacity="" assessed="" by="" state="" 4="" respiration="" using="" complex="" i+ii="" substrates="" by="" 26±13%="" in="" the="" white="" gastrocnemius="" (p="0.044)and" by="" 29±12%="" in="" the="" soleus(p="0.024;" figure="">

3.3. İskelet Kasında Oksidatif Stres Belirteçleri

WT farelerindeki hücresel protein oksidatif stres seviyesi, SOD2'nin hücresel içeriği beyaz gastrocnemius ve soleus'taki deney ve kontrol gruplarında benzer olduğundan CF takviyesinden etkilenmedi (Şekil 4E). Ayrıca, beyaz gastroknemius ve soleusta protein karbonilasyonunda hiçbir fark gözlenmedi(Şekil 4F). Ek olarak, CF takviyesinden sonra katalaz ve MnSod mRNA ifadesinde hiçbir fark gözlenmedi (Tablo 3).

3.4.NAD Metabolizması

Toplam piridin nükleotid havuzu, CF takviyesinin ardından yüzde 36±33 arttı (p=0.012). Spesifik olarak, beyaz gastroknemiusta NAD ve NADH içerikleri arttı (sırasıyla yüzde 69±60 ,p{{6 }}.026 ve yüzde 29±42 ,p=0.017;Şekil 5A,B)ve NAD artı /NADH oranı CF grubunda (p =0.084) yükselme eğilimindeydi.Hayır Sirt3 mRNA (p=0.096), NMNAT mRNA (p=0.094) ve Sirt1 mRNA(p =0.869 için önemli etki gözlemlendi.869; Tablo 3 ).

3.5.Sirt'te CF Takviyesinin Ardından Tüm Vücut ve Hücresel Metabolizma Tepkisi3-/ Fareler

Sirt{{0}}farelerinde CF takviyesinin etkisini inceledik. KF ve kontrol grupları arasında ağırlık, yağsız kütle ve yağ kütlesi olarak vücut kompozisyonu farklı değildi (sırasıyla p= 0.52,p=0.66,p=0.45; Şekil 6A).Benzer şekilde, günlük enerji harcaması CF takviyesinden etkilenmedi ({{10}}.38±0.{{40}}1 Kcal.lean body) kontrollerde kütle-1.gün-1 ile 0.39 ± 0.01 Kcal·yağsız vücut kütlesi-1.gün-1 karşılaştırması CF'de, p=0.502; Şekil 6B). RER, aydınlık ve karanlık döngülerde her iki grup arasında benzerdi (p=0.301; Şekil 6C) ve substrat oksidasyonu CF takviyesinden etkilenmedi (enerji tüketiminin yüzde 44 ± 17'si CHO oksidasyonuna bağlıydı). aydınlık fazda KF grubunda yüzde 50 ± 11'e karşı kontrol grubu,p=0.209 ve kontrol grubunda yüzde 65±19'a karşılık karanlık fazda KF grubunda yüzde 77±21, p=0.395; Şekil 6D). 24 saat boyunca RER amplitüdü ile değerlendirilen metabolik esneklik iki grup arasında benzer kalırken (kontrolde 0.19±0.05 ve CF'de.0.20±0.03,p=0.604) PRCF eğimi CF grubunda azalmıştır. (H değerleri: kontrolde 17.77±4.38 ve CF'de 12.79±3.93,p=0.039).

Daha sonra, CF takviyesinin mitokondriyal enzim aktiviteleri üzerindeki etkisini karşılaştırdık. CF takviyesi, daha önce WT'de gözlemlendiği gibi Sirt3-/farelerde kompleks I,I,IV ve CS'nin enzim aktivitesini arttırmada başarısız oldu (sırasıyla: p=0.623,p=0 .629,p=0.283 ve p=0.791, Şekil 6E). CF takviyesinden sonra Sirt3-7farelerine kıyasla WT'de kompleks ve IV'ün daha yüksek enzim aktivitesi gözlendi ( sırasıyla:p=0.027 ve P=0.045)

4. Tartışma

Bu çalışmada, KF alımının etkisinin bütünleştirici bir analizini sunuyoruz. Kronik CF alımının mitokondriyal solunumu iyileştirdiğini ve miyofiber ortamlarında değerlendirildiğinde H2O2 üretimini azalttığını, buna karşın PTP açılmasının duyarlılığının değişmediğini gözlemledik. CF alımı, gözlenen mitokondriyal adaptasyonlar üzerinde sirtuin yollarının katılımını destekleyen NADmetabolizmasını arttırdı. Ayrıca, ana substrat olarak karbonhidratları daha fazla kullanma kabiliyetine yönelik tüm vücut metabolizması modifikasyonlarını gözlemledik, bu da mitokondriyal adaptasyonların muhtemelen gözlenen tüm vücut metabolizması adaptasyonuna katkıda bulunduğunu düşündürdü.

4.1.Metabolizma

Kakao flavanollerinin diyetle uygulanması, glikoz intoleransını hafifletmek için etkili bir strateji olarak tanımlanmıştır ve metabolik hastalıkları iyileştirme fırsatlarına izin verir [34]. Sonuçlarımız, flavanol alımını takiben artan bir glukoz toleransı bildiren önceki çalışmalarla uyumludur [35,36]. Bu etki için önerilen mekanizmalar, GLUT4'ün hücre zarına doğru yer değiştirmesinde bir artış, AMPK fosforilasyonunda bir artış ve iskelet kasında UCP-2 gen ekspresyonunun yukarı regülasyonunu içerir [8,37] . Ayrıca, KF alımı insanlarda insülin duyarlılığının iyileşmesi ile ilişkilendirilmiştir[8]. 15 günlük bitter çikolata tüketiminden sonra, sağlıklı deneklerde kantitatif insülin duyarlılığı kontrol endeksi ve insülin duyarlılığı endeksinde bir artışla eş zamanlı olarak insülin direnci endeksinin homeostaz modeli değerlendirmesinde bir düşüş gözlendi [8]. Ayrıca, bir organizmanın yakıt oksidasyonunu yakıt mevcudiyetine uyarlama kapasitesini ifade eden, WT farelerinde glikoz toleransında ve metabolik esneklikte eşlik eden bir artış gözlemledik [38]. İlginç bir şekilde, bozulmuş mitokondriyal oksidatif kapasite ve ilgili substrat oksidasyonu insülin direnci ile ilişkiliyken 39, dayanıklılık egzersiz eğitimi mitokondriyal içeriği, insülin duyarlılığını ve metabolik esnekliği arttırdı [38]. Bu nedenle, mevcut sonuçlar CF takviyesine özeldir ve spontan aktiviteden etkilenmez.

CF'nin metabolik esneklik üzerindeki olumlu etkisinin yanı sıra mitokondriyal kompleks aktivitesinin artması, Sirt3-7 farelerinde körelmiştir, bu da CF'nin olumlu etkilerinin en azından kısmen Sirt3 yoluyla gerçekleştiğini gösterir. Bu sonuçlar önceki bulguları ve Sirt3'ün metabolik esneklik regülasyonu üzerindeki önemli rolünü desteklemektedir [24]. Sonuçlarımız, mitokondriyal fonksiyondaki bir artışın metabolik esnekliği artırabileceğini göstermektedir. Ancak mitokondriyal fonksiyonun yanı sıra bazal solunum katsayısı, glukoz atılma hızı, yağ dokusu lipid depolama kapasitesi ve plazma serbest yağ asidi konsantrasyonu da metabolik esnekliğin belirleyici faktörleri olarak tanımlanmış ve dikkate alınmalıdır [40]. Gelecekteki çalışmalar, KF takviyesini takiben metabolik esnekliğin artmasının altında yatan nedenleri anlamamızı derinleştirmek için metabolik esnekliğin hücresel belirleyicilerini daha derinden değerlendirmelidir.

Tüm vücut metabolizması değerlendirmesi, CF takviyesinin ardından nispi CHO oksidasyonunda bir artış olduğunu ortaya koydu. Bu sonuç, farelerde akut flavanol alımını veya iki haftalık flavan-3-ols takviyesini takiben lipolizde bir artış bildiren önceki bir çalışma ile çelişmektedir [36]. Ekstrakt bileşimi farklılıklarının yanı sıra, bu çelişkili bulgular NO'nun pleiotropik etkilerinden kaynaklanabilir. KF alımının NO metabolizmasının üretimini veya biyoyararlanımını uyardığı iyi kabul edilmektedir [7]. Bir tarafta NO, iskelet kasında glikoz taşınmasını ve alımını uyarır. Hücre dizisinden türetilen miyotüplerde NO üretiminin insülin veya hidrojen peroksit tarafından uyarılması, nNOS inhibisyonu ile azaltılan GLUT4 translokasyonunda bir artışa neden oldu [41]. Ayrıca NO, insülinden bağımsız bir yolda glikoz taşınmasını artırabilir, bu da siklik GMP ve AMPK [42] düzeylerinde bir artışa yol açar, bu da sıçan iskelet kasında yağ asidi mevcudiyeti ve oksidasyondan bağımsız olarak glikoz oksidasyonunu destekler [43]. Öte yandan NO, asetil-CoA karboksilazın inhibisyonu ve iskelet kasında malonil-CoA dekarboksilazın aktivasyonu yoluyla malonil-CoA seviyesini azaltarak yağ asidi oksidasyonunu destekler[44]. CF ile yağ asidini substrat olarak kullanmak için daha düşük bir nispi orana doğru bir kayma gözlemlesek de, kJ olarak ifade edilen mutlak değerler açısından bir fark yoktu. Bu, CF takviyesi ile gözlemlenen enerji harcamasındaki artışın, glikoz oksidasyonundaki bir artışa bağlı olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, bu sonuçlar, KF tüketiminin insülin duyarlılığını arttırdığı ve yağ asidi oksidasyon kapasitesi üzerinde eşzamanlı bir etki olmaksızın glikoz oksidasyonunu desteklediği fikrini desteklemektedir. Bu sonuçlar, kakao flavanollerini yüksek yağlı bir diyet bağlamında kullanmanın önemi sorusunu gündeme getiriyor. Gelecekteki çalışmalar, bir KF takviyesi ve yüksek yağlı bir diyetin olası bir zararlı etkisini değerlendirmelidir.

4.2.Mitokondriyal Fonksiyon

Kakao flavanollerinin diyetle uygulanmasının, (i) mitokondriyal solunum ve elektron taşıma zinciri enzim aktiviteleri; (i) mitokondriyal reaktif oksijen türleri (ROS) üretimini yansıtan mitokondriyal H2O2 salınımı; ve (i) mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözenek (mPTP) açılmasına duyarlılığı yansıtan mitokondriyal kalsiyum tutma kapasitesi (inceleme için bakınız [11]. Geçirgenleştirilmiş liflerde ve farklı kas tiplerinde yerinde değerlendirilen mitokondriyal fonksiyon üzerine CF takviyesi İzole mitokondri üzerine önceki çalışmaların aksine, geçirgenleştirilmiş liflerdeki mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi mitokondriyal morfolojiyi, diğer hücre içi bileşenlerle fonksiyonel etkileşimleri korur [1] ve mitokondriyal yapıyı önler mitokondriyal izolasyon süreci sırasında bozulma [32] Bu nedenle, mitokondriyal yapının korunduğu ve mitokondriyal havuzun tamamının temsil edildiği doku preparasyonlarında mitokondriyal fonksiyonu incelemek, tedaviye yanıtı daha iyi değerlendirmek için önemlidir.

Hücre kültüründe veya farelerde in vivo gerçekleştirilen önceki çalışmalar, CF'deki ana biyoaktif molekül olarak kabul edilen EPI ile takviyenin, mitokondri bir enerji kombinasyonu ile enerjilendiğinde maksimum ADP ile uyarılan solunumu (örn. solunum zinciri [45-49] boyunca çeşitli bölgeleri besleyen substratlar. Bu sonuçlarla tutarlı olarak, KF takviyesinin oksidatif ve glikolitik kaslarda mitokondriyal solunum üzerinde ana etkisini gözlemledik. Bu artışın mitokondriyal kütle artışıyla mı yoksa mitokondriyal solunum komplekslerinin yeniden şekillenmesiyle mi ilgili olduğunu belirlemek için kuadriseps kasından mitokondriyal süper kompleksleri değerlendirdik. Bu supramoleküler yapıların ROS üretimini azalttığı, bireysel komplekslerin birleştirilmesine stabilize ettiği veya yardımcı olduğu, solunum zinciri aktivitesini düzenlediği ve protein açısından zengin iç mitokondriyal membranda protein birikmesini önlediği düşünülmektedir [50-52]. Sınırlı sayıda önleme rağmen, sonuçların görsel analizi (Ek Malzemeler), CF takviyesinin, spesifik solunum zinciri kompleksi yeniden düzenlemelerinden ziyade tüm süper kompleks türlerdeki bir artışın yansıttığı gibi, mitokondriyal kütlede bir artışa neden olduğunu göstermektedir. Toplu olarak, bu sonuçlar CF'nin solunum zinciri kompleksi düzenlemelerinin kalitatif adaptasyonu olmadan mitokondriyal bir kütle artışını desteklediğini göstermektedir.

Mitokondriyal solunum sırasında, değişken miktarlarda süperoksit oluşur ve diğer ROS tiplerini oluşturmak üzere metabolize edilebilir [53]. Mitokondriden aşırı ROS üretimi, geniş bir patoloji yelpazesinde yer almasına rağmen, düşük fizyolojik ROS konsantrasyonları, bulaşıcı ajanlara karşı koruma ve hücresel sinyalleşmeye katılma gibi yararlı etkilere sahip olabilir [2,54]. Kemirgenlerde ve insanlarda in vivo gerçekleştirilen önceki çalışmalar ve hücre kültürü modelleri, ROS üretimi ve çeşitli antioksidan sistemler üzerinde yararlı CF takviyesi etkileri bildirmiştir [11]. Örneğin, 15 gün boyunca EPI ile oral gavaj, farelerin kuadriseps kaslarında SOD2 ve katalaz aktivitesini arttırır [17]. Mitokondriyal ROS üretimi geniş çapta değerlendirilmemiş olsa da, değerler kas ağırlığı başına ifade edildiğinde ROS üretim seviyelerinin benzer olduğunu, buna karşın mitokondriyal kütle başına ifade edildiğinde üretimin azaldığını gözlemledik, bu da ROS'un fizyolojik konsantrasyonlarını korumak için kalitatif adaptasyonların meydana geldiğini düşündürdü. Ayrıca, protein karbonilasyonu ile değerlendirilen SOD2 veya ROS kaynaklı hasarlar üzerinde CF'nin herhangi bir etkisi gözlemlemedik. CF, yaygın olarak bildirilen SOD2 ve katalaz seviyeleri [16,17,55] dahil olmak üzere antioksidan protein havuzlarını geliştirirken, bu adaptasyon her zaman ROS kaynaklı hasarlarda [56-59] bir azalma ile ilişkili değildi. Bu veriler, normal hücre homeostazı için düşük seviyelerde ROS üretiminin gerekli olduğu teorisini desteklemektedir [2]. Toplu olarak, bu sonuçlar, mitokondriyal kütlenin artmasıyla birlikte, CF'nin antioksidan kapasitesini arttırmak ve düşük ROS üretimini sürdürmek için kalitatif mitokondriyal adaptasyonları desteklediğini göstermektedir.

4.3.Mitokondriyal Biyogenez

Mitokondriyal kütle, mitokondriyal biyogenez ve mitofaji arasındaki etkileşimin sonucudur. Çalışmamız, polifenol tüketimi ile aktive edilen mitokondriyal biyogeneze odaklandı [60]. Mitokondriyal biyogenez, mitokondriyal kütleyi iyileştiren hücresel süreçtir. Bu karmaşık ve yüksek düzeyde düzenlenmiş süreç, nükleer ve mitokondriyal DNA kodlu genlerin ekspresyonundaki değişiklikleri koordine etmek için topluca hareket eden birkaç transkripsiyon faktörünü, nükleer hormon reseptörlerini ve transkripsiyon koaktivatörlerini içerir [61]. Önceki çalışmalar, CF takviyesinin neden olduğu mitokondriyal biyogenezin altında hangi yolların yatabileceğini belirlemeye çalışmıştır. NO'ya bağlı sinyallemenin uyarılması, mitokondriyal biyogenezde yer alan merkezi bir yol olarak ortaya çıkmıştır. CF takviyesi, NO biyosentezi için L-argininin kullanılabilirliğini artıran arginin parçalayıcı enzim arginazı inhibe ederek NO oluşumunu artırır [62,63]. Ayrıca, bir eNOS inhibitörü kullanılarak, epikateşinin mitokondriyal biyogenez üzerindeki uyarıcı etkisi kısmen körelmiştir [17]. Bu sonuçlar, mitokondriyal biyogenezi uyarmak için diğer sinyal yollarının dahil olduğunu göstermektedir.

Son zamanlarda, Aragones ve ark. (2016), polifenol ailesinin üyeleri olan diyet proantosiyanidinlerinin, sıçanlarda doza bağımlı bir şekilde de şimdi o NAD artı biyosentez yolunu ve Sirte aktivitesini artırarak hepatik NAD artı metabolizmasını artırdığını bildirmiştir[12]. Ayrıca, karaciğer, NAD sentezleme kapasitesi daha düşük olan iskelet kası gibi diğer organlara NADt öncüllerini ihraç eder ve bu da karaciğerde gözlenen etkilerin tüm organizmaya yayılma olasılığını artırır [64]. Bazı çalışmalar, CF takviyesinin Sirt1 protein içeriği, aktivitesi veya mRNA üzerinde bir etkisi olduğunu bildirse de [12,15-17,65,66], NAD metabolizmasının, CF takviyesini takiben mitokondriyal biyogenezdeki katılımı, kayıp veya kazanç kullanarak işlevi hiç test edilmedi. Çalışmamızda kullanılan tüm vücut Sirt3 KO farelerine göre kasa özgü bir nakavt tercih edilirken, sonuçlarımız CF'nin NAD metabolizmasını geliştirdiğini ve Sirt3'ün bu takviye kaynaklı mitokondriyal elektron taşıma zinciri aktivitesinde yer aldığını gösteriyor. CF takviyesini takiben mitokondriyal kompleks aktivitesi üzerinde gözlemlenen pozitif etkiler Sirt3-7fareleri kullanılarak gözlenmedi ve sadece WT'de CF takviyesinden sonra kompleks I ve IV aktivitelerinde daha büyük bir aktivite gözlemlendi. Bu gözlemler, Sirt3'ün mitokondriyal fonksiyonda önemli bir rol oynadığını gösteren önceki çalışmaları genişletmektedir]67. Toplu olarak, bu bulgular, sirtuinlerin, NAD metabolizmasının modülasyonu yoluyla, CF takviyesinin ardından gözlemlenen mitokondriyal kütle iyileşmesine dahil olduğunu göstermektedir. 4.4.Sınırlar

Kakao çekirdekleri monomerik, oligomerik ve polimerik flavanollerin bir karışımından oluşur. Flavanoller arasında EPI, kakao ürünlerinde bulunan ve polifenol içeriğinin yüzde 35'ini temsil eden en bol polifenolik monomer gibi görünmektedir [68]. EPI, kakao ve çikolata takviyesi ile ilişkili faydaların altında yatan ana biyoaktif molekül olarak kurulmuştur [47,69]. Bununla birlikte, EPI metabolitleri (EPIm), in vivo çalışmalarda gözlemlenen EPI kaynaklı biyolojik etkilerde rol oynayabilir. EPIm, EPI[70]'den daha yüksek plazma konsantrasyonlarına ulaşabilir. Ayrıca, türler arasında EPIm'de büyük farklılıklar gözlendi. Gerçekten de, insanlarda bulunan EPIm'in yüzde 80'i sıçanlarda saptanmazken, fareler ve insanlar arasındaki benzerliğin, iki ana insan metaboliti saptandığından biraz daha olumlu olduğu bulunmuştur [70]. Fermente edilmemiş kakao çekirdeklerinden beş kata kadar daha fazla EPI içeren zenginleştirilmiş CF özü kullandık[71]. Ayrıca, EPI içeriği fermantasyon yoluyla yüzde 10-20 oranında azaltılmış ve kavurma sırasında sıcaklığa bağlı olarak azalmıştır [71,72]. Toplu olarak, bu veriler, EPI takviyesinin insan sağlığı üzerindeki yararlarını değerlendirirken yalnızca EPI içeriğine dikkat edilmesi gerektiğini ve insanlarda gözlenen altta yatan mekanizmaları tahmin etmeden önce mevcut sonuçların dikkatle düşünülmesi gerektiğini göstermektedir.

5. Sonuçlar

15 gün boyunca günlük CF takviyesi, oksidatif ve glikolitik kaslarda mitokondriyal fonksiyon iyileştirmelerine yol açar. Mevcut sonuçlar, artan mitokondriyal solunumun, hücresel ROS üretimi seviyesi korunurken mitokondriyal kütlede bir artışla sonuçlandığını ve mitokondri içinde kalitatif adaptasyonlar olduğunu düşündürmektedir. Daha önce tarif edilen [73] NO metabolizması üzerindeki hücresel etkiye eşlik eden CF, sirtuin aktivitesini uyaran NAD metabolizmasını modüle eder. Sirt3, CF takviyesinin ardından mitokondriyal adaptasyonlarda ve metabolik esneklikte merkezi bir rol oynar. Sirtuinler, diyabet veya astım [74,75l] gibi çeşitli hastalık patogenezinde yeni hedefler olduğundan, daha ileri çalışmalar sirtuinlerin doğal bir aktivatörü olarak CF kullanmanın potansiyel ilgisini keşfedecektir.

Referanslar

1. Kuznetsov, AV; Veksler, V.; Gellerich, FN; Saks, V.; Margreiter, R.; Kunz, WS Geçirgenleştirilmiş kas lifleri, dokular ve hücrelerde in situ mitokondriyal fonksiyonun analizi. Nat. Protokol 2008, 3, 965-976. [Çapraz Referans]

2. Sena, Los Angeles; Chandel, NS Mitokondriyal Reaktif Oksijen Türlerinin Fizyolojik Rolleri. Mol. Hücre 2012, 48, 158-167. [Çapraz Referans]

3. Wacquier, B.; Combettes, L.; Van Nhieu, GT; Dupont, G. Hücre İçi Ca2 artı Salınımlar ve Ca2 artı uyarılmış Mitokondriyal Metabolizma Arasındaki Etkileşim. bilim 2016, 6, srep19316. [Çapraz Referans]

4. Suomalainen-Wartiovaara, A.; Battersby, BJ Mitokondriyal hastalıklar: Organel stres tepkilerinin patolojiye katkısı. Nat. Rev. Mol. Hücre Biol. 2018, 19, 77-92. [Çapraz Referans]

5. Heyman, E.; Daussin, F.; Wieczorek, V.; Caiazzo, R.; Matran, R.; Berthon, P.; Aucouturier, J.; Berthoin, S.; Descatoire, A.; LeClair, E.; et al. Tip 1 Diyabette Ortam Havasından Mitokondriyal Solunum Zincirine Kas Oksijen Temini ve Kullanımı: Sınırlayıcı Bir Basamak Var mı? Diyabet Bakımı 2020, 43, 209–218. [Çapraz Referans]

6. Daussin, FN; Boulanger, E.; Lancel, S. Mitokondriden sarkopeniye: İltihaplanmanın rolü ve RAGE-ligand ekseni uygulaması. Tecrübe. Gerontol. 2021, 146, 111247. [CrossRef] [PubMed]

7. Katz, DL; Doughty, K.; Ali, A. Kakao ve Çikolatada İnsan Sağlığı ve Hastalıkları. Antioksit. Redoks Sinyali. 2011, 15, 2779–2811. [CrossRef] 8. Grassi, D.; Lippi, C.; Necozione, S.; Desideri, G.; Ferri, C. Kısa süreli bitter çikolata uygulamasını, sağlıklı kişilerde insülin duyarlılığında önemli bir artış ve kan basıncında azalma izler. Ben. J. Clin. Nutr. 2005, 81, 611-614. [CrossRef] [PubMed]

9. Grassi, D.; Desideri, G.; Necozione, S.; Lippi, C.; Casale, R.; Uygun, G.; Blumberg, JB; Ferri, C. 15 Gün Yüksek Polifenol Bitter Çikolata Tüketildikten Sonra Kan Basıncı Düşürüyor ve İnsülin Duyarlılığı Artıyor. J. Nutr. 2008, 138, 1671-1676. [Çapraz Referans]

10. Ottaviani, JI; anne, TY; Heiss, C.; Kwik-Uribe, C.; Schroeter, H.; Keen, CL Flavanollerin stereokimyasal konfigürasyonu, insanlarda flavanollerin seviyesini ve metabolizmasını ve in vivo biyolojik aktivitelerini etkiler. Ücretsiz Radic. Biol. Med. 2011, 50, 237–244. [CrossRef] [PubMed]