Doğal Scrapie'nin Farklı Beyin Bölgelerinde Ayırt Edici Toll benzeri Reseptörler Gen İfadesi ve Glial Tepki Bölüm 3

Scrapie ile doğal olarak enfekte olmuş koyunların dört farklı beyin bölgesinde, prion hastalığının nöropatolojik özellikleri ile TLR gen ekspresyonu arasındaki olası korelasyonları araştırdık. Dört beyin alanının tamamında, doğal olarak enfekte olmuş koyunlarla kontrol koyunları arasında PrPSc birikimi, spongiyoz, astroglioz ve mikroglioz açısından önemli farklılıklar gözlemledik.

Tapınak fuarı hastalığı, balmumu yiyen hastalık vb. olarak da bilinen Prion hastalığı, prionların neden olduğu akut viral bir enfeksiyondur. Hastalık esas olarak prion içeren pişmemiş yiyeceklerin tüketilmesiyle bulaşır. Prionlarla enfekte olduğunda beyin iltihabına ve sinir sistemi hasarına neden olabilir ve baş ağrısı, kusma ve ateş gibi semptomlar ortaya çıkabilir.

Ancak böyle bir durumla karşılaştığımızda prion hastalığının varlığından dolayı hafızamıza olan güvenimizi kaybedemeyiz. Enfekte kişilerin çoğu tedaviden sonra iyileşebilir ve hafızasını geri kazanabilir.

Elbette önleyici bir bakış açısıyla prion enfeksiyonunu önlemek için daha fazla pişmiş yemek yemeyi deneyebiliriz. Aynı zamanda herhangi bir belirti hissederseniz hastalığın daha da kötüleşmesini önlemek için en kısa sürede doktora başvurmalısınız.

Günlük hayatta hafızamızı geliştirmek için okuma, liste oluşturma, etkinlik ve bilgi düzenleme gibi basit hafıza eğitimlerini deneyebiliriz. Bu eğitimler fazla zaman ve enerji gerektirmez ancak sağlıklı bir beyin ve etkili hafıza fonksiyonunu sürdürmek için çok önemlidir.

Kısacası prion hastalığı gibi hastalıklarla karşılaştığımızda bunu olumlu karşılamalı, profesyonel tıbbi tedavi ve önleyici tedbirler aramalı, fiziksel sağlığımızı ve verimli çalışmamızı sağlamak için günlük hafıza egzersizlerine dikkat etmeliyiz. Belleği geliştirmemiz gerektiği görülebilir ve Cistanche, hafızayı önemli ölçüde geliştirebilir çünkü aynı zamanda hafıza ve öğrenme için çok önemli olan asetilkolin ve büyüme faktörlerinin seviyelerini arttırmak gibi nörotransmitterlerin dengesini de düzenleyebilir. Ayrıca Cistanche kan akışını iyileştirebilir ve oksijen dağıtımını destekleyebilir, bu da beynin yeterli beslenme ve enerji almasını sağlayarak beyin canlılığını ve dayanıklılığını artırır.

Beyin fonksiyonunu iyileştirmenin yollarını bilin'e tıklayın

Bu farklılıklar en çok caudalarea olan medulla oblongata'da belirgindi. Buna karşılık en hafif lezyonlar en rostralarea olan frontal kortekste gözlendi. Bu sıralı model, prion nöroinvazyonu ve CNS boyunca yayılma, omurilik ve obeksteki giriş yerlerinden başlayıp en sonunda frontal kortekse ulaşma yolu ile uyum içindedir [1,5,51].

Beklenmedik bir şekilde, anatomik yakınlıkları göz önüne alındığında, patolojinin kademeli kaudo-rostral ilerlemesini takip etmeden, talamustan hipokampusa geçerken PrPSc birikiminde ve vakuolizasyonunda ciddi bir azalma ve astrogliosiste önemli bir düşüş gözlemledik.

Çubuk mikroglia olarak bilinen spesifik bir mikrogliamorfoloji, CA3'teki piramidal hücre nöronlarının yakınında gözlemlendi ancak incelenen diğer nöroanatomik bölgelerin hiçbirinde yoktu.

Bildiğimiz kadarıyla bu mikroglial profil bugüne kadar prionlar tarafından tetiklenen nöroinflamasyonla ilişkilendirilmemiştir, ancak yakın zamanda yapılan bir çalışmada CJD'li insan hastaların beyinciklerinde çubuk şeklinde mikrogliaların varlığı rapor edilmiştir [52].

Her ne kadar 1900'lerdeki ilk tanımlardan bu yana çok az çalışılmış olsa da, çubuk mikroglia'nın yakın zamanda epilepsi, Lewy cisimcikli demans, Huntington hastalığı ve AD gibi nörolojik bozukluklarda, özellikle serebral korteks ve hipokampusun orta derecede hasar görmüş bölgelerinde rapor edildiği rapor edilmiştir [40,41,53]. Çubuk mikrogliasının fenotipik ifadesi ve fonksiyonları henüz net değildir.

Bununla birlikte, bu morfolojik özelliğin tipik olarak hasar görmüş veya hasara karşı hassas olan nöronal elemanların varlığıyla örtüşmesi, nöroprotektif bir rol oynadığını düşündürmektedir [42,54,55].

Bu durumlarda ameboid morfolojiye doğru ilerleme beklendiğinden, çubuk mikrogliasının ciddi lezyonlarla ilişkili olduğu düşünülmemektedir [56]. Scrapie ile enfekte olmuş koyunların hipokampusunda rodmicroglia'nın varlığı, ancak diğer beyin bölgelerinde bulunmaması, bu bölgede gözlemlenen sınırlı nöron kaybıyla iyi bir uyum içinde, nöroprotektif bir ortamın göstergesi olabilir.

TLR ekspresyonu analizimiz, lezyon şiddeti ile TLR geninin aşırı ekspresyonu arasında, prion nöropatolojisinin yukarıda bahsedilen kaudo-rostral ilerlemesi ile örtüşen doğrudan bir korelasyon olduğunu ortaya koymaktadır.

Tersine, TLR4 lezyonun ciddiyetine bakılmaksızın tüm alanlarda benzer şekilde aşırı eksprese edildi. Daha hafif nöronal hasar alanlarında (yani hipokampus ve frontal korteks) TLR4'ün aşırı ekspresyonu, daha önce makrofajlar ve mikroglia gibi fagositik hücreler için tanımlandığı gibi anöro-koruyucu rolü yansıtabilir [23,57]. TLR7'nin yukarı regülasyonu daha önce fare modellerinde rapor edilmişti. prion hastalığı ve insan hastalar [22,26,31].

Yalnızca en yüksek düzeyde spongioz ve PrPSc birikiminin tespit edildiği en hasarlı bölge olan medulla oblongata'da TLR7'nin artışını gözlemledik.

Apoptoz yoluyla nöron ölümü daha önce TLR7 uyarımı ile ilişkilendirilmişti [58,59] ve medulla oblongata'daki aşırı ekspresyonu bu mekanizma ile ilişkili olabilir [60]. TLR1'in nörodejeneratif hastalıklardaki rolü henüz net olmasa da, TLR2'nin mikroglial aktivasyona katılımı amyotrofik lateral skleroz, MS ve AD'de giderek daha fazla gösterilmiştir [61,62].

TLR2'nin prion hastalıklarındaki rolü tam olarak anlaşılmamakla birlikte, yararlı etkileri öne sürülmüştür: Scrapie ile intraserebral aşılamayı takiben TLR2 eksprese etmeyen farelerde hayatta kalma süresi azalır [22].

TLR2 ve MyD88'in aşırı ekspresyonu aynı zamanda proinflamatuar mikroglia fenotipinin göstergesi olabilir; bu da talamusta gözlemlediğimiz TNF- ve IL-6 artışını açıklayabilir [8,63].

İlginç bir şekilde, ölümsüzleştirilmiş bir mikroglia benzeri fare hücre dizisi olan EOC 13.31 hücrelerinin kullanıldığı deneyler, TLR2 aktivasyonuna yanıt olarak inflamatuar yanıt yolunda bir düzensizlik olduğunu göstermiş ve TLR2 ekspresyonu ile mikroglia'nın fagositoz için optimal olmayan bir durumda birikmesi arasında bir bağlantı olduğunu öne sürmüştür [26] .

Bu nedenle, aşırı fagositik mikroglia seviyelerinin de tespit edildiği en hasarlı alanlar olan medulla oblongata ve talamusta TLR2'nin aşırı ekspresyonu, PrPSc'nin işlevsiz temizlenmesinin PrPSc'nin sürekli birikmesine ve nöronal hasara yol açabileceğini düşündürmektedir [9,17].

Scrapie ile enfekte olmuş koyunların hipokampüsündeki bulgularımız, analiz edilen diğer beyin alanlarıyla karşılaştırıldığında, TLR1, TLR2 ve MyD88'in aşağı regülasyonu ve sitokin değişikliklerinin olmadığı zıt bir modeli ortaya koymaktadır.

Bu, mikroglia'nın hipokampusta farklı tepki verdiğini gösterebilir; aslında, neonatal farelerden (0-3 günlük) alınan ve nörotoksik peptit PrP106-126 ile uyarılan birincil mikroglial hücre kültürlerindeki TLR2 eksikliğinin, mikroglial aktivasyonu nörotoksik bir fenotipten nöroprotektif bir fenotipe kaydırdığı gösterilmiştir [63 ]

Ancak PrP106-126 peptidinin prion patolojisindeki önemi sorgulanmıştır [64]. CD36, amiloid oluşturan peptitler gibi endojen olarak türetilmiş ligandları tanıyabilen ve bu bileşenlerin endositik alımında rol oynayan farklı tipte bir model tanıma reseptörüdür [65,66]. Bu reseptör proinflamatuar mikroglial durumla ilişkilendirilmiştir [67].

İn vitro, bir tür ölümsüzleştirilmiş mikroglial hücre olan BV-2 hücrelerinin PrP106-126 ile uyarılması, CD36 yukarı regülasyonuna, proinflamatuar sitokinlerin ve iNOS ve NO üretiminin artmasına neden olur [68,69].

Ek olarak, -amiloid peptidinin CD36 tarafından tanınması, doğuştan gelen bağışıklık tepkisini aktive eden yeni bir heterotrimerik kompleks CD36-TLR4-TLR6'nın birleşmesini tetikler [70,71].

Çalışmamızda hipokampus dışındaki tüm bölgelerde CD36'nın anlamlı düzeyde yukarı regülasyonu görüldü. En hasarlı bölgeler olan medulla oblongata ve obex'te CD36, TLR4 ve TLR6'nın yukarı regülasyonu, bu üçlünün prion enfeksiyonuna yanıt olarak proinflamatuar bir mikroglial durumun tetiklenmesinde rol oynadığını düşündürmektedir.

Tersine, hipokampusta aşırı CD36 ve TLR6 ekspresyonunun yokluğu, bu heterotrimerin oluşmadığını düşündürmektedir; bu da yine bu beyin bölgesindeki anöro-koruyucu ortamın göstergesidir.

Mikrogliaların bu beyin bölgesinde neden farklı tepki verdiğinin açıklanması gerekmektedir. Prion türüne özgü hücre tropizmi, mikrogliosis ve strogliosis modelini belirleyebilirken, son bulgular her iki reaksiyonun da esas olarak beyin bölgesinden etkilendiğini göstermektedir [18,72].

Ne mikroglia ne de astroglia, CNS boyunca aynı şekilde yanıt vermez ve bu bölgeye özgü yanıt, prion hastalıklarında bazı beyin bölgelerinin seçici hassasiyetine yol açabilir [16,18].

Bu bağlamda, mikroglia'nın prion enfeksiyonuna verdiği inflamatuar yanıtın, PrPSc'nin sialilasyonu tarafından düzenlendiği [14,73-75] ve PrPSc sialilasyonunun beyin bölgesine bağımlı olduğu [18] öne sürülmüştür. Spesifik olarak, hipokampus ve kortekste talamus ve beyin sapına göre daha yüksek düzeyde PrPSc sialilasyonu bulunur ve bu, bu beyin bölgelerinin seçici hassasiyetinde potansiyel bir rol olduğunu düşündürür [18,73,75].

Hipokampustaki yüksek düzeyde PrPSc sialilasyonu, yavaşlamış prion replikasyonu ile ilişkili olabilir; bu, bu bölgede belirgin prion kaynaklı mikroglial aktivasyona yol açar; bu, bulgularımızın ima ettiği bu bölgenin duyarlılığının azalmasıyla tutarlıdır.

İlginç bir şekilde, önceki bulgular hipokampüsün doğal CJD enfeksiyonunda prion nörotoksisitesinden korunabileceğini düşündürmektedir [76,77] ve CJD vakalarının ayrıntılı nöropatolojik çalışmaları hipokampusta diğer beyin bölgelerine göre daha hafif lezyonlar bildirmiştir [76].

Spesifik olarak, esas olarak hipokampusu içeren arkakorteks, CJD'deki diğer kortikal bölgelerle karşılaştırıldığında nispeten korunmuş görünmektedir [77]. Doğal CJD'de tanımlanan bu hafif hipokampal tutulum, doğal olarak scrapie ile enfekte olmuş koyunlardaki mevcut bulgularla uyumludur.

İlginç bir şekilde, en az iki doğal prion hastalığına karşı bu kısmi koruma, filogenetik olarak serebral korteksin en eski bölgesi olan ve en temel kortikal doku tipini içeren hipokampusta meydana gelir.

Bu korelasyonun ilişkisini araştırmak için daha ileri çalışmalara ihtiyaç duyulacaktır. Özetle, sonuçlarımız, doğal scrapie ile enfekte olmuş koyunların hipokampüsünde, kaudal-to-kaudal bölge göz önüne alındığında beklenenden daha düşük seviyelerde spongioz, PrPSc birikimi ve astrogliosis ile karakterize edilen, özellikle hafif nöropatolojiyi ortaya koymaktadır. Scrapielezyonların rostral yayılımı.

Dahası, hipokampusta nöroprotektif bir rol oynayabilecek özel bir mikroglial morfoloji olan çubuk mikroglia'nın varlığı [54], farklı bir model tanıma reseptörü (TLR genleri ve CD36) gen ekspresyon profili ile birlikte, bu beyin bölgesini diğer nöroanatomik beyin bölgesinden daha da farklılaştırır. doğal scrapie ile enfekte koyunlardaki bölgeler.

Bu bulgular, hipokampusta doğal prion enfeksiyonuna karşı daha fazla araştırmayı hak eden bir dereceye kadar nörolojik koruma olduğunu göstermektedir. Protein yanlış katlanmasının neden olduğu nörodejeneratif hastalıklar, yanlış katlanmış protein birikimi, glial aktivasyon ve protein birikimini şiddetlendiren ve glial inflamatuar aracıların salınmasından oluşan kısır bir iltihaplanma döngüsünü içerir. nöroinflamasyon.

Belirli bir hastalık aşamasında spesifik TLR inhibitörleri kullanarak mikroglia aktivasyonunu hedefleyerek bu kısır döngüyü kesintiye uğratmak, daha fazla nöroenflamasyonu sınırlamak için umut verici bir yaklaşım oluşturabilir. Bulgularımız, böyle bir yaklaşım için potansiyel bir hedef olarak TLR2 aşağı regülasyonunun altını çizmektedir, çünkü bu, mikroglia'da nörotoksik bir fenotipten anöro-koruyucu bir fenotipe doğru bir kaymaya neden olabilir [63].

Son olarak, nörodejeneratif hastalıkların fare modellerini kullanarak glial fenotiplerin çeşitliliğini karakterize etmede büyük ilerleme kaydedilmiş olsa da, fare modellerinin prion hastalıklarının temel yönlerini güvenilir bir şekilde yansıtıp yansıtmadığı bazı tartışma konusudur [78,79].

Tg338 transgenik modelindeki sonuçlarımız, belirgin PrPSc birikimi, nöropil spongiyoz, astroglioz ve mikroglioz dahil olmak üzere prion enfeksiyonunun ortak patolojik belirtilerini yeniden üretti.

Bununla birlikte, enfekte olmuş fareler, TLR1 ve TLR2'nin önemli ölçüde aşırı ekspresyonunu ve TLR7 aşırı ekspresyonuna eğilimi gösterdi. Bu genlerin yukarı regülasyonu daha önce scrapie ile enfekte olmuş diğer fare modellerinde tanımlanmış olmasına rağmen [22,26], bu model koyun beynindeki bulgularımız ile çelişmektedir. Dikkat çekici bir şekilde, fare beyninde, koyun örneklerinde ekspresyonunda en büyük değişikliklerin gözlemlendiği gen olan TLR4'ün ekspresyonunda hiçbir değişiklik gözlemlemedik.

Bu çelişkili bulgular, farklı enfeksiyon yollarının ve/veya tg338 farelerindeki prion proteini ekspresyon seviyelerinin bir sonucu olabilir [80,81]. Bununla birlikte, sonuçlarımız sonuçta, aşırı büyük tg338 farelerinde scrapie'nin intraserebralinokülasyonunun, doğal scrapie enfeksiyonunda gözlemlenen bağışıklık tepkisini yeniden üretmediğini göstermektedir.

4. Malzemeler ve Yöntemler

4.1. Scrapie ile Enfekte ve Kontrol Koyunları

Bu çalışmaya 21 dişi Rasa Aragonesa koyunu (2-6 yaş arası) dahil edildi. Hepsi daha önce bildirildiği gibi [82] PRNP polimorfizmleri için genotiplendi ve bir ARQ/ARQ genotipi sergiledikleri bulundu. Kontrol hayvanları (n=8), hiçbir scrapie vakasının rapor edilmediği bir sürüden seçildi.

Scrapie ile enfekte olmuş hayvanlar(n=13), scrapie'den etkilenmiş sürülerden elde edildi ve rektal mukoza biyopsilerinin immünohistokimyası (IHC) ile teşhis edildi. Enfeksiyon, yayınlanmış kriterlerin ardından obexte PrPSc'nin ölüm sonrası immünodeteksiyonuyla doğrulandı [83].

Hayvanlara intravenöz aşırı dozda barbitürat ve kan kaybı uygulanarak ötenazi uygulandı.

Ötenazi sırasında, scrapie ile enfekte olmuş tüm koyunlar, farklı şiddette klinik belirtiler gösterdi: bazı hayvanlar, dijital uyarımdan sonra sırtta ve yanlarda kaşıntı ve vücut durumunda hafif bir azalma gibi başlangıç ​​belirtileri gösterirken, diğerleri, kendiliğinden kaşıma gibi ileri klinik belirtiler gösterdi. kuyruk kökü, bel bölgesi ve uzuvlar, ataksi ve kafa titremeleri dahil nörolojik belirtiler ve diş gıcırdatması, yün kaybı ve yoğun kilo kaybı [84].

4.2. Tg338 Fare Enfeksiyonu

Bir scrapie fare modelinin beynindeki TLR gen ekspresyonlarını değerlendirmek için, on haftalık tg338 fareleri (n=8) (koyun VRQ/VRQ PrPC 8- ila 10-katını aşırı eksprese eden [ 85]), klinik aşamada kurban edilen doğal scrapie ile enfekte Rasa Aragonesa koyunundan alınan beyin havuzuyla aşılandı.

Fareler, izofluran anestezisi altında sağ serebral yarıküreye 20 uL scrapie aşısı (PBS içinde %2 a/h seyreltilmiş) ile aşılandı. İntraserebral enjeksiyonlar 50 µL'lik bir şırınga ve 25G'lik bir iğne kullanılarak yapıldı. Aşılamadan sonra farelere analjezi sağlamak için deri altı buprenorfin (0.3 mg/kg) enjeksiyonu uygulandı.

Kontroller olarak, tg338 fareleri (n=8), yukarıda açıklanan prosedürün aynısı izlenerek scrapie negatif bir koyundan elde edilen beyin homojenatı ile aşılandı. Fareler klinik belirtilerin gelişimi açısından izlendi ve ciddi ataksi ve beslenememe gibi hastalığın son belirtileri ortaya çıktığında servikal dislokasyonla ötenazi uygulandı.

Scrapie pozitif aşıyla enfekte edilen farelerde ortalama 187 ± 26 dpi'lik bir hayatta kalma süresi sergilendi.

4.3. Doku Koleksiyonu

CNS'den örnekler toplandı ve sagittal olarak iki yarıya bölündü; biri histopatolojik ve immünohistokimyasal analiz için %10 nötr tamponlu formalinde sabitlendi ve diğeri doğrudan donduruldu ve protein analizi için -80 ◦C'de tutuldu veya RNA ekstraksiyonu için RNAlaterTM Solüsyonu (InvitrogenTM, Waltham, MA, ABD) içerisinde stabilize edildi ve ardından dondurularak saklandı. −80 ◦C'de.

4.4. PRNP Sıralaması

Üreticinin talimatlarına göre Speedtools Doku DNA Ekstraksiyon kiti (Biotools, Madrid, İspanya) kullanılarak kan örneklerinden DNA ekstrakte edildi. PCR amplifikasyonu ve dizilimi daha önce anlatıldığı gibi yapıldı [82].

4.5. İmmünohistokimya

Formalinle sabitlenmiş dokular standart histopatolojik prosedürlere göre işlendi. Doku kesitleri parafine gömüldü, 4 µm kalınlığında kesitler halinde kesildi ve vakuolasyon ve nöropil spongiyozun değerlendirilmesi için hematoksilen-eozin (HE) ile boyandı.

PrPSc tespiti için IHC, koyunlarda fare monoklonal primer antikoru L42 (30 dakika boyunca oda sıcaklığında 1:500 seyreltme) (R-Biopharm, Darmstadt, Almanya) ve farelerde tavşan poliklonal antikoru R486 kullanılarak gerçekleştirildi (1: 8000 seyreltme, gece boyunca 4 °C'de)(R. Jackman, yayınlanmamış) daha önce açıklandığı gibi [86,87].

Kesitler ayrıca astrosit işaretleyici glial fibriler asidik protein (GFAP) (1:500; Dako, Glostrup, Danimarka) ve mikroglia işaretleyici iyonize kalsiyum bağlama adaptör molekülü 1 (Iba1) (1:1000; Wako, Richmond) için geleneksel immün boyamaya da tabi tutuldu. , VA, ABD), yayınlanmış protokollere göre [88]. Tüm histolojik ve IHC değerlendirmeleri, klinik verilere kör olan iki veteriner patolog tarafından gerçekleştirildi.

Spongioz ve PrPSc boyama yoğunluğunun değerlendirilmesi yarı kantitatif olarak gerçekleştirildi ve önceki çalışmalarda açıklanan kriterleri takip ederek uyarlandı: nöropil ve perikaryanın vakuolasyonu 0 (yok) ila 5 (çok sayıda ve birleşik) arasında puanlandı [51], PrPSc sinyali, daha önce bildirildiği gibi 0 (etiketleme yok) ile 5 (yoğun tek biçimli etiketleme) arasında immün boyamanın kapsamına dayalı olarak ölçüldü [89] ve GFAP ve Iba1 immün etiketlemenin kapsamı, {{ 8}} ila 5 (0=zayıf boyama; 5=bölge genelinde önemli immün etiketleme) [88]. Dört beyin bölgesi değerlendirildi: frontal korteks (Fc), talamus (Th), hipokampal formasyon (Hc) ve medulla oblongata (Mo) ve her alan, puanlama için global olarak analiz edildi ve grafiksel olarak ortalama ± standart hata olarak temsil edildi.

4.6. Batı Lekesi

Scrapie ile enfekte olmuş 13 koyundan (8'i ileri klinik belirtilere sahip ve 5'i yeni başlayan klinik belirtilere sahip) her beyin alanından (Fc, Th, Hc ve Mo) 100 mg beyin dokusu, 1 mL lizis tamponunda homojenleştirildi.

Enfekte olmuş 8 farenin ve 8 kontrol faresinin hemensefalonları, liziz tamponunda %10 (a/h) oranında homojenleştirildi. Doku örnekleri, bir TeSeEPrecess 48 TM homojenleştirici (Bio-Rad, Hercules, CA, ABD) kullanılarak öğütme tüpleri (Bio-Rad, Hercules, CA, ABD) homojenize edildi ve protein konsantrasyonu, PierceTM BCA Protein Test kiti (ThermoScientificTM, Waltham, MA, ABD) üreticinin talimatlarına göre.

PrPres analizi için, doku homojenatlarından eşit protein miktarları, daha önce açıklandığı gibi [90] proteinaz K çözeltisi ile 37 °C'de 10 dakika süreyle inkübe edildi.

Elde edilen numuneler %12 CriterionTM XT Bis-Tris Protein Jel (Bio-Rad, Hercules, CA, ABD) içerisinde elektroforeze tabi tutuldu ve TBST'de (Tris-Tris-Tris) %2 yağsız kuru süt ile 1 saat süreyle bloke edilen PVDF membranlara aktarıldı. 0.1% Tween20 ile tamponlanmış salin.

İmmünoblotlama için membranlar, 1 µg/mL konsantrasyonda Sha31 primer antikoru (SPI-Bio, Montigny-le-Bretonneux, Fransa) ile gece boyunca 4 °C'de inkübe edildi, ardından yaban turpu peroksidazı ile oda sıcaklığında (RT) 1 saat inkübasyon yapıldı. konjuge anti-fare IgG ikincil antikoru (1:5000) (Santa Cruz Bioteknoloji, Dallas, TX, ABD).

İmmünoreaktivite, kemilüminesan substrat ImmobilonCrescendo Western HRP (Merck, Darmstadt, Almanya) kullanılarak tespit edildi. TLR4 protein ekspresyonu, üreticinin talimatlarına göre 2xLaemmli Numune tamponu (Bio-Rad, Hercules, CA, ABD) ile karıştırılmış doku homojenatlarından analiz edildi. .

Kuyu başına kırk mikrogram toplam protein yüklendi, %7,5 CriterionTM TGXTM Precast Midi Protein Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, ABD) içerisinde çalıştırıldı ve PVDF membranlarına aktarıldı; bunlar daha sonra %4 sığır serum albümini ile 2 saat süreyle bloke edildi. (BSA)(Merck, Darmstadt, Almanya) TBST'de RT'de. Membranlar, 0,5 µg/mL konsantrasyonda tavşan poliklonal anti-TLR4 antikoru (Novus Biological, Minneapolis, MN, ABD) ile gece boyunca 4 °C'de inkübe edildi ve daha sonra yıkandı ve keçi anti-tavşan IgG () ile inkübe edildi. H + L) HRP sekonder antikoru (ThermoScientificTM, Waltham, MA, ABD), 1:20'de,000 1 saat süreyle oda sıcaklığında.

Lekeler yukarıda açıklandığı gibi görselleştirildi. Daha sonra membranlar RestoreTM Western Blot Stripping buffer (ThermoScientificTM, Waltham, MA, ABD) ile 37 ◦C'de 15 dakika boyunca sıyrıldı, yıkandı ve tekrar bloke edildi.

Daha sonra, membranlar gece boyunca 4 °C'de fare monoklonal -aktin primer antikoru (Santa Cruz Bioteknoloji, Dallas, TX, ABD) ile 1:1000'de inkübe edildi, yıkandı ve anti-fare m-IgGкBP-HRP sekonder antikoru (Santa Cruz) ile inkübe edildi. Biyoteknoloji, Dallas, TX, ABD) 1 saat süreyle. Yıkamadan sonra lekeler yukarıda anlatıldığı gibi geliştirildi.

ImageJ yazılımıyla dansitometriler yapıldı ve değerler -actin kullanılarak normalleştirildi. Normalleştirilmiş değerler GraphPad Prism 6.0 (SanDiego, CA, ABD) ile temsil edildi.

Enfekte olan ve kontrol gruplarını karşılaştırmaya yönelik istatistiksel analizler, Öğrenci t testi ile gerçekleştirildi ve varyansların eşitliği, SPSS yazılımı (SPSS İstatistikleri Windows, Sürüm 17.0, Chicago, Chicago, ABD) kullanılarak Levene testi ile belirlendi. IL, ABD). Gruplar arasındaki farklar * p'de istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.<0.05.

4.7. RNA Ekstraksiyonu, cDNA Sentezi ve Gen İfadesi

Koyun toplam RNA'sı, frontal korteks, talamus, hipokampus ve medulla oblongata'dan alınan 90 mg doku örneğinden ekstre edildi. Fare beyinleri orta hattan bölündü ve toplam RNA bundan çıkarıldı.<90 mg obtained from the thalamic area. 

Dokular, olası genomik DNA kontaminasyonunu ortadan kaldırmak için TURBO DNase (Invitrogen TM, Waltham, MA, ABD) ile birleştirilmiş RNeasy LipidTissue Mini Kiti (Qiagen, Hilden, Almanya) içeren bir TeSeEPrecess 48TM homojenleştirici (Bio-Rad) kullanılarak homojenleştirildi. RNA konsantrasyonu, bir NanoDrop spektrofotometre (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ABD) kullanılarak spektrofotometrik olarak belirlendi ve her numune için, numune saflığını doğrulamak üzere 260/280 ve 260/230 oranları analiz edildi.

Üreticinin talimatlarına göre qScriptTM cDNA SuperMix (Quantabio BiosciencesTM, Beverly, MA, ABD) kullanılarak bir mikrogram tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezlendi. Ek olarak RT-negatif numunelerde DNaz tedavisinin etkinliği değerlendirildi. Ters transkripsiyondan sonra, aynı seyreltilmiş cDNA grubu, TLR'leri amplifiye etmek için qPCR'ye tabi tutuldu.

Hedef genlerin ekspresyonunu normalleştirmek için yaygın olarak kullanılan iki temizlik (HK) geni seçildi: gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH) ve aktin-beta (ACT) [91]. Bu HK geninin stabilitesi deneysel koşullarımız altında doğrulandı. Haberci RNA (mRNA) ekspresyonu, 1 ila 10 koyun TLR geni, 1 ila 9 fare TLR geni ve her iki tür için MyD88 geni için qPCR ile belirlendi.

İki proinflamatuar (TNF- ve IL-6) ve iki anti-inflamatuar (IL-10 ve TGF-) sitokin de koyun talamusu ve hipokampusunda incelenmiştir. Primer dizileri ve verimlilikleri daha önce yayınlanmış veya Primer3Plus aracı kullanılarak tasarlanmıştı [92](Tablo 2).

Kontrol cDNA'sının 1:2 seri seyreltmelerini yükselterek ve ardından başlangıç ​​şablonu konsantrasyonu ile döngü eşiği (Ct) değerleri arasındaki doğrusallığı kontrol ederek standart bir eğri oluşturan her genin verimliliğini doğruladık. Tüm genler, 0,9 ile 0,99 arasında bir korelasyon katsayısı gösterdi; standart eğrilerin eğim değeri -3,2 ila -3,5 aralığındaydı ve qPCR verimliliği %90-110'du.

qPCR reaksiyonları, Applied BiosystemsTM QuantStudioTM 5 RealTime PCR Sistemi kullanılarak, 96-evrensel amplifikasyon koşullarıyla birlikte gerçekleştirildi: 95 ◦C'de 10 dakikalık bir başlangıç ​​aktivasyonu ve cDNA denatürasyon adımı, ardından 95 ◦C'de 3 saniyelik 40 döngü ve 30 60 ◦C'de gerçekleşti.

Spesifik olmayan PCR amplikonlarının veya yüksek düzeyde primerdimerlerin varlığını belirlemek için her qPCR reaksiyonundan sonra bir ayrışma eğrisi protokolü gerçekleştirdik. Her numune, 15 ng cDNA, 5 µL Fast SYBR Green Master Mix (2X) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ABD) ve gerekli miktarda ileri ve geri hareketten oluşan toplam 10 µL reaksiyon hacminde üç kopya halinde analiz edildi. primerler (Tablo 2).

10 uL'lik son hacme kadar nükleaz içermeyen su eklendi. Gen ekspresyonu seviyeleri karşılaştırmalı Ct yöntemi kullanılarak belirlendi. Sonuçlar kat değişimi olarak temsil edildi ve kontrol grubunun ortalama seviyesine göre gen ekspresyonu farklılıkları 1'e ölçeklendi.

4.8. Veri Analizi ve İstatistik

Toplanan tüm niceliksel veriler Shapiro-Wilk Wtest ile normallik açısından test edildi. Enfekte ve kontrol grupları arasındaki histolojik ve immünohistokimyasal farklılıklar, parametrik veya parametrik olmayan veri dağılımına bağlı olarak Öğrenci t testi veya Mann-Whitney U testi kullanılarak değerlendirildi.

Scrapie ile enfekte koyunlarda dört farklı beyin bölgesi arasındaki istatistiksel farklar, parametrik veya parametrik olmayan veri dağılımına bağlı olarak tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından bir Bonferroni post hoc testi veya Kruskal-Wallis testi kullanılarak belirlendi. QPCR verilerinin istatistiksel analizleri, her gen için ortalama ∆Ct değerlerinden yapıldı.

Enfekte ve kontrol gruplarının istatistiksel karşılaştırması için, her genin normal dağılımına bağlı olarak bir Öğrenci t testi veya Mann-Whitney U testi yapıldı ve varyansların eşitliği bir Levene testi ile belirlendi. İfadedeki farklılıkların p < 0.05'te anlamlı olduğu kabul edildi.

Şekillerdeki p-değerlerini belirtmek için aşağıdaki gösterimler kullanılmıştır: * p < 0.05; ** p Küçük veya eşittir 0.01; # p < 0.1. İstatistiksel analizlerde SPSS (SPSS İstatistikleri for Windows, Versiyon 17.0, Chicago, IL, ABD) yazılımı kullanıldı. Grafikler GraphPad Prism 6.0 (San Diego, CA, ABD) ile oluşturulmuştur ve şekillerde gösterilen veriler ortalamayı ve ortalamanın standart hatasını (ortalama ± SEM) temsil etmektedir.

5. Sonuçlar

Bildiğimiz kadarıyla bu çalışma, doğal scrapie ile enfekte olmuş koyunların ve deneysel olarak scrapie ile enfekte edilmiş büyük boy tg338 farelerin farklı beyin bölgelerinde TLRgenlerinin ekspresyon seviyelerini tanımlayan ilk çalışmadır.

Çalışmamız, TLR'lerin ve özellikle koyunlarda TLR4'ün ve farelerde TLR1 ve TLR2'nin scrapie patogenezinde rol oynadığını açıkça göstermektedir. Ayrıca, incelenen diğer tüm bölgelerden farklı olarak, benzersiz mikroglial morfoloji ile birlikte TLR gen ekspresyonunun ayırt edici profili de ortaya çıkmıştır. ve hipokampusta gözlemlenen hafif nöropatoloji, doğal scrapie enfeksiyonunda beyin bölgesine özgü bir bağışıklık tepkisi olduğunu düşündürmektedir.

Bununla birlikte, her hücre tipinin nöroinflamasyona kesin katkısını anlamak için mikroglia, astroglia ve scrapie enfeksiyonundaki nöronlardaki TLR ekspresyonunu karakterize etmek için daha ileri çalışmalara ihtiyaç duyulacaktır. Ayrıca TLR aktivasyonunun prion toksisitesine doğrudan bir yanıt mı olduğu yoksa diğer inflamatuar mekanizmalara ikincil olarak mı meydana geldiği henüz belirlenmemiştir.

TLR'ler, prion hastalıklarına yönelik terapötik yaklaşımlar için umut verici bir hedef oluşturur ve bu nedenle, bu alanda daha fazla ilerleme sağlamak için TLR tarafından düzenlenen nöroinflamatuar yanıtların daha iyi anlaşılmasına ihtiyaç duyulacaktır.

Ek Malzemeler: Aşağıdakiler çevrimiçi olarak şu adreste mevcuttur:https://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms23073579/s1.

Yazar Katkıları: Kavramsallaştırma, araştırma ve veri iyileştirme, MCG ve LMC; yazı-orijinal taslak hazırlama, MG-M., MCG ve LMC; deneysel metodoloji, MG-M.;yazma-inceleme ve düzenleme, MG-M., MCG, LMC ve AO; in vivo metodoloji, MB; finansman satın alma, RB ve JJB; moleküler metodoloji, BS-P.; denetim, MCG ve JJB Tüm yazarlar yazının yayınlanmış versiyonunu okudu ve kabul etti.

Finansman: Bu araştırma "A05_20R: Enfermedades Priónicas, Vectoriales y Zoonosis Emergentes" projesi aracılığıyla "Departamento de Ciencia, Universidad y Sociedad delConocimiento" (Aragon Hükümeti) tarafından finanse edildi.

Kurumsal İnceleme Kurulu Beyanı: Hayvanları içeren tüm prosedürler, İspanyol Hayvanları Koruma Yasası RD53/2013 ve deneysel amaçlarla kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin Avrupa Birliği Direktifi 2010/63'te yer alan yönergelere uymuştur. Protokol, Zaragoza Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etiği Komitesi tarafından onaylandı (İzin Numarası: PI38/159 Ekim 2015 ve PI19/14 11 Nisan 2014).

Bilgilendirilmiş Onam Beyanı: Geçerli değil.

Veri Kullanılabilirliği Beyanı: Bu çalışmada sunulan veriler makale metni, şekiller ve ek materyal içerisinde mevcuttur.

Teşekkür: Bu deneyler için kullanılan tg338 farelerini sağlama nezaketini gösteren Olivier Andreoletti'ye (UMR INRAEENVT 1225-IHAP) ve VincentBeringue'ye (UMR VirologieImmunologieMoleculaires (VIM-UR892), INRAE, Universite Paris-Saclay) teşekkür ederiz.

Çıkar Çatışmaları: Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir. Fon sağlayıcıların çalışmanın tasarımında hiçbir rolü yoktu; verilerin toplanmasında, analiz edilmesinde veya yorumlanmasında; Makalenin yazılmasında veya sonuçların yayınlanması kararında. Bu yazıdaki resim ve şekiller orijinal verilerdir.

Referanslar

1. Andreoletti, O.; Berthon, P.; Marc, D.; Sarradin, P.; Grosclaude, J.; van Keulen, L.; Schelcher, F.; Elsen, JM; Lantier, F. Naturalscrapie'li bir Romanov sürüsünden duyarlı koyunların bağırsakla ilişkili lenfoid ve sinir dokularında PrP(Sc)'nin erken birikimi. J. Gen. Virol. 2000, 81 Bölüm 12, 3115–3126. [CrossRef] [PubMed]

2. Prusiner, SB Prion hastalıkları ve BSE krizi. Bilim 1997, 278, 245–251. [CrossRef] [PubMed]

3. McBride, Pensilvanya; Schulz-Schaeffer, WJ; Donaldson, M.; Bruce, M.; Diringer, H.; Kretzschmar, HA; Beekes, M. Scrapie'nin gastrointestinal sistemden merkezi sinir sistemine erken yayılması, splanknik ve vagus sinirlerinin otonomik liflerini içerir.J. Virol. 2001, 75, 9320–9327. [ÇaprazRef]

4. Mabbott, NA; MacPherson, GG Prionlar ve beyne giden ölümcül yolculukları. Nat. Rev. Mikrobiyol. 2006, 4, 201–211. [ÇaprazRef]

5. Wemheuer, WM; Benestad, SL; Wrede, A.; Wemheuer, BİZ; Brenig, B.; Bratberg, B.; Schulz-Schaeffer, WJ PrPSc farklı prion türleriyle bağlantılı koyunların beynindeki desenleri yayıyor. Veteriner. Res. 2011, 42, 32. [CrossRef]

6. Betmouni, S.; Perry, VH; Gordon, JL Scrapie ile farelerin merkezi sinir sisteminde erken bir inflamatuar yanıtın kanıtı. Sinirbilim 1996, 74, 1–5. [ÇaprazRef]

7. Sandberg, MK; Al-Doujaily, H.; Sharps, B.; De Oliveira, MW; Schmidt, C.; Richard-Londt, A.; Lyall, S.; Linehan, JM; Brandner,S.; Wadsworth, JD; ve ark. Prion nöropatolojisi, enfektif titre zirveye ulaştıktan sonra alternatif prion protein izoformlarının birikmesini takip eder. Nat. İletişim 2014, 5, 4347. [CrossRef]

8. Vincenti, JE; Murphy, L.; Grabert, K.; McColl, BW; Cancellotti, E.; Freeman, TC; Manson, JC Kronik Nörodejenerasyonun Zaman Sürecinde Mikroglia Tepkisinin Tanımlanması. J. Virol. 2015, 90, 3003–3017. [ÇaprazRef]

9. Aguzzi, A.; Zhu, C. Prion hastalıklarında Microglia. J. Clin. Araştır. 2017, 127, 3230–3239. [ÇaprazRef]

10. Obst, J.; Simon, E.; Mancuso, R.; Gomez-Nicola, D. Prion Hastalıklarında Mikroglia'nın Rolü: Fonksiyonel Çeşitlilik Paradigması. Ön. Yaşlanma Nörobilimi. 2017, 9, 207. [CrossRef]

11. Lawson, LJ; Perry, VH; Dri, P.; Gordon, S. Normal yetişkin fare beynindeki mikroglia'nın dağılımı ve morfolojisindeki heterojenlik. Sinirbilim 1990, 39, 151–170. [ÇaprazRef]

12. Matyash, V.; Kettenmann, H. Astrosit morfolojisi ve fizyolojisinde heterojenlik. Beyin Arş. Rev. 2010, 63, 2–10. [CrossRef][PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com