Cistanche: Ekinakozit, Mitojenle Etkinleştirilen Protein Kinaz Yolu Yoluyla Apoptozu İndükleyerek Pankreatik Adenokarsinom Hücre Büyümesini Bastırır

İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com

WEI WANG, JINBIN LUO, YINGHUI LIANG ve XINFENG LI

Soyut.

Geleneksel Çin tıbbından elde edilen doğal ürünlerin klinik uygulaması, kanser kemoterapötiklerinde dikkat çekmiştir.Ekinakozit(ECH), feniletanoidlerden biri olup,cistanche(bir Çin bitkisel ilacı) merkezi sinir sistemi üzerinde doku koruyucu ve anti-apoptotik etkilere sahiptir. Bununla birlikte, ECH'nin tümör baskılayıcı aktiviteye sahip olup olmadığı büyük ölçüde belirsizliğini koruyor. Bu çalışmada, ECH'nin reaktif oksijen türlerinin üretimini ve mitokondriyal membran potansiyelinin bozulmasını indükleyerek ve böylece apoptozu tetikleyerek pankreas adenokarsinom hücrelerinin proliferasyonunu belirgin şekilde engelleyebildiği gösterilmiştir. Ayrıca, ECH'nin(Ekinakozit)MAPK aktivitesini modüle ederek tümör hücresi büyümesini baskılar. Sonuç olarak, bu çalışma ECH'nin yeni bir işlevini ortaya koymaktadır(Ekinakozit) kanser gelişimini önlemede ve ECH kullanımının kanser için potansiyel bir kemoterapötik strateji olabileceğini ima eder.

giriiş

Tümör baskılayıcının uyarılması yoluyla p53 tümör baskılayıcı yol, ARF onkojenik E3-ligaz fare çift dakika (MDM)2-aracılı p53 bozulmasını azaltır (3). Bu, hücrelerin habis dönüşümden korunmasını sağlayan, otomatik olarak düzenlenen, kendini koruyan bir mekanizmadır. Özellikle p53, transkripsiyonel olarak aktive ederek Myc aktivitesini baskılayabilir, örneğin miR-145Benim Cçeviri susturma (4,5) için mRNA, böylece negatif bir geri besleme düzenleyici döngü oluşturur.

Kanseri tedavi etmenin en basit ve etkili stratejisi kanserli hücreleri öldürmektir. Sisplatin (6), aktinomisin D (7) ve adriamisin (8) gibi yaygın olarak kullanılan antikanser ilaçlarının, apoptozu teşvik ederek tümör büyümesini engellediği gösterilmiştir. Son zamanlarda, artan kanıtlar, bitkilerden, özellikle geleneksel Çin tıbbında (TCM) kullanılan tıbbi bitkilerden elde edilen bir dizi doğal ürün ve türevin, kanser hücrelerinin apoptozunu indükleyerek tümör baskılayıcı bir işlev sergilediğini ve klinik uygulama potansiyeline sahip olduğunu göstermiştir. kanser tedavisinde (9). Örneğin, doğal antrakinon emodin, çok sayıda kanser hücresinden izole edilir (10,11). Çin'deki 'mutlu ağaçtan' türetilen kamptotesin,kamptoteka keskinleştirmek, topo I aracılı iplik kopmalarını takiben DNA ligasyonunu engelleyen değerli bir doğal üründür (12). İlerlemiş meme kanserli toplam 729 hastayı içeren bir başka geriye dönük popülasyona dayalı kohort çalışmasında, TCM tedavisinin kanser tedavisine katkıda bulunabileceği öne sürülmüştür. Bu kohortun 115'i TCM kullanıcısıydı, 614'ü TCM kullanmıyordu. Çok değişkenli analiz, kullanıcı olmayanlara kıyasla, TCM kullanımının tüm nedenlere bağlı ölüm riskini önemli ölçüde azalttığını göstermiştir (13). Yukarıda bahsedilen tüm bulgular, TCM'nin kanser tedavisinde kullanılabilecek önemli bir tamamlayıcı ve alternatif ilaç olduğunu göstermiştir.

akut akciğer hasarı olan fareler (16,17). Ayrıca, ECH(Ekinakozit)Parkinson hastalığının murin modellerinde sinir dokusu üzerinde koruyucu etkileri olduğu ve davranış bozukluklarını iyileştirdiği gösterilmiştir (18). Özellikle, ECH'nin fare bağırsak epitelyal MODE-K hücrelerinde hücre proliferasyonunu desteklediği ve apoptozu inhibe ettiği bulunmuştur (19). Ancak şimdiye kadar, kanser önlemede ECH'nin potansiyel rolüne daha az ilgi gösterildi.

Bu çalışmada ECH tedavisinin tümör hücre büyümesini ve proliferasyonunu etkileyip etkilemediği ve ECH tedavisinin ECH tedavisinin tümör hücre büyümesini ve proliferasyonunu etkileyip etkilemediği araştırılmıştır.(Ekinakozit)apoptozu indükler, reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini yükseltir ve mitokondriyal membran potansiyelini (MMP) azaltır ve sonuç olarak tümör hücresi büyümesini baskılar. Ayrıca, bu çalışma, ECH aracılı hücre büyümesi inhibisyonundan sorumlu moleküler mekanizmaları tanımlamayı amaçladı.

Malzemeler ve yöntemler

Hücre astar, reaktif ve antikorlar.SW1990 pankreas adenokarsinom hücreleri (ATCC, Manassas, VA, ABD), yüzde 10 fetal sığır serumu, 50 U/ml penisilin ve 0.1 mg/ml streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında 37°C'de bir ortamda kültürlendi. Yüzde 5 CO2 ile nemlendirilmiş atmosfer. ECH(Ekinakozit)Jrdun Biotechnology Corp.'tan (Shanghai, China) satın alındı. AKT, P-AKT, ERK, P-ERK, JNK, p-JNK, P38, p-P38 ve GAPDH'ye karşı antikorlar, Cell Signaling Technology'den (Danvers, MA, ABD) satın alındı; anti-Bax ve anti-Bcl-2, Santa Cruz Biotechnology Inc.'den (Santa Cruz, CA, ABD) satın alındı; ve Caspase karşıtı-3 Abcam'dan (Şanghay, Çin) satın alındı.

Hücre canlılıktahlil. Tümör hücresi büyüme oranını değerlendirmek için, üreticinin talimatlarına göre Hücre Sayım kiti{{0}} (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, ABD) kullanıldı. Hücre süspansiyonları, 96 -yuvalı kültür plakalarında 0, 12, 24, 48 veya 72 saat boyunca ECH işlemi ile oyuk başına 5,000 hücrede tohumlandı. Hücre büyümesi inhibisyonu, CCK‑8 kitinden WST-8 reaktifinin her kuyuya yüzde 10'luk bir nihai konsantrasyonda eklenmesiyle belirlendi ve numunelerin absorbansı bir mikroplaka okuyucu (Multiskan MK3; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, ABD).

Hoechst 33342 boyama.Hücreler (yüzde 60 izdiham) Hoechst 33342 (Beyotime Biyoteknoloji Enstitüsü, Haimen, Çin) ile 1'lik son konsantrasyonda işlendi.µg/ml, 37°C inkübatörde 15 dakika inkübe edildi, iki kez fosfat tamponlu salin ile yıkandı, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yüzde 4 paraformaldehit içinde sabitlendi ve slaytlara monte edildi. Hücre çekirdeklerinin morfolojik değişiklikleri bir floresan mikroskobu (Olympus BX51, Melville, NY, ABD) altında gözlemlendi. Normal çekirdekler yuvarlak ve açık mavi renkteyken, apoptotik çekirdekler küçülmüş ve parlak mavi renkte boyanmıştır.

Floresan etkinleştirilmiş hücre sıralama (FACS) analizler.Apoptoz değerlendirmesi için, üreticinin talimatlarına göre floresan izotiyosiyanat (FITC)-Annexin V Apoptosis Detection kiti (BD Biosciences, Şangay, Çin) kullanıldı. Kısaca, 5x104 hücre buz gibi soğuk PBS ile yıkandı, 0.1 ml bağlama tamponu (Beyotime Biyoteknoloji Enstitüsü) içinde yeniden süspanse edildi ve 10 ml FITC-konjuge Annexin V (10 mg/ml) ve 10 ml ile boyandı. ml propidyum iyodür (PI) (50 mg/ml). Karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübasyonun ve 400 ml bağlama tamponunun eklenmesinin ardından hücreler bir akış sitometresi (C6; BD Biosciences, Şanghay, Çin) ile analiz edildi.

Ölçüm nın-nin reaktif oksijen Türler (ROS).ROS üretimini değerlendirmek için üreticinin talimatlarına göre Reaktif Oksijen Türleri Test kiti (Vigorous Biotechnology, Beijing, China) kullanıldı. Kısaca, hücreler (yüzde 80 izdiham) toplandı ve dihidroetidyum (DHE) çözeltisi (Beyotime Biyoteknoloji Enstitüsü) ile boyamadan önce PBS ile yıkandı. Hücreler daha sonra akış sitometrik analizleri ile analiz edildi.

Ölçüm nın-nin mitokondriyal zar potansiyel (MMP).

MMP'deki değişiklikleri saptamak için bir tetrametilrodamin metil ester (TMRM) Test kiti (ImmunoChemistry Technologies, Bloomington, MN, ABD) kullanıldı. Kısaca, hücreler (yüzde 80 izdiham) toplandı, PBS ile yıkandı ve 37°C'lik bir inkübatörde 15-20 dakika boyunca TMRM ile boyandı. Hücreler daha sonra bir kez PBS ile yıkandı ve akış sitometrik analizlerine tabi tutuldu.

immünoblotlamaanalizler. Hücreler (yüzde 80 izdiham) toplandı ve 50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, yüzde 1 NP‑40, yüzde 1 sodyum deoksikolik asit ve yüzde 0.1 SDS ve yeni eklenen proteazom inhibitörleri. Daha önce tarif edildiği gibi immünoblotlama analizi için eşit miktarlarda berrak hücre lizatı kullanıldı (20).

istatistiksel analiz.Nicel veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edilir. İstatistiksel farklılıklar, istatistiksel SPSS 15.0 yazılımı kullanılarak eşleştirilmemiş Student t testi ile değerlendirildi. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Sonuçlar

ECH (Ekinakozit)bastırır tümör hücrebüyüme. ECH olduğu bildirilse de(Ekinakozit)nöronal ve bağırsak epitel hücreleri (16-19) gibi somatik hücrelerde apoptozu ve enflamatuar sinyalleri inhibe ederek koruyucu bir rol sergiler, ECH'nin kanserli hücre büyümesini ve proliferasyonunu kontrol edip etmediği belirsizliğini korur. Bunu test etmek için, derece II pankreas adenokarsinomundan türetilen SW1990 hücrelerinin, Şekil 1'de gösterildiği gibi titre edilmiş ECH dozları ile tedavi edilmesiyle bir hücre hayatta kalma tahlili yapıldı. Özellikle, ECH'nin bir dozda tümör hücresi proliferasyonunu önemli ölçüde geciktirdiği gösterildi. 5-günlük bir kültür periyodu boyunca bağımlı bir şekilde (Şekil 1).ECH tetikleyicilerapoptoz. Apoptoz kaybı, pankreas kanseri hücrelerinin kontrolsüz çoğalmasının altında yatan başlıca nedensel mekanizmalardan biri olduğundan (21) bu çalışma, ECH'nin apoptozu tetikleyip tetiklemediğini belirlemek için bir dizi deney gerçekleştirdi. İlk olarak, tümör hücrelerinin çekirdeklerinin Hoechst 33342 ile boyanmasıyla, ECH'nin doza bağlı bir şekilde apoptoz ile sonuçlandığı gösterilmiştir (Şekil 2A). Ek olarak, ty ECH'nin apoptotik etkisini daha fazla doğrulamak için Annexin V/PI boyaması kullanılarak FACS analizleri yapıldı (Şekil 2B). Apoptotik hücrelerin ortalama yüzdesi, normal kültür koşulları altında yüzde 1.1 iken, bu yüzde, doza bağlı bir şekilde ECH tedavisine yanıt olarak önemli ölçüde yüzde 10.6, 21.4 ve 51,3'e yükseldi (Şekil 2C). Bu sonuçlar, Şekil l'de gösterilen hücre canlılığı tahlili ile birlikte, ECH tedavisinin apoptozu tetikleyerek tümör hücrelerinin proliferasyonunu baskıladığını gösterir.

ROS üretimini değerlendirmek için bu çalışmada DNA ile interkalasyon yapan etidyum üretmek kullanıldı. Diğer antikanser ilaçları gibi, ECH'nin de, ECH tedavisi üzerine artan floresan yoğunluğunun gösterdiği gibi, doza bağlı bir şekilde ROS üretimini uyardığı bulundu (Şekil 3).

ECH (Ekinakozit)azaltır MMP.Mitokondriyal disfonksiyonun apoptoz indüksiyonunda rol oynadığı gösterilmiştir. Mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin açılmasının, transmembran potansiyelinin depolarizasyonunu ve proapoptotik faktörlerin salınımını indüklediği gösterilmiştir (23). Bu nedenle, TMRM floresansının yoğunluğu membran potansiyeli ile orantılı olduğundan, iyi bilinen bir yaklaşım olan bir TMRM tahlili gerçekleştirilerek ECH'nin tümör hücrelerinde MMP kaybını indükleyip indükleyemeyeceği test edildi. ECH tedavisinin doza bağlı bir şekilde MMP'yi önemli ölçüde azalttığı gösterilmiştir (Şekil 4).ECH kontroller tümör hücre büyüme aracılığıyla mitojenle aktive olan proteinECH aracılı tümör hücresi ölümünün moleküler temeli, hücre hayatta kalmasını ve ölümünü kontrol eden MAPK ve AKT (24,25) gibi birkaç hayati sinyal yolunun aktivitesi incelenmiştir. MAPK'ler, hücre dışı sinyalle düzenlenen kinazlar (ERK'ler), c-Jun NH2-terminal kinaz (JNK'ler) ve üç aracılığıyla aktive edilen p38 ailesi üyeleri dahil olmak üzere evrimsel olarak korunmuş, prolin yönelimli Ser/Thr protein kinazlarıdır. katmanlı kinaz sinyalleşme basamakları (26,27). Bu çalışmada, MAPK'lerin ve AKT'nin ekspresyonu ve bunların aktive fosforile formları değerlendirildi ve ECH'nin JNK ve ERK1/2 aktivitesini belirgin şekilde baskıladığı, ancak p38 aktivitesini arttırdığı ortaya çıktı (Şekil 5). Özellikle hücre proliferasyonu için kritik öneme sahip olan AKT aktivitesinin ECH tedavisinden etkilenmediği gösterilmiştir (Şekil 5). Ek olarak, ECH tedavisinin, Şekil 2 ile tutarlı olan Bcl-2 ifadesini azaltırken (Şekil 5) Bax ve Kaspaz-3 ifadesini yükselttiği gösterilmiştir. ECH, MAPK yolu yoluyla tümör hücresi apoptozunu tetikler.

Tartışma

Bildiğimiz kadarıyla, bu, ECH'nin apoptozu tetikleyerek (Şekil 2), ROS üretimini teşvik ederek (Şekil 3) ve mitokondriyal membran potansiyel depolarizasyonunu indükleyerek (Şekil 4) tümör baskılayıcı bir işleve sahip olduğunu gösteren ilk çalışmadır. , sonuç olarak tümör hücresi büyümesinin inhibisyonuna yol açar (Şekil 1). Ayrıca, ECH aracılı tümör hücresi ölümünün moleküler temelinin, MAPK sinyal yolaklarını düzenleyerek meydana geldiği gösterilmiştir (Şekil 5). Bu bulgular, ECH'nin tümör oluşumunu önlemede yeni bir işlevi olduğunu göstermektedir ve bu nedenle kanser tedavisi için aday bir ajan olabileceğini düşündürmektedir.

Antikanser ilaçların çoğu, tümör hücresi apoptozunu, yaşlanmasını ve/veya hücre döngüsü durmasını indükleyebilir, bu da tümör hücresi büyümesi ve çoğalmasının inhibisyonuna yol açar. Hücre döngüsü durması, replikatif DNA sentezi veya mitoz başlatmadan önce hücrelerin hasarlı DNA'yı onarmasına izin veren hafif stres sinyallerine hücresel bir yanıttır, oysa apoptoz ve yaşlanma (kalıcı hücre döngüsü durması) onarılamaz veya kötü huylu hücreleri ortadan kaldıran stres sinyallerine yanıt olarak meydana gelir. 28,29). Bu nedenle, kanserli hücrelerin öldürülmesi bir antikanser ajanının potensinin değerlendirilmesinde önemli bir kriter olduğundan, bu çalışmada sadece ECH'nin tümör hücreleri üzerindeki apoptotik etkisi değerlendirildi. Özellikle, ECH'nin ifadesini indüklediği gösterilmiştir.Bax(Şekil 5), proapoptotik bir gen, tümör baskılayıcı p53 (30) tarafından transkripsiyonel olarak aktive edilir. Bu nedenle, ECH'nin p53 sinyal yolunu aktive edip edemediğini test etmeye değer. Eğer öyleyse, ECH ayrıca p53-bağımlı hücre döngüsü durması, yaşlanma, apoptoz veya otofaji ortaya çıkarabilir. Bu çalışmada, SW1990 pankreas adenokarsinom hücre hattında ECH'nin tümör baskılayıcı işlevi aydınlatılmıştır. Bununla birlikte, daha fazla pankreas kanseri hücre dizisini gözlemleyen ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Onkojenik protein RAS ve tümör baskılayıcı p53'teki mutasyonların pankreas kanseri gelişimi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir (31); bununla birlikte, SW1990 hücre çizgisi, IARC p53 veritabanına (//p53.iarc.fr/CellLines.aspx) göre herhangi bir p53 mutasyonu barındırmaz. Bu nedenle, ECH'nin farklı p53 mutasyonlarına sahip diğer pankreas kanseri hücre hatlarının büyümesini ve proliferasyonunu etkileyip etkilemediğini araştırmak önemlidir. Ek olarak, ECH'nin apoptozu teşvik edip edemediğini ve diğer tümör türlerinin büyümesini engelleyip engellemediğini belirlemek ilginç olacaktır.

ECH tedavisinin neden olduğu ROS yükselmesi ve MMP azalmasının apoptoz indüksiyonunda esas olduğu gösterilmiştir (22). Ek olarak, ROS'un sitokrom salınımına katkıda bulunan mitokondriyal gözeneklerin oksidasyonunu indükleyebildiği bulunmuştur.c, MMP'nin bozulması nedeniyle apoptozda bir ara madde (22). Bu nedenle, ECH'nin ROS'un indüklenmesi yoluyla dolaylı olarak MMP'yi bozup bozmadığı henüz belirlenmemiştir. Ayrıca, ROS ile tetiklenen oksidatif stresin ayrıca p53, NF-KB, HIF'ler ve PI3K (32) dahil olmak üzere sayısız hücre büyümesini kontrol eden sinyalin modüle edilmesinde rol oynadığı gösterilmiştir. ECH'nin bu önemli sinyal yollarını düzenleyip düzenlemediği ve eğer öyleyse nasıl düzenlediği henüz belirlenmemiştir. Özellikle oksidatif stres, merkezi sinir sisteminin yüksek oksijen tüketimi, zayıf antioksidan sistemleri ve terminal farklılaşma özellikleri nedeniyle çeşitli nörodejeneratif hastalıklara neden olur (33). Bununla birlikte, çeşitli çalışmalar ECH'nin sinir dokusu üzerinde koruyucu ve anti-apoptotik etkileri olduğunu göstermiştir. Bu bağlamda, ECH'nin terminal farklılaşmış sinir hücrelerinde ROS üretimini azaltabileceğini varsaymak mantıklıdır. Bu nedenle, ECH tarafından ROS üretiminin düzenlenmesinin hücre farklılaşma durumuna bağlı olup olmadığı da belirlenmeye devam etmektedir. Dolayısıyla, diğer çalışmalarla birlikte mevcut sonuçlar, yaygın olarak kullanılan TCM olan ECH'nin sadece nörodejeneratif hastalıkların tedavisi için değil, aynı zamanda malign karsinomların tedavisi için de önemli bir kemoterapötik strateji olabileceğini ortaya koymaktadır.

Son zamanlarda kanser tedavisinde TCM kullanımı giderek daha fazla ilgi görmeye başlamıştır. TCM'de kullanılan tıbbi bitkilerden elde edilen doğal ürünlerin potansiyeli batı dünyasında bile bilim camiası tarafından kabul görmüştür (9). Sonunda kanser tedavisi için etkili ve güvenli ilaçların geliştirilmesine yol açabilecek bu doğal ürünlerin altında yatan etki mekanizmalarını aydınlatmak için çaba gösterilmesi gerekmektedir.

Sonuç olarak, bu çalışma ECH'nin tümör inhibe edici fonksiyonunu gösterdi ve ayrıca ECH aracılı tümör baskılamanın moleküler temelini detaylandırdı, böylece ECH'nin kanser tedavisinde potansiyel klinik uygulamasını ortaya koydu.

Teşekkür

Bu çalışma, FMU'nun Temel Bilimsel Araştırma Programı (hibe no. 09ZD014) tarafından finanse edildi ve desteklendi. Yazarlar, makaleyi düzenleme konusunda yardım için Biomedworld'e (Şanghay, Çin) teşekkür etmek isterler.

Referanslar

1. Hanahan D ve Weinberg RA: Kanserin ayırt edici özellikleri: Yeni nesil. Hücre 144: 646-674, 2011.

2. Alderton GK: Transkripsiyon: MYC'nin transkripsiyonel etkileri. Nat Rev Kanser 14: 513, 2014.

3. Zindy F, Eischen CM, Randle DH, Kamijo T, Cleveland JL, Sherr CJ ve Roussel MF: ARF tümör baskılayıcı yoluyla Myc sinyali, p53-bağımlı apoptozu ve ölümsüzleştirmeyi düzenler. Genes Dev 12: 2424-2433, 1998.

4. Sachdeva M, Zhu S, Wu F, Wu H, Walia V, Kumar S, Elble R, Watabe K ve Mo YY: p53, tümör baskılayıcı miR-145 indüksiyonu yoluyla c-Myc'yi bastırır. Proc Natl Acad Sci USA 106: 3207-3212, 2009.

5. Liao JM, Cao B, Zhou X ve Lu H: Hedef mikroRNA'ları aracılığıyla p53 işlevlerine ilişkin yeni görüşler. J Mol Cell Biol 6: 206-213, 2014.

6. Zamble DB ve Lippard SJ: Kanser kemoterapisinde sisplatin ve DNA onarımı. Trendler Biochem Sci 20: 435-439, 1995.

7. Kleeff J, Kornmann M, Sawhney H ve Korc M: Actinomycin D, apoptozu indükler ve pankreas kanseri hücrelerinin büyümesini engeller. Int J Kanser 86: 399-407, 2000.

8. Tacar O, Sriamornsak P ve Dass CR: Doksorubisin: Antikanser moleküler etki, toksisite ve yeni ilaç dağıtım sistemleri hakkında bir güncelleme. J Pharm Pharmacol 65: 157-170, 2013.

9. Efferth T, Li PC, Konkimalla VS ve Kaina B: Geleneksel Çin tıbbından akılcı kanser tedavisine. Trendler Mol Med 13: 353-361, 2007.